DETERMINACION Y VALIDACIN DE INICIADORES MICROSATLITES PARA SU

USO EN PROGRAMAS DE CONSERVACIN Y MEJORAMIENTO GENTICO EN

OCA (Oxalis tuberosa Molina)
DETERMINATION AND VALIDATION OF MICROSATELLITE PRIMERS FOR
THEIR USE IN CONSERVATION AND BREEDING PROGRAMS IN OCA (Oxalis
tuberosa Molina)

Abel Turumaya Andia1; Jorge rojas Beltrn2;

1

Conservacin y Manejo de Recursos Fitogenticos y Biotecnologa Vegetal Aplicada, CIUFUMSS.

2

Instituto Nacional de Innovacin Agropecuaria y Forestal (INIAF)

RESUMEN
La oca cultivada (Oxalis tuberosa Mol.), originada en la regin andina, ha sido subutilizada,
ignorando el gran valor nutricional y econmico que tiene este cultivo, es una especie que
difcilmente se reproduce por semilla botnica, generalmente su reproduccin se realiza por
va vegetativa a travs de tubrculos. Entender y determinar su origen taxonmico hasta el
momento es muy complicado ya que presenta una gran diversidad dentro sus variedades
que an no est completamente estudiada. El presente trabajo tuvo como finalidad
conformar un conjunto de marcadores microsatlites reproducibles polimrficos e
informativos para utilizarlos en estudios de diversidad gentica en oca (Oxalis tuberosa
Mol.). Se obtuvieron 6 iniciadores altamente polimrficos (OT 07970=0.73, OT 07102=0.72,
OT 21842=0.72, OT 08126=0.72, OT 05385=0.55, OT 22715=0.41) los cuales mostraron
una parte de la gran diversidad gentica de las ocas bolivianas. En este trabajo se pudo
comprobar que los marcadores moleculares y los descriptores morfolgicos no presentan una
correlacin Rxy importante (0.021) pero si revelan la diversidad gentica de las accesiones
elegidas. Estos marcadores son altamente polimrficos y pueden ser utilizados en distintos
estudios genticos en el banco de germoplasma de ocas bolivianas.

ABSTRACT
The cultivated oca (Oxalis tuberosa Mol.), originated in the Andean region has been
underutilized, ignoring its high nutritional value and economic importance, is a species that
reproduces hardly by botanic seed, reproduction usually takes place via vegetative using
tubers. Understand and determine their taxonomic origin so far is very complicated because
it has a great diversity within the varieties that are not yet fully studied. The present work
was to form a set of reproducible polymorphic microsatellite markers and information for use
in studies of genetic diversity in oca (Oxalis tuberosa Mol.). Six highly polymorphic primers
were obtained (OT 07970=0.73, OT 07102=0.72, OT 21842=0.72, OT 08126=0.72, OT

05385=0.55, OT 22715=0.41) they showed some of the high genetic diversity of Bolivian
oca. In this work it was found that molecular markers and morphological descriptors have no
significant correlation Rxy (0.021) but reveal the genetic diversity of selected accessions.
These markers are highly polymorphic and can be used in various genetic studies in the
genebank of Bolivian oca.

