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Fecha: 2009.11.05
08:48:45 -06'00'
UNIVERSIDAD MICHOACANA DE SAN NICOLAS DE HIDALGO
FACULTAD DE QUMICOFARMACOBIOLOGIA
Actividad Hemaglutinante e Identificacin de Lectinas en el Arbol del Neem

Azadirachta indica
TESIS PROFESIONAL
PARA OBTENER EL TITULO DE:

QUIMICO FARMACOBIOLOGO
PRESENTA:
P.Q.F.B. JUAN ANTONIO VARGAS SOTELO
DIRECTOR DE TESIS:
D.C. BERTHA FENTON NAVARRO
MORELIA, MICHOACAN, MEXICO

2009
Este trabajo se realiz bajo la

Direccin de la D.C. Bertha Fenton
Navarro en el laboratorio de glicobiologa
Divisin de Estudios de Posgrado
Facultad de Ciencias Mdicas y
Biolgicas Dr. Ignacio Chavz
UMSNH
AGRADECIMIENTOS
A Dios por haberme permitido realizar el sueo de haber terminado la carrera

de Qumico FarmacoBiologa, dndome salud y bienestar en todos los
sentidos.
A la D.C. Bertha Fenton por su incansable esfuerzo ya que con su apoyo y

consejos fue posible haber logrado tal hazaa.
Mencin honorfica a mis Padres que a ellos me debo, ya que con su esfuerzo,
dedicacin, empeo y sacrificio, hoy por hoy me han brindado a lo largo de 23
aos una vida llena de alegrias y satisfacciones, y que sin duda ellos son la
causal.
A mis hermanas que con su apoyo y alientos me han ayudado a realizar este
trabajo.
A viri por su apoyo incondicional, siempre estando ah cuando necesito ayuda,

por su comprensin, por sus ganas de salir adelante.
A mis amigos Rosa, Perla, Naye, Ivan y Christian que de alguna u otra manera
me han ayudado en este camino.
A todos ellos
Gracias!!!
i
INDICE GENERAL
Agradecimientos..i
Indice general..ii
Indice de tablas..iv
Indice de figuras..v
Indice de abreviaturas..vi
Glosario de trminos....vii
Resumen..1
I INTRODUCCION
1. Plantas.......................................2
1.1 Descripcin del Neem...2
1.2 Usos en la Medicina Tradicional.....4
1.3 Composicin Qumica...5
1.4 Acciones Farmacolgicas del Neem..8
2. Lectinas...12
2.1 Descripcin...12
2.2 Historia de las Lectinas..12
2.3 Carbohidratos; Glicocdicos por excelencia..14
2.4 Funcin de las Lectinas.14
2.5 Toxicidad..18
2.6 Clasificacin.....18
2.7 Lectinas de Plantas........18
2.7.1 Leguminosas....19
2.7.2 Cereales....19
2.8 Usos de las lectinas en plantas....19
2.9 Funciones de las lectinas en plantas...20
3. Estudio de lectinas........21
3.1 Identificacin de Lectinas......21
3.2 Las protenas deben ser liberadas...21
3.3 Centrifugacin......21
3.4 Precipitacin Salina....22
3.5 Dilisis...23
3.6 Liofilizacin...23
II JUSTIFICACION...23
III HIPOTESIS...23
IV OBJETIVOS.....23
a) Generales. 23
b) Especficos....24
V MATERIAL....24
ii
VI METODOS..........24
VII RESULTADOS...26
VIII DISCUSION.......38
IX CONCLUSIONES...40
X BIBLIOGRAFIA.41
iii
INDICE DE TABLAS
Nmero de tabla
Pgina
1. Funciones de las lectinas en los diversos organismos16

2. Algunas aplicaciones para las lectinas de las plantas..20
3. Algunas posibles funciones naturales de las lectinas en plantas21
4. Actividad del extracto crudo..26
5. Actividad de la Fraccin Proteica.27
6. Precipitacin fraccionada para concentracin 0-20%...................................28
7. Precipitacin fraccionada para concentracin 20-40%.................................29
10. Precipitacin fraccionada para concentracin 80-100%.............................32
11. Precipitacin Fraccionada para concentracin 80-100% sobrenadante.33
12. Especificidad de carbohidrato para extracto crudo.35
13. Especificidad de carbohidrato para Fraccin Proteica...36
14. Especificidad de carbohidrato para Fraccin 80-100% sb36
15. Tabla comparativa para especificidad a carbohidrato37
iv
INDICE DE FIGURAS
Numero de figura
Pgina
1. Azadiractina...........6
2. Meliatriol.........7
3. Salanina..7
4. Nimbin y Nimbidin..7
5. Interacciones Carbohidrato-Lectina sobre la superficie
celular en procesos fisiolgicos y patolgicos....15
6. Lectinas de la superficie.....17
7. Actividad Especifica del extracto crudo...26
8. Actividad Especifica de la Fraccin proteica..27
9. Actividad Especifica de 0-20%.......................................................................29
10. Actividad Especfica de 20-40%..................................................................30
13. Actividad Especifica de 80-100% pp............................................................33
14. Actividad Especifica de 80-100% sb..34
INDICE DE ABREVIATURAS
Abreviaturas
M
m.
cm.
mm.
C
Col.
Kg.
BeWo.
ROS
DNA
NLP
B16MelSAg
NLGP
CEA
MIC
MFC
ml.
g.
hrs.
%
kDa
Ca
Mn
IMSS
EC
grs.
UHA
AE
C
FP
mol
Fuc
Lac
Gal
Gal Acet
Man
Ac.
Xyl
GluNAc
Glu
Sac
sb
pp
Molar
Metros
Centmetros
Milmetros
Grado centgrado
Colaboradores
Kilogramo
Clulas de cariocarcinoma humano
Especies reactivas al oxigeno
Acido desoxiriboninucleico
Preparacin de hojas del neem
Antgeno de superficie melanoma B16
Glicoprotena de la hoja del neem
Antgeno Carcinoma Embriognico
Concentracin Mnima Inhibitoria
Concentracin Mnima Fungicida
Mililitro
Microgramos
Horas
Por ciento
Kilodaltons
Calcio
Manganeso
Instituto Mexicano del Seguro Social
Extracto Crudo
Gramos
Unidades de Hemaglutinacin
Actividad Especfica
Concentracin Mnima Inhibitoria
Fraccin Proteica
Micromol
Fucosa
Lactosa
Galactosa
Galactosa Acetilada
Manosa
Acido
Xilosa
N Acetil Glucosamina
Glucosa
Sacarosa
Sobrenadante
Precipitado
vi
Glosario de trminos
Acido: Son sustancias de sabor agrio que reaccionan con los metales
produciendo hidrgeno, teniendo un pH con valor menor a 7.
Adyuvante: Que ayuda, especialmente referido a las sustancias que
administrada con un antgeno o previamente a este, aumenta la formacin de
anticuerpos.
Aminocido: nombre que reciben ciertos cidos orgnicos, algunos de los
cuales son los componentes bsicos de las protenas.
Analgsico: Sustancia o medicamento que calma o quita el dolor fsico.
Anticuerpo: Protena existente en el organismo animal o producido en l por la
introduccin de un antgeno, contra cuya accin reacciona especficamente
proporcionando inmunidad contra las enfermedades.
Antibacterial: Que destruye las bacterias.
Antgeno: Toda sustancia que, introducida en un organismo animal, determina
en l una reaccin inmunitaria, como la formacin de anticuerpos.
Antisptico: Que impide el desarrollo de los microorganismos patgenos
causantes de las infecciones o los mata.
Apoptosis: muerte celular programada.
Cncer: Tumor maligno originado por el desarrollo anormal e incontrolado de
ciertas clulas que invaden y destruyen los tejidos orgnicos.
Enfermedad: Alteracin de la salud que afecta el funcionamiento de un
organismo
Frmaco: es toda sustancia qumica purificada utilizada en el tratamiento, cura,
prevencin o el diagnstico de una enfermedad, o para evitar la aparicin de un
proceso fisiolgico no deseado.
Fitoterapia: curacin por medio de plantas medicinales.
Fungicida: Agente que destruye los hongos.
Hormonas: Producto de la secrecin de ciertas glndulas del cuerpo de
animales y plantas que, transportado por la sangre o por la savia, regula la
actividad de otros rganos.
Infeccin: Penetracin y desarrollo de grmenes patgenos en el organismo la
cual causan enfermedades.
vii
Inhibicin: Accin y resultado de inhibir o inhibirse. Componente de los

sistemas de regulacin psicolgicos o fisiolgicos que actan en los seres
vivos.
Inocuo: Que no hace dao
Insecticida: Producto que sirve para matar insectos.
In Vitro: designacin de procesos biolgicos o experimentos conducidos en un
ambiente artificial fuera de un organismo vivo.
In Vivo: designacin de procesos biolgicos o experimentos conducidos en un
organismo vivo.
Ismero: Cuerpo que tiene la misma composicin qumica que otro pero
distintas propiedades fsicas.
Letal: Mortfero, capaz de ocasionar la muerte.
Lpidos: Cada una de las sustancias orgnicas que se caracterizan por ser
solubles en disolventes orgnicos e insolubles en agua y constituyen las
reservas de energa de los seres vivos.
Liofilizar: Retirar el agua de una sustancia o de una disolucin, mediante
congelacin y posterior sublimacin a presin reducida del hielo formado, para
dar lugar a un material esponjoso que se disuelve posteriormente con facilidad.
Metstasis: Reproduccin de una enfermedad en rganos distintos de aquel
en que se manifest. Capacidad de los tumores malignos de propagarse a las
vas sanguneas y a los vasos linfticos.
Micosis: Infeccin producida por hongos en alguna parte del organismo.
Mitognica: agente o sustancia que induce a la mitosis.
Mitosis: Tipo de divisin celular en el que a partir de una clula madre se
originan dos clulas hijas con el mismo nmero de cromosomas y la misma
informacin gentica con el fin de mantener constante la dotacin cromosmica
de las clulas resultantes.
Molcula: Conjunto de tomos iguales o diferentes, unidos por enlaces
qumicos, que constituyen la mnima porcin de una sustancia que puede
separarse sin alterar sus propiedades.
Morfologa: Parte de la biologa que estudia la forma de los seres orgnicos y
de las modificaciones o transformaciones que experimenta.
Patolgico: Que constituye una enfermedad o es sntoma de ella, indica una
enfermedad.
viii
Protenas: Cualquiera de las numerosas sustancias qumicas formadas por

