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Notas
ndice
1. OBJETIVOS.....................................................................................................................2
2. NOMENCLATURA...........................................................................................................2
3. PRECISIN .....................................................................................................................6
3.1. Diseo experimental del estudio de imprecisin ........................................................................................ 6
3.2. Comparacin con otras evaluaciones de la precisin ................................................................................ 6
3.3. Comparacin estadstica con el fabricante ................................................................................................ 7
3.4. Componentes de la precisin ..................................................................................................................... 7
3.5. Materiales de calibracin y reactivos ......................................................................................................... 7
3.6. Deteccin de datos extremos (outliers) ...................................................................................................... 8
3.7. Estimacin de la repetibilidad..................................................................................................................... 8
3.8. Estimacin de la precisin intralaboratorio............................................................................................... 9
3.9. Comparacin con los datos de imprecisin del fabricante u otros criterios ............................................. 10
3.10. Comparacin de la repetibilidad ............................................................................................................. 10
5. LMITE DE CUANTIFICACIN......................................................................................22
5.1. Establecimiento del lmite de cuantificacin............................................................................................. 22
5.2. Verificacin de un lmite de cuantificacin ............................................................................................... 22
5.3. Informe de resultados............................................................................................................................... 23
6. LINEALIDAD..................................................................................................................24
6.1. Pool de muestras de pacientes ................................................................................................................ 25
6.2. Pool de muestras de pacientes diluido con un diluyente recomendado .................................................. 25
6.3. Pool de muestras de pacientes suplementado con el analito de inters ................................................. 25
6.4. Pool diluido con materiales tratados de baja concentracin o con otro pool tratado............................... 25
6.5. Controles / calibradores / materiales para estudio de linealidad comerciales ......................................... 25
6.6. Pool diluido con suero salino u otros diluyentes diferentes del recomendado ........................................ 25
6.7. Material de control comercial diluido con diferente volumen del establecido .......................................... 25
6.8. Soluciones acuosas.................................................................................................................................. 26
6.9. Disoluciones en otros disolventes ............................................................................................................ 26
6.10. Intervalo analtico ................................................................................................................................... 26
6.11. Determinacin del intervalo lineal........................................................................................................... 27
6.12. Regresin polinmica ............................................................................................................................. 27
6.13. Orden de la regresin polinmica........................................................................................................... 28
6.14. Grado de nolinealidad .......................................................................................................................... 29
6.15. Consideraciones acerca del error aleatorio............................................................................................ 29
7. CALIBRACIN ..............................................................................................................31
7.1. Conceptos bsicos asociados a la calibracin......................................................................................... 31
7.2. Chequeo de la falta de ajuste................................................................................................................... 32
7.3. Diseo de un experimento de calibracin ................................................................................................ 33
7.4. Linealidad exacta? ................................................................................................................................. 33
7.5. Ajuste de datos a una funcin lineal con error en ambas variables......................................................... 34
7.6. Modelos de regresin y de relacin funcional .......................................................................................... 34
7.7. Aplicaciones analticas de FREML ........................................................................................................... 35
7.8. Cmo estimar las ponderaciones ............................................................................................................. 35
1. Objetivos
Conocer los procedimientos estadsticos adecuados para abordar la evaluacin y validacin de mtodos
e instrumentos analticos;
Conocer los criterios y algoritmos propuestos por entidades cientficas de mbito nacional e
internacional para la evaluacin de mtodos e instrumentos.
2. Nomenclatura
A lo largo de las dos partes de este tema dedicado a la evaluacin de mtodos, se emplearn trminos que
conviene definir y matizar previamente. Tambin se recomienda revisar algunos documentos de la SEQC
que hace referencia a la validacin de mtodos.1
Exactitud
y error
Exactitud
Veracidad Veracidad
y sesgo
Sesgo
Intervalo lineal
Linealidad
Precisin
Precisin
Condiciones de
repetibilidad
pgina 3
Condiciones de
reproducibilidad
Repetibilidad
ISO. International of vocabulary of basic and general terms of metrology (VIM). Geneva:ISO, 1993.
ISO. Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results Part 1: General principles
and definitions. ISO 5725-1. Geneva:ISO, 1994.
pgina 4
Precisin
Instrumental
Mensurando
Incertidumbre
Incertidumbre
tpica
Incertidumbre
expandida
3. Precisin
En el presente apartado se presenta el protocolo de estudio de imprecisin segn recomendaciones del
CLSI.5 Se recomienda consultar tambin otros protocolos publicados por la SEQC para conocer otros
posibles enfoques del procedimiento.6
Repetibilidad;
Imprecisin interserial;
Imprecisin intrada;
Imprecisin interda; y
Imprecisin intralaboratorio.
De estas, la repetibilidad y la imprecisin intralaboratorio son generalmente las de ms inters. En este
diseo, no se pretende incorporar especficamente las estimaciones separadas de otras fuentes
significativas de variabilidad, como el calibrador o las diferencias de lote de reactivos o de
tcnicos/operadores.
pgina 7
aceptables para llevarlo a cabo. Durante los primeros cinco das del experimento, el usuario debe
familiarizarse con el protocolo.
Se considera un mtodo corto a aquel en que la duracin de la determinacin es inferior a 2 h, mientras que
un mtodo largo (como el radioimmunoanlisis) dura considerablemente ms y no se procesa ms de uno al
da. Para mtodos largos, existe un procedimiento aplicable incluyendo una serie analtica por da. Para
procedimientos cortos, las muestras pueden ser analizadas en cualquier momento de la serie analtica. Para
realizar el anlisis de la varianza, una serie analtica de evaluacin es un periodo de tiempo discreto de
recogida de datos diseado para poder estimar la variabilidad (o deriva) en un da. Para algunos
dispositivos, como instrumentos de acceso aleatorio, discretos, o individuales, el concepto de serie analtica
(run) puede no ser apropiado. En este caso, las muestras deberan procesarse por duplicado en
condiciones de repetibilidad y tiempos aleatorios a lo largo de una jornada de trabajo para simular la
operacin real de instrumento.
Cada da habr que realizar los siguientes pasos:
1. Analizar dos series analticas (runs o batches);
2. Si una serie analtica debe ser rechazada debido al control de calidad o a dificultades operativas, se
realiza una nueva serie analtica despus de que se haya solucionado el problema;
3. En cada serie, se analizarn dos alcuotas del material chequeado para cada concentracin;
4. Se deben incluir en cada serie las muestras de control de calidad que se juzguen necesarias para
valorar la aceptabilidad de la serie analtica o el da;
5. Se cambia el orden de anlisis de los materiales analizados y muestras de control de calidad para cada
serie analtica o da;
6. Para simular la operacin verdadera, se incluyen al menos diez muestras de pacientes en cada serie, si
es posible;
7. Separar la series analticas realizadas cada da al menos en 2 h.
sf =
donde I
( x
i =1
j =1
i j1
xi j2 )
4I
x I j1
xI j2
pgina 8
Se necesitan dos resultados de cada uno de las dos series analticas de cada da para usar la frmula
anterior. Si solo se dispone de una serie analtica en un da dado, se puede utilizar la frmula (con j = 1 ).