INTRODUCCIN
La oca es un cultivo endmico de los andes domesticada posiblemente entre el norte de Bolivia y
el sur del Per, donde se encuentra la mayor diversidad de ocas cultivadas, como silvestres
(FAO, 2009). En Bolivia la oca es muy importante, como fuente de alimento (Yunque 2007). La
erosin gentica que ha sufrido en los ltimos 30 aos ha provocado el inters de instituciones
nacionales e internacionales a la recoleccin de germoplasma de oca, estudio de la diversidad
gentica y su conservacin (Castillo y Hermann 1995).
Para estudios de diversidad gentica y conservacin, es importante conocer el grado y
distribucin de la variacin gentica existente con el fin de desarrollar formas eficientes de
conservacin y evaluacin. Para esto, se utilizan marcadores morfolgicos y moleculares, estos
ltimos estn exentos de efectos ambientales, adems la cantidad de polimorfismo en un locus
estudiado es mucho ms alta que en los marcadores morfolgicos (Ferreira y Gattapaglia 1998).
En este trabajo se identificaron y seleccionaron marcadores microsatlites altamente polimrficos
para utilizarlos en programas de investigacin gentica y fitomejoramiento en oca boliviana.
MATERIALES Y MTODOS
El material de este estudio fue conformado por 30 accesiones de oca (Oxalis tuberosa) con
diferentes caractersticas morfolgicas, elegidas del Banco de germoplasma del INIAF. La
extraccin del ADN se realiz utilizando el protocolo de Doyle and Doyle (1990) y la
visualizacin se realizo en geles de agarosa al 1%.
Determinacin de temperatura de hibridacin y amplificacin PCR: Se utiliz el
termociclador en gradiente y la amplificacin PCR para cada microsatlite se realizo en 15l de
volumen de reaccin, conteniendo 8ng de ADN molde, 1l de 10x PCR (500mM KCl, 100 mM
Tris HCl PH 8.0, 15 mM MgCl),1l de cada dNTPs (2 mM), 0.8l de cada iniciador de inicio y
reversa (10 pmol/l), 0.1 l de Taq polimerasa (0.025 U/l). El programa para PCR utilizado fue
Hot start, 1 Ciclo a 94C por 5 min, 35 Ciclos a 94C por 1 min, T de hibridacin por 30 seg,
72C por 30 seg y 1 Ciclo a 72C por 7 min.
Separacin de fragmentos microsatlites: Para su visualizacin se utiliz agarosa de alta
resolucin GenePure Hi Res al 4 % mediante tincin con Bromuro de Etidio (1 g/ml).
Procesamiento de datos y anlisis estadstico: La lectura de los fragmentos amplificados se
realiz mediante medicin directa, con la finalidad de obtener el peso molecular de cada alelo o
banda.
Eleccin de marcadores microsatelites: Se realizo por medio del anlisis de variabilidad
utilizando los siguientes estadisticos: Nmero de alelos promedio por locus, polimorfismo o tasa
de polimorfismo (Pj) e ndice de Contenido Polimrfico PIC.
Verificacin de la diversidad gentica en accesiones de oca: Para la verificacin de la diversidad
gentica de las 30 accesiones de oca utilizando los marcadores microsatlites elegidos, se
2

utilizaron modelos estadsticos de conglomerados jerrquicos para representar la diversidad

gentica de estas accesiones.
Los clculos y grficos se realizaron utilizando el programa MVSP 3.1 y GenAlex 6 , donde
tambin fueron construidos los dendogramas y coordenadas principales utilizando el mtodo de
ligamiento promedio UPGMA (Unweighted Pair-Group with Arithmetic Mean; Sokal y Sneath,
1963)
IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES
Anlisis de componentes principales
Para identificar y elegir 30 accesiones se tomaron datos morfolgicos de 465 accesiones de la
coleccin boliviana de oca. Mediante un anlisis de componentes principales, (COP) se
escogieron 7 variables (color predominante de piel, color secundario de piel, distribucin del
color secundario de piel, color predominante de pulpa, color secundario de pulpa, distribucin
color secundario de pulpa, forma tubrculo).
Anlisis de correspondencia mltiple
Se realizo para verificar los resultados de los componentes principales en la eleccin de las
variables ms representativas para la discriminacin de las accesiones. Con este anlisis se
validaron las 7 (figura 1) variables elegidas en el anlisis de COP.
Figura 1. Anlisis de correspondencia mltiple representando el grado de discriminacin.

(C1P = color predominante de la piel, C2P = color secundario de la piel, CP2 = color secundario de la pulpa, D2P =
distribucin del color secundario de la piel, CP1= Color predominante de la pulpa, DP2 = distribucin del color
secundario de la pulpa y FT = forma del tubrculo.