aminocidos que forman parte de la materia fundamental de las clulas y de las
sustancias vegetales y animales.
Simbiosis: Asociacin de individuos animales o vegetales de diferentes
especies, en la que ambos asociados sacan provecho de la vida en comn
Sinttico: Producto obtenido por procedimientos mecnicos, electrnicos o
industriales y que imita otro producto natural.
Sntomas: Fenmeno que revela la existencia de una enfermedad.
Suero: Parte acuosa de la sangre o linfa que permanece lquida tras su
coagulacin.
Tumor: Alteracin patolgica de un rgano o de una parte de l, producida por
la proliferacin creciente de las clulas que lo componen.
Ulceras: Lesin que destruye tejidos de la piel o de la mucosa de un rgano.
ix
RESUMEN
En la medicina tradicional se reconoce que el rbol del Neem
(Azadirachta indica), posee numerosas propiedades curativas para diversos
padecimientos. Con respecto a las acciones farmacolgicas reportadas se ha
comprobado que tiene propiedades antioxidantes, antitumorales, anti
cancergenas, pro-apoptosis, antiproliferativo celular, antibacterial, caries,
antifngica. En la bsqueda de principios activos se ha encontrado que
existen liminoides, sin embargo, no se han reportado como principios activos
a las protenas.
Hasta donde sabemos, no existen reportes de lectinas en esta planta.
Por esta razn, y por representar una fuente de productos teraputicos, como
objetivo de este trabajo, se planteo estudiar la presencia de lectinas en
extractos de hojas del Neem, ya que estas intervienen en numerosos
procesos tanto fisiolgicos como patolgicos.
Se analiz la actividad utilizando un ensayo de hemaglutinacin y se
inici la identificacin de las lectinas presentes en el rbol del Neem. El
extracto crudo presento actividad hemaglutinante para los cuatro grupos
sanguneos humanos: A1 y A2: GalNAc-Gal-Fuc, B: Gal-Gal-Fuc y O: FucGal. Lo que indica que el extracto contiene una mezcla de lectinas. Una vez
que se comprob esta presencia de lectinas. Se parti de una mezcla
enriquecida, utilizando una mayor concentracin inicial de protenas y
eliminando los pigmentos y compuestos liposolubles, a la que se le llam
fraccin proteica y en la que se corrobor los resultados iniciales obtenidos
con el extracto crudo.
Posteriormente, para identificar las afinidades y proporciones de esta
mezcla de lectinas, se procedi a realizar una precipitacin fraccionada
utilizando sulfato de amonio con intervalos de 0 a 100%, dentro de los
resultados se observa que en el intervalo 0-20% tiene una afinidad preferente
para el grupo sanguneo O, en los intervalos de 20-40%, 40-60 tienen
afinidad preferente con A2. En las fracciones con protenas de menor peso
molecular, en intervalos de sulfato de amonio de 60-80% y 80-100%, se
observaron mayores actividades hemaglutinantes al utilizar los grupos
sanguneos B y O, siendo significativamente mayor con B, por lo que la
afinidad de las protenas contenidas es para Gal-Gal-Fuc.
En cuanto a la especificidad para carbohidratos el extracto crudo
present las siguientes afinidades: GalNAc, Lac, Ac. Silico > Gal, Sac, Rib >
Glu, GluNAc, Xyl > Gal Acet > Fructosa > Fucosa, Man > Con A, esto
corrobora que las lectinas presentes en el neem tienen efectos sobre algunos
vertebrados ya que reconocen los carbohidratos de sus superficies.
El ensayo de especificidad para carbohidrato de fraccin proteica se
observo una mayor sensibilidad para Manosa, Ac. Silico y Mucosa. Por
ltimo en los intervalos de concentracin salina donde se obtuvieron la mayor
actividad y concentracin de protenas (60-80% y 80-100%) present una
mayor sensibilidad para Gal y GalNAc.
Las mayores afinidades encontradas en los diferentes pasos de
purificacin mostraron afinidades para carbohidratos que se encuentran
comnmente en la superficie de tejidos y microorganismos por lo que estas
lectinas pueden estar relacionadas a las funciones biolgicas reportadas.
I INTRODUCCION
La utilizacin de las plantas medicinales, se ha producido en todas las
culturas desde tiempos remotos (http://www.mtplantas.com/). Desde la
aparicin del hombre sobre la tierra, siempre ha tenido la necesidad de
alguna manera, eliminar o aminorar sus padecimientos y para ello ha
recurrido a los medios que estn a su alcance. El hombre ha confirmado su
dependencia al reino vegetal, pues han sido parte fundamental como
proveedores de un gran nmero de especies, con propiedades medicinales
(http://www.cucba.udg.mx/new/informacionacademica/coaxican/herbolaria/pi
el.htm).
La prctica de la medicina tradicional dio inicio en el momento mismo
en que el hombre uso alguna parte de planta para contrarrestar sus
padecimientos.
(http://www.cucba.udg.mx/new/informacionacademica/coaxican/herbolaria/pi
el.htm).
Tradicionalmente, las plantas medicinales sirvieron como remedios
para aliviar sntomas o tratar enfermedades, con resultados dispares.
Debido a su actividad farmacolgica, actuaban directamente sobre el
organismo, produciendo cambios significativos en su funcionamiento
(http://es.wikipedia.org/wiki/Planta_medicinal).
La prolongada tradicin de uso de productos de origen vegetal en medicina
y la reaccin contempornea contra los frmacos sintticos han llevado a un
resurgimiento
del
herbalismo,
denominado
fitoterapia.
(http://es.wikipedia.org/wiki/Planta_medicinal).
El descubrimiento del Neem corresponde al entomlogo y agrnomo
alemn Heinrich Schmutterer. En 1959, destinado en un proyecto de
cooperacin en Sudn, el joven Schmutterer observ que el nico rbol que
no era depredado sin compasin por las frecuentes plagas de langosta era
una especie recientemente introducida, Azadirachta indica. Schmutterer
decidi investigar este fascinante fenmeno, aunque seguramente no
imagin que su hallazgo derivara en la obtencin de numerosos productos
derivados del Neem, que generara ms actividad que cualquier otro
producto botnico en el siglo XX (http://www.neem.es/).
1.1 Descripcin del Neem

El neem tambin llamado margosa o lila india es un rbol originario de
la India y Birmania, miembro de la familia de la caoba (Shultz y col, 1992).
Vive
en
regiones
tropicales
y
subtropicales
(http://es.wikipedia.org/wiki/Azadirachta_indica).
Tiene por clasificacin cientfica, Reino: Plantae, Divisin:
Magnoliophyta, Orden: Sapindales, Familia: Meliaceae, Gnero:
Azadirachta, Especie: indica, Nombre binomial: Azadirachta ndica
El neem es un rbol de rpido crecimiento que puede alcanzar 15 a
20 metros de altura y raramente 35 a 40 m. Tiene abundante follaje todas
las temporadas del ao, pero en condiciones severas se deshoja, incluso

casi completamente. El ramaje es amplio, y puede alcanzar de 15 a 20 m.
de dimetro ya desarrollado http://es.wikipedia.org/wiki/Azadirachta_indica).
El tronco es corto y recto, puede alcanzar 12 cm. de dimetro. La
corteza es dura, fuertemente agrietada y va desde color gris claro hasta
castao rojizo. La savia es blanca griscea y el corazn del tronco es rojo;
cuando se expone al aire se torna de castao rojizo. Las races consisten de
una robusta raz principal y muy desarrolladas races laterales
(http://es.wikipedia.org/wiki/Azadirachta_indica). Las races penetran en la
tierra profundamente, cuando el sitio permite, sobre todo cuando estn
heridos, y producen retoos. Esto tiende a ser especialmente en localidades
secas (Shultz y col, 1992).
El tallo de hojas mide de 20 a 40 cm. de longitud, de 20 a 31 hojas
verdes oscuras de 3 a 8 cm. de longitud. La hoja terminal es a menudo
faltante. Las Hojas muy jvenes son de color rojo o prpura. La forma de las
hojas maduras es menos asimtrica y sus mrgenes estn dentados
Las flores son blancas dispuestas axialmente, la flor mide 5 a 6
milmetros
de
longitud
y
de
8-11
de
ancho
(http://es.wikipedia.org/wiki/Azadirachta_indica). El Neem tiene flores
bisexuales y masculinas con un agradable olor a miel (Shultz y col, 1992).
Su fruto es una drupa parecida a la aceituna en forma que vara
desde un ovalo elongado hasta uno ligeramente redondo, y cuando madura
mide 14 a 28 mm. de longitud y 10 a 15 mm. de ancho. Su epicarpio es
delgado, el mesocarpio es blanco amarillento, y fibroso, pero es
desagradable al gusto. El endocarpio es blanco, duro y almacena una
semilla, en raras ocasiones dos o tres semillas elongadas con una corteza
de color castao (http://es.wikipedia.org/wiki/Azadirachta_indica), que
cuando estn maduras van de un color amarillo a amarillo verdoso (Shultz y
col, 1992).
El rbol del Neem tiene una notable resistencia a la sequa.
Normalmente sobrevive en zonas con condiciones subridas a subhmedas
como se menciono anteriormente, con una precipitacin pluvial entre 400 a
1200 mm. Puede desarrollarse en regiones con una precipitacin inferior a
los 400 mm, pero en ambos casos el desarrollo depende de la cantidad de
agua subterrnea. El Neem puede desarrollarse en diferentes tipos de suelo,
pero sobrevive mejor en sustratos bien drenados, profundos y arenosos (con
un pH de 6,2 a 7). Vive en regiones con una temperatura anual de entre 21 y
32 C, puede tolerar muy altas temperatura, pero no tolera temperaturas
menores de 4 C, porque se deshoja y puede morir. Como especie oriunda
de zonas tropicales y subtropicales, el rbol demanda mucha luz y
temperaturas entre 26 y 36 C, aceptando cierto grado de salinidad en el
suelo (http://es.wikipedia.org/wiki/Azadirachta_indica), aunque tambin crece
bien en algunos suelos cidos. De hecho, se dice que las hojas cadas del
neem son ligeramente alcalinas (pH 8,2) por lo que son buenos para
neutralizar la acidez en el suelo. El neem no puede permanecer en suelos

muy hmedos ya que muere rpidamente al permanecer durante largo
tiempo expuesto a la tierra con extrema humedad (Shultz y col, 1992).
Un rbol de neem normalmente comienza a dar frutos despus de 3-5
aos, se convierte productivo plenamente en 10 aos, y desde entonces
puede producir hasta 50 kg de frutas anualmente. Puede vivir durante ms
de dos siglos (Shultz y col, 1992).
1.2 Usos en la Medicina Tradicional

Desde la antigedad el neem ha sido conocido por su accin curativa.
Los primeros escritos mdicos snscritos hacen referencia a los beneficios
de sus frutos, semillas, aceite, hojas, races, y corteza. Cada uno de estos
ha sido durante mucho tiempo utilizado en los sistemas de la medicina
Ayurveda de la India y Unani. As pues, durante miles de aos, millones de
asiticos han utilizado medicinalmente el neem (Shultz y col, 1992).
En los lugares donde el rbol ha sido recientemente introducido,
como Amrica y frica, a sido til para curar diversas enfermedades. Es un
antisptico general. Se utiliza para tratar una gran variedad de
enfermedades de la piel, por ejemplo, llagas spticas, quemaduras
infectadas, lceras y eczema. El aceite se utiliza para la tia (Shultz y col,
1992).
Algunos resultados recientes del Neem han mostrado actividad
fungicida demostrando su eficacia contra determinados hongos que infectan
a
humanos
como
Trichophyton,
Epidermophyton,
Microsporum
Trichosporon, Geotrichum y Candida (Shultz y col, 1992).
As como propiedades antibacterianas, actividad antiviral, insecticida,
antihelmntico, en tratamientos dentales, enfermedad del Chagas,
antipaldico, antimalrico, analgsico, antipirtico, anti-inflamatorios, control
de la natalidad en el hombre, espermaticida. Adems del control de
parsitos intestinales, evita erosin de suelo, antiansiedad, estimulante del
sistema inmunolgico, control de diabetes, desordenes nerviosos,
problemas digestivos, enfermedades cardiacas, entre otros (Shultz y col,
1992; Conrick, 2003).
Los compuestos hallados en la semilla, corteza y hojas del rbol han
sido probados como antisptico, antifebriles, antiflamatorios, antivirales y
fungicida. Estudios preliminares sugieren algunas interesantes aplicaciones
para el Neem tales como: herpes, alergias, hepatitis, propiedades
cicatrizantes,
desinflamatoria,
varicela,
influenza,
mononucleosis,
tuberculosis, tia, candidiasis, algodoncillo, gonorrea, sfilis, clamida,
problemas de riones, hemorroides, insomnio, epilepsia, artritis, conjuntivitis
(Etcheverry y Roja. 2003).
Azadirachta indica, elabora un vasto arreglo de fotoqumicos
bioactivos que exhiben potentes propiedades medicinales. Aunque todas las
partes del rbol del Neem son reconocidas por que confieren beneficios a la
salud, las utilidades medicinales de la hoja del Neem es el de ms amplio
rango e incluye efectos de inmunomodulacin, antiinflamatorias,
antioxidantes, antimutagenico y anticarcinogenico, es decir, ejerce un efecto
citotxico contra lneas celulares tumorales e induciendo apoptosis celular
tumoral por la liberacin de citocinas citotxicas de las clulas
mononucleares perifricas de la sangre humana (Harish y col., 2008).
1.3 Composicin Bioqumica