Siempre que no haya ms de un 10 % de los das de la evaluacin en que falten series analticas (por
ejemplo, con un solo run) en un diseo experimental de dos series analticas por da, los clculos
resultantes pueden ser vlidos (aplicando las frmulas del Apndice 1) si slo hay una serie analtica por
da.
A =
donde: I
(x
i =1
i 1i
x i 2i )
2I
x I j1
xI j2
B =
donde: I
(x
i =1
i ii
x iii )
I 1
es el nmero de das;
x i ii
x iii
s d2 d = B 2
s r2r = A 2
A2
2
s r2
2
donde: s d d
srr
sT =
s d2 d + s r2r + s r2
Con esta formula para s T el resultado obtenido ser diferente al estimado con el clculo mediante la
desviacin tpica de todos los datos (sin tener en cuenta el da o la serie analtica). La formula anterior es la
forma correcta para estimar la imprecisin instrumental, porque sopesa adecuadamente la repetibilidad as
pgina 9
3.9. Comparacin con los datos de imprecisin del fabricante u otros criterios
La estimacin de la imprecisin obtenida en la seccin anterior puede compararse con las especificaciones
de la imprecisin del fabricante. El estadstico jicuadrado
tomar como referencia la estimacin puntual que ofrezca el fabricante (por ejemplo, la desviacin tpica).
Se deben comparar por separado la repetibilidad y la imprecisin intermedia.
( ) . El test de ji
r
cuadrado usa el cuadrado de las estimaciones de la repetibilidad, tanto del usuario como del fabricante.
2
Deben conocerse el nmero de grados de libertad asociados con s r (varianza intraserial estimada por el
2
usuario). s r tendr tantos grados de libertad como pares de datos (replicados) se usen para calcularla. Por
tanto, ser igual el nmero de series analticas realizadas en el experimento, identificadas en adelante como
R . Para aplicar el test es necesario calcular el siguiente valor:
2 =
2
donde: s r
s r2 R
2r
2r
El valor calculado de
utilizando el valor
crtico superior del 95 % de confianza con R grados de libertad (tabla 1). Si el valor calculado es inferior al
de la tabla, la estimacin no es significativamente diferente del valor de la imprecisin aportado por el
fabricante y se puede aceptar como verificada.
g. de l. de la varianza
estimada por el usuario
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
11,1
12,6
14,1
15,5
16,9
18,3
19,7
21,0
22,4
23,7
25,0
26,3
27,6
1,51
16,8
18,5
20,1
21,7
23,2
24,7
26,2
27,7
29,1
30,6
32,0
33,4
pgina 10
g. de l. de la varianza
estimada por el usuario
18
19
20
25
30
35
40
50
60
70
75
79
80
90
100
28,9
30,1
31,4
37,7
43,8
49,8
55,8
67,5
79,0
90,5
96,2
100,7
101,9
113,1
124,3
34,8
36,2
37,6
44,3
50,9
57,3
63,7
76,2
88,4
100,4
106,4
111,1
112,3
124,1
135,6
Tabla 1. Valores crticos de ji-cuadrado para la estimacin de la varianza estimada por el usuario
Se puede emplear una aproximacin similar a la anterior para comparar la estimacin de la imprecisin
intralaboratorio (o instrumental, within-device) con los requerimientos de la aplicacin mdica de cada
parmetro. Sin embargo, a diferencia de la estimacin de la repetibilidad, calcular el nmero exacto de
grados de libertad para s T implica un clculo ms complicado. Dada la estructura del protocolo propuesto
en este tema, el usuario no puede asumir que todas las observaciones sean independientes, lo que es
requisito necesario antes de que se pueda utilizar la estimacin de los grados de libertad del propio usuario
(nmero total de observaciones menos uno). La siguiente formula para los T grados de libertad de s T tiene
en cuenta esta falta de independencia.
I ( 2 ME + MR + MD )
T =
I
2 ME 2 + MR 2 +
MD 2
I 1
2
donde: ME = s r
MR = 2 A 2
MD = 4 B 2
El valor entero ms prximo al calculado segn esta formula ser empleado como grados de libertad para
s T . Usando este valor, el estadstico apropiado es el siguiente:
2 =
2
donde: s T
s T2 T
T2
2
T
Si el valor calculado de
Si, por el contrario, el valor de calculado es mayor que dicho lmite crtico superior del 95 % de la
imprecisin estimada no entra dentro de los lmites aceptables para la aplicacin mdica definida.
La estimacin del usuario puede ser superior que la desviacin tpica aportada por el fabricante y ser an
as aceptable. Dado que el experimento del usuario se basa en un nmero limitado de observaciones, cabe
esperar errores de muestreo para los valores calculados de s r y s T en torno a los valores verdaderos.
2
Cuanto mayor sea el tamao del experimento, ms prximas sern las estimaciones al valor real. El test de
se usa para determinar si la estimacin del usuario es significativamente peor que la aportada por el
fabricante.
La valoracin de la tolerancia que puede considerarse aceptable en funcin del analito considerado es una
informacin que debe obtenerse a partir de las especificaciones de variabilidad biolgica descritas en la
bibliografa y de los requisitos necesarios para que un test tenga utilidad para la aplicacin que se le desee
dar.
CLSI Documento EP17 - Protocols for determination of limits of detection and limits of quantitation;
Approved guideline.
8
Recomendaciones para el estudio de la capacidad de deteccin de los procedimientos de medida en el
laboratorio clnico. Qum Cln 2004; 23: 439-41.
pgina 12
este tema: lmite de blanco ( LB ) , lmite de deteccin ( LD ) y lmite de cuantificacin ( LQ ) . Sin embargo,
hay otros dos tipos de lmites, el lmite inferior del intervalo lineal y el lmite inferior del intervalo de medida.
Es posible que cuatro de estos cinco lmites coincidan (con el modelo que consideraremos en el presente
tema el LB es inferior al LD , o podran ser los cinco diferentes). Es ms frecuente que algunos sean
iguales, pero no todos.
Al describir estos conceptos es importante distinguir entre la verdadera cantidad de sustancia que se
encuentra realmente en la muestra y el resultado de una medida individual. En este tema, se hablar de
concentracin real para describir la que contiene realmente la muestra y concentracin medida o resultado
para describir los valores que se obtendrn en el laboratorio cuando se utilice un mtodo analtico particular.