Eleccin de accesiones

La eleccin de las accesiones fue totalmente aleatoria para cada grupo identificado de acuerdo al
color de la piel. De esta manera se eligieron 30 accesiones; 24 altamente diversas entre si y 6 con
caractersticas similares entre ellas (cuadro 1).
Cuadro 1. Accesiones de oca elegidas de acuerdo a sus caractersticas morfolgicas.
No
Accesin No
Accesin
1 Bol 3903
16 Bol 4280
2 Bol 3906
17 Bol 4289
3 Bol 3939
18 Bol 4337
4 Bol 3943
19 Bol 4340
5 Bol 4009
20 Bol 4360
6 Bol 4039
21 Bol 4368
7 Bol 4061
22 Bol 4450
8 Bol 4107
23 Bol 4517
9 Bol 4115
24 Bol 4560
10 Bol 4134
25 *Bol 4400
11 Bol 4155
26 *Bol 4415
12 Bol 4172
27 *Bol 4430
13 Bol 4188
28 *Bol 4433
14 Bol 4200 29 *Bol 4469
15 Bol 4262 30 *Bol 4546
() Accesiones con caractersticas morfolgicas distintas, (*) Accesiones con caractersticas morfolgicas
similares.

De acuerdo a los resultados obtenidos en el anlisis de componentes principales y el dendograma

morfolgico se escogieron 6 accesiones en el grupo A (BOL 4400, BOL 4415, BOL 4430, BOL
4433, BOL 4469 y BOL 4546) las cuales comparten caractersticas morfolgicas similares y en
el grupo B 24 accesiones con distintas caractersticas morfolgicas (cuadro 1). Es as que con los
marcadores moleculares se deseaba ver como se conformaban estos grupos, si se mantenan o no
sus agrupaciones.
Eleccin de temperaturas ptimas de hibridacin
En la foto 1 se observa la migracin de los fragmentos amplificados utilizando diferentes
iniciadores. Las temperaturas ptimas para cada iniciador se escogieron observando la intensidad
y resolucin de la banda (temperaturas entre 55 y 60 C, por el mtodo Hot start PCR). De los
30 iniciadores, tres no presentaron amplificacin del fragmento esperado (OT 06453, OT 31337
y OT 17612) (cuadro 2). La mayora de los iniciadores tuvieron una amplificacin exitosa,

Foto 1. Gel de agarosa de alta resolucin al 4% con amplificaciones de 18 iniciadores en la accesin BOL 3906 con
tres temperaturas diferentes de hibridacin.
Cuadro 2. Temperaturas de hibridacin ptimas seleccionadas para los diferentes iniciadores microsatlites.
Temperaturas de
hibridacin
T de
T en
T
N Iniciadores referencia gradiente ptima
(C)
(C)
(C)
1 OT 12024
55-60
56.5
57
2 OT 25246
55-60
56.5
57
3 OT 28001
55-60
58.3
58
4 OT 34142
55
56.5
56
5 OT 34335
55
56.5
56
6 OT 40912
55
56.5
57
7 OT 01419
60
56.5
57
8 OT 21842
60
56.5
57
9 OT 11987
60
56.5
57
10 OT 43 595
55
56.5
57

Determinar el grado de polimorfismo para los

11 microsatlites elegidos
En esta etapa, se trabajo con 11 iniciadores
elegidos de los 30, con los cuales se determin
para cada uno de ellos el nmero de alelos
observados por locus (NAO), frecuencias allicas,
tamao de producto PCR (PRO), tasa de
polimorfismo (Pj), porcentaje de polimorfismo e
ndices de contenido polimorfico (PIC).
Nmero de alelos por locus NAO
El tamao de fragmentos amplificados revelo un
rango de 202 a 118pb (cuadro 3). Los 11
iniciadores mostraron un total de 37 bandas
confiables y reproducibles, de las cuales 31 (83%)
mostraron polimorfismo. El nmero de bandas
polimrficas para los diferentes microsatlites
varan entre 2 a 6 bandas por iniciador, excepto
para (OT 9869, OT 11876 y OT 16815) que no
presentaban bandas.

