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THSE DE DOCTORAT
Prsente par
Ibtissam EL-HILALI
Discipline : Biologie
Spcialit : Microbiologie et Biologie Molculaire
LA SYMBIOSE RHIZOBIUM-LUPIN :
BIODIVERSIT DES MICROSYMBIOTES
ET MISE EN EVIDENCE DUNE MULTI-INFECTION
NODULAIRE chez LUPINUS LUTEUS
Soutenue le 25 / 03 / 2006
Devant le jury :
Mr. Abdelkarim FILALI-MALTOUF
Prsident
Examinateurs
Ibtissam EL-HILALI
Discipline : Biologie
Spcialit : Microbiologie et Biologie Molculaire
UFR : SV 02/98
Responsable de lUFR : Professeur Abdelkarim Filali Maltouf
Priode daccrditation : 1998/2006
Titre de la thse : La symbiose Rhizobium Lupin : Biodiversit des
Microsymbiotes et mise en vidence dune Multi-Infection Nodulaire chez Lupinus
luteus
RESUME
Ce travail a t ralis afin dvaluer la diversit gntique et phnotypique qui existe au
sein dune collection de cent cinquante neuf symbiotes isols partir des nodosits de six
espces de lupin issues de diffrentes rgions du Maroc.
La PCR/REP a rvl un grand niveau de polymorphisme molculaire entre les isolats.
Cette technique nous a permis de mettre en vidence la possibilit dune infection multiple
chez Lupinus luteus.
Toutes les souches sont infectives vis--vis de L. luteus. Lefficience relative, comprise
entre 60% et 80%, sest rvle plus importante avec les symbiotes isols des espces
sauvages.
La croissance rapide des souches ainsi que lassimilation des substrats carbons a rvl des
profils comparables ceux du Rhizobium. A loppos, elles se sont rvles, comme les
Bradyrhizobium, trs rsistantes aux mtaux lourds et aux antibiotiques.
Une large tolrance au NaCl, au pH et la temprature a t note pour lensemble de la
collection. La moiti des souches ont pu hydrolyser lure et rduire le nitrate.
LARDRA a rvl une grande diversit entre les souches et a confirm la distinction du
genre Bradyrhizobium.
Nous avons pu reprer, sur la base du potentiel fixateur dazote et la tolrance lalcalinit,
des candidats trs performants qui ont t utiliss pour des inoculations au champ.
N dordre : 2298
Ibtissam EL-HILALI
Pour lobtention du DOCTORAT
Spcialit : Microbiologie et Biologie Molculaire
LA SYMBIOSE RHIZOBIUM-LUPIN :
BIODIVERSIT DES MICROSYMBIOTES
ET MISE EN EVIDENCE DUNE MULTI-INFECTION
NODULAIRE chez LUPINUS LUTEUS
Soutenue le 25 / 03 / 2006
Devant la commission dexamen :
Mr. Abdelkarim FILALI-MALTOUF
Prsident
Examinateurs
PREAMBULE
Le travail prsent ici a t ralis dans le laboratoire de Microbiologie et Biologie
Molculaire la Facult des Sciences, Universit Mohammed V - Agdal Rabat, en
collaboration avec lunit de recherche Amlioration, Conservation et Valorisation
des Ressources Gntiques lINRA de Rabat.
Ce travail a bnfici du soutien financier dans le cadre du :
- Projet PROTARS N P5T2/13 (Valorisation de le culture du lupin dans les
sols calco-alcalins du Maroc par lexploitation du potentiel fixateur dazote de
la symbiose Bradyrhizobium lupin).
- Projet AIRE dveloppement/I.R.D. 01-2-MAR-28-1.
Il a t prim lors de manifestations scientifiques nationale et internationale.
Publications
EL HILALI I., BRHADA F., THAMI ALAMI I. AND FILALI-MALTOUF A. 2003.
Characterization of Lupinus rhizobia isolated from Moroccan soils. In Lupin-high protein plant of
XXI century, Sciences Academy of Wroclaw, Pologne N 495.
Communications orales
EL HILALI I., BRHADA F., THAMI ALAMI I. AND FILALI-MALTOUF A. Analyse
physiologique et molculaire des symbiotes du lupin. 3me Congrs National de Biologie et
Biologie Molculaire. Tanger, Maroc, 18-20 Dcembre 2003.
EL HILALI I., BRHADA F., THAMI ALAMI I. AND FILALI-MALTOUF A.
Caractrisation phnotypique et molculaire des rhizobia nodulant le lupin au Maroc. 1re
Rencontre du Ple de Comptence MiSoBioP. Fs, Maroc, 10-11 Dcembre 2004.
A lchelle nationale
Prix reus
Prix du meilleur poster. 5th European Nitrogen Fixation Congress. Norwich, Angleterre, 6 - 10
Septembre 2002.
Prix du meilleur poster et de communication orale. 3me Congrs National de Biologie et
Biologie Molculaire. Tanger, Maroc, 18 - 20 Dcembre 2003.
AVANT-PROPOS
Les travaux prsents dans cette thse ont t raliss dans le Laboratoire de Microbiologie et
Biologie Molculaire la Facult des Sciences, Universit Mohammed V - Agdal Rabat.
Au terme de ce travail, jaimerai exprimer mon profond remerciement mon professeur Fatiha
Brhada, Professeur la Facult des sciences de Rabat, pour le grand honneur quelle ma fait en
acceptant de diriger ce travail, pour ses recommandations et ses discussions perspicaces ainsi que
pour ses conseils qui ont beaucoup enrichi non seulement ma recherche au sein du laboratoire
mais galement diffrents aspects de ma vie.
Mon apprciation et ma gratitude vont aussi mon professeur Abdelkarim Filali-Maltouf, Chef
du Laboratoire de Microbiologie et Biologie Molculaire la Facult des sciences de Rabat,
pour avoir accept de prsider ce jury mais surtout pour mavoir accept au sein de son
laboratoire, pour avoir cru en moi, pour ses encouragements et pour son implication et les
conseils scientifiques quil ma accords.
Ma gratitude va Mme Imane Thami-Alami, Directeur de recherche et Chef du Centre Rgional
de la Recherche Agronomique Rabat, pour avoir accept de juger ce travail, pour ces vifs
encouragements et pour son amiti.
Ma gratitude va Mr Chaouki El Faiz, Directeur de recherche et Coordinateur de lUnit de
Recherche Amlioration, Conservation et Valorisation des Ressources Gntiques lInstitut
National de Recherche Agronomique de Rabat, pour avoir accept de participer au jury de cette
thse et pour son amabilit.
Je suis trs reconnaissante Mr Bernard Dreyfus, Directeur de recherche (DR 1) et Directeur
dUMR lInstitut National de Recherche pour le Dveloppement (IRD) Montpellier, France,
pour avoir accept aimablement de juger ce travail et de participer au jury de cette thse.