La relacin entre estos conceptos se describe a continuacin:
El menor es el lmite de blanco, LB , que es el valor ms alto que se espera observar en una serie de
resultado obtenidos en una muestra que no contenga analito. Es importante notar que el LB se refiere
a un resultado observado de la prueba, mientras que el resto de lmites se refieren a concentraciones
reales del analito.
( LMR )
condiciones definidas para el mtodo. Las condiciones definidas incluyen caractersticas establecidas,
como sesgo e imprecisin, incertidumbre, entre otras caractersticas.
mtodo tiene una relacin lineal con la concentracin verdadera9. Esto implica requisitos para el error de
nolinealidad, el cual debe acompaar a cualquier informe de linealidad.
Siempre se cumple que LB < LD < LQ . El resto de lmites pueden no tener una relacin consistente con
cada uno de los dems. El puesto relativo de estos lmites vendr determinado por los objetivos de
cuantificacin, error de nolinealidad y otras caractersticas definidas para el mtodo.
NCCLS. Documento EP6. Evaluation of the linearity of quantitative measurement procedures: A statistical
approach.
pgina 13
discriminante entre los resultados positivos y los negativos (tambin denominado umbral o cutoff), y la
respuesta instrumental a concentraciones cercanas a cero, deberan estar totalmente documentadas por el
fabricante y ser comunicada a los usuarios. Esto no se aplica a los mtodos en que el punto discriminante
est muy por encima del lmite de deteccin, como es el caso de los tests de embarazo.
Las pruebas cualitativas pueden tener un intervalo dinmico estrecho y alcanzar la saturacin de la seal a
concentraciones relativamente bajas. Sin embargo, todas las pruebas cualitativas con un fondo continuo
tienen un rea de transicin desde la ausencia de respuesta o seal de fondo hasta la respuesta completa,
y el punto discriminante est generalmente diseado para situarse en esa rea. Para algunas pruebas, los
fabricantes definen un umbral diferente para los resultados positivos y los negativos, creando una zona
donde la respuesta es indeterminada. Esta rea indeterminada se denomina intervalo del 95 % en el
documento NCCLS EP12. User protocol for evaluation of qualitative test performance. En dicho documento,
sin embargo, no se define un intervalo de confianza estadstico entorno al punto de cutoff, sino que los
extremos que delimitan este intervalo son las concentraciones a las que resultados repetidos son positivos
el 95 % de las veces o negativos el 95 % de las veces, respectivamente. Cabe destacar que la repeticin de
una prueba de concentracin exactamente igual a la del cutoff proporcionar resultados positivos en el 50 %
de las rplicas y resultados negativos en el restante 50 % de las veces. En este protocolo, el LB es el
mismo que el punto de cutoff, el lmite superior del intervalo del 95 % se corresponde con el LD (donde las
muestras verdaderamente positivas producen resultados positivos en el 95 % de las ocasiones), y el lmite
inferior del intervalo es el cero (no existe analito presente en la muestra).
El conocimiento del lmite de deteccin para un test cualitativo, combinado con el anlisis frecuente de un
control positivo dbil, permite monitorizar en el laboratorio la consistencia de la eficacia del mtodo en la
zona prxima a la concentracin de cutoff. Es posible experimentar un incremento no observado en el lmite
de deteccin de una prueba cualitativa, por ejemplo, debido a cambios en los reactivos. Esto puede
incrementar la proporcin de resultados falsamente negativos, debido a que las muestras con
concentraciones detectables de un analito pueden tener resultados que caigan por debajo del cutoff,
mientras que muestras con concentraciones altas seguiran en todo caso aportando respuestas
correctamente positivas. Como consecuencia, la determinacin experimental del LD es importante para
controlar la calidad de muchas pruebas cualitativas.
Figura 1. Distribuciones de las concentraciones observadas para el blanco y una muestra de baja
concentracin de analito. La lnea discontinua correspondiente a concentraciones negativas indica
que algunos instrumentos no proporcionan resultados menores de 0.
10
Currie AL, et al. Nomenclature in evaluation of analytical methods including detection and quantification
capabilities (IUPAC recommendations). Pure Appl Chem. 1995; 67: 1699-723.
pgina 14
11
recomend una definicin del mnimo lmite de deteccin en relacin con los niveles
establecidos para el error de tipo I y II. Por defecto, dichos errores se acotan al 5 %
( = = 5% ) . Un valor
de del 5 % se corresponde con usar el percentil 95 de la distribucin de valores del blanco como lmite
para declarar un valor medido significativamente por encima del blanco.
Dada una distribucin gaussiana de valores del blanco (figura 1), este lmite se corresponde con:
LB = B + 1, 645 B
donde:
B y B
[1]
Para una situacin donde no existe posibilidad de obtener valores negativos, o si la distribucin de los
valores del blanco no es gaussiana (por ejemplo, cuando siguen una distribucin asimtrica), el percentil 95
debe estimarse por otra aproximacin.
El procedimiento ms directo es aplicar un mtodo no paramtrico basado en los valores ordenados. El
percentil que constituye el lmite de la distribucin de los blancos, p B , es el que deja un porcentaje de
valores en la cola superior de la distribucin, y se define como lmite de blanco, LB , es decir,
LB = p B 100
[2]
ISO. Capability of detection Part 1: Terms and definitions. ISO 11843-1. Geneva: ISO, 1997.
pgina 15
LB = s 1, 645 s
donde:
s y S
[3]
Globalmente, se tendr:
S = LD = LB + 1, 645 S
Si la distribucin de valores del blanco es gaussiana, LB =
LD = B + 1, 645 B + 1, 645 S
En caso de que la distribucin muestral no sea gaussiana (ni se pueda transformar en gaussiana), puede
estimarse el LD no paramtricamente, como se ver; En caso contrario, ser necesario producir muestras
de concentracin prxima al LD , y chequear cul es el valor para el que el 5 % o menos de las medidas
observadas estn por debajo del LB .
Figura 2 Distribuciones de replicados para las muestras de blanco (curva izquierda en ambas
figuras) y dos muestras hipotticas positivas de baja concentracin (2a y 2b). Cuando la
concentracin real de analito presente en la muestra es igual al LB , el 50 % de las medidas sern
superiores al (a). Con una concentracin real en la muestra igual al LD , (100% - ) (95%) de las
medidas de las muestras sern superiores al LB (b).
pgina 16
incertidumbre de la estimacin del LB y la variabilidad entre las medidas en las muestras de bajo nivel (se
hablar en trminos de s S ).