Temperaturas de
hibridacin
T de
T en
T
N Iniciadores referencia gradiente ptima
(C)
(C)
(C)
11 OT 26959
55
55.0
57
12 OT 08126
55-60
58.3
58
13 OT 24976
55
56.5
56
14 OT 07355
55
58.3
58
15 OT 05813
55
58.3
58
16 OT 06453
55
17 OT 12644
60
59.6
60
18 OT 04178
60
59.6
60
19 OT 04636
60
58.3
58
20 OT 05385
60
58.3
58
21 OT 07102
60
58.3
58
22 OT 07970
60
58.3
58
23 OT 16815
60
58.3
58
24 OT 22713
60
58.3
58
25 OT 21599
55
58.3
58
26 OT 00840
60
59.5
60
27 OT 09869
60
59.5
60
28 OT 11876
60
59.5
60
29 OT 31337
55
30 OT 17612
60
-

Cuadro 3. Nmero de alelos observados (NAO) y tamao de producto PCR (PRO) hallados con 11 iniciadores
microsatlites
Iniciador
OT 21842
OT 08126
OT 07102

NAO
5
4
6

PRO
150pb
123pb
194pb

OT 05385
OT 04636
OT 07970
OT 09869
OT 21599
OT 22715
OT 11876
OT 16815

3
3
5
2
3
3
2
2

190pb
198pb
156pb
156pb
129pb
185pb
165pb
157pb

Frecuencia allica y tasa de polimorfismo

Las frecuencias allicas son parmetros importantes para medir el polimorfismo de cada
iniciador a travs de la tasa de polimorfismo (Pj). Cuando la frecuencia de los dos alelos con
valores altos es mayor al 99 %, se dice que el marcador no es polimrfico. En el cuadro 4 se
identifican tres marcadores como no polimrficos (OT 09869, OT 11876 y OT 16815), debido a
que su valor de polimorfismo es igual al 100%. Por otro lado el porcentaje de polimorfismo
calculado por el programa GenAlex6 (Peakall y Smouse, 2005), revelo un 89.47%, confirmando
el alto valor polimrfico de los 11 iniciadores utilizados.
Cuadro 4. Tasa de polimorfismo y valor polimrfico.
Microsatlites
OT 21842
OT 08126
OT 07102
OT 05385
OT 04636

Microsatlites
OT 07970
OT 09869
OT 21599
OT 22715
OT 11876
OT 16815

Pesos
moleculares
155pb
127pb
129pb
117pb
202pb

valor de
(Pj) polimorfismo
28%
Polimrfico
45%
49%
Polimrfico
43%
45%
Polimrfico

186pb

7%

203pb
193pb
198pb

31%
49%
75%

Pesos
moleculares
193pb
164pb
158pb
165pb
148pb
138pb
130pb
186pb
168pb
180pb
150pb
164pb
150pb

(Pj)
10%
30%
25%
93%
7%
3%
93%
70%
17%
57%
43%
94%
6%

Polimrfico
Polimrfico

valor de
polimorfismo
Polimrfico
No polimrfico
Polimrfico
Polimrfico
No polimrfico
No polimrfico

ndice de polimorfismo PIC

Para los 11 iniciadores se revel un rango de PIC entre 0,11 y 0,73 de los cuales se observaron
5 iniciadores con bajo PIC, con ndices inferiores a 0,4 (OT 04636=0,36, OT 09869=0,12, OT
21599=0,12, OT 11876=0,37, OT 16815) adems mostraron patrones de bandas de difcil lectura.
Con el PIC, a travs de las frecuencias obtenidas, se determin que la probabilidad de dos
variantes tomadas al azar en una poblacin son diferentes (Marshall and Jain, 1969).
Mientras ms diferentes son estas variantes, el valor del PIC es ms elevado. De esta manera se
eligieron los iniciadores que presentan mayor polimorfismo (OT 07970=0,73, OT 07102=0,72,
OT 21842=0,72, OT 08126=0,72, OT 05385=0,55, OT 22715=0,41) que tienen valores cercanos
a 1 (cuadro 5).
Los marcadores microsatlites son usados para estudiar la relacin gentica entre genotipos y
accesiones a nivel intraespecfico (Smith et al, 2000). El polimorfismo que estos revelan es
altamente informativo y confiable. Se demostr que los diferentes microsatlites observados
revelaron un alto porcentaje de polimorfismo como demuestran los alelos y los diferentes
estadsticos utilizados.
Cuadro 5. ndice de polimorfismo para los 11 iniciadores.
Iniciador
OT 21842
OT 08126
OT 07102
OT 05385
*OT 04636
OT 07970
*OT 09869
*OT 21599
OT 22715
*OT 11876
*OT 16815