Je tiens remercier galement les professeurs El Bekkay Berraho, Jamal Aurag, Bouchra
Belkadi, Ilham Bouhmouch et Jamila Matallah pour leur sympathie et leurs encouragements,
ainsi que toutes les amies au sein du laboratoire LMBM et toutes celles que jy ai rencontr :
Najlae Elafi, Farah Ait Ouhmane, Salwa Moussaid, Loubna Temsamani, Nargisse Bennani,
Siham Brhada, Bouchra Mouhcine, Nezha Mlaiji, Amina Sorouri, Laila Medraoui, Leila Sbabou
et Fatiha El Maghi.
Je remercie galement tous (es) les amis (es) que jai rencontr lINRA de Rabat et au
CNESTEN.
Mes vifs remerciements reviennent Jamaleddine El Jamali et Ibrahim Konat pour tre de trs
bons amis et pour avoir t l chaque fois que javais besoin deux.
Mes trs spciaux remerciements reviennent mes trs chres amies : Lamiae Filali, Amal
Berkia, Amine Bradley et Emane Michle Majdoline pour tous les moments partags ensemble,
pour leurs soutien et leurs mots encourageants et pour leur amiti sincre.
Finalement, mon plus grand merci revient ma mre Amina Jad et mon pre Houssine El Hilali
et toute ma grande famille pour le pouvoir de leur amour sur moi, pour tre leur fiert, et pour
me faire sentir dtre si spciale pour eux.
Acide deoxyribonuclique
Amplified fragment length polymorphism
Arbitrarily primed PCR
Amplified ribosomal DNA restriction analysis
ARN de transfert
Srum Albumine Bovine
Bleu de bromothymol
Biovar
Capacit dchange cationique
DNA amplification fingerprinting
Dsoxyribonuclotides triphosphate
Densit optique
Acide thylnediaminottraactique
Exopolysaccharides
Efficience relative
Enteric Repetitive Intergenic Consensus
Fatty Acid Methyl Electrophoresis
Guanine + Cytosine
Acide sulfurique
Acide chlorhydrique
Chlorure mercurique
Gnes de la spcificit de lhte
Espace intergnique
Institut Technique des Crales et des Fourrages
Espace intergnique transcrit
Oxyde de potassium
Chlorure de potassium
Nitrate de potassium
oligosaccharide de Lipo-chitine
Lipopolysaccharide
Grande sous unit
Molaire
2- (N-morpholino)-ethanesulfonic acid
Chlorure de Magnsium
Minutes
Multilocus enzyme electrophoresis
Millimtre centimtre mtre
Matire organique
Nitrogne
Chlorure de sodium
Hydroxyde de sodium
Nitrate
Gnes de nodulation
Super oxyde de phosphore
pb
PCR
PFGE
ppm
pSym
RAPD
REP
RFLP
RNA
SDS
SDS-PAGE
SSU
TBE
TY
UPGMA
USDA
v/v
w/v
YEM
Paire de base
Raction en chane par polymrase
Pulsed field gel electrophoresis
Partie pour millions
Plasmide symbiotique
ADN amplifi de manire alatoire
Squence rptitive extragnique palindromique
Polymorphisme de la longueur des fragments de restriction
Acide ribonuclique
Sodium Dodecyl Sulfate
Sodium Dodecyl Sulfate- Polyacrilamide gel electrophoresis
Petite sous unit
Tris Acide borique EDTA
Tryptone Yeast Extract
Unweight Pair Group Method with Arithmetic mean
United States Department of Agriculture
Volume par volume
Poids par volume
Yeast Extract Mannitol
Figure 2 :
Figure 3 :
Figure 4 :
Figure 5 :
58
Figure 6 :
69
Figure 7 :
Figure 8 :
Figure 9 :
74
86
Figure 15 : Efficience relative des souches nodulant le lupin value huit semaines 86
aprs linoculation des plantes
Figure 16 : Croissance des souches nodulant le lupin value dans le milieu YEM
91
102
Figure 20 : Effet des mtaux lourds sur la croissance des souches nodulant le lupin
108
112
119
122
Figure 24 : Phnogramme indiquant les similarits phnotypiques entre les souches 127
nodulant le lupin issues de diffrentes rgions du Maroc sur la base de
lanalyse numrique
Figure 25 : Profil de la bande de lADNr 16S de quelques souches nodulant le lupin
138
47
Tableau 2 :
58
Tableau 3 :
59
Tableau 4 :
Tableau 5 :
Nombre des isolats obtenus partir de chaque espce de lupin selon les 63
prospections menes par lINRA de Rabat
Tableau 6 :
Tableau 7 :
Tableau 8 :
Tableau 9 :
Tableau 10:
Tableau 11 :
Tableau 12 :
Tableau 13 :
Tableau 14 :
Tableau 15 :
Tableau 16 :
Tableau 17 :
93
106
123
132
Tableau 18 :
Tableau 19 :
Tableau 20 :
Tableau 21 :
190
Annexe 2 :
191
Annexe 3 :
Coloration de Gram
191
Annexe 4 :
Composition du milieu TY
192
Annexe 5 :
192
Annexe 6 :
Composition du tampon TE
192
Annexe 7 :
193
Annexe 8 :
193
Annexe 9 :
193
Annexe 10 :
194
Annexe 11 :
194
Annexe 12 :
195
Annexe 13 :
Annexe 14 :
202
RESUME
Ce travail a t ralis afin dvaluer la diversit gntique et phnotypique qui existe au sein
dune collection de cent cinquante neuf symbiotes isols partir des nodosits de six espces de
lupin issues de diffrentes rgions du Maroc.
La PCR/REP a rvl un grand niveau de polymorphisme molculaire entre les isolats. Cette
technique nous a permis de mettre en vidence la possibilit dune infection multiple chez
Lupinus luteus.
Toutes les souches sont infectives vis--vis de L. luteus. Lefficience relative, comprise entre
60% et 80%, sest rvle plus importante avec les symbiotes isols des espces sauvages.
La croissance rapide des souches ainsi que lassimilation des substrats carbons a rvl des
profils comparables ceux du Rhizobium. A loppos, elles se sont rvles, comme les
Bradyrhizobium, trs rsistantes aux mtaux lourds et aux antibiotiques.
Une large tolrance au NaCl, au pH et la temprature a t note pour lensemble de la
collection. La moiti des souches ont pu hydrolyser lure et rduire le nitrate.
LARDRA a rvl une grande diversit entre les souches et a confirm la distinction du genre
Bradyrhizobium.
Nous avons pu reprer, sur la base du potentiel fixateur dazote et la tolrance lalcalinit, des
candidats trs performants qui ont t utiliss pour des inoculations au champ.
Mots cls: Lupinus rhizobium Biodiversit REP ARDRA
SUMMARY
This study was made to assess the genetical and phenotypical diversity of one hundred and fifty
nine symbiotes isolated from six Lupinus species harvested in different geographical regions of
Morocco.
The REP/PCR method revealed a high polymorphism among the isolates. It helped to identify a
multiple infection process of Lupinus luteus.
Symbiotic data indicated that all strains were infective with L. luteus. Relative efficiency ranging
between 60% and 80% was higher with symbiotes isolated from the wild species.
The fast growth rate of the strains and their carbohydrates assimilation results showed profiles
similar to those of Rhizobium. However, they were highly resistant to heavy metals and
antibiotics like Bradyrhizobium.