La estimacin no paramtrica del LB es aproximadamente la mitad de eficaz que el procedimiento
paramtrico. Esto significa que se espera obtener el mismo resultado mediante procedimientos
paramtricos y no paramtricos, pero empleando el mismo nmero de muestras la estimacin paramtrica
tiene menor incertidumbre (si los datos son gaussianos). Las incertidumbres del percentil o la estimacin de
la desviacin tpica tambin sern proporcionales a la dispersin de las distribuciones. Por tanto, con una
estimacin no paramtrica del LB y la estimacin paramtrica del LD , el nmero de medidas de blanco
debera ser mayor que el de muestras de baja concentracin.
Sin embargo, es ms frecuente que la dispersin de las medidas de la muestra de bajo nivel sea superior
que la de las medidas del blanco. En conjunto, en la mayora de los casos puede ser aceptable procesar el
mismo nmero de muestras de bajo nivel que de blancos.
Cuando el nmero de medidas de blanco es el mismo que el de medidas de bajo nivel, la incertidumbre del
LD decrece con el inverso de la raz cuadrada del nmero de medidas (ajustada por el nmero de
muestras diferentes incluidas en el estudio). La relacin entre el tamao muestral y la incertidumbre del LD
fue descrita por Linnet y Kondratovich.12.
Una solucin de compromiso razonable entre precisin y coste es un mnimo de 60 medidas (tanto de
blanco como de muestras de bajo nivel) para establecer el LD , generalmente cuando se desarrolla un
mtodo. Para verificar un LD estipulado por el fabricante, se emplear un mnimo de 20 resultados de la
concentracin esperada y, si es necesario, tambin de la concentracin del LB . Esta ser la evaluacin
habitual realizada por el usuario.
Linnet K, Kondratovich M. A partly nonparametric procedure for determination of the limit of detection. Clin
Chem. 2004; 50: 732-40.
pgina 17
medidas de cada una de cinco muestras. Las medidas deberan realizarse en das diferentes de modo que
la s S refleje la variacin analtica total.
Para que las estimaciones del LD y el LB tengan significado, los valores medidos deberan ser trazables
hasta un nivel conocido. Si existe mtodo de referencia para el analito de inters, deberan compararse las
medidas obtenidas por ambos mtodos en concentraciones cercanas al mmite inferior del intervalo
analtico. La trazabilidad tambin puede comprobarse con medidas sobre muestras suplementadas.
4.11. Resultados
Las medidas pueden realizarse de una caracterstica o propiedad como la concentracin o la actividad
siempre que la cantidad medida (el mensurando) est claramente definida. Cuando el mensurando difiere
del analito de inters (por ejemplo, una actividad enzimtica no es lo mismo que la concentracin en masa
del enzima), la cantidad debe estar bien definida. Esto es esencial para entender las diferencias en LD
para diferentes mtodos o bajo diferentes condiciones de medida.
LB = resultado en la posicin
N B + 0,5
100
[5]
Si no es un valor entero se realizar una interpolacin lineal. En la prctica suele calcularse el percentil de
orden 100 mediante cualquier software apropiado.
( ) a partir de
NS
medidas repetidas de muestra(s) con una concentracin baja detectable, por ejemplo, una concentracin en
aproximadamente de cuatro veces el LB . Se recomienda un mnimo de 60 resultados obtenidos a partir de
muestras de baja concentracin. El procedimiento preferido es tomar varias muestras de bajo nivel (de
cuatro a seis) y calcular una estimacin conjunta de la precisin a esos niveles. Antes de juntar las
estimaciones individuales de la precisin, debera comprobarse la consistencia de las mismas mediante un
test F convencional (dos muestras) o un test de Cochran, en caso de que se trate de ms de dos
muestras. Si el test falla, es preciso investigar una posible causa tcnica. Puede ser indicativo de
inestabilidad de la reaccin o de que alguna de las muestras est afectada de una variabilidad superior a la
esperada. Se obtiene de este modo una estimacin preliminar, LD p segn:
LD p = LB + c s S
donde: s S
[6]
pgina 18
S.
c =
donde: g
1, 645
1
1
4g
(N
= N S k = 55
c =
1, 645
= 1, 653
1
1
220
No es necesario ni deseable obtener todas las medidas en la misma muestra de baja concentracin. El
motivo es que el empleo de varias muestras permite tener en cuenta la variabilidad entre sujetos.
Consideraciones acerca de la desviacin tpica
Es importante considerar si la s s obtenida al nivel medido puede ser la misma que al nivel del LD p . En la
estimacin del LD , un problema comn es que la desviacin tpica muestral no sea constante, pues
frecuentemente aumenta con la concentracin. Sin embargo, en un intervalo limitado de concentraciones,
podra ser aproximadamente constante y el procedimiento anterior es adecuado. Si se puede asumir una s s
constante, entonces LD = LD p .
En caso contrario, se debe considerar una aproximacin ms complicada, asumiendo que la desviacin
tpica muestral es funcin de la concentracin13,14.
LD = LB + D S ,
Si la s S no es constante, y no es posible obtener datos normales, deber emplearse un procedimiento de
prueba y error no paramtrico Se prepararn muestras a niveles similares al LD esperado y se obtendr
una serie de medidas (en distintos tiempos y con diferentes operadores). Se calcularn los percentiles ,
13
ISO. Capability of detection. Part 1. Terms and definitions. ISO 11843-1. Geneva:ISO, 1997.
ISO. Capability of detection. Part 2. Methodology in the linear calibration case. ISO 11843-2. Geneva:ISO,
2000.
14
pgina 19
como porcentaje de observaciones por debajo de LB . El LD es el menor nivel para el cual dicho percentil
sea del 5 % o menor.
20
30
40
50
60
70
80
90
100
150
200
250
300
400
500
1000
85
87
88
88
88
89
89
90
90
91
92
92
92
93
93
94
Tabla 2. Lmites inferiores del 95 % de confianza para los resultados observados que excedan el LB
con una proporcin esperada de 1- = 95 % (modificado de Linnet & Kondratovich)15
Ejemplo de verificacin de un LD
Un procedimiento analtico para medir una hormona un LD de 45 UI/L segn el fabricante con
= = 5% . El usuario determina 25 medidas de blanco (5 medidas de 5 muestras de blanco durante 5
das) y 25 medidas en muestras a las que se ha aadido 45 U/L del analito (5 medidas de 5 muestras en 5
das). Los resultados se presentan en la tabla 3 y la figura 2. La inspeccin visual revela que la distribucin
15
Linnet K, Kondratovich M. A partly nonparametric procedure for determination of the limit of detection. Clin
Chem. 2004; 50: 732-40.
pgina 20
orden
blancos muestras
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1,08
1,92
2,38
2,98
3,8
4,78
7,3
8,81
10,31
11,29
13,48
14,39
16,97
17,4
21
24
18,8
19,02
26,63
26,91
31,08
33,99
35,11
35,9
36,12
41,67
43,9
46,32
47,77
47,99
48,83
54,67
57,3
59,1
61,17
61,96
62,97
66,44
73,44
73,8
75,71
Figura 3. Ejemplo de verificacin del LD distribuciones de las 25 medidas del blanco y de las 25 de
muestras suplementadas con analito de modo que la concentracin sea igual al LD supuesto de 45
U/L. Se estim el LB en 20,28 UI/L (p95 de la distribucin de los blancos).