Los primeros trabajos sobre la qumica del neem se hicieron en la
India en los aos 20, con el aislamiento de un cido en el aceite de neem al
que se llam cido margsico. En 1942, Siddiqui & cols. aislaron tres
molculas, nimbina, nimbidina y nimbineno, y tras los trabajos de
Schmutterer se han descubierto la mayor parte de los principios activos del
neem: azadiractinas, meliantriol, salanina, etc. Estas molculas estn
relacionadas entre ellas estructuralmente y se clasifican qumicamente en el
grupo de los tetranorcicloterpenos, tambin conocidos como liminoides
(http://www.neem.es/).
Hasta la fecha, al menos nueve liminoides del neem han demostrado
una capacidad de bloquear el crecimiento de los insectos, que afectan a una
amplia gama de especies que incluye algunas de las ms mortales plagas
de la agricultura y la salud humana (Shultz y col, 1992).
Existen muchos ms compuestos activos en el rbol del Neem. De las
hojas se pueden aislar varias molculas como un flavonoide polifenlico
llamado quercetina, un sitosterol, el nimbosterol, nimbina y otros liminoides,
como la nimocinolida e isonimocinolida. Tambin se han aislado un grupo de
alcanos de entre 14 y 31 carbonos, aminocidos y cidos grasos
De las flores se extrae un aceite que contiene sesquiterpenos,
nimbosterol y numerosos flavonoides entre los que destacan la melicitrina y
el kaempferol. Las flores producen una cera compuesta por una mezcla
compleja de cidos grasos tales como araqudico, esterico, palmtico,
oleico y linolico (http://www.neem.es/).
La corteza y madera del rbol del neem son tambin fuente de
numerosos principios activos: nimbina, nimbidina, nimbinina, nimbosterol,
margosina, nimbineno y algunos diterpenos como la nimbinona, nimbocilina,
nimbidiol y nimbiona (http://www.neem.es/).
De las semillas se obtiene gran riqueza en lpidos y tiene la presencia
de molculas con una intensa actividad biolgica. El hueso de la drupa
contiene una o dos semillas y de ellas se obtiene un aceite compuesto de
cido oleico (50-60%), palmtico (13-15%), esterico (14-19%), linoleico (816%) y araqudico (1-3%), composiciones que varan segn el mtodo de
extraccin (http://www.neem.es/).
De entre los ms estudiados del Neem se encuentran los siguientes:

Azadiractina: Es la principal responsable de la actividad biolgica del aceite
de neem. Se encuentra en la semilla del neem en proporciones que oscilan
entre el 0.1 y el 0.9%. La azadiractina son nueve ismeros diferentes,
nombrados de la A a la K. Los principales son la azadiractina A (83%) y
azadiractina B (16%). Trabajos de investigacin recientes apuntan a que la
azadiractina es responsable de la mayora de las interferencias que provoca
el aceite de neem sobre el sistema endocrino y la fisiologa digestiva de
numerosos artrpodos, debido a su parecido estructural con las ecdisonas,
hormonas que controlan el proceso de metamorfosis en los insectos de
pasar de larva a adulto, es decir, afecta a la Cardiacum corpus, una rgano
similar a la pituitaria humana, que controla la secrecin de hormonas y para
que ocurra la metamorfosis requiere la cuidadosa sincrona de muchas
hormonas y otros cambios fisiolgicos para tener xito, por tanto la
azadiractina parece ser un "bloqueador de ecdisona" (http://www.neem.es/;
Shultz y col, 1992).
Figura. 1.- Azadiractina (Shultz y col, 1992).
Meliantriol: Aislado por primera vez en 1967, es una molcula igualmente

compleja. El meliantriol, a concentraciones muy bajas, tiene un potente
efecto fagosttico sobre los insectos, al interferir sobre los mecanismos de la
deglucin y posiblemente inhibir el peristaltismo intestinal. El meliantriol
afecta al crecimiento del insecto y muestra actividad contra nematodos.
(http://www.neem.es/). La primera prueba cientfica del neem fue la
demostracin de su capacidad para evitar que las langostas arrasaran los
cultivos, un uso tradicional para el control de insectos en los cultivos de la
India (Shultz y col, 1992).
Figura. 2.-Meliatrol (Shultz y col., 1992).
Salanina: Tercer principio activo en importancia, cuya actividad se explica

por su gran efectividad como inhibidor de deglucin; no parece tener efecto
alguno sobre el crecimiento del insecto. In vitro se ha mostrado
extraordinariamente efectiva contra numerosas plagas de distintos cultivos
Figura. 3.- Salanina (Shultz y col, 1992).

Nimbina y nimbidina: Son los principios amargos ms importantes
(alrededor de un 2%) que se obtienen cuando se somete a la semilla del
neem a extraccin con alcohol. Se ha verificado la actividad de estas
molculas contra algunos virus, como el virus X de la patata
(http://www.neem.es/; Shultz y col, 1992).
Figura. 4.- Nimbin y Nimbidin (Shultz y col, 1992).
1.4 Acciones Farmacolgicas del Neem

En bases a sus usos teraputicos tradicionales numerosas
investigaciones se han hecho entorno al rbol del neem, por lo que se le ha
probado en diversas acciones farmacolgicas reportadas para el Neem,
sustentadas mediante pruebas cientficas entre las cuales podemos
destacar:
Propiedades antioxidantes, antitumorales,
apoptosis, antiproliferativo celular.
anticancergenas,
pro-
En estudios recientes se report que el nimbolide un liminoide del

Neem, inhibe el crecimiento de clulas cariocarcinoma humano (BeWo)
acompaado de una disminucin en la proliferacin antgeno nuclear
celulares (PCNA), un marcador en la proliferacin celular, por lo que en el
ensayo de citotoxicidad, se prob el efecto inhibitorio a diferentes
concentraciones y tiempos del nimbolide en el crecimiento de clulas BeWo
y se demostr que ambos parmetros se relacionaban con la inhibicin del
crecimiento en clulas BeWo, adems se demostr que tal inhibicin de
crecimiento era causada por apoptosis, evidenciada por la fragmentacin
nuclear y la condensacin; evento provocado por el incremento en la
generacin de especies reactivas al oxigeno (ROS) que media la apoptosis,
disminuyendo en PCNA (un cofactor para DNA polimerasa y bloquea la
apoptosis por inhibicin de Gadd45 y MyD118) y Bcl-2 e incrementando la
expresin de Bax, Apaf-1, caspase-3 y PARP en comparacin con las
clulas control no tratadas, que sugiere que es el modo de muerte celular
inducida por nimbolide (Harish y col., 2008).
El anlisis del mecanismo fundamental de la induccin a la apoptosis
por nimbolide esta mediada por la activacin de ROS en la mitocondria.
Adems de la glutatin, un antioxidante bloquea la generacin de ROS y el
efecto citotxico del nimbolide confirma la injerencia de ROS. Excesiva
generacin de ROS puede guiar a la apertura de la permeabilidad
mitocondrial de la transicin del poro con la subsecuente liberacin de
citocromo c del espacio intermembranal dentro del citosol culminando en la
activacin de la cascada de caspasas y la muerte celular apoptotica (Harish
y col., 2008).
El extracto etanlico del Neem causa apoptosis en las clulas
cancergenas de la prstata (PC-3) por induccin de la fragmentacin del
DNA, disminucin en Bcl-2 e incremento en la expresin de Bax (Harish y
col., 2008).
Azadiractina, un limonoide aislado de las semillas del Neem as como
azadirone ha sido reportado por exhibir efecto citotxico contra lneas
celulares en cncer humano. Nimbolide y 28-deoxonimbolide ha sido
identificado como constituyentes citotxicos del Neem. Estudios han
mostrado que el nimbolide es el ms importante contribuyente citotxico de
los extractos del Neem y se confirm con citometra de flujo que inhibe el
ciclo celular (Harish y col., 2008).
Se prob el uso de un adyuvante inmune en el aumento de la

inmunogenicidad de un antgeno, por lo que se ha reportado que el
tratamiento en el ratn con la preparacin de la hoja del Neem (NLP) puede
limitar el crecimiento del carcinoma murino ERLICHS y el melanoma B16.
Por tanto el presente estudio se examin el ratn C57BL/6 y la
inmunogenicidad del antgeno de superficie melanoma B16 (B16MelSAg)
por NLP (Baral y col, 2005).
Se observo que la combinacin NLP con B16MelSAg, dio un elevado
nivel de anticuerpos generados en comparacin con el bajo nivel de los
anticuerpos producidos solamente por B16MelSAg, medidos mediante la
prueba de ELISA, estos anticuerpos generados por NLP con B16MelSAg
fueron principalmente IgG1, y adems de que los ttulos con los valores ms
altos fueron obtenidos con la combinacin anterior podan ser mantenidos
tras inmunizaciones subsecuentes, demostrando su efectividad como
adyuvante y que en comparacin con el adyuvante de Freunds (con ttulos
de anticuerpos totalmente comparables) no produce inflamaciones o
ulceraciones en el sitio de inyeccin lo cual ocurre generalmente durante la
inmunizacin con el adyuvante de Freunds (Baral y col, 2005).
Aunado a esto, la dosis ptima de NLP no tiene efectos letales en el
ratn, adems de que no se genero suero inmune reactivo con el antgeno
negativo con clulas MCF7 por lo que se demuestra su especificidad (Baral
y col, 2005).
Por otro lado, en otras pruebas hechas a los ratones se observo que
inculos de dosis letales de clulas B16Mel a estos, el volumen del tumor
fue significativamente pobre con ratones preinmunizados con
B16MelSAg+NLP en comparacin con los ratones no tratados y que el
volumen del tumor era significativamente mayor, as como la restriccin del
crecimiento local del tumor por medio de suero inmune (Baral y col, 2005).
Es esencial generar ttulos altos de anticuerpos para obtener el
mximo beneficio clnico en la inmunoterapia ya que recientes estudios
revelan que una gran produccin de anticuerpos esta correlacionada con un
buen resultado clnico (Baral y col, 2005).
La glicoprotena de la hoja del Neem (NLGP) se utilizo como un
adyuvante al CEA. El CEA es un antgeno presente en clulas tumorales en
ms del 95% en cncer de colon-rectal, en adenocarcinoma de pulmn
(70%) y en pacientes con cncer de mama (50%). Se utilizaron macrfagos
peritoneales de ratn, los cuales se analizaron estudiando su adherencia y
morfologa (numero de pseudpodos). Los resultados mostraron que la
inmunizacin con la glicoprotena del Neem (NLGP) gnero una mayor
cantidad de anticuerpos con predominancia IgG subclase 2. En conclusin
proponen utilizar un esquema de vacunacin con la glicoprotena de Neem
como una vacuna adyuvante. En particular en la vacuna de CEA a travs de
macrfagos (Sarkar y col., 2008).
Un punto interesante es que la inmunizacin con NLGP solamente,
tambin genera un conjunto de anticuerpos que pueden reaccionar con
CEA. Donde el anticuerpo anti-NLGP puede reaccionar eficientemente con

CEA en diferentes formatos (Sarkar y col., 2008).
Propiedades Anti-Bacteriana
Se probaron serogrupos de Vibrio cholerae 01, 0139 y no-01, no-0139
para evaluar la actividad antibacteriana del extracto crudo de las hojas del
Neem usada en la medicina tradicional india para el tratamiento de diarrea y
clera, con cepas multiresistentes a diferentes drogas probadas mediante
una prueba de susceptibilidad antibitica. Los estudios mostraron actividad
inhibitoria en todas las cepas, adems de que la administracin del extracto
de hojas del Neem no produjo ningn signo de toxicidad y ninguna muerte
en los ratones tratados, por otro lado se encontr que el extracto en dosis
orales de 450mg/kg inhiba la secrecin de fluido y la hemorragia en los
intestinos inducida por las cepas de Vibrio cholerae (Thakurta y col., 2007).
Actividad Anti-fngica
En estudios anteriores se ha comprobado que los extractos etanlicos
de las hojas del Neem, as como en los extractos con acetato de etilo y
hexano han mostrado una inhibicin en cuanto al crecimiento de los
diferentes tipos de dermatofitos causantes de la gran mayora de micosis
tales como Trichophyton
rubrum, Trichophyton
mentagrophytes y
Microsporum nanum. En cuanto al extracto etanlico mostr una
Concentracin Mnima Inhibitoria (MIC) y una Concentracin Mnima
Fungicida (MFC) de 250 g/ml para todas las cepas de T. rubrum y M.
Nanum probados. En cuanto a T. mentagrophytes la MIC y MFC fue de 125
g/ml para todas las cepas.
Adems de que el anlisis estadstico mostr que el crecimiento y los
cambios en la prueba fueron significativamente diferentes del crecimiento en
los no tratados (Natarajan y col., 2003).
Enfermedades periodentales
Se realizo un estudio contra cuatro organismos: Streptococcus
mutans, Streptococcus salivarius, Streptococcus mitis y Streptococcus
sanguis, conducido a evaluar el efecto antimicrobiano de las hojas del neem
sobre los microorganismos, los cuales estn involucrados en el desarrollo de
la caries dental. El filtrado se inoculo en placas de agar sangre que
contenan especies individuales de microorganismos y se incubo a 37C por
48 hrs. Los resultados arrojan que el neem mostr actividad inhibitoria de
crecimiento con los cuatro microorganismos con una mnima concentracin
de 5%. Por otra parte la mxima actividad antimicrobiana fue observada
sobre Streptococcus mutans a 50% de concentracin, con una zona de
inhibicin de 3.8 mm. (Prashant y col., 2007).
10
Por otro lado, otro estudio informo que el pre-tratamiento de saliva e