ndice de
Polimorfismo (PIC)
0,63
0,48
0,72
0,55
0,36
0,73
0,12
0,12
0,41
0,37
0,11

(* Iniciadores no polimrficos)

Diversidad gentica
El dendograma morfolgico (figura 2) calculado con la distancia de Gower, (1971) constata
que la separacin de las ramas del rbol tiene un coeficiente de similitud de 0,54. Al contrario, en
la figura 3, el dendograma molecular muestra que el grupo A (BOL 4546, BOL 4430, BOL 4469,
BOL 4400, BOL 4415, BOL 4433) de 6 accesiones estn dispersas en el dendograma
manteniendo juntas solo 2 accesiones (BOL 4546 y BOL 4430). Se puede ver que la distancia de
separacin de las ramas empieza en un coeficiente de similitud de 0,3. Para una mejor
visualizacin de la diversidad gentica, se realizo el anlisis de coordenadas principales (figura 4)
en el cual se ve similar agrupacin al dendograma molecular (figura 3) donde sus dos primeros
7

ejes representan el 46 % de la diversidad gentica de las 30 accesiones. Se puede observar que las
accesiones del grupo A se dispersan tanto en el plano bidimensional de coordenadas principales
(figura 4) como en el dendograma molecular (figura 3), en este se puede verificar que las
accesiones BOL 4546 y BOL 4430 comparten un mismo espacio y las otras 4 accesiones (BOL
4400, BOL 4415, BOL 4433) estn dispersas en el rbol, siendo la ms distante la accesin BOL
4469. Con marcadores ISSR Malice, (2009) encontr similar resultado al determinar que de 51
accesiones estudiadas, algunas tenan correspondencia al agruparse de acuerdo al nombre de las
variedades (caracterizadas con datos morfolgicos).

Gower
Figura 2. Dendograma generado con 7 variables morfolgicas relacionadas al tubrculo utilizando el coeficiente de
Gower que representa la diversidad gentica de las 30 accesiones.

Figura 3. Dendograma generado con datos moleculares utilizando el coeficiente de Jaccard que representa la
diversidad gentica de las 30 accesiones, representados por los iniciadores OT 21842, OT 08126, OT 07102, OT
05385, OT 04636, OT 07970, OT 09869, OT 21599, OT 22715, OT 11876, OT 16815.

Figura 4. Coordenas principales generado con datos moleculares utilizando el coeficiente de Jaccard que representa
la diversidad gentica de las 30 accesiones, representados por los iniciadores OT 21842, OT 08126, OT 07102, OT
05385, OT 04636, OT 07970, OT 09869, OT 21599, OT 22715, OT 11876, OT 16815.

De acuerdo a los ndices de polimorfismo PIC, tasa de polimorfismo (Pj) y dendogramas que
muestra la diversidad gentica de las 30 accesiones, se eligen 6 microsatlites que permiten
representar la diversidad gentica de esta pequea coleccin elegida aleatoriamente (cuadro 6).
Cuadro 6. Iniciadores escogidos de acuerdo al NAO, PIC y (Pj)
Iniciador
OT 07970
OT 07102
OT 21842
OT 05385
OT 08126
OT 22715