El 92 % de las medidas de las muestras, 23
25
, superaron el LB .
pgina 21
En la tabla 3 se observa que el 92 % es mayor que el lmite inferior (85 %) para una confianza del 95 %
siendo el tamao muestral de 25. Por tanto, la proporcin observada no es contradictoria con el LD
esperado.
5. Lmite de cuantificacin
El Lmite de cuantificacin ( LQ ) es la menor cantidad de analito que puede ser detectado con fiabilidad (el
LD ), y al cual el error total cumple los requisitos del laboratorio para aportar un aceptable uso clnico.
Dependiendo del objetivo definido para el error, el LQ puede ser igual la LD o mucho mayor. Nunca
puede ser inferior. El LQ debera determinarse como parte del desarrollo del mtodo y puede ser
documentado por el fabricante. El usuario puede establecer su propio LQ o verificar el del fabricante. No
es necesario determinar el LQ para cada mtodo si puede determinarse la incertidumbre (o error total) de
la medida para los niveles bajos. En estos casos, puede ser aceptable informar la incertidumbre estimada
del resultado de cada resultado de nivel bajo y permitir al usuario interpretar si es adecuado para su uso.
se obtienen hasta tres resultados con error excesivo, el LQ puede considerarse verificado. Si existe duda
acerca de este resultado (en el ejemplo, permitiendo al 10 % de las muestras tener un error excesivo),
deben obtenerse ms replicados.
Si no se cumple este criterio, el LQ descrito por el fabricante quedar en entredicho.
Si
resultado LB
se informa como
se informa como
Si LD resultado < LQ
Si
resultado > LQ
se informa.
Si un laboratorio elige informar slo resultados cuantitativos y simplificar el informe de las concentraciones
inferiores al LQ , puede ser adecuado el siguiente procedimiento:
Si
resultado LB
Si
Si
resultado LQ
se informa como
Figura 4.
5.3.2. Precauciones en la interpretacin de resultados cuantitativos
Los valores medidos menores que el LQ pero superiores al LB pueden servir para demostrar la presencia
del analito, pero los niveles reales medidos no deberan emplearse para ninguna interpretacin clnica. Los
resultados que se siten entre el LD y el LQ no deberan informarse sin alertar de la posible mayor
incertidumbre de esos valores.
El LD y el LQ pueden coincidir o diferir en cierta cantidad, dependiendo de la incertidumbre del LD y de
los objetivos del laboratorio. Si hay diferencia entre ambos valores, no se puede asumir que la respuesta
medida entre el LD y el LQ sea lineal, ni siquiera que siga una funcin montona creciente. Aunque esta
monotona sea cierta en la mayora de los casos, pueden darse situaciones en que no exista relacin a esos
pgina 23
niveles, debido a discontinuidades, valores nulos, etc. Si no existe una documentacin clara acerca de la
relacin montona, no deben hacerse interpretaciones acerca de concentraciones en este intervalo de
concentraciones.
En la prctica rutinaria, el LD y el LQ deberan emplearse como se ha descrito anteriormente para decidir
cmo informar los resultados. Existen otras situaciones, como es el caso de que se use el promedio de
varias rplicas como resultado para un sujeto, o en estudios cientficos, en que deben registrarse las
concentraciones medidas (si se dispone de ellos), independientemente de que estn por debajo o por
encima del LD , porque en estas situaciones si se emplean resultados truncados, cualquier promedio
estara sesgado.
6. Linealidad
La demostracin del intervalo lineal requiere una serie de concentraciones conocidas o relaciones
conocidas establecidas por dilucin. En todas las situaciones la secuencia de anlisis debe ser aleatoria. El
experimento del intervalo lineal requiere contar con suficiente cantidad de cada espcimen para preparar
diluciones y llevar a cabo el anlisis de cada uno de cinco o ms concentraciones. El volumen puede variar
segn lo que se desee establecer:
Para demostrar que la operacin del sistema est dentro de las especificaciones del fabricante deben
emplearse de cinco a siete concentraciones elegidas a lo largo de todo el intervalo lineal establecido.
Deben chequearse dos replicados de cada nivel.
El nmero mnimo de puntos para describir de una manera fiable un intervalo lineal es cinco, mediante
un mtodo polinmico. Con mayor nmero de puntos, se obtendr una descripcin ms exacta de la
linealidad se podr tambin establecer un intervalo lineal ms amplio, una vez se hayan eliminado los
puntos necesarios.
Se recomienda preparar adecuadamente niveles de concentracin intermedia igualmente espaciados
mezclando proporcionalmente un pool alto y uno bajo, aunque el mtodo que se propone en el documento
CLSI EP6 no lo requiere necesariamente.9 Se acepta el empleo de muestras especialmente preparadas
para obtener concentraciones especficas, dado que se conocern las concentraciones relativas a cada una
de las dems. Para esta evaluacin, se cometer menos error si se emplean mezclas preparadas,
dispensando con exactitud adecuada, a partir de un pool alto y otro bajo, que si se emplean muestras
individuales o soluciones reconstituidas o preparadas en el laboratorio. Debe tenerse especial precaucin
cuando se dispensen volmenes pequeos. Las pipetas de desplazamiento positivos son tiles para
preparar diluciones exactas con pequeos volmenes.
S = 5 muestras S = 6 muestras
1: bajo (L)
2: 0,75 L + 0,25 H
3: 0,50 L + 0,50 H
4: 0,25 L + 0,75 H
5: Alto (H)
1: bajo (L)
2: 0,80 L + 0,20 H
3: 0,60 L + 0,40 H
4: 0,40 L + 0,60 H
5: 0,20 L + 0,80 H
6: Alto (H)
S = 7 muestras
S = 8 muestras
1: bajo (L)
2: 0,833 L + 0,167 H
3: 0,667 L + 0,333 H
4: 0,500 L + 0,500 H
5: 0,333 L + 0,667 H
6: 0,167 L + 0,833 H
7: Alto (H)
1: bajo (L)
2: 0,857 L + 0,143 H
3: 0,714 L + 0,286 H
4: 0,571 L + 0,429 H
5: 0,429 L + 0,571 H
6: 0,286 L + 0,714 H
7: 0,143 L + 0,857 H
8: Alto (H)
S = 9 muestras
1: bajo (L)
2: 0,875 L + 0,125 H
3: 0,750 L + 0,250 H
4: 0,625 L + 0,375 H
5: 0,500 L + 0,500 H
6: 0,375 L + 0,625 H
7: 0,250 L + 0,750 H
8: 0,125 L + 0,875 H
9: Alto (H)
Tabla 4. Esquemas de dilucin para preparar muestras de cinco a once concentraciones
igualmente espaciadas
pgina 24
Se pueden emplear productos comerciales para diagnstico in vitro, siempre que se sigan las instrucciones
del fabricante. Estos productos permiten verificar cuantitativamente una calibracin, validar intervalos de
medida, y determinar la linealidad de sistemas qumicos automticos, semiautomticos y manuales.