hidroxiapatita con el extracto de las hojas del neem antes de la exposicin a
las bacterias, produjo una reduccin significativa en la adhesin bacteriana.
Este resultado sugiere que le extracto de las ramitas del neem puede reducir
la capacidad de algunos estreptococos a colonizar las superficies dentales
(Wolinsky y col., 1996).
Otro estudio realizado por Khalid en 1999 examino la eficacia de la
actividad antimicrobiana de extractos de neem en diversas concentraciones
e informo que el neem es eficaz en el 50% de concentracin de
Streptococcus mutans.
11
2. Lectinas
Lectinas (del latn legere, seleccionar o escoger) son protenas que
unen a mono y oligosacridos especfica y reversiblemente, carecen de
actividad cataltica (es decir, no son enzimas) y en contraste con los
anticuerpos, no son producto de una respuesta inmune (Sharon y Lis, 2001).
2.1 Descripcin
Las lectinas tpicamente contienen dos o ms sitios de unin a
carbohidrato por molcula, es decir, son divalentes o polivalentes aunque
hay algunas excepciones (Sharon y Lis, 2001).
Son capaces de aglutinar clulas, y desde que se sabe que las
lectinas difieren en los tipos de estructuras de los carbohidratos que
reconoce con gran afinidad, son muy tiles en la caracterizacin de
glicoconjugados (Varky y col., 1999), principalmente de las glicoprotenas,
por histoqumica de clulas y tejidos, para el examen de los cambios que
ocurren en las superficies celulares durante procesos fisiolgicos y
patolgicos, as como el diferenciamiento celular para el cncer (Sharon y
Lis, 2004).
2.2 Historia de las lectinas
Hacia finales del siglo XIX, las pruebas comenzaron a acumularse por
la presencia en la naturaleza de protenas que poseen la capacidad de
aglutinar eritrocitos. Estas protenas se conocen como hemaglutininas o
fitohemaglutininas por que originalmente se encontraban en las plantas
(Varky y col., 1999). En general se considera que la primera descripcin de
una hemaglutinina fue por Peter Hermann Stillmark en su tesis doctoral
presentada en 1888. Esta hemaglutinina, altamente toxica, fue aislada por
Stillmark de semillas del rbol de Ricino (Ricinus communis) y fue nombrada
como la ricina. Posteriormente H. Helin tambin demostr la presencia de
una toxica hemaglutinina denominada abrina en los extractos de la planta
denominada regaliz americano (Abrus precatorius) (Sharon y Lis, 2004).
En 1919 James B. Summer en la universidad de Cornell (tambin
conocido por que fue el primero en cristalizar en 1926 la enzima ureasa)
aisl de la semilla del frjol (Canavalia ensiformis) una protena cristalina a la
que llam Concanavalina A y de esta manera se obtuvo por primera vez una
hemaglutinina pura. Sin embargo, casi dos dcadas despus Summer y
Howell (1936) informaron que la Concanavalina A aglutina clulas como
eritrocitos, levaduras y glicgeno en solucin. Por lo que puso de manifiesto
que la hemaglutinacin con Concanavalina A se inhiba con la sacarosa, lo
que demostr por primera vez la especificidad de azucares a lectinas. Con
gran previsin, sugirieron que haba una reaccin entre de las protenas de
las plantas con los carbohidratos en la superficie de los glbulos rojos. Este
suceso fue corroborado y ampliado por Karl Landsteiner en 1900, el
12
descubridor de los grupos sanguneos humanos :A, B y O (Sharon y Lis,

2004).
En 1940 se dio el descubrimiento por parte de William C. Boyd e
independientemente Karl O. Renkonen, que la sangre humana en los
diferentes grupos tienen especificidad a hemaglutininas. Descubrieron que
los extractos crudos de la semilla de lima (Phaseolus limensis) y la Vicia
cracca aglutinaban a los eritrocitos del tipo A, pero no de eritrocitos del tipos
O ni B, mientras que un extracto del esprragos guisante (Lotus
tetragonolobus) aglutinaban eritrocitos del tipo O (Sharon y Lis, 2004).
En la dcada de 1950, Walter JT Morgan y Winfred M. Watkins
encontraron que la aglutinacin de eritrocitos tipo A por la lectina de la
semilla de lima fue mejor inhibida por N-acetil-D-galactosamina y que la
aglutinacin por los eritrocitos tipo O por la lectina L. tetragonolobus fue
mejor inhibida por L-fucosa. Por lo que concluyeron que N-acetyl-Dgalactosamina y L-fucosa son azucares determinantes confirindoles
especificidad a los grupos sanguneos A y O respectivamente (Sharon y Lis,
2004).
El trabajo pionero de Watkins y Morgan fue uno de las primeras
pruebas para detectar la presencia de azucares en las superficies celulares
y sus posibles funciones como marcadores de identidad (Sharon y Lis, 2004)
La capacidad de las aglutininas de las plantas para distinguir entre los
eritrocitos de los distintos tipos de sangre, provocaron que Boyd y Shapleigh
(1954) acuaran el trmino Lectinas del latn legere, seleccionar o elegir
(como ya antes se haba mencionado). (Sharon y Lis, 2004; Varky y col.,
1999). Termino generalizado para abarcar todo los azucares de aglutininas
especificas de origen no inmune (Sharon y Lis, 1972).
Sin embargo, el mayor auge lo tuvo con dos importantes
descubrimientos realizados con ellas. El primero fue presentado por Meter
C. Novell (1960), encontr que la lectina del frjol rojo (Phaseolus vulgaris),
puede estimular a los linfocitos a someterse a la mitosis. Este
descubrimiento tuvo un impacto revolucionario en la inmunologa ya que los
linfocitos son clulas que no podan dividirse o diferenciarse ms all. Este
hallazgo proporciono la prueba de que la estimulacin mitognica es el
resultado de la unin de lectinas a azucares en la superficie de los linfocitos
(Sharon y Lis, 2004).
El segundo descubrimiento fue hecho por Joseph C. Aub. Encontr
que las aglutininas del germen de trigo (WGA) tiene la capacidad de
aglutinar preferentemente clulas malignas. Estas investigaciones previstas
de datos preliminares parecen indicar que los cambios en los azucares de
las superficies celulares estn asociados con el desarrollo del cncer
(Sharon y Lis, 2004). La primer lectina animal aislada fue de la anguila la
cual demostr ser especfica para un azcar (L-fucosa) (Watkins y Morgan,
1952).
13
En 1980 el nmero de lectinas purificadas de animales comenz a

aumentar rpidamente, gracias a la aparicin de tcnicas recombinantes
(Sharon y Lis, 2004). De hecho la primer lectina cuya secuencia primaria fue
establecida fue la Concanavalina A (Edelman y col., 1972). Ahora, en los
ltimos aos, el nmero de lectinas primarias y estructuras en tercera
dimensin ha ido aumentando de manera rpida, con unos 200 ejemplares
de estos ltimos (www.cermav.cnrs.fr/lectinas).
2.3 Carbohidratos; glicocdigos por excelencia
Las interacciones moleculares basadas en el reconocimiento
especifico entre lectinas y glicanos (azucares de la membrana celular)
cumplen un papel clave en mltiples procesos biolgicos. Ello se debe, en
parte, al enorme potencial codificador de informacin de las estructuras de
los glicanos, superior al de las protenas y cidos nucleicos (Gallego del Sol
y Col., 2006).
Las unidades estructurales de los monosacridos pueden engarzarse
entre si en varios puntos de varias formas, si tenemos en cuenta la isomera
/ (Gallego del Sol y Col., 2006).
Los aminocidos de las protenas y los nucletidos de los cidos
nucleicos se limitan en cambio, a generar estructuras lineales, lo que
restringe su diversidad, por tanto entonces, los polisacridos constituyen
molculas de reconocimiento por excelencia. El potencial informativo
codificado en la estructura de los polisacridos (lo que ha dado en llamarse
glicocdigo) se descifra en la unin selectiva de lectinas a glicanos. Los
polisacridos gozan de una amplia distribucin en sistemas unicelulares y
organismos pluricelulares, de forma libre o unidos (por enlace covalente) a
protenas y lpidos de la membrana celular, a protenas de la matriz
extracelular, y a protenas de los fluidos biolgicos. La expresin de
glicocdigos, controlada en el espacio y en el tiempo, constituye, un
elemento clave del plan de desarrollo de un organismo, de su morfognesis,
entonces podemos decir que los carbohidratos resultan esenciales para el
normal funcionamiento de los organismos (Gallego del Sol y Col., 2006).
2.4 Funcin de las lectinas
La ubicuidad de las lectinas refleja su participacin decisiva en
actividades celulares muy diversas. Operan en numerosos procesos
intracelulares e intercelulares, lo mismo fisiolgicos que patolgicos como
antes se ha mencionado. Ejemplo de los primeros son el reconocimiento del
espermatozoide y vulo durante la fecundacin, adhesin de clulas, en el
desarrollo, diferenciacin y proliferacin celular. En procesos patolgicos
donde interviene lectinas a la unin de bacterias, virus y toxinas a la
superficie celular, inflamacin, transformacin maligna y metstasis, entre
otros (Gallego del Sol y Col., 2006).
La base de este reconocimiento molecular es la adecuacin entre
pares de estructuras complementarias, en este caso la combinacin de sitio
de una lectina y un carbohidrato (a menudo denominado lectina ligando), en
14
las superficies de interaccin entre las clulas o las relativas a una clula y
en una molcula en solucin (Sharon y Lis, 2001).
Las lectinas representan un grupo heterogneo de protenas
oligomericas que varan en tamao, estructura y organizacin celular, as
como en la constitucin de sus sitios de combinacin, sin embargo, algunas
de ella pertenecen a distintas familias de protenas con secuencias similares
y caractersticas estructurales (Sharon y Lis, 2001).
Lectinas con la misma especificidad pueden diferir notablemente en
su afinidad para diversos derivados del correspondiente monosacrido,
especialmente para oligosacridos, mientras que algunas lectinas
interactan solo con los oligosacridos y no con los monosacridos. Las
uniones de lectinas a monosacridos son por lo general dbiles, mientras
que las uniones entre lectinas y oligosacridos es a menudo mucho ms
fuerte (Sharon y Lis, 2001).
En un sentido ms amplio, lo anterior implica que las lectinas poseen
la capacidad de actuar como molculas de reconocimiento en las clulas y
en las superficies celulares y en los fluidos fisiolgicos. Tal como se muestra
en la Fig. 5 y Tabla 1 (Sharon y Lis, 2004). De hecho esta es la vista actual
de las funciones biolgicas de las lectinas que tambin evoluciono durante
1970. (Ashwell y Morell, 1972; Ofek y col., 1978)
Figura 5.-Interacciones Carbohidrato-Lectina sobre la superficie celular en

procesos celulares, fisiolgicos y patolgicos.(Sharon y Lis, 2004)
15
Tabla 1.- Funciones de lectinas en los diversos organismos (Sharon y Lis,