The whole bacterial collection showed a wide range of tolerance to NaCl, pH and temperature.
Half of the strains were scored to have a positive reaction for urea hydrolysis and nitrate
reduction.
ARDRA analyses indicated a great diversity among the strains and confirmed that they were
distinct from the genus Bradyrhizobium.
We were able, on the basis of the nitrogen fixing potential and the tolerance to alkalinity, to
recover useful candidates for field inoculations.
Keywords: Lupinus rhizobium Biodiversity REP ARDRA
Sommaire
SOMMAIRE
INTRODUCTION GENERALE
12
16
16
16
2. 1. 2- Le lupin au Maroc
18
2. 1. 2. 1- Caractristiques botaniques
18
2. 1. 2. 2- Ecologie
18
2. 1. 2. 3- Exploitation
19
20
21
22
22
3. 1. 1. 1 - La croissance
22
23
24
3. 1. 1. 4 - Tolrance la salinit
25
3. 1. 1. 5 - Tolrance au pH
26
3. 1. 1. 6 - Tolrance la temprature
27
28
Sommaire
2
.
29
30
30
30
31
31
32
32
33
35
35
35
3. 1. 2. 9 - Le squenage
36
37
3. 1. 2. 11 - Les plasmides
37
3. 1. 3 - Autres marqueurs
38
38
38
39
3. 1. 3. 4 - La srologie
39
3. 1. 4 Etude polyphasique
40
40
40
43
46
4. 3. 1 Allorhizobium
46
Sommaire
3
.
4. 3. 2 Azorhizobium
46
4. 3. 3 Bradyrhizobium
49
4. 3. 4 Msorhizobium
50
4. 3. 5 Rhizobium
51
4. 3. 6 Sinorhizobium
52
53
54
56
57
57
61
61
64
64
65
65
66
66
66
67
68
Sommaire
4
.
3. 2 Rsultats et discussion
68
3. 2. 1 Qualit de lADN
68
68
72
78
2 - MATERIELS ET METHODES
79
79
80
80
80
2. 5 Hydrolyse de lure
81
2. 6 Rduction du nitrate
81
81
82
2. 9 Tolrance la salinit
82
2. 10 Tolrance au pH
82
2. 11 Tolrance la temprature
84
84
3 Rsultats et discussion
84
3. 1 Caractrisation Symbiotique
84
90
92
96
Sommaire
5
.
100
101
105
3. 8 Tolrance la salinit
111
3. 9 Tolrance au pH
117
3. 10 Tolrance la temprature
120
3. 11 Analyse numrique
124
131
2 - MATERIELS ET METHODES
133
133
133
134
136
3 RESULTATS
137
137
137
142
146
4 DISCUSSION
151
153
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
158
ANNEXES
190
INTRODUCTION
GENERALE
Introduction gnrale
6
.
Introduction gnrale
7
.
Sur le plan pratique, la slection dun couple plante hte et son rhizobium appropri dpend
galement du milieu daphique. Ce dernier subit une srie dirrgularits selon lintensit et la
nature des cultures, lenvironnement gographique et les conditions du sol. Les contraintes
environnementales les plus importantes sont les suivantes : la salinit, les pH extrmes, le
taux de nitrate dans le sol et lhumidit insuffisante ou excessive du sol.
Dautres facteurs peuvent influencer la fixation symbiotique dune faon bien marque telles
que les composantes biotiques du milieu (biocide, photosynthse inadquate de la plante
hte), la pression humaine (augmentation de la charge ionique des sols par lapport dengrais
dans les systmes dagriculture intense) et les facteurs climatiques. Il savre donc ncessaire
dvaluer les facteurs environnementaux afin que le couple symbiotique slectionn possde
les aptitudes ncessaires qui lui permettent de stablir dans un type de sol donn et de
rpondre aux exigences dfinies.
Des facteurs climatiques dfavorables, une utilisation intensive des terres ainsi que des
pratiques agricoles inadquates peuvent aboutir la dgradation des cosystmes naturels et
laccroissement des terres marginales. Les associations rhizobiumslgumineuses ont une
application potentielle dans la restauration des terres dgrades en rgnrant et en maintenant
leur fertilit. De ce fait et pour limiter galement lrosion gntique massive dun certain
nombre despces et/ou dcotypes, des stratgies de protection des plantes spontanes et des
bactries associes doivent tre entreprises via des programmes de conservation in- et ex situ. Lexploitation de la diversit naturelle des lgumineuses et la constitution de collections
de souches de rhizobia indignes pourraient donc contribuer la revalorisation de la culture
de ces lgumineuses et la rinstallation par la suite du couvert vgtal sur des sols dgrads.
Les lupins sont des lgumineuses fourragres utilises communment comme engrais vert
naturel. Ils sont galement utiliss pour lalimentation humaine et animale. En fait, les lupins
possdent un taux lev en protines de lordre de 40% contre 36% pour le soja (Guillemand,
1999). Les plantes ainsi que les graines sont dune grande richesse en matires azotes. La
teneur en matires azotes digestibles (MAD) de lupin est value 299g par kilogramme de
matire sche de plantes et la teneur en matires azotes totales (MAT) est value 340g/Kg
(Pointereau, 2001). Les lupins jouent aussi un rle important dans lamlioration de la fertilit
du sol. Le potentiel de fixation dazote valu pour L. luteus varie de 145 208 kg ha-1 anne1
et le taux dazote rsiduel dans le sol aprs la culture est valu entre 40 75 kg ha-1 anne-1
(Annon.).
Introduction gnrale
8
.
Il a t rapport que la culture du lupin fut introduite au Maroc vers les annes trente (Foury,
1954). Cependant, ce nest que rcemment que des tudes prcises ont t tablies pour
valuer la biodiversit des diffrents cotypes spontans ou introduits (Thami Alami et
Bounejmate, 1997 ; El Mzouri et Thami Alami, 2000 ; Thami Alami et al., 2004). Cette
biodiversit est dautant plus importante que les ressources naturelles sont indispensables pour
lamlioration potentielle des plantes cultives. Cependant, ltude de la biodiversit des
populations des micro-organismes symbiotiques autochtones reste ncessaire pour toute
slection de couples symbiotiques performants ou de leur introduction dans un nouvel
environnement.
La prsente tude porte en priorit sur lvaluation de la biodiversit des micro-organismes
symbiotiques nodulant les lupins au Maroc. Le programme fait partie dun projet de
coopration technique entre la facult des sciences et lINRA de Rabat. Lobjectif du projet
consiste en la conservation des diffrentes espces de lupin rencontres au Maroc via le
stockage des semences et des bactries fixatrices dazote existant au niveau des nodosits
racinaires et dans la rhizosphre, ltude de la biodiversit des deux partenaires symbiotiques
et la slection de souches bactriennes et de plantes adaptes aux conditions
environnementales prdominantes dans les rgions "candidates" pour sa culture.
Ainsi, dans le cadre du travail relatif ce mmoire, nous nous sommes fixs les objectifs
suivants :
- La prospection de diffrents sites localiss dans les aires de rpartition gographique des
diffrentes espces de lupin existantes au Maroc, et ralisation de collecte de plantes nodules
afin de pouvoir constituer une collection de symbiontes indignes nodulant le lupin.