A continuacin, se presenta una lista de posibles tipos de especmenes en orden de preferencia para la
aplicacin que nos atae. Debe extremarse la precaucin en lo que respecta a emplear una matriz
apropiada para un mtodo particular.
6.4. Pool diluido con materiales tratados de baja concentracin o con otro pool tratado
Si es posible, se emplear para las diluciones un pool de pacientes de baja concentracin.
Alternativamente, pueden emplearse ciertos tratamientos para reducir la concentracin de analito, (como
dilisis, tratamiento por calor o cromatografa). Debe tenerse en cuenta que estos tratamientos pueden
alterar el analito y/o la matriz fsica o qumicamente. Es ms importante mantener constante la matriz que
alcanzar bajos niveles por simple dilucin.
6.6. Pool diluido con suero salino u otros diluyentes diferentes del recomendado
Cuando se empleen estas muestras debe considerarse posibles efectos de matriz que puedan afectar a los
resultados. Las diluciones deben ser las mnimas necesarias y han de documentarse.
6.7. Material de control comercial diluido con diferente volumen del establecido
Cuando se empleen estas muestras deben considerarse posibles efectos de matriz que puedan afectar a
los resultados: estos efectos pueden modificar la concentracin. Las diluciones deben ser las mnimas
necesarias y han de documentarse. Debe extremarse la precaucin para asegurar que se consigue una
completa disolucin del material liofilizado.
pgina 25
concentracin =
donde: C 1
es la concentracin de Pool 1;
C5
es a concentracin de Pool 5;
V1
V5
es el volumen de Pool 5.
C 1 V1 + C 5 V 5
pgina 26
V1 + V 5
Pool 4 =
Las concentraciones esperadas de los pooles son 40, 60, 80, 100, y 120 unidades.
La representacin de los resultados analticos puede emplear concentraciones conocidas o calculadas.
Para confirmar que el intervalo lineal es vlido en un laboratorio: 5 a 7 niveles, y 2 replicados de cada
nivel.
Las muestras deberan analizarse aleatoriamente durante la misma serie o series analticas prximas.
El nmero de rplicas deber ser suficiente para proporcionar una estimacin fiable de la concentracin a
cada nivel. Para algunos analitos, en algunas concentraciones, se puede requerir 35 rplicas. Los usuarios
deben juzgar acerca del nmero de rplicas necesarias. Este procedimiento no se ve afectado
negativamente por el empleo de diferente nmero de replicados a diferentes niveles.
En este captulo, se hablar de outliers en el sentido de aquellos resultados aislados que sean visual o
estadsticamente diferentes del resto de los resultados, y se aplica slo a valores individuales de los
replicados. No son mltiples replicados del mismo nivel o un valor promedio a un nivel; Estos tipos de
resultados desviados seran indicativos de falta de linealidad o de error sistemtico. Los outliers son
resultados que proceden de errores probados o razonablemente asumidos. En este contexto, los outliers
son resultados que no se ajustan al patrn representado por el resto de los datos. La inspeccin visual de la
grfica de los resultados frente a los valores esperados suele ser suficiente para detectarlos. Un nico
outlier en una serie de datos puede ser eliminado y no necesita ser reemplazado. Si subjetivamente se
observa ms de un punto candidato a ser eliminado, el sistema de medida probablemente sea impreciso, y
las causas de la misma deberan ser examinadas y a ser posible solucionadas antes de tratar de establecer
o verificar la linealidad del mtodo.
pgina 27
A continuacin, se realiza un anlisis de regresin polinmica para polinomios de primero, segundo y tercer
orden. Esto puede llevarse a cabo en la mayora de los programas estadsticos comerciales.
polinomio
primero
y = b 0 + b1 x
segundo
y = b 0 + b1 x + b 2 x 2
tercero
y = b 0 + b1 x + b 2 x 2 + b3 x 3
El modelo de primer orden es una lnea recta. Esta ser la ecuacin de mejor ajuste lineal tanto si el mtodo
es lineal como si no lo es. El modelo de segundo orden describe una relacin en la que existe una curva de
respuesta, tanto con una tendencia creciente en la misma como decreciente. El modelo de tercer orden
ajusta situaciones donde la respuesta cambia segn los niveles; respuestas con forma sigmoide se ajustan
bien a este modelo, dado que son modelos donde no hay linealidad en los extremos del intervalo de
medida.
Los coeficientes de regresin se etiquetan como bi . En el modelo de segundo orden, b 2 es el coeficiente
de nolinealidad; en el modelo de tercer orden, b 2 y b3 son coeficientes de nolinealidad. Se debe obtener
el error estndar de la pendiente para cada coeficiente de nolinealidad, es i . El siguiente paso es realizar
una prueba t para comprobar si los coeficientes de nolinealidad son estadsticamente significativos; esto
) no se
chequean porque nunca reflejarn noinealidad. El test se calcula como sigue, para b 2 y b3 :
t =
bi
es i
= 0, 05 ),
b3 en el modelo de tercer orden, ( p < 0, 05 ) , entonces los datos no son lineales segn este protocolo. Es
importante notar que ste es un mero test de significacin estadstica, e indica solo que se ha detectado
falta de linealidad, no que sea suficientemente relevante como para afectar a los resultados de los
pacientes.
pgina 28
medidos y el modelo, de modo que el modelo con menor valor de es y , x proporciona el mejor ajuste de los
datos.
Se calcula la desviacin de la linealidad ( DL ) a cada concentracin como sigue:
DL i = p ( x i ) ( b 0 + bi x i )
donde: x
vara desde x1 a x s ; y
(r
i =1
sr =
ri 2 )
i1
2L
ri1 y ri 2 pueden ser tanto resultados reales del procedimiento como expresarse como porcentajes de la
media (aunque se deben usar las mismas unidades para todos los niveles). Si se emplean las diferencias
porcentuales entonces el resultado obtenido sera un CV x en lugar de s x .
Para situaciones con ms de dos replicados, la estimacin del error aleatorio deber venir de un anlisis de
la varianza.