2004)
Lectina
Funcin
Microorganismos
Amiba
Bacteria
Virus Influenza
Infeccin
Infeccin
Infeccin
Plantas
Varios
Leguminosas
Defensa
Simbiosis con bacterias fijadoras de nitrgeno
Animales
Calnexin, calreticulin. ERGIC-53
Control de la biosntesis
Colectinas
Inmunidad innata
Dectina 1
Inmunidad innata
Galectinas
Regulacin del crecimiento celular, apoptosis, ciclo celular,

modulacin de interacciones clula-clula y clula-sustrato
Macrfagos Receptores de Manosa
Receptores Man-6-P
L-Selectinas
E- y P-Selectinas
Siglecs
Espermadhesina
Inmunidad innata, eliminacin de hormonas glicoproteicas

sulfatadas.
Direccin para el sustrato de enzimas lisosomales
Recaptura de los linfocitos
Transporte de leucocitos al sitio de inflamacin
Interaccin clula-clula en la inmunidad y en el sistema neural
Interaccin ovula-espermatozoide
Un descubrimiento clave se hizo en 1979, cuando se demostr que la

infeccin del tracto urinario en ratones por Escherichia coli especificas para
manosa poda ser impedido por Metil--D-manosa (Aronson y col., 1979).
Fue la primera evidencia directa en la participacin de lectinas de bacterias
en el inicio de la infeccin, por lo cual es la base para los intentos actuales
para la terapia anti-adhesin para estas enfermedades (Sharon y Lis, 2004).
Especial inters reviste el mecanismo de infeccin aplicado por
Tripanosoma cruzi. Este protozoario se adhiere a la membrana celular a
travs de una lectina que reconoce el acido silico unido, mediante un
enlace 2-3, a galactosa. El patgeno secreta una transialidasa, que cataliza
la adicin del acido silico de componentes de la superficie celular a
protenas propias, asegurndose as puntos de anclaje para la infeccin, es
decir, un conocimiento detallado de las bases moleculares de las
interacciones entre lectinas y glicanos resulta, entonces, necesario para
16
abordar los procesos biolgicos y patolgicos en que estas participan

(Gallego del Sol y Col., 2006).
Como se ha mencionado, la funcin principal de lectinas es el
reconocimiento y adherencia celular. Las lectinas de las superficies virales y
bacterianas median la adhesin de los organismos a las clulas hospederas,
siendo un requisito previo para que se produzca la infeccin, Como se
muestra en la figura 6 (Sharon y Lis, 2001).
Figura. 6.- Lectinas de la superficie regulan la adhesin celular por la unin

al carbohidrato correspondiente (Sharon y Lis, 2001).
La expresin de galectinas (lectinas de animales) en el organismo

esta regulado por el desarrollo, su sntesis se da en un determinado tejido y
solo se da en una determinada etapa de desarrollo o etapa fisiolgica. Por lo
tanto, se cree que son esenciales para el desarrollo normal y la
diferenciacin de todos los organismos multicelulares, actuando como
molculas de adhesin celular (Sharon y Lis, 2001)
Las selectinas participan en las interacciones biolgicas de
reconocimiento. Ellas pueden mediar la adhesin primaria de leucocitos
circulantes a las clulas endoteliales de los vasos sanguneos, un requisito
previo para la salida y su migracin en los tejidos (Sharon y Lis, 2001)
Adems de su participacin en la inflamacin (Sharon y Lis 2001), las
selectinas pueden funcionar en la propagacin de las clulas cancerosas del
tumor principal a otros sitios del cuerpo y que mediante el bloqueo de sus
sitios de uniones a azucares es posible evitar la metstasis (Sharon y Lis,
2004).
Las colectinas participan en un tipo de defensa denomina inmunidad
innata, surge en el conjunto de reacciones inmediatas inducidas por el dao
tisular (lesin o infeccin) antes del inicio de la respuesta inmune. Acta
unindose a los carbohidratos de la superficie celular de las bacterias y los
hongos, causando la lisis de los patgenos (Sharon y Lis, 2001).
17
2.5 Toxicidad
Algunas lectinas de plantas son toxicas a clulas de animales. Las
lectinas consumidas durante la dieta pueden ser inocuas, usualmente son
desnaturalizadas por el cocimiento y digeridas proteolticamente en el
consumo. Sin embargo, algunas lectinas no se cocinan o son
extremadamente estables a las proteasas (Varky y col., 1999).
Algunas lectinas de plantas, son clasificadas propiamente como
toxinas, sin embargo, estn entre las protenas ms venenosas del planeta y
pueden resultar en la muerte no solo de clulas en cultivo sino tambin de
animales. La alta toxicidad de las lectinas es usualmente heterodimrica y
contiene una subunidad para la actividad vinculante y un segunda subunidad
que no tiene actividad vinculante a carbohidrato, en lugar de ello tienen un
sitio cataltico (una enzima). Por ejemplo, ricina de Ricinos communis, es
una protena heterodimerica con una masa molecular de 60 kDa, compuesta
de dos cadenas vinculadas por un puente disulfuro S-S, con una cadena A y
una cadena B. La cadena B es la subunidad con el sitio vinculante y la
cadena A es una enzima con actividad adenosina-N-glycosidasa que
cataliza inactivando los ribosomas; tales enzimas son denominadas
protenas inactivantes de ribosomas (RIPs). Una simple molcula de la
subunidad A entrando por endocitosis a la clula puede bloquear
completamente la sntesis proteica (Varky y col., 1999; Sharon y Lis, 2001).
2.6 Clasificacin
Debido a la tremenda diversidad de especificidades a carbohidrato
entre las lectinas de las plantas, algunos investigadores las clasifican de
acuerdo al carbohidrato que reconozcan (Varky y col., 1999).
Basados en su especificidad a carbohidratos, las lectinas se clasifican
en cinco grupos acorde al monosacrido por el cual tenga mayor afinidad:
1.-Manosa, 2.-N-acetil glucosamina, 3.-Galactosa/N-acetil galactosamina, 4.Fucosa y 5.- Acido Silico (Sharon y Lis, 2001).
De acuerdo al origen tambin se clasifican en: lectinas de plantas,
lectinas microbianas y lectinas de origen animal (Sharon y Lis, 2001).
2.7 Lectinas de plantas

Las plantas continan siendo la fuente ms rica en lectinas, con
cientos de lectinas bien estudiadas a la fecha. Muchas de ellas son de las
semillas de las plantas, aunque tambin se han obtenido prcticamente de
todo tipo de tejido vegetativo, tales como cortezas, hojas, tallos, frutos y
races. Cuando las lectinas son aisladas de la misma familia y tejidos son
18
estructuralmente similares, aunque pueden tener diferentes caractersticas

especificas (Sharon y Lis, 2001).
2.7.1 Leguminosas
Las lectinas de las semillas de las leguminosas comprende la familia
ms grande de esta clase, con ms de 100 miembros. Todas ellas constan
de dos o cuatro subunidades idnticas o casi idnticas de 25-30 kDa, cada
una con un solo sitio de combinacin para carbohidrato y un sitio para Ca2+ y
Mn2+ por unidad, esenciales para la unin de los carbohidratos (Sharon y
Lis, 2001).
Los metales pueden ser quelados con EDTA e inactivar
reversiblemente a las protenas. Las lectinas de las leguminosas son
sintetizadas como precursor de pptidos de aproximadamente 30 kDa
dentro de las organelos secretores de las clulas de las plantas y
usualmente oligomerizadas en forma de homodmeros y homotetrmeros.
Durante su biosntesis algunas lectinas son proteolticamente clivadas para
generar cadenas correspondiente al amino Terminal y cadenas
correspondiente al carboxilo Terminal (Varky y col., 1999).
Las estructuras tridimensionales de las subunidades de todas las
lectinas de las legumbres son casi idnticas, mientras que su estructura
cuaternaria vara. Las subunidades tienen la forma de un domo, con el sitio
de combinacin para carbohidrato localizado en la parte superior de la
cpula, muy cerca de los iones metlicos. La discriminacin esta
estrechamente relacionada entre los azucares, debido a los diferentes
posicionamientos de los monosacridos respecto a los sitios de unin a
carbohidrato, debido a las diferencias estructurales (Sharon y Lis, 2001).
Esta familia incluye lectinas tales como por ejemplo: concanavalina A
(ConA), aglutinina de soya, lectina gentil, etc. (Varky y col., 1999).
2.7.2 Cereales
Las lectinas de esta familia son especificas para todos los N-acetil
glucosamina y acido N-acetil neuramnico. Consisten de dos subunidades
idnticas, y difieren notablemente de las leguminosas al carecer de metales
para la activacin del sitio vinculante y son ricas en cistena (Sharon y Lis,
2001).
Otra familias pequea de plantas cuyas lectinas han sido
caracterizadas son las solanceas papa y tomates (Varky y col., 1999).
2.8 Usos de las lectinas de plantas

Aunque las funciones naturales de las lectinas de las plantas estn
entendindose justo ahora, investigadores a lo largo de los aos han
19
encontrado docenas de usos para las lectinas de las plantas tales como lo
muestra la tabla 2.
Tabla 2. Algunas aplicaciones para las lectinas de plantas (Varky y col., 1999).
Aglutinacin de clulas y tipificacin sangunea
Separacin celular y anlisis
Tipificacin bacterial
Identificacin y seleccin de clulas mutadas con alteraciones en la glicosilacin
Conjugados txicos para la muerte de clulas tumorales
Mitognesis de clulas
Trazamiento de mapas neuronales
Purificacin de glicoconjugados
Ensayos de glicosiltranferasas y glicosidasas
Definicin del estado de glicosilacin y glicoconjugados blanco.
Debido a su habilidad para distinguir los determinados carbohidratos
de las clulas sanguneas humanas. Las lectinas son ampliamente usadas
en estudios inmunolgicos, debido a que a bajas concentraciones, las
lectinas, tales como Con A, y fitohemaglutininas (L-PHA), son mitognicas
para los linfocitos de la sangre perifrica. Sin embargo, algunas lectinas
como Con A y L-PHA son extremadamente citotxicas a las clulas a altas
concentraciones y son usadas para seleccionar lneas celulares mutadas en
el camino de la glicosilacin (Varky y col., 1999).
Por otra parte tambin son usadas extensamente para caracterizar
las estructuras de glicoconjugados de clulas animales, la cual la
especificidad de unin a carbohidrato ha sido bien definida (Varky y col.,
1999).
2.9 Funciones de las lectinas en plantas

Aunque usualmente pensamos que las lectinas de las plantas solo
tiene la habilidad de unirse a carbohidratos existe evidencia de que esas
protenas pueden tener otra actividad. A pesar del enorme inters en las
lectinas de las plantas poco es lo que se sabe acerca de sus funciones en la
planta, y que probablemente tenga diferentes e importantes funciones en las
plantas (Varky y col., 1999).
Como se ha mencionado, la funcin principal de las lectinas es el
reconocimiento celular y adhesin. Por lo tanto, las lectinas de las
leguminosas pueden estar ligadas en el establecimiento de la simbiosis,
entre la fijacin de nitrgeno y las bacterias, el caso ms estudiado es el de
Rhizobium que se une a las races de las plantas (Sharon y Lis, 2001; Varky
y col., 1999).
Algunas de las lectinas de las plantas tambin son toxicas para
algunas plantas patgenas, y esto puede ser el principal rol dentro de las
semillas o de algn otro tejido de la planta (Varky y col., 1999).
20
Tabla 3. Algunas posibles funciones naturales de las lectinas en plantas