- La caractrisation molculaire et phnotypique des souches de la collection afin dvaluer
leur diversit gntique et fonctionnelle en prenant en compte lhtrognit entre les
espces et les variations lies aux diffrents types de sol et en vue de slectionner les souches
les plus performantes pour des applications potentielles.
- Lvaluation de la position taxonomique et caractrisation phylogntique des diffrentes
souches de la collection.
CHAPITRE I
REVUE
BIBLIOGRAPHIQUE
Revue bibliographique
.9
Revue bibliographique
. 10
molculaire et sont donc facilement dcomposables par les micro-organismes. Cela conduit
lexistence dune grande population microbienne autour de la racine. Dautres composs
trouvs dans les exsudats racinaires exercent des pressions slectives sur la communaut
microbienne. Les (iso) flavonoides, stachydrines et acides aldoniques sont les plus importants
de point de vue symbiotique (Ara Begum et al., 2001). Ils constituent les premiers signaux de
lhte qui dclenchent chez la bactrie lexpression du gne de rgulation de la nodulation
nod D et induisent le mcanisme du chimiotactisme des rhizobiums (Petes et Verma, 1990).
Une lgumineuse peut scrter diffrents (iso) flavonoides. De mme, la prsence de plus
dun gne de nod D a t rapporte (cas de S. meliloti et R. leguminosarum) (Davis et
Johnston, 1990).
Dautres molcules originaires de la plante telles que les lectines jouent un rle important
dans le processus de linfection. Les proprits et la squence en acides amins dune lectine
isole chez la lgumineuse Dolichos biflorus (Etzler et al., 1999) ont montr quil sagit dune
metalloprotine qui prsente une grande affinit pour le facteur Nod. Diffrents analogues de
cette lectine sont connus pour stimuler ladsorption des rhizobiums (Lodeiro et al., 2000). Ils
constituent de ce fait une entit spcifique parmi les rcepteurs oprationnels au niveau
membranaire (Bhagwat et al., 1996, Hirsch, 1999).
Les gnes de rhizobium essentiels pour linfection et la nodulation incluent les gnes nod
(nod, nol, noe), les gnes hsn (gnes de nodulation spcifique de lhte) et dautres gnes qui
codent pour lexpression et la synthse des molcules de structure de la surface bactrienne
tels que les gnes ndv responsables de la synthse des -glucans, les gnes exo responsables
de la synthse des exopolysaccharides, et les gnes lps responsables de la synthse des
lipopolysaccharides (Broughton et al., 2000 ; Spaink, 2000, 1999).
En ce qui concerne les gnes de nodulation, les gnes nod ne sont exprims que par laction
dun activateur de transcription, le Nod D. Le gne nod D est exprim de manire constitutive
(Geurts et Bisseling, 2002), il est activ par des molcules produites par les plantes telles que
les flavonoides (Spaink, 1987 ; Zuanazzi et al., 1998). Les gnes nod ABCIJ sont des gnes
communs trs conservs chez les diffrentes espces de rhizobia.
Les facteurs Nod sont des lipo-chito-oligosaccharides (LCOs) produits par les diffrents
gnes nod, nol et noe. Les LCOs sont forms par 3 5 rsidus N-actyl-glucosamine lis en
configuration ,1-4. Un acide gras est li la partie non rductrice du sucre terminal. La
Revue bibliographique
. 11
longueur et la saturation de la chane de lacide gras ainsi que les diffrents substituants
greffs sur le squelette du LCO jouent un rle crucial dans la spcificit entre la bactrie et la
plante (Perret et al., 2000).
Les facteurs Nod chez Azorhizobium et Sinorhizobium sont trs similaires (Lorquin et al.,
1997), cela suggre lacquisition des gnes qui dterminent la structure des LCOs par transfert
latral (Suominen, 2000). La plupart des gnes symbiotiques sont localiss sur de grands
plasmides. Cet emplacement renforce lide que ces gnes ont la possibilit dtre transfrs
horizontalement. Bien que les grands plasmides ne soient pas transmissibles, ils sont en
rapport avec dautres plasmides trs transmissibles (Hirsch et al., 2001). Le mcanisme de
lexcision et de lintgration de ces rgions dans le chromosome bactrien a t galement
dmontr (Sullivan et Ronson, 1998).
En ce qui concerne les composants de la surface cellulaire cods par les gnes ndv, exo et lps
on trouve les -glucans, les exopolysaccharides et les lipopolysaccharides qui sont considrs
comme dimportants facteurs dans lefficacit symbiotique (Breedveld et Miller, 1998),
Les -glucans sont majoritairement des molcules du priplasme qui permettent la croissance
des bactries sous des conditions hypoosmotiques (Pfeffer et al., 1994). Ils ont galement un
rle spcifique dans linteraction symbiotique (Breedveld et Miller, 1998). Daprs Bhagwat
et al. (1996), ces molcules jouent un rle important dans la suppression du dclenchement du
mcanisme de dfense par les phytoalexines chez lhte.
Les exopolysaccharides (EPS) sont forms par des units rptitives de sucres avec une
chane latrale substitutions variables. Deux EPS sont connus, le EPS I de type
succinoglucan et le EPS II de type galactoglucan. Gonzalez et al. (1996) ont montr que ces
molcules fonctionnent comme des messagers pendant linfection.
Les lipopolysaccharides (LPS) sont forms par trois constituants (Forsberg et Carlson, 1998),
le lipide A, partie hydrophobe du LPS localise dans la partie externe de la double couche
membranaire, le core, un oligosaccharide dont la structure de base est similaire chez plusieurs
rhizobiums, et lantigne O, partie hydrophile qui constitue le composant le plus variable du
LPS (Niehaus et al., 1998). La prsence ou labsence de ce dernier composant engendre
respectivement lapparence de colonies bactriennes lisses S-LPS (smoot LPS) ou rugueuses
R-LPS (rough LPS) (Lerouge et al., 2001).
Revue bibliographique
. 12
Chez les rhizobia, les mutants dfectifs en la synthse ou faible production de LPS nont pas
la capacit dinduire la formation de cordons dinfection, perdent leur capacit comptitive ou
forment des nodosits incompltement dveloppes (Lagares et al., 1992). Il a t rcemment
dcouvert que les rhizobiums adaptent des structures diffrentes de LPS (composition en
sucres, type et degr de modifications par actylation et mthylation) en rponse aux
conditions de lenvironnement (Kannenberg et Carlson, 2001 ; Noel et al., 2000, Berkia,
2004).
Les associations entre la lgumineuse et le rhizobium sont gnralement slectives. Par
exemple, Sinorhizobium meliloti peut sassocier efficacement avec les genres Medicago,
Melilotus et Trigonella, alors que Bradyrhizobium japonicum ne nodule que Glycine max. A
loppos, ces associations peuvent tre moins strictes. Ainsi, la souche Sinorhizobium sp.