PRO
156pb
194pb
150pb
190pb
123pb
185pb

NAO
5
6
5
3
4
3

PIC
0,73
0,72
0,63
0,55
0,48
0,41

(Pj)
55%
52%
73%
80%
92%
87%

Los marcadores microsatlites en oca (Oxalis tuberosa Mol) reflejan la habilidad de revelar la
variabilidad gentica dentro una coleccin limitada de germoplasma. Entre los diferentes
dendogramas y coordenadas principales se puede evidenciar la amplia discriminacin existente y
una baja similitud entre datos morfolgicos y moleculares.
El coeficiente de separacin de las ramas del rbol con marcadores morfolgicos comienza a
0.53 de similitud, en cambio los arboles de similitud con marcadores moleculares inician en
valores ms bajos (0.3). Aparentemente los datos moleculares tienen un mayor rango de
variabilidad. Similares valores se encontraron en el anlisis de diversidad gentica de oca
utilizando marcadores ISSRs y marcadores morfolgicos (Malice, 2009).
Aplicando el test de mantel entre las matrices moleculares y morfolgicas (calculadas con
distancias de similitud de Jaccard y Gower) utilizando 11 iniciadores y 18 variables, con los
cuales se encuentra una relacin (Rxy = - 0.006) se confirma una baja correlacin entre la matriz
morfolgica y molecular en las 30 accesiones seleccionadas. Para 11 iniciadores y 7 variables
morfolgicas se hall una relacin de Rxy = 0.021. Realizando tambin un ltimo anlisis usando
el test de mantel con los 6 iniciadores polimrficos encontrados y las 7 variables utilizadas en
9

este trabajo podemos constatar una relacin de Rxy = 0.030. Demostrando la baja correlacin
entre descriptores morfolgicos y moleculares.
En este sentido segn Pissard (2008), la baja correlacin entre datos morfolgicos y moleculares
podra estar influenciada por las colecciones y diferenciaciones que realiza el agricultor andino,
debido al limitado uso de caractersticas morfolgicas que bsicamente estn relacionadas al
tubrculo. Es posible que los agricultores, independientemente del lugar, apliquen descriptores
locales similares, dejando una correspondencia dbil entre marcadores morfolgicos y
moleculares. Esto an no est verificado en Bolivia, sin embargo resultados de ISSR (Pissard,
2008 y Malice, 2009) ya han revelado este fenmeno con variedades y accesiones estudiadas en
el territorio nacional. Los marcadores microsatlites ayudaran a dilucidar esta teora. Los
resultados comparados entre marcadores morfolgicos y moleculares revelan que los marcadores
microsatlites podran representar la diversidad gentica ampliamente. Con los iniciadores
seleccionados se espera tener resultados mucho ms congruentes en la correlacin de datos
morfolgicos y moleculares para estudios intravarietales, que puede ser una herramienta til para
este propsito. Para esto es necesario someter estos iniciadores a evaluar el banco de
germoplasma de oca boliviana y comprobar su eficiencia.
CONCLUSIONES
Utilizando estimadores de diversidad gentica se pudo conformar un conjunto de iniciadores,
capaces de amplificar microsatlites, tiles para estudios de diversidad gentica.
Se obtuvo las temperaturas de hibridacin para 27 iniciadores, capaces de amplificar regiones
microsatlites en ocas bolivianas.
Un total de 37 alelos fueron identificados, de los cuales 31 alelos fueron altamente polimrficos
(83 %). El porcentaje de polimorfismo calculado fue de 89.47% en la coleccin, determinando as
un polimorfismo elevado.
Las 30 accesiones sometidas al anlisis conglomerado jerrquico, demostraron que los 11
iniciadores revelan ampliamente la diversidad gentica a travs de dendogramas y coordenadas
principales, expresando la variabilidad existente entre las 30 accesiones.
La tasa de polimorfismo y el ndice de polimorfismo (PIC) pudo determinar 6 iniciadores con
contenidos altos de polimorfismo, informativos y altamente reproducibles, los cuales son muy
tiles para estudios de diversidad gentica.
BIBLIOGRAFA CONSULTADA
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10

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