(Varky y col., 1999).
Almacenaje de protenas en las semilla
Defensa contra hongos, virus y bacterias patgenas
Defensa contra animales predadores
Simbiosis en leguminosas
Transporte de carbohidratos
Estimulacin mitognica de clulas embriognicas de plantas
Elongacin de la pared celular
Reconocimiento del polen
3. Estudio de Lectinas
3.1 Identificacin de Protenas
Es necesario purificar una protena antes de estudiar su estructura y
el mecanismo de accin. Sin embargo, dado que las protenas varan en
tamao, carga e hidrosulibilidad, no se puede utilizar un nico mtodo para
aislar todas las protenas (Lodish y Col., 2002).
El primer paso de una serie de estudios dirigidos a explorar la funcin
de una protena es la purificacin de esa protena de inters, por lo que las
protenas se pueden separar entre si en base a su solubilidad, tamao,
masa, carga y capacidad de unin (Stryer y Col., 2002)
Como primer paso se necesita una prueba de ensayo, que identifique
alguna propiedad especial de esa protena que permita determinar si esta
presente. En este caso corresponde un ensayo de actividad hemaglutinante,
caracterstica principal de las lectinas (Stryer y Col., 2002)
Para tener claro que nuestro esquema de purificacin funciona,
necesitamos un elemento adicional de informacin: la cantidad de protena
presente en la mezcla que se ensaya. En este caso la actividad especfica
crecer conforme se produzca la purificacin y la mezcla proteica ensayada
est formada en mayor medida por la protenas en cuestin (Stryer y Col.,
2002).
3.2 Las protenas deben ser liberadas
Elegido el ensayo y la fuente de protena, debemos fraccionar la
clula en sus componentes y precisar que componente esta enriquecido en
la protena que nos interesa (Stryer y Col., 2002).
3.3 Centrifugacin
Es el primer paso en un esquema tpico de purificacin de protenas.
Se basa en el principio de que dos partculas en suspensin (clulas,
21
organelos o molculas), con masas o densidades diferentes, se

sedimentaran en el fondo de un tubo con velocidades diferentes. Por tanto,
las molculas mas pesadas o mas densas se sedimentaran con mas rapidez
que las mas livianas o menos densas. (Lodish y Col., 2002).
Entonces como paso previo se forma un homogenizado por ruptura
de la membrana celular, se fracciona la clula por centrifugacin, que da
lugar a un precipitado de material pesado en el fondo del tubo de centrifuga
y un sobrenadante mas ligero encima. El sobrenadante se centrifuga de
nuevo con una fuerza centrifuga mayor obteniendo un nuevo precipitado y
otro sobrenadante; a esto normalmente se le conoce como centrifugacin
diferencial por que produce varias fracciones de densidad decreciente, cada
una de ellas con varios cientos de protenas distintas, que se ensayan
posteriormente para obtener la actividad que se purifica. Normalmente, se
encontrara una fraccin enriquecida en actividad, y ser la fuente de
material en la que se aplicaran las tcnicas de purificacin mas
discriminatorias (Stryer y Col., 2002).
La fuerza centrifuga y la duracin de la centrifugacin se ajusta para
asegurar que todo el material insoluble se sedimente, mientras que en el
sobrenadante permanecern las protenas solubles (Lodish y Col., 2002).
El mecanismo habitual consiste en que la mezcla de protenas se
somete a diferentes separaciones, cada una de ellas basada en propiedades
diferentes, para obtener la protena pura. En cada paso de la purificacin, se
ensaya la actividad de la protena deseada y se determina la concentracin
proteica. Se necesitan cantidades importantes de protena puras, del orden
de muchos miligramos, para esclarecer sus estructuras tridimensionales y
sus mecanismos de accin. Por lo tanto, el rendimiento global es un rasgo
importante de un esquema de purificacin (Stryer y Col., 2002).
3.4 Precipitacin salina

Una de las formas ms antiguas, ms simples y aun ms bastante
eficaz para llevar a cabo una mezcla de protenas es utilizar la solubilidad
diferente en disoluciones salinas concentradas.
Muchas protenas se hacen insolubles en presencia de
concentraciones elevadas de sales, especialmente las polivalentes que
contribuyen a la fuerza inica. Sin embargo, la solubilidad vara entre una
protena y otra y en disoluciones concentradas varia rpidamente con la
fuerza inica. (Mathews y Col., 2002).
Entonces, las concentraciones de sal en las que precipita una
protena varan de una protena a otra; de aqu que la precipitacin salina
puede utilizarse para fragmentar diferentes protenas. Por ejemplo: el sulfato
de amonio 0.8 M precipita el fibringeno (una protena de la coagulacin
sangunea), mientras que se necesita una concentracin de 2.4 M para
22
precipitar la albmina del suero. Para eliminar la sal, cuando sea necesario,
se puede utilizar la dilisis (Stryer y Col., 2002).
3.5 Dilisis
Las protenas se pueden separar de molculas pequeas mediante la
dilisis a travs de una membrana semipermeable, como puede serlo una
membrana porosa de celulosa. Las molculas con dimensiones
significativamente mayores que el dimetro del poro se retienen dentro de la
bolsa de dilisis, mientras que las molculas mas pequeas y los iones
atraviesan los poros de esta membrana y aparecen en el dializado, fuera de
la bolsa. Esta tcnica es til para retirar la sal u otras molculas pequeas,
pero no discriminara de forma efectiva las protenas entre si. (Stryer y Col.,
2002)
3.6 Liofilizacin
El procedimiento consiste en la eliminacin del solvente mediante el
proceso de sublimacin, en el cual la muestra es congelada y sometida a
una cmara de alto vaci, para favorecer que los solventes pasen del estado
slido a vapor, lo que permite la concentracin de la muestra (liofilizado)
eliminando el solvente.
II JUSTIFICACION
Las propiedades medicinales del Neem se encuentran ampliamente
reportadas tanto en medicina tradicional como en literatura cientfica, donde
incluso se proponen explicaciones de las diferentes acciones
farmacolgicas. Sin embargo, sorprendentemente no existen reportes de
lectinas, aunque se sabe que muchas de las funciones reportadas se
encuentran reguladas por stas protenas. Es por ello que en esta tesis se
enfoc hacia dilucidar la presencia de estas protenas en extractos crudos
de las hojas del Neem.
III HIPOTESIS
Las hojas del Neem (Azadirachta indica) contienen lectinas
IV OBJETIVOS
Objetivo general
Identificar la presencia de lectinas en el extracto crudo del Neem
23
Objetivos especficos
1.- Realizar un anlisis en la actividad hemaglutinante en el extracto
crudo de hojas del Neem
2.-Identificar la presencia de lectinas en el extracto de hojas del Neem
3.-Realizar un ensayo de especificidad de carbohidratos para el extracto
crudo del Neem
V MATERIAL
1.- Infusiones de hojas secas de Neem (Azadirachta indica)
2.- Reactivos con grado analtico
3.- Panel de fenotipo conocido con los cuatro grupos sanguneos,
donado por el Qumico Jos Lus Alcaraz del Banco Central de
Sangre, Siglo XXI, IMSS, Mxico.
VI METODOS
Obtencin del Extracto Crudo
Se obtuvo utilizando 50g de hojas de Neem, que se hirvieron con 200
mL de agua destilada, se hirvieron por 15 min a 100C, se homogeneizaron,
centrifugaron a 300 rpm X 10 min. El sobrenadante se filtr y se le denomin
extracto crudo.
Fraccin Proteica
Se inici removiendo los pigmentos de las hojas de rbol del Neem
utilizando varios lavados con acetona. Posteriormente se pusieron a secar y
se trituraron obteniendo una cantidad de 150 grs., de peso seco.
A las hojas secas se le aadi 1.25 litros de buffer d PBS 0.1 M pH
7.4, posteriormente se homogeniz, se filtr y centrifug a 3000 rpm X 30
min. El sobrenadante se separ del precipitado, obteniendo un volumen final
de 750 ml. Al sobrenadante se le denomin Fraccin Proteica, ya que se
encuentra enriquecida en protenas en comparacin con el extracto crudo.
Precipitacin Fraccionada
La precipitacin fraccionada se llevo a cabo con sulfato de amonio
(NH4)2 SO4 que permite la separacin de protenas en base a su solubilidad
y peso molecular sin modificar su estructura molecular.
24
Dilisis
Para realizar las dilisis se utilizaron membranas Spectra-Por
MWCO:3500 (Sprectrum Laboratorios, Inc.) y agua destilada cada una con 2
lavados respectivamente.
Determinacin de protenas
La cuantificacin de protenas se llevo a cabo por el mtodo de
Bradford el cual se basa en la unin del colorante Coomassie G-250 azul a
la protena presente en la muestra, despus la cuantificacin de protena se
obtiene al espectrofotmetro con la absorbancia de 595 nm, al interpolarla
en una curva patrn (0-10 mg/mL).
Ensayo de hemaglutinacin
Se realizo en placas de 96 pozos (Corning Incorporated NY 14831)
con un panel de fenotipo conocido humano formado por los grupos
sanguneos A1, A2, B y O, donados por el Banco Central de Sangre, IMSS,
Mxico. Este ensayo se realizo con diluciones seriadas (Debray y col. 1981).
Los resultados se expresan como unidades de hemaglutinacin y como
actividad especifica. Una unidad de hemaglutinacin se define como la
cantidad de lectina capaz de aglutinar y por lo tanto precipitar el 75% de los
eritrocitos en suspensin despus de 60 min. (Bonay y Fresno, 2000). Las
unidades de hemaglutinacin se obtienen en la ltima dilucin en la que se
observa aglutinacin, la actividad especfica se expresa como resultado de
las unidades de hemaglutinacin/mg de protena. La concentracin mnima
de protenas necesaria para producir hemaglutinacin se obtiene con la
ltima dilucin que conserva la actividad. El ensayo se desarrollo con un
control negativo (carente de hemaglutinacin) y con uno positivo (con
hemaglutinacin), se utilizo un extracto de jamaica (Fenton N. B; y col. 2008)
Afinidad para carbohidratos

La especificidad para carbohidratos se obtuvo al comparar la
actividad inhibidora de varios carbohidratos en la hemaglutinacin inducida
por la lectina. Los resultados se expresan como la mnima concentracin
requerida para inhibir completamente la actividad de la lectina a estudiar
(Zenteno y col., 1988). Los carbohidratos utilizados fueron: D-galactosa, Nacetil-galactosamina, D-glucosa, N-acetil-glucosamina, D-fucosa, Dmanosa, D-lactosa, D-ribosa, galactosa- acetilada.
Anlisis estadstico
A los valores obtenidos en cada parmetro analizado se les realizaron
los siguientes clculos: Media ( X ), Desviacin Estndar (DE), varianza (),
EE = DE/n, Coeficiente de variacin s/X. Se realizo un anlisis de varianza
(ANOVA) de dos factores para cada uno de los parmetros analizados. Con
este anlisis se obtuvieron media, DE, EE y la de varianza.
25
VII RESULTADOS
Como primer objetivo se plante determinar la presencia de lectinas
en el extracto crudo del Neem. Para lo cual se desarrollo un ensayo de
hemaglutinacin utilizando los cuatro grupos sanguneos humanos (A 1, A2, B
y O).
Los resultados, que se muestran en la Tabla 4. mostraron que
presenta lectinas ya que se observ actividad hemaglutinante al utilizar los
cuatro grupos sanguneos humanos.
Grupo Sanguneo
UHA
AE
C
A1
12800 10861 33698 28594 4 3
A2
6400 5430 16849 14297 7 6
B
40960 0
107836 0
0.7 0
O
30720 14481 80877 38125 1 0.5
Tabla 4. Actividad del extracto crudo. Se observa actividad con los cuatro grupos
sanguneos. Los resultados representan la media DE (n = 2) e ensayos
independientes por duplicado.
UHA.- Unidades de hemaglutinacin, AE.- Actividad Especifica (UHA/ concentracin
de protena mg/mL) y C.- concentracin mnima de protenas necesaria para generar
una aglutinacin en g/mL. Protena: 0.8255 0.3 mg/mL.
Actividad Especifica (UHA/(mg/mL))
En la Figura 7, se muestra la actividad especfica del extracto crudo. Se

puede observar que el grupo sanguneo B y O presentan una mayor
actividad especifica.
160000
140000
120000
100000
80000
60000
40000
20000
0
A1
A2
Grupos Sanguneos
Fig. 7. Actividad especifica del Extracto crudo. Los resultados representan la media
DE (n = 2) de ensayos independientes por duplicado. La mayor actividad se observa
con los grupos sanguneos B y O.
De esta manera se comprob la presencia de lectinas, por lo que se

cubri el primer objetivo.
Para realizar el anlisis de las proporciones y tipos de lectinas
presentes se decidi enriquecer este extracto crudo, utilizando una mayor
26
concentracin inicial de hojas y adems de remover los pigmentos y otros

compuestos liposolubles. Este enriquecimiento de protenas se hizo evidente
al realizar la cuantificacin de protenas.
Fraccin Proteica
Los resultados que se presentan en la Tabla 5 y en la Figura 8
muestran que se obtuvo actividad con los diferentes grupos sanguneos. En
particular, se obtuvo una mayor actividad con los grupos sanguneos B y O.
Grupo Sanguneo
A1
A2
B
O
UHA
10400 8101
7840 4800
72320 69084
81920 57926
AE
32033 24954
24148 14784
222757 212790
252326 178421
C
11 4
12 4
22
0.4 .2
Tabla 5. Actividad de la Fraccin Proteica. Se observa actividad con los cuatro

grupos sanguneos. Los resultados representan la media DE (n = 4) de ensayos
una aglutinacin en g/mL. Protena: .8255 .3 mg/mL.
Actividad Espcifica (UHA/(mg/mL))
En la figura 8, esquematiza la actividad especfica de la fraccin proteica

utilizando los diferentes grupos sanguneos. Se puede observar que el grupo
sanguneo B y O presentan una marca actividad especifica, mientras que A2
aparenta una menor actividad que el resto de los grupos. En este anlisis
estadstico se utilizaron como medidas de dispersin a la desviacin
estndar.
350000
300000
250000
200000
150000
100000
50000
0
A1
A2
Grupos Sanguneos
Figura 8. Actividad especifica de la fraccin proteica. Los resultados representan la

media DE (n = 4) de ensayos independientes por duplicado. La mayor actividad se
observa con los grupos sanguneos B y O.
27
Habiendo corroborado los resultados obtenidos en el extracto crudo, se

procedi a la separacin de esta mezcla de protenas utilizando una
precipitacin en base al peso molecular.
Precipitacin fraccionada
La precipitacin fraccionada se llevo a cabo con sulfato de amonio a
diferentes concentraciones (0-20%, 20-40%, 40-60%, 60-80%, 80-100%),
para que las protenas vayan precipitando de acuerdo a su solubilidad y
peso molecular progresivamente.
A continuacin se muestran los resultados de las diferentes
concentraciones de sulfato de amonio.
Concentracin de 0-20% de (NH4)2 SO4