NGR 234 peut noduler 353 espces de lgumineuses appartenant 112 genres diffrents et
elle peut mme noduler une plante non lgumineuse, Parasponia andersonii (Pueppke et
Broughton, 1999).
Revue bibliographique
. 13
(Beringer et al., 1979). Dans ce processus de dveloppement, les bactries subissent des
changements morphologiques et physiologiques qui mnent la formation de bactroides
(Irigoyen et al., 1990).
La fixation de lazote atmosphrique est assure par la nitrognase. Mais, les bactroides ne
sont pas capables de fixer lazote tant que loxygne dsactive la nitrognase et bloque la
transcription du gne de cet enzyme. Ce dernier est alors protg par la leghemoglobine,
protine scrte par la plante et qui joue un rle dans le transport de loxygne en maintenant
une forte pression du O2 dans le cytoplasme des cellules racinaires de la plante pour la
phosphorylation oxydative et en fournissant un niveau bas soutenu doxygne aux bactroides
(Verma et Long, 1983). Latmosphre dans lenvironnent nodulaire tant alors favorable, la
nitrognase devient active et catalyse la rduction du N2 en NH4+.
La production de nodulines (tardives) est particulirement intressante au dveloppement
nodulaire. Elles activent entre autres, lexpression des gnes nif, fix, etc. qui codent pour la
synthse de diffrents enzymes de la fixation comme la nitrognase, luricase, le glutamate
dshydrognase, la glutamine synthtase, etc. Ainsi, le N2 fix est converti en glutamate,
glutamine, aspartate, asparagine etc. qui seront transports dans la sve du xylme de la plante
(figure 1). Une abondance de composs carbons est fournie en retour aux bactroides.
Le type de nodosit dveloppe est dtermin par la plante hte :
-
. 14
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N2
NH3
Glutamate
Asparagine
Glutamine
Aspartate
Glutamine
Oxaloglutarate
Glutamate
Xylem de la Plante
Aspartate
Oxaloacetate
Glutamate
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-
. 15
Deux autres types ont t signals chez Arachis hypogeae (Ndoye et al., 1994) et chez
Mimosa scabrella (de Faria et al., 1988). Pour ces espces, le mode dinfection est un cas
particulier. Les rhizobiums pntrent directement dans les cellules du cortex entre les
cellules pidermiques dans le premier cas et travers les jonctions des cellules
pidermiques dans le second cas.
Selon Corby (1988), le lupin est distingu par des nodosits dites de type lupinoid. Celles-ci
peuvent se dvelopper soit sur les racines latrales sous forme de nodosits individuelles,
arrondies et rugueuses, soit sur la racine principale sous forme de clusters de nodosits ou
damas nodulaires en forme de cne de pin. Chaque nodosit de lamas possde son propre
point dattachement au niveau de la racine et peut crotre par diffusion latrale couvrant ainsi
la surface de la racine existant tout autour de son point dattachement. La couche des cellules
corticales qui protgent la nodosit progresse et spaissie avec llargissement de la nodosit.
Les nodosits indtermines de type lupinoid caractrisent le genre Lupinus. Cependant,
lauteur a signal leur prsence galement chez le genre Lotononis.
Selon le mme auteur, les amas nodulaires chez le lupin peuvent tre trs volumineuses. La
taille dun amas peut atteindre un diamtre de 16 mm dans le cas de Lupinus mutabilis, voire
mme celle dune pomme de terre moyenne (Frank, 1980, cit par Corby, 1988).
La prsence dune autre forme de nodosit dite de type crotalaroid a t rapporte chez les
plantes de lupin (Erikson, 1873, cit par Corby, 1988). Ces nodosits possdent gnralement
une forme en ventail plus ou moins aplatie avec plusieurs lobes qui mergent partir dun
seul point dattachement au niveau de la racine et progressent par diffusion latrale des
mristmes apicales. Mais dans le cas du lupin, les diffrents lobes restent souds et
progressent par un moulage circulaire autour de la racine.
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. 16
2 SYMBIOSE LUPIN-RHIZOBIUM
2. 1 Aperu gnral sur la plante
2. 1. 1 - Taxonomie et caractristiques du genre Lupinus
Le genre Lupinus comprend plus de 300 espces (Cowling et al., 1998). Laire de rpartition
gographique de ces espces comprend la rgion mditerranenne, lAsie et le continent
amricain (Gladstones, 1998). Au sicle dernier, diffrentes espces de lupin ont t
introduites en Afrique du Sud ainsi quen Australie (Kass et Wink, 1997).
En 1974, Gladstones a propos une distinction taxonomique des lupins sur la base de laspect
des graines : un groupe despces graines rugueuses et un autre groupe graines lisses.
Les lupins ont t communment considrs comme des herbes annuelles, mais lexistence
despces vivaces, arbrisseaux et sous-arbrisseaux dans le continent amricain a permis la
rpartition des espces en 1984 en deux grands groupes gographiquement spars :
- Les espces du monde ancien, au nombre de douze espces, toutes annuelles et larges
graines (Plitman and Heyn, 1984).
- Les espces du nouveau monde qui stendent de lAlaska jusquen Argentine et qui
comprennent des plantes annuelles et vivaces petites graines (Dunn, 1984).
Dans la mme anne, il a t propos quune espce feuille simple originaire du Brsil
pourrait tre un anctre primitif des lupins, mais cette proposition a t rejete par Monteiro et
Gibbs (1986).
Une nouvelle espce : L. anatolicus a t rcemment propose par Swiecicki et al. (1996).
Toutefois, Clements et al. (1996) ont montr quil sagit dune nouvelle accession de L.
pilosus graines lisses.
La classification initiale du lupin subdivisait le genre en deux sous genre Eulupinus et
Platycarpos (Ascherson et Graebner, 1907). Jusqu nos jours, la rpartition tablie en 1984
est retenue, avec cependant une subdivision du genre en deux nouveaux sous genres : Le
premier est dorigine mditerranenne (Subgenus Lupinus) et le second est natif de
lAmrique (Subgenus Platycarpos) (Kurlovick et al., 1995 cit par Cowling et al., 1998).
. 17
Revue bibliographique
Parmi toutes les espces de lupin, quatre seulement sont actuellement cultives : L. luteus, L.
albus, L. angustifolius et L. mutabilis (Gladstones, 1998).
Les lupins sont classs de point de vue taxonomique dans le genre Lupinus, la tribu des
Gnistes, la sous Famille des Papilionaces, la famille des lgumineuses (ou Fabaceae),
lordre des Fabales (anciennement Rosales), la sous-classe des Rosidae, la classe des
Dicotyldones,
le
sous
embranchement
des
Angiospermes,
lembranchement
des
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. 18
2. 1. 2 - Le lupin au Maroc
2. 1. 2. 1 - Caractristiques botaniques
Le genre lupinus est reprsent au Maroc par six espces : L. luteus, L. albus, L. angustifolius,
L. atlanticus et L. cosentinii. Toutes les espces sont annuelles avec un systme racinaire trs
robuste et une hauteur comprise entre 30 et 70 cm, cette dernire peut atteindre les 150 cm de
long dans le cas de L. albus. Les fleurs sont unicolores et la dure de vgtation est de
lordre de cent trente cent cinquante jours (Birouk, 1990 ; Gladstones, 1998).