L
sr =
donde: R
(r
i =1
ij
j =1
r ji )
L ( R 1)
( j =1, 2, , R ) ;
es el nmero de niveles ( i = 1, 2, , L ) ;
ri
Se compara s x con el objetivo para la repetibilidad, tanto si se expresa con sus unidades como en
porcentaje. Si s x es mayor que el objetivo, la imprecisin puede no ser adecuada para efectuar una
determinacin fiable de la linealidad. Esto es, la media de los replicados a cada nivel puede ser demasiado
incierta para realizar una determinacin veraz de la linealidad. En este caso puede ser necesario estudiar el
motivo de la imprecisin, corregirlo y repetir el experimento de linealidad. Cuando la repetibilidad es muy
diferente a lo largo de las distintas concentraciones, puede ser preferible emplear regresin ponderada para
el modelo lineal. Para ello se utiliza el inverso de la varianza de los replicados a cada nivel.
Los objetivos de la linealidad no deben ser superiores que los del sesgo;
Los objetivos del sesgo deben ser menores o iguales que los del error de medida.
Cuando las concentraciones de las muestras analizadas son desconocidas, los objetivos para la linealidad
deben estar en unidades relativas (porcentaje).
Ciertos requisitos que implcitamente deben cumplirse para la evaluacin estadstica del intervalo lineal
segn el presente protocolo, son:
16
NCCLS. Estimation of total analytical error for clinical laboratory methods. Approved guideline. NCCLS
document EP21-A.
pgina 30
Los niveles de las muestras deben ser conocidos sin error (niveles reales conocidos, o conocidos con
respecto a cada uno de los otros);
El intervalo lineal se chequear slo entre las concentraciones menor y mayor que demuestren
caractersticas aceptables;
El intervalo lineal se evaluar para la salida final del sistema (concentracin o actividad) y no para la
seal instrumental, la cual puede ser procesada posteriormente por el sistema;
Las muestras usadas han de estar libres de interferencias, que invalidaran el experimento;
Los tests de significacin de los coeficientes de regresin tambin asumen que los replicados se
distribuyen segn una normal a cada nivel, y que la varianza de esta distribucin es constante a lo largo
de todos los niveles.
7. Calibracin
7.1. Conceptos bsicos asociados a la calibracin
La calibracin y todos los conceptos asociados a sta, han sido determinados a lo largo de los aos por los
organismos metrolgicos y de normalizacin internacionales. En un principio fueron fijados bsicamente con
miras a su empleo desde dentro de los laboratorios de calibracin, ensayo, etc. Sin embargo, hoy da el
personal tcnico de una empresa en la que se desea mantener un Sistema de Confirmacin Metrolgica se
ve enfrentado con toda esta terminologa, conceptos y definiciones, que le resultan ajenos y de difcil
comprensin. La definicin de calibracin desde la norma ISO17 es la operacin de comparar la salida de un
equipo de medida frente a la salida de un patrn de exactitud conocida cuando la misma entrada (magnitud
medida) es aplicada a ambos instrumentos. Durante el proceso de calibracin el equipo es verificado para
un conjunto de puntos representativos de todo su intervalo de medida. El requisito 4.11 de la norma ISO
900118 especifica claramente que los equipos de medida se deben gestionar y utilizar de manera adecuada:
"El suministrador debe establecer y mantener al da procedimientos documentados para controlar, calibrar y
realizar el mantenimiento de los equipos de inspeccin, medicin y procedimiento (incluyendo el soporte
lgico usado en los procedimientos analticos) utilizados por el suministrador para demostrar la conformidad
del producto con los requisitos especificados." Ms concretamente, el documento ISO 10012-1 y en su
versin UNE EN 30012-119 indica que se debe disear e implantar un Sistema de Confirmacin Metrolgica.
El objetivo ltimo de este sistema de confirmacin es garantizar el correcto funcionamiento de los equipos
de medida que afectan a la calidad. Si se atiende a la definicin de confirmacin metrolgica dada en el
mismo documento, este sistema debe incluir toda operacin requerida para asegurar que un equipo de
medida cumple con los requisitos establecidos para su uso planificado. Entre estas operaciones se
encuentra la calibracin, ajuste, reparacin, sellado y etiquetado, etc.
Examinar la linealidad de una funcin de calibracin es una tarea habitual tanto en la validacin de mtodos
analticos como en las operaciones de la prctica rutinaria. La linealidad es una caracterstica importante y
deseable de un mtodo analtico. Por ejemplo, si la funcin de calibracin es lineal, es ms fcil estimar la
ecuacin y los errores en la estimacin de concentraciones desconocidas a partir de la funcin de
calibracin sern probablemente menores. Adems, asumir la linealidad de la calibracin es implcito al uso
vlido de un mtodo para adiciones estndar. Dada la importancia de la calibracin lineal, no es infrecuente
que se tienda a usar el coeficiente de correlacin como indicador de linealidad.
El coeficiente de correlacin, dado por
17
pgina 31
r =
(x
i =1
( x
i =1
x )( y i y )
x)
2 n
( y
i =1
y)
es una medida de la relacin entre dos variables x e y . Tiene diversas propiedades muy tiles (vase el
tema Correlacin, Notas). Su uso en calibracin, sin embargo, se basa en una incorrecta interpretacin
bastante generalizada. Es cierto que, si los puntos de la calibracin se ajustan mucho a una recta, el valor
experimental de r ser prximo a la unidad (figura 5).
Figura 5. Datos A
Sin embargo, la afirmacin inversa no es cierta. Un valor de r prximo a la unidad no necesariamente
procede de una relacin lineal sino que puede ser, por ejemplo, resultado de que los puntos se ajusten
claramente a una curva (figura 4).
Figura 6. Datos B
Existe un problema adicional relacionado con esto: los valores de r no pueden compararse
apropiadamente. No es correcto decir que unos datos con r = 0,99 sean ms lineales que otros con una
r = 0,95 . Lo mismo ocurre con el estadstico R 2 obtenido de una regresin. Subyace una cuestin de
grado. Una calibracin con r = 0,9999 se aproximar necesariamente a una recta. El problema es que no
se puede decir cunto o si ser lo suficientemente prxima.
Sin embargo, si no hay linealidad, se podr percibir un patrn en la grfica de los residuales, generalmente
con forma de una tendencia en los puntos, como puede observarse en la figura 8, correspondiente a los
datos de la figura 6. Para saber si este patrn que sugiere nolinealidad es significativo se debe replicar las
medidas en cada punto de la calibracin, proporcionando la informacin inherente a la variabilidad de la
respuesta de las medidas (lo que se conoce como el error puro). En la figura 8 se observa, por ejemplo, una
desviacin sistemtica de los residuales respecto al cero que es razonablemente grande con respecto a las
diferencias entre las medidas de los duplicados, y por tanto probablemente sea estadsticamente
significativa.