Los resultados obtenidos por la concentracin 0-20% muestra una
mayor actividad para el grupo sanguneo O.
Grupo Sanguneo
A1
A2
B
O
UHA
3840 1810
6400 5430
40960 0
92160 318
AE
12223 5762
20372 17286
130384 0
293364 568
C
73
65
0.6 0
0.6 0.8
Tabla 6. Precipitacin Fraccionada para concentracin 0-20%. Se observa

actividad hemaglutinante con los cuatro grupos sanguneos. Los resultados
representan la media DE (n=2) de ensayos independientes por duplicado.
una aglutinacin en g/mL. Protena: .305 mg/mL.
En la figura 9 se observa la Actividad Especfica del intervalo de

concentracin de 0 a 20%, donde se puede apreciar que el grupo sanguneo
O tiene una actividad significativamente en comparacin con los otros tipos
sanguneos, obteniendo la menor actividad con el grupo sanguneo humano
A1
28
Actividad Especifica (UHA/(mg/ml))
400000
350000
300000
250000
200000
150000
100000
50000
0
A1
A2
Grupos Sanguneos
Figura 9. Actividad Especfica 0-20%. Los resultados representan la media DE

(n=2) de ensayos independientes por duplicado. La mayor actividad se observa con los
grupos sanguneos B y O con mayor marcaje hacia el grupo O.

La separacin de protenas en base a su peso molecular se hace
evidente en los resultados obtenidos en esta concentracin, ya que la mayor
actividad se obtuvo al utilizar el grupo sanguneo A2. y la menor actividad
con el grupo sanguneo B, los resultados se muestran en la Tabla 7 y en la
Figura 10.
Grupo Sanguneo
A1
A2
B
O
UHA
1920 950
15360 7240
80 0
3840 1810
AE
10978 5175
87824 41401
457 0
21956 10350
C
83
1 0.4
174 0
41

actividad hemaglutinante con los cuatro grupos sanguneos. Los resultados
representan la media DE (n=2) de ensayos independientes por duplicado.
En la Figura 10 se puede observar que la mayor actividad se encuentra

en A2, la cual es significativamente diferente a las actividades obtenidas con
los otros grupos sanguneos probados.
29
120000
100000
80000
60000
40000
20000
0
A1
A2
Grupos Sanguneos
Fig. 10 Actividad Especfica 20-40%. Los resultados representan la media DE (n=2)

de ensayos independientes por duplicado. La mayor actividad se observa con el grupo
sanguneo A2 con menor porcentaje ahora hacia el grupo B.

La especificidad para los grupos sanguneos en el intervalo de
concentracin anterior se observ tambin en este intervalo, con la
diferencia de que la especificidad para Gal-Gal-Fuc es ms evidente, como
se puede observar en la Tabla 8.
Grupo Sanguneo
A1
A2
B
O
UHA
120 56
5120 0
3200 2715
200 169
AE
284 133
12126 0
7579 6431
473 401
C
316 149
60
16 13
263 223

actividad hemaglutinante con los cuatro grupos sanguneos. El grupo B presenta la
mayor actividad. Los resultados representan la media DE (n=2) de ensayos
La Figura 11 muestra una actividad especfica mayoritaria hacia el grupo

B y una despreciable actividad para los grupos a A1 y O
30
16000
14000
12000
10000
8000
6000
4000
2000
0
A1
A2
Grupos Sanguneos
Fig. 11. Actividad Especifica 40-60%. Los resultados representan la media DE
(n=2) de ensayos independientes por duplicado. La mayor actividad se observa con el
grupo sanguneo A2 con menor porcentaje ahora hacia el grupo A1.

La tabla 9 resume los resultados obtenidos al analizar la actividad en
este intervalo de concentracin. La mayor actividad se obtuvo al utilizar el
grupo sanguneo B.
Grupo Sanguneo
A1
A2
B
O
UHA
640 0
480 226
40960 0
480 226
AE
2267 0
1700 801
145098 0
1700 801
C
35 0
52 24
0.5 0
52 24
Tabla 9. Precipitacin Fraccionada para concentracin 60-80%. Se observa actividad

hemaglutinante con los cuatro grupos sanguneos. Los resultados representan la media DE
(n=2) de ensayos independientes por duplicado.
UHA.- Unidades de hemaglutinacin, AE.- Actividad Especifica (UHA/ concentracin de protena
mg/mL) y C.- concentracin mnima de protenas necesaria para generar una aglutinacin en
g/mL. Protena: .207 mg/mL.
En la Figura 12 se observa una actividad marcada hacia el grupo B,

presentando una diferencia significativa al compararla con los dems grupos
(A1, A2 y O) se observa escasa actividad.
31
Actividad Hemaglutinante
(UHA/(mg/mL))
200000
180000
160000
140000
120000
100000
80000
60000
40000
20000
0
A1
A2
Grupos Sanguneos
Fig. 12. Actividad especifica 60-80%. Los resultados representan la media DE

(n=2) de ensayos independientes por duplicado. La mayor actividad se observa con el
grupo sanguneo B con menor porcentaje los dems grupos sanguneos.

Los resultados obtenidos con la concentracin 80-100% muestran
que persiste una mayor actividad para el grupo sanguneo B.
Grupo Sanguneo
A1
A2
B
O
UHA
1920 905
2560 0
61440 28963
80 0
AE
7084 3339
9446 0
226715 106874
295 0
C
12 5
8.46 0
0.3 0.1
271 0
Tabla 10. Precipitacin Fraccionada para concentracin 80-100%. Se observa actividad

hemaglutinante con los cuatro grupos sanguneos. Los resultados representan la media
DE (n=2) de ensayos independientes por duplicado.
UHA.- Unidades de hemaglutinacin, AE.- Actividad Especifica (UHA/ concentracin de
protena mg/mL) y C.- concentracin mnima de protenas necesaria para generar una
aglutinacin en g/mL. Protena: .096 mg/mL
En la Figura 13 se puede observar que la mayor actividad se obtiene

con el grupo sanguneo B, con la diferencia que en esta concentracin es
mucho mas evidente esta marcada especificidad por este grupo sanguneo.
32
300000
250000
200000
150000
100000
50000
0
A1
A2
Grupos Sanguneos
Figura 13. Actividad especifica 80-100%. Los resultados representan la media

DE (n=2) de ensayos independientes por duplicado. La mayor actividad se sigue
observando con el grupo sanguneo B mientras que en los dems grupos
sanguneos persiste la poca actividad.
Concentracin de 80-100% sobrenadante

En la saturacin, los resultados obtenidos mostraron que tambin
presentan lectinas, ya que se observa mayor actividad con el grupo
sanguneo B como se muestra en la tabla 11.
Grupo Sanguneo
A1
A2
B
O
UHA
40 7
40 7
81920 0
80 0
AE
215 17
215 17
440430 0
430 0
C
93 11
93 11
0 .1 0
186 0
Tabla 11. Precipitacin Fraccionada para concentracin 80-100% sobrenadante.

Se observa actividad hemaglutinante con los cuatro grupos sanguneos. Los
resultados representan la media DE (n=2) de ensayos independientes por duplicado.
una aglutinacin en g/mL. Protena: .056 mg/mL
33
La Figura 14. muestra claramente que la especificidad de las lectinas

contenidas en este grupo sanguneo es hacia el grupo B.
Actividad Especifica
(UHA/(mg/mL))
600000
500000
400000
300000
200000
100000
0
A1
A2
Grupos Sanguneos
Fig. 14. Actividad especifica 80-100% sb. Los resultados representan la media DE
(n=2) de ensayos independientes por duplicado. La mayor actividad se sigue
observando con el grupo sanguneo B mientras que en los dems grupos sanguneos
persiste la poca actividad.
Como se pudo observar en la mayora de las actividades especificas

mediante el estudio estadstico el grupo con mayor actividad que presento
fue el grupo sanguneo B por lo que se puede predecir que la lectina que se
encuentra mayoritariamente en el Extracto del neem tiene una mayor
afinidad hacia Gal-Gal-Fuc.
Especificidad para Carbohidratos

Para determinar la especificidad por carbohidratos en el extracto
crudo (EC) se realizo el ensayo utilizando el grupo sanguneo B. Se prob
contra los carbohidratos presentados en la Tabla 12.
La afinidad del extracto crudo para carbohidratos de mayor a menor
fue la siguiente: GalNAc, Lac, Ac. Silico > Gal, Sac, Rib > Glu, GluNAc, Xyl
> Gal Acet > Fructosa > Fucosa, Man > Con A.
34
Carbohidrato Extracto Crudo

(mol)
Gal
0.000095
GalNAc
0.000023
Gal acet
0.00305
Glu
0.00076
GluNAc
0.00038
Fuc
0.024
Man
0.024
Fruct
0.006
Xyl
0.00038
Sac
0.000095
Rib
0.000095
Lac
0.000023
Ac.Sialico
0.000023
Con A
0.024
Tabla 12. Especificidad de carbohidratos extracto crudo. Los resultados
representan la mnima concentracin de carbohidratos (en mol) que se requiere
para inhibir completamente la actividad hemaglutinante. Se utilizo el grupo
sanguneo B. la afinidad por los carbohidratos fue la siguiente: GalNAc, Lac, Ac.
Silico > Gal, Sac, Rib > Glu, GluNAc, Xyl > Gal Acet > Fructosa > Fucosa, Man >
Con A.
Especificidad para carbohidratos para la Fraccin Proteica

Para determinar la especificidad por carbohidratos en la fraccin
proteica (FP), fraccin se realizo el ensayo utilizando el grupo sanguneo B.
se prob contra los carbohidratos presentados en la tabla 13. La afinidad de
la fraccin proteica fue la siguiente: Fuc, Lac > Gal acet, Man, Ac.sialico >
Xyl > Gal > GluNAc > Fruct, GalNAc > Glu > Sac, Rib
35
Carbohidrato
(mol)
Gal
GalNAc
Gal acet
Glu
GluNAc
Fuc
Man
Fruct
Xyl
Sac
Rib
Lac
Ac.Sialico
Neem FP
0.0061
0.1953
0.00004765
0.781
0.0122
0.00002382
0.00004765
0.1953
0.0003814
1.5625
1.5625
0.00002382
0.00004765
Tabla 13. Especificidad de carbohidratos para FP. Los resultados representan la mnima
concentracin de carbohidratos (en mol) que se requiere para inhibir completamente la
actividad hemaglutinante. Se utilizo el grupo sanguneo B. La afinidad para carbohidrato fue:
Fuc, Lac > Gal acet, Man, Ac.silico > Xyl > Gal > GluNAc > Fruct, GalNAc > Glu > Sac,
Rib.
Especificidad para carbohidratos para fraccin neem 80-100% sb