2. 1. 2. 2 - Ecologie
Les lupins exigent des sols ars et se dveloppent mieux sur les sols grossiers ou
moyennement grossiers de texture sableuse ou de type terreux et peu fertiles. Ils sont ainsi
dnomms les plantes dor des sables . Au Maroc, ces plantes sont rencontres ltat
spontan principalement sur les terrains accidents secs, les falaises ou sur les sables ctiers.
La plupart des espces sont sensibles aux sels solubles. La temprature optimale de la
croissance est denviron 20 25C (Dracup, 1993).
La distribution spontane des six espces est variable et dpend principalement de laltitude,
la pluviomtrie et des caractristiques lies au sol telles que la nature de la roche mre et le
pH (Gladstones, 1973 ; 1980).
- L. luteus est adapte aux basses altitudes (< 500 m), aux terres sablonneuses acides et aux
pluviomtries variant de 300 1000 mm. Lespce est sensible au froid et la floraison est
influence par la photopriode.
- L. albus est adapte aux sites de basse altitude, aux sols sablonneux ou sablo - limoneux
acides ou voisins de la neutralit. Lespce existe dans des rgions pluviomtrie allant de
400 1200 mm.
- L. angustifolius est lespce la plus prcoce et la plus rsistante au froid. Laire de
rpartition est plus large. Elle abonde dans les zones littorales ainsi quen hautes altitudes
mais reste toutefois limite dans la rgion Nord du pays. Elle peut sinstaller sur des sols
pauvres et peu fertiles sous des pluviomtries comprises entre 100 et 1400 mm.
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. 19
- L. atlanticus qui est une espce endmique du Maroc, est adapte aux altitudes leves des
chanes de lAtlas, aux sols lourds et alcalins et aux pluviomtries variant de 100 700 mm.
- L. pilosus est adapte aux altitudes leves, aux sols alcalins texture fine et aux
peut rencontrer des populations isoles dans les chanes de lAtlas des altitudes denviron
1000 m et pluviomtrie abondante.
2. 1. 2. 3 - Exploitation
Au Maroc, deux espces sont actuellement exploites : L. albus ou le lupin blanc avec la
varit douce et prcoce Multolupa et L. luteus ou le lupin jaune avec une population
ancienne du Gharb. Ces espces sont principalement utilises comme fourrage, comme
engrais vert et pour la production des graines (Thami-Alami et Bounejmate, 1997).
Selon une tude tablie sur une vingtaine dannes dans la rgion du Gharb par lOffice
Rgional de la Mise en Valeur du Gharb (ORMVAG) (1999), on peut noter que la superficie
de la culture de lupin est passe dun chiffre de 120 ha en 1982/83 pour atteindre un
maximum de 3225 ha en 1991/92 puis 676 ha en 1997/98. Toutefois, la superficie note
pour 2000/2005 est de lordre de 4000 ha (MADR, 2005 DPV).
Le lupin est essentiellement exploit en culture dans la zone ctire du Gharb avec une
superficie de 700 ha, la rgion de Khmisset (500 ha), le Loukkos (464 ha), la rgion de
Rabat-Sal (250 ha) et enfin la rgion de Benslimane (12 ha) (DPV-DREF, 2000). Cependant,
la production du lupin au titre de la campagne 1999/2000 (DPV-DREF, 2000) ne dpassait
gure les 31.9 milliers de tonnes de matire verte. Selon lorganisation mondiale FAO (Food
& Agricultural Organization), la production marocaine en lupin pour la campagne 2003/2004
est de lordre de 14000 tonnes.
La rduction notable de la superficie de culture et de la production du lupin tait due au dficit
hydrique, au retard des pluies qua connu le pays durant les dernires annes, mais
essentiellement la non disponibilit des semences slectionnes et la politique qui
favorisait dautres cultures cralires et fourragres notamment la luzerne, le trfle
dAlexandrie et le mas fourrager.
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. 21
dinfection visualiss dans les racines du lupin est bien diffrente par rapport celle des
cordons dinfection chez une dizaine dautres espces de lgumineuses.
Sur le plan gntique, la caractrisation des rhizobia de lupin a t initialement rapporte par
Heumann (1979). De nombreux rhizobia indignes caractriss ont t attribus au genre
Bradyrhizobium (Jensen, 1967 ; Jordan, 1984 ; Legocki et al., 1997). Jusqu nos jours,
ltude de la diversit gntique des souches de lupin sest porte essentiellement sur
lanalyse du polymorphisme de la longueur des fragments de restriction du gne de lADNr
16S amplifi par PCR (Laguerre et al., 1994 ; 1997 ; Xu et al., 1995) et sur lanalyse de la
squence de ce gne (Scholla et al., 1990 ; Barrera et al., 1997).
Au Maroc, le lupin est spontanment nodul par des rhizobia dans son aire naturelle et dans
les sols o il a t introduit (Birouk, 1990). Trs peu dtudes ont t menes pour la
caractrisation du microsymbiote par rapport la plante hte (Guedira, 2002). Cependant,
aucune tude na t jusqu lors tablie pour tudier la diversit gntique des rhizobia
indignes.
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. 22
qu'ils influencent ou dont ils sont les acteurs " daprs la XVIIIme Assemble Gnrale de
l'Union Internationale pour la Nature (UICN) tenue Costa Rica (1988).
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. 24
La comptitivit reprsente la rsistance de la souche bactrienne considre aux microorganismes antagonistes et la concurrence avec les souches indignes pour la nodulation.
3. 1. 1. 3 - Utilisation des sources de carbone
Les rhizobiums sont des bactries htrotrophes. Ils ont besoin de composs organiques dj
synthtiss par les plantes quils utilisent pour la synthse de leurs propres molcules
organiques (Lynch et Wipps, 1990).
Dans la rhizosphre, les rhizobia sont fortement stimuls par les exsudats racinaires et par les
dbris cellulaires qui contiennent diffrents hydrates de carbone. La concentration des
substrats carbons a un effet stimulant sur la croissance et la survie de nombreuses espces de
rhizobium (Whipps, 1990). En symbiose, ces substrats fournissent lnergie ncessaire pour le
dveloppement des bactroides et pour le bon fonctionnement des diffrentes tapes de la
rduction de lazote atmosphrique.
Toutefois, les rhizobiums diffrent dans leur aptitude assimiler les variables sources de
carbone (Allen et allen, 1950).
Selon Graham (1964), les bactries croissance rapide prsentent un spectre dassimilation
trs large vis--vis des substrats carbons par rapport aux bactries croissance lente.
Plusieurs tudes ultrieures ont indiqu que les rhizobiums montrent une bonne croissance par
lutilisation prfrentielle des disaccharides. Cet aspect a permis Jordan (1984) de faire la
distinction entre les deux genres tablis lpoque, Rhizobium et Bradyrhizobium.