Figura 7. Residuales estandarizados de la regresin lineal usando los datos A. No se observa patrn
alguno respecto a los residuales.
Figura 8. Residuales estandarizados de la regresin lineal usando los datos B. Se observa clara
tendencia de los residuales.
En casos de duda, el test estadstico que se aplica es un anlisis de la varianza de los residuales en el
contexto de una ausencia de ajuste o de error puro. Si existe una falta de ajuste significativa, y el patrn de
los residuales apoya esta interpretacin, se habr demostrado la nolinealidad significativa de una manera
inequvoca. Dados los datos de la figura 8, el estadstico muestra que existe falta de ajuste significativo,
p 0, 01 . Si hay evidencia de diferente varianza en la respuesta, lo que es frecuente en calibraciones en un
intervalo amplio, se puede emplear una regresin ponderada.
En la figura 9 se observa cmo emplear una relacin lineal para representar una curva de calibracin que en
realidad es curva puede conllevar una falta de ajuste que conducir a resultados seriamente errneos. En
este ejemplo, bajas concentraciones de analito pueden estar sujetas a errores sistemticos relativamente
grandes.
Figura 9
7.5. Ajuste de datos a una funcin lineal con error en ambas variables
Una condicin bsica de la regresin es que los valores de la variable respuesta (variable dependiente)
sean aleatorios mientras que los de la variable x (independiente o predictora) deberan estar exentos de
error. Este modelo a menudo se aproxima a las aplicaciones clnicas, por ejemplo en el caso de las
calibraciones. Sin embargo, si no se cumplen las condiciones, los resultados de la regresin son en principio
incorrectos y en la prctica pueden llevar a error. Alternativamente puede ser vlido un mtodo general de
estimacin funcional de mxima verosimilitud
( FREML ) .
pendiente, as como sus correspondientes errores estndar, sin introducir sesgos debidos al uso
inadecuado de la regresin. El mtodo es simtrico, por lo que las variables x e y pueden ser
intercambiadas sin afectar al resultado y permite manejar datos heterocedsticos, es decir resultados con
diferentes precisiones.
regresin
ponderada
normal
se
basa
en
un
modelo
de
los
pares
de
datos
( )
( a , b)
de a y b se obtienen
minimizando la funcin
n
i =1
(y
a b xi )
s y2 i
con respecto a a y b . La minimizacin se lleva a cabo por simple aplicacin del clculo a las conocidas
ecuaciones de la regresin.
En la estimacin de la relacin funcional el modelo es diferente:
xi = u i + i
yi = i + i
i = + ui
donde
pgina 34
i =1
(x
ui )
(y
i =1
a bui )
Esta formulacin sigue el principio de mxima verosimilitud, que es una aproximacin de estimacin
estadstica ms general que el conocido mtodo de mnimos cuadrados. Sin embargo, a diferencia de la
regresin, la minimizacin ahora no puede resolverse algebraicamente, sino que requiere mtodos
numricos iterativos.
za =
Asimismo, se podra chequear H 0 :
=1
a
es a
za =
b 1
es b
Los valores de z pueden interpretarse como una distribucin normal estndar, de modo que para una
confianza del 95 % debe usarse el valor crtico de 1,96 para | z | .
El estadstico de ausencia de ajuste es la suma de cuadrados de los residuales escalados, que pueden ser
tratados aproximadamente como una variable con n 2 grados de libertad. Un valor significativamente
alto de este estadstico sugiere tanto que la estimacin de la varianza fue considerada demasiado baja (un
fallo comn) como una ausencia de ajuste. En el segundo caso puede deberse a una interferencia no
corregida o a una verdadera falta de linealidad. El examen de la representacin grfica de los residuales
escalados permite dilucidar cual de las situaciones se est dando.
2
pgina 35
sr =
donde: I
(x
i =1
i1
xi2 )
2I
x i1
es el replicado 1 del da i ; y
xi2
es el replicado 2 del da i .
El procedimiento ser el descrito en el apartado 3, salvo por el hecho de que se realizar solo una serie
analtica por da en lugar de 2.
En esta estimacin los grados de libertad sern la mitad de los del protocolo que utiliza dos series analticas
por da. Para aumentar el nmero de grados de libertad hay dos alternativas:
(a) Incrementar el tamao del experimento, prolongando el estudio durante ms das (se recomienda un
mnimo de 30), procesando dos alcuotas del material empleado para el estudio de la imprecisin en
cada serie analtica;
(b) Incrementar el nmero de alcuotas procesadas en cada serie manteniendo la duracin del estudio en
20 das. En este caso, la desviacin tpica intraserial se estimar mediante la siguiente frmula:
I
sr =
donde: I
( x
i = 1 j =1
i1
xii )
I ( N 1)
N
xi j
xii
El nmero de grados de libertad en esta estimacin es igual a I veces el nmero de replicados efectuados
en cada serie analtica menos 1, esto es, g . de l. = I ( N 1) . Cada serie analtica debe contener el mismo
nmero de replicados para que la frmula anterior sea adecuada. No se incluye el factor 2 en el
denominador porque ahora esta formula emplea la suma de desviaciones cuadrticas respecto a la media
de las series analticas, a diferencia de las diferencias entre los duplicados empleados en frmulas previas
(adecuado slo para dos observaciones).
B =
donde: I
(x
i =1
ii
x ii )
I 1
es el nmero de das;
pgina 36
xii
x ii
B
es la desviacin tpica de los promedios diarios (generalmente denominado error estndar
de las medias diarias). Cuando slo se realiza una serie analtica por da, esta estimacin combina las
componentes interdiaria e interserial de la imprecisin. Esta ser la formula empleada independientemente
del nmero de das o el nmero de replicados.
A partir de la anterior estimacin, B , y de la desviacin tpica intraserial, s r , se puede calcular la
imprecisin instrumental o intralaboratorio segn la expresin:
sT =
donde: N
B
s
2
r
B2 +
N 1 2
sr
N
Esta frmula puede emplearse independientemente del mtodo usado para incrementar el nmero de
observaciones del estudio de repetibilidad (das adicionales o replicados adicionales en cada serie
analtica).
T =
donde: ME = s r
MD = N B 2
( ( N 1) ME + MD )
( N 1) ME 2
I MD 2
I 1
Se utiliza el valor entero ms prximo al resultado obtenido para T como grados de libertad para evaluar
sT .
pgina 37
(x
var ( x ) =
i =1
ii
x ii )
I 1
= s D2
E(s
donde: x i i
2
D
2
dd
r2
N
x ii
d2 d
r2
sdd =
A2
B
2
2
srr =
A
2
s r2
sdd =
donde: N
B2
s r2
N
pgina 38