Para determinar la especificidad por carbohidratos en la fraccin
Neem 80-100 sb, se realizo el ensayo utilizando el grupo sanguneo B. se
probo contra los carbohidratos presentados en la tabla 14. La afinidad de la
fraccin proteica fue la siguiente: Gal, GalNAc > Lac > Rib > Ac. Silico, Glu
> Gal Acet, Man, Xyl, Sac > Fruct, GluNAc > Fuc.
Carbohidrato
(mol)
Gal
GalNAc
Gal acet
Glu
GluNAc
Fuc
Man
Fruct
Xyl
Sac
Rib
Lac
Ac.Sialico
Neem 80-100 sb
0.1953
0.1953
12.5
1.562
25
50
12.5
25
12.5
12.5
0.781
0.3906
1.562
Tabla 14. Especificidad de Carbohidratos fraccin Neem 80-100 sb. Los resultados
representan la mnima concentracin de carbohidratos (en mol) que se requiere para
inhibir completamente la actividad hemaglutinante. Se utilizo el grupo sanguneo B. La
afinidad para carbohidrato fue: GalNAc > Lac > Rib > Ac. Silico, Glu > Gal > Gal Acet,
Man, Xyl, Sac > Fruct, GluNAc > Fuc.
36
Como se puede observar en la Tabla 14., el Neem presenta una alta

especificidad para una variedad de carbohidratos, ya que se requieren muy
pequeas cantidades para inhibir la actividad especfica, lo que representa
una mezcla de lectinas y carbohidratos presentes en las hojas del Neem.
Carbohidrato
(mol)
Gal
GalNAc
Gal acet
Glu
GluNAc
Fuc
Man
Fruct
Xyl
Sac
Rib
Lac
Ac.Sialico
Extracto Crudo
B
B
0.000095
0.000023
0.00305
0.00076
0.00038
0.024
0.024
0.006
0.00038
0.000095
0.000095
0.000023
0.000023
Neem FP
0.0061
0.1953
0.000047
0.781
0.0122
0.000023
0.000047
0.1953
0.00038
1.5625
1.5625
0.000023
0.000047
Neem 80-100 sb
B
0.1953
0.1953
12.5
1.562
25
50
12.5
25
12.5
12.5
0.781
0.3906
1.562
Tabla 15. Tabla comparativa de Especificidad a Carbohidrato en Extracto Crudo,

Fraccin Proteica y Neem 80-100 sb. Como se puede observar el Neem presenta
una alta especificidad para una variedad de carbohidratos, que varan entre los
diferentes pasos de purificacin.
37
VIII Discusin
Azadirachta indica comnmente conocida como Neem, elabora un
vasto arreglo de fotoqumicos bioactivos que exhiben potentes propiedades
medicinales. Aunque todas las partes del rbol del Neem son reconocidas
por que confieren beneficios a la salud, las utilidades medicinales de la hoja
del Neem es el de ms amplio rango e incluye efectos de
inmunomodulacin, antiinflamatorios, antioxidantes, antimutagnico y
antineoplsicos (Harish y col., 2008).
El presente trabajo de investigacin se dio a la tarea de identificar
protenas con carcter hemaglutinante mejor conocidas como Lectinas en
las hojas del rbol del neem a partir de su extracto crudo y hasta donde
sabemos este estudio representa el primer estudio de lectinas en el rbol del
neem.
Para determinar si los extractos obtenidos de las hojas del Neem
presentaban lectinas se realizo una prueba de hemaglutinacin utilizando los
cuatro grupos sanguneos, para comprobar la presencia de lectinas en el
neem, para lo cual se utilizaron hojas del rbol del Neem recolectadas en
Acapulco, en el estado de Guerrero. El ensayo arrojo como resultado una
actividad hemaglutinante con todos los tipos sanguneos que representa la
presencia de lectinas.
Al corroborar los resultados obtenidos con el extracto crudo se
observ que la fraccin proteica presenta actividad hemaglutinante con
todos los grupos sanguneos y que la mayor actividad se observ con los
grupos sanguneos B y O. Lo que claramente indica que las hojas del Neem
poseen una mezcla de lectinas.
Para poder identificar las afinidades y proporciones de esta mezcla de
lectinas, se procedi a realizar una precipitacin fraccionada utilizando
sulfato de amonio con intervalos de 0 a 100%.
En el primer intervalo de concentracin salina (0-20%), los resultados
mostraron que la mayor actividad se obtuvo con el grupo sanguneo O en
comparacin con los otros grupos. Debido a que en este intervalo precipitan
las protenas con mayor peso molecular, con este ensayo se concluye las
protenas que tienen mayor peso molecular en los extractos del Neem tienen
afinidad por Fuc Gal.
La separacin de protenas en base a su peso molecular se evidenci
al utilizar un intervalo de concentraciones de sulfato de amonio mayor (2040%) ya que la mayor actividad se obtuvo al utilizar el grupo sanguneo A2
(GalNAc-Gal-Fuc). Este mismo resultado fue evidente en el intervalo de 4060%.
A partir de las concentraciones de 60-80% hasta 80-100% se observ
que la afinidad vario, ya que la mayor actividad se obtuvo al utilizar los
grupos sanguneos B y O. Siendo significativamente mayor para el grupo B,
38
por lo que la afinidad de las protenas contenidas en estos intervalos (mas

pequeas) es para Gal-Gal-Fuc.
Por otro lado, la especificidad a carbohidrato se llevo a cabo con el
grupo sanguneo B, ya que como se observa en los resultados, fue el grupo
sanguneo ms afn. Cabe mencionar que la especificidad para
carbohidratos se llevo a cabo con los carbohidratos encontrados
habitualmente en las lectinas de plantas (Hernndez y col., 2005).
Para estudiar las afinidades de las lectinas presentes en los
diferentes intervalos se realiz un ensayo utilizando diferentes
carbohidratos.
La especificidad para carbohidratos (Tabla 15), mostr que el extracto
crudo se observ una alta especificidad para todos los carbohidratos, en la
fraccin proteica, que se encuentra enriquecida (mayores concentraciones
proteicas utilizadas) se observaron diferencias ya que la sensibilidad se
increment para Manosa, cido silico y fucosa, estos carbohidratos se
localizan en diferentes tejidos de vertebrados y de microorganismos, por lo
que concuerda perfectamente con las acciones reportadas en la literatura,
ya que los efectos benficos del Neem se correlacionan por un lado en el
reconocimiento lectina-carbohidrato ya que al reconocer de manera
especfica a las lectinas y carbohidratos de tejidos (como clulas malignas o
modificadas) o microorganismos. Al realizar el anlisis con la concentracin
80-100% sb se obtuvo que la mayor sensibilidad es para Gal, GalNAc, lo
que concuerda perfectamente con los resultados obtenidos teniendo la
mayor actividad con el grupo sanguneo B.
Un punto importante en este trabajo de investigacin es sealar que
las acciones farmacolgicas antes mencionadas se encuentran relacionadas
con las lectinas. Ya que en recientes reportes cientficos revelan la
participacin
de
glicoprotenas
del Neem
implicadas
en
la
inmunomodulacin, metstasis y otros sucesos relacionados con el
desarrollo del cncer, sin que estas se hayan aislado hasta el momento.
Este trabajo de investigacin constituye el primer reporte donde se
investiga la presencia de lectinas del Neem, se puede correlacionar
perfectamente con los reportes de actividades farmacolgicas
anticancergenas donde se ha reportado que es una glicoprotena, sin
describir sus caractersticas, por lo que es factible proponer que estas
lectinas son las responsables de estas actividades.
39
IX CONCLUSIONES
Se comprob la presencia de Lectinas en el extracto del Neem.
El extracto crudo presenta actividad hemaglutinante con afinidades
para GalNAc-Gal-Fuc, Gal-Gal-Fuc y Gal-Fuc y contiene una mayor
proporcin de lectinas para Gal-Gal-Fuc (grupo sanguneo B).
En la fraccin 0-20% la mayor actividad fue del grupo sanguneo O.
lectinas de mayor peso molecular con afinidad por Fuc-Gal.
En la fraccin 20-40% la mayor afinidad fue para A2, as como de la
fraccin 40-60% con afinidad a GalNAc-Gal-Fuc.
En la fraccin 60-80%, as como 80-100% tuvieron las lectinas mayor
afinidad por el grupo B, lo que corresponde a Gal-Gal-Fuc.
La afinidad para los diferentes carbohidratos analizados demuestra la
diversidad de componentes, esto es la presencia de ms de una
lectina.
El ensayo de especificidad para carbohidrato de extracto crudo es:
GalNAc, Lac, Ac. Silico > Gal, Sac, Rib, > Glu, GluNAc, Xyl > Gal
Acet > Fructosa > Fucosa, Man > Con A.
El ensayo de especificidad para carbohidrato de fraccin proteica es:
Fuc, Lac > Gal acet, Man, Ac.silico > Xyl > Gal > GluNAc > Fruct,
GalNAc > Glu > Sac, Rib.
Hasta donde sabemos, este constituye el primer estudio de Lectinas
en Neem.
40
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43

ACTIVIDADHEMAGLUTINANTEEIDENTIFICACIONDELECITINASENELARBOLDELNEEMAZADIRACHTAINDICA Desbloqueado PDF

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UNIVERSIDAD MICHOACANA DE SAN NICOLAS DE HIDALGO

Actividad Hemaglutinante e Identificacin de Lectinas en el Arbol del Neem

PARA OBTENER EL TITULO DE:

MORELIA, MICHOACAN, MEXICO

Este trabajo se realiz bajo la

A Dios por haberme permitido realizar el sueo de haber terminado la carrera

A la D.C. Bertha Fenton por su incansable esfuerzo ya que con su apoyo y

A viri por su apoyo incondicional, siempre estando ah cuando necesito ayuda,

1. Funciones de las lectinas en los diversos organismos16

Inhibicin: Accin y resultado de inhibir o inhibirse. Componente de los

Protenas: Cualquiera de las numerosas sustancias qumicas formadas por

1.1 Descripcin del Neem

las temporadas del ao, pero en condiciones severas se deshoja, incluso

neutralizar la acidez en el suelo. El neem no puede permanecer en suelos

1.2 Usos en la Medicina Tradicional

1.3 Composicin Bioqumica

De entre los ms estudiados del Neem se encuentran los siguientes:

Figura. 1.- Azadiractina (Shultz y col, 1992).

Meliantriol: Aislado por primera vez en 1967, es una molcula igualmente

Figura. 2.-Meliatrol (Shultz y col., 1992).

Salanina: Tercer principio activo en importancia, cuya actividad se explica

Figura. 3.- Salanina (Shultz y col, 1992).

Figura. 4.- Nimbin y Nimbidin (Shultz y col, 1992).

1.4 Acciones Farmacolgicas del Neem

En estudios recientes se report que el nimbolide un liminoide del

Se prob el uso de un adyuvante inmune en el aumento de la

CEA. Donde el anticuerpo anti-NLGP puede reaccionar eficientemente con

Por otro lado, otro estudio informo que el pre-tratamiento de saliva e

descubridor de los grupos sanguneos humanos :A, B y O (Sharon y Lis,

En 1980 el nmero de lectinas purificadas de animales comenz a

Figura 5.-Interacciones Carbohidrato-Lectina sobre la superficie celular en

Tabla 1.- Funciones de lectinas en los diversos organismos (Sharon y Lis,

Regulacin del crecimiento celular, apoptosis, ciclo celular,

Macrfagos Receptores de Manosa

Inmunidad innata, eliminacin de hormonas glicoproteicas

Un descubrimiento clave se hizo en 1979, cuando se demostr que la

abordar los procesos biolgicos y patolgicos en que estas participan

Figura. 6.- Lectinas de la superficie regulan la adhesin celular por la unin

La expresin de galectinas (lectinas de animales) en el organismo

2.7 Lectinas de plantas

estructuralmente similares, aunque pueden tener diferentes caractersticas

2.8 Usos de las lectinas de plantas

2.9 Funciones de las lectinas en plantas

Tabla 3. Algunas posibles funciones naturales de las lectinas en plantas

organelos o molculas), con masas o densidades diferentes, se

3.4 Precipitacin salina

Afinidad para carbohidratos

Actividad Especifica (UHA/(mg/mL))

En la Figura 7, se muestra la actividad especfica del extracto crudo. Se

De esta manera se comprob la presencia de lectinas, por lo que se

concentracin inicial de hojas y adems de remover los pigmentos y otros

Tabla 5. Actividad de la Fraccin Proteica. Se observa actividad con los cuatro

Actividad Espcifica (UHA/(mg/mL))

En la figura 8, esquematiza la actividad especfica de la fraccin proteica

Figura 8. Actividad especifica de la fraccin proteica. Los resultados representan la

Habiendo corroborado los resultados obtenidos en el extracto crudo, se

Concentracin de 0-20% de (NH4)2 SO4

Tabla 6. Precipitacin Fraccionada para concentracin 0-20%. Se observa

En la figura 9 se observa la Actividad Especfica del intervalo de

Actividad Especifica (UHA/(mg/ml))

Figura 9. Actividad Especfica 0-20%. Los resultados representan la media DE

Concentracin de 20-40% de (NH4)2 SO4