Ltude de lassimilation de diverses sources de carbone par diffrentes souches a indiqu que
les bactries du genre Rhizobium ont une grande aptitude assimiler les mono- et les
disaccharides, et dune manire restreinte les trisaccharides et les polyalcools. A loppos, les
bactries du genre Bradyrhizobium ont une aptitude variable pour lassimilation des
monosaccharides, moindre pour les disaccharides et rare pour les trisaccharides (Stowers,
1985).
La description de nouveaux genres de rhizobiums sest accompagne par la rvlation dune
grande diversit des profils dutilisation de sources de carbone (Zhang et al., 1991 ; de
Lajudie et al., 1994 ; Stowers et Elkan, 1984 ; Odee et al.,1997).
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. 25
3. 1. 1. 4 - Tolrance la salinit
Parmi les facteurs environmentaux, la salinit constitue la contrainte majeure limitant le
dveloppement et la productivit des plantes cultives. Environ 40% de la surface terrestre
prsente des problmes potentiels de salinit (Cordovilla et al., 1994). Les zones problmes
se localisent essentiellement dans les rgions tropicales et mditerranennes (FAO, 1988). Le
facteur causal de la salinisation des sols est principalement lirrigation (Szabolcs, 1986).
Laugmentation de la teneur en sel est galement lie au lessivage des cations,
lvapotranspiration, aux conditions climatiques et la nature du sol.
Le stress salin affecte dune manire dltre la croissance et la persistance des souches
rhizobiennes dans le sol. La croissance des rhizobiums sous des conditions salines varie dune
espce lautre et dun type de sel lautre (El Sheikh et Wood, 1989).
La plupart des rhizobiums sont inhibs par des concentrations de 100 mM NaCl (Singleton et
al., 1982). Diffrentes souches de Bradyrhizobium sont compltement inhibes entre 50 et 90
mM NaCl. Cependant, il existe des souches trs tolrantes au NaCl, par exemple
Sinorhizobium meliloti peut crotre des concentrations variant de 300 700 mM NaCl, des
souches de Bradyrhizobium nodulant le soja et de Mesorhizobium nodulant le pois chiche
peuvent tolrer 340 mM NaCl. Il a t rapport que chez la mme espce Rhizobium
leguminosarum, il existe des souches dont la croissance est inhibe par 150 mM NaCl (Rai,
1983) et dautres qui supportent 350 mM NaCl (Breedveld et al., 1993). Zahran et al. (1994)
ont rapport lexistence de souches hautement tolrantes chez le lupin qui peuvent survivre
une concentration aussi leve que 1700 mM NaCl.
Concernant le type de sel, il a t rapport que les chlorures sont plus toxiques que les sulfates
(El Sheikh et Wood, 1989). La croissance de Sinorhizobium meliloti a t svrement affecte
par les chlorures associs aux ions de magnsium que par les ions de sodium et de potassium
(Jian et al., 1993).
Les cellules de rhizobia exposes aux concentrations leves de sel accumulent souvent des
osmolytes organiques protecteurs tels que des acides amins comme la proline, la btaine (et
drivs), lectone et le glutamate ou des carbohydrates comme le trhalose, le saccharose et
autres afin de maintenir la turgescence de la cellule et de limiter les dgts causs par le sel
(Boncompagni et al., 1999 ; Botsford et Lewis, 1990 ; Brhada et al., 1997 ; Gouffi et al.,
1999).
Revue bibliographique
. 26
La slection des souches osmotolrantes haut potentiel fixateur dazote doit tre intgre
dans toute slection de lgumineuses pour des rgions prsentant des problmes de salinit.
3. 1. 1. 5 - Tolrance au pH
Les pH extrmes affectent les deux partenaires symbiotiques. La majorit des lgumineuses
ncessitent des pH neutres ou lgrement acides pour stablir dans le sol (Bordeleau et
Prvost, 1994). Cependant, dans les sols acides, les fortes teneurs en manganse et surtout en
aluminium inhibent la croissance racinaire, le nombre des nodosits diminue et lactivit de la
nitrognase ainsi que lultrastructure nodulaire se trouvent trs affectes.
Le pH du sol a une grande influence sur la survie et la multiplication des rhizobiums. Le pH
optimal pour les diverses phases de la croissance des rhizobiums peut varier, mais en gnral
ce sont des bactries neutrophiles. Graham et Parker (1964) ont montr que le pH bas critique
pour la croissance de Rhizobium japonicum et de Rhizobium lupini est compris entre 4 et 6.
Des tudes ultrieures ont indiqu que les rhizobiums prsentent des rponses varies face
aux variations du pH (Jordan, 1984 ; Glenn et Dilworth, 1994).
Lacidit est beaucoup plus rpandue que lalcalinit dans plusieurs rgions du monde. A
loppos, les sols acides sont rares au Maroc. Le pH le plus bas enregistr pour diffrentes
rgions du pays est de lordre de 5 units (Aurag et Sasson, 1992).
Face lacidit, les souches de rhizobium varient largement dans leur tolrance.
Sinorhizobium meliloti a t rapport tre sensible au pH acide (Brockwell et al., 1991). Une
souche appartenant cette espce a t rcemment caractrise par une tolrance satisfaisante
dans un champ de sol pH 5.0 (Howieson et al., 1998). Rhizobium tropici et Mesorhizobium
loti sont considrs comme des souches trs tolrantes lacidit (Graham et al., 1994 ; Wood
et al., 1988). Certaines souches rhizobiennes peuvent mme supporter et survivre dans un pH
trs bas de lordre de 3,5 (Yadav et Vyas, 1973).
Les mcanismes dadaptation physiologiques et biochimiques des rhizobiums sous les
conditions acides sont nombreux (OHara et Glenn, 1994 ; Graham et al.,1994). Ces
mcanismes incluent entre autres lexclusion et lexpulsion des protons H+ (Chen et al.,
1993a), la forte teneur en potassium et en glutamate du cytoplasme des cellules stresses
(Aaron et Graham, 1991), le changement de la composition du LPS (Chen et al., 1993b), et
laccumulation de polyamines (Fujihara et Yoneyama, 1993).
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. 27
Lalcalinit est moins nfaste sur la survie des rhizobiums. Jordan (1984) a montr que la
majorit de ces bactries peuvent tolrer des pH allant jusqu 9. Le mme rsultat a t
retrouv chez des souches nodulant lacacia (Zerhari et al., 2000) et le pois chiche (Matallah
et al., 2002). Cependant, leffet ngatif que reprsente le pH alcalin du sol est lindisponibilit
des minraux indispensables autant pour le rhizobium que pour la plante hte tel que le fer et
le manganse (Bordeleau and Prvost, 1994).
La slection des souches tolrantes aux pH extrmes peut constituer un moyen prometteur
pour une augmentation symbiotique potentielle dans les zones problmes.
3. 1. 1. 6 - Tolrance la temprature
La temprature joue un rle important sur les quilibres microbiens du sol. Linfluence de la
temprature sur la croissance est en fait une mesure de linfluence de la temprature sur la
turgescence et sur laction des enzymes de la cellule. Les tempratures leves engendrent la
dshydratation et la dgradation des enzymes de la voie mtabolique des bactries. Par contre,
les basses tempratures entranent la glification de leau cellulaire et linactivation parfois
irrversible des enzymes. Le stress thermique (non extrme) induit gnralement lexpression
de protines de stress thermique HcP (Heat shock proteins), qui assurent la protection des
enzymes clefs de la physiologie microbienne (Cloutier et al., 1992).
Leffet des basses tempratures sur les rhizobiums est moins rapport par rapport aux
tempratures leves (Prvost et al., 1987 ; Lynch et Smith, 1993 ; Roughley, 1970). En
gnral, ces bactries sont tolrantes aux basses tempratures de lordre de 4C et 5C. Cest
le cas courant chez les souches isoles des rgions arctiques (Bordeleau and Prvost, 1994).
Hume et Shelp (1990) ont montr que la souche Bradyrhizobium japonicum 532C, isole au
Canada, a t plus performante dans des tests dinoculation de plantes de soja sous les
conditions canadiennes que les souches USDA 110 et USDA 142 isoles aux Etats Unis.
Il a t rapport que les tempratures basses extrmes inhibent lexpression des gnes nod et
donc linfection et la nodulation (Zhang et al., 1996). A loppos, la temprature leve
affecte la diffrenciation des rhizobia en bactroides ainsi que le fonctionnement de la
nodosit (Zahran, 1999). Piha et Munns (1987) ont rapport que les nodosits de la fve
formes 35C taient de petite taille et que lactivit de la nitrognase tait trs basse.
La temprature optimale de la fixation dazote dune espce bactrienne est gnralement
corrle avec la temprature de lhabitat normal de cette espce. Il a t ainsi rapport que les
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tempratures critiques de la fixation dazote sont de 30C pour la trfle et le pois (Michiels et
al., 1994), de 30C 33C pour le Haricot (Piha et Munns, 1987) et varient entre 35C et
40C pour les graines de cacahutes et de soja (Michiels et al., 1994).
Dans les conditions extrmes, en loccurrence sous stress thermique et hydrique, des souches
de rhizobiums ayant une capacit suprieure dadaptation peuvent tre slectionnes pour une
exploitation effective de la fixation dazote (Aurag et Brhada, 1995 ; Mpepereki et al., 1997).
3. 1. 1. 7 - Rsistance intrinsque aux antibiotiques
Le sol reprsente une niche cologique o diffrents microorganismes peuvent tre prsents.
Les rhizobiums rpondent de faon slective aux diffrents stimuli mis par ces organismes.
Ces derniers peuvent scrter des antibiotiques afin dinhiber la croissance ou de dtruire les
autres microorganismes voisins.
Schwinghamer (1967) et Brockwell et al. (1977) ont rapport que les antibiotiques exognes
peuvent affecter extrmement la capacit des rhizobiums infecter leur plante hte voire
mme entraner la perte de leur capacit symbiotique.
Laction dun antibiotique est caractrise par la concentration minimale inhibitrice (CMI) qui
reprsente la plus faible concentration de lantibiotique inhibant la croissance du rhizobium
la temprature optimale de 28C. Les profiles de la CMI de diffrents antibiotiques sont dun
intrt cologique trs important puisquils permettent didentifier une souche de rhizobium
dtermine introduite dans un sol particulier (Obaton, 1971).
Les antibiotiques agissent globalement sur les enveloppes cellulaires (paroi, membrane
cytoplasmique) et sur la synthse des protines et des acides nucliques par des mcanismes
spcifiques (Karanja et Wood, 1988). Le mode daction de ces molcules varie en fonction du
type de lantibiotique (Graham, 1963) ainsi quen fonction de la concentration teste
(Lindstrm et Lehtomki, 1988).
La rsistance intrinsque aux antibiotiques a t tudie aussi bien chez les souches de
Rhizobium (Eaglesham, 1987 ; Zhang et al., 1992) que celles de Bradyrhizobium (Kuykendall
et al., 1988). Le degr de la rsistance peut varier dune espce une autre et mme entre les
souches de la mme espce (Shishido et Pepper, 1990 ; Zhang et al., 1991 ; Odee et al.,
1997). Une rsistance multiple diffrents types dantibiotiques peut tre identifie chez une
mme souche de rhizobium (Cole et Elkan, 1979 ; Jenkins et Bottomley, 1985). La rsistance
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. 30
mtal, soit par compartimentation lintrieur des cellules et soit par le moyen le plus
commun, la diminution de lassimilation et lactivation de lexportation (Ross, 1993 ;
Tomsett, 1993). Comme chez toutes les bactries, les gnes de rsistance aux mtaux lourds
chez les rhizobiums sont localiss au niveau des plasmides (Silver, 1992).
Lidentification et la slection de couples symbiotiques Rhizobium-lgumineuse rsistants aux
mtaux lourds peut constituer un moyen trs efficace pour palier lcotoxicologie des sols
contamins (Wetzel et werner, 1995).
Dans la PCR-RFLP, les fragments amplifis par PCR sont digrs par des enzymes de
restriction puis rvls par lectrophorse. Le nombre et la diffrence de migration des
diffrents fragments obtenus permet lvaluation et lanalyse du polymorphisme
apparent. Une des techniques qui drive de cette mthode est la PCR-RFLP du gne de
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. 31
lADNr 16S connu galement par lARDRA (Grtler et al., 1991 ; Vaneechoutte et al.,
1992). Cette technique est largement utilise pour ltude de la diversit gntique ainsi
que la classification des rhizobia (Willems et Collins, 1993 ; Laguerre et al., 1994 ;
1997).
-
Dans le cas du Southern Blot, lADN digr est soumis une lectrophorse sur gel
dagarose puis les fragments obtenus sont sujets lhybridation par des sondes
spcifiques travers une membrane de nitrocellulose. Chez les rhizobiums, des sondes
drivs partir de lopron de lADNr ont t utilises (Sadowsky et al., 1990 ; Grimont
et Grimont, 1991 ; Eardly et al., 1992).
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. 32
Ces techniques sont trs sensibles aux variations infimes de la concentration de lADN, des
ions magnsium, de la polymrase et exigent une grande puret de lADN (Berg et al., 1994)
ce qui rend leur reproductibilit trs limite.
3. 1. 2. 5 Le polymorphisme de la longueur des fragments amplifis (AFLP)
LAFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) est lamplification slective de
fragments de restriction partir de lADN gnomique totalement digr (Vos et al., 1995). La
technique de lAFLP permet une grande rsolution gntique et elle est plus reproductible que
les autres mthodes (Terefework et al., 2001). Cette technique sest rvle plus
discriminative que lARDRA dans le cas des souches de Bradyrhizobium (Willems et al.,
2001a, b, c).
3. 1. 2. 6 Les squences rptitives (REP, ERIC et BOX)
Les squences rptitives existent en multiples copies dans le gnome de la plupart des
bactries Gram ngatives et plusieurs Gram positives (Lupski et Weinstock, 1992). Trois
types de squences rptitives ont t identifis chez les bactries : des squences rptitives
inverses REP de 35 40 pb (Sharples et Lloyd, 1990), des consensus entrobactriens
squences rptitives intergniques ERIC de 124 127 pb (Hulton et al., 1991) et les
lments BOX de 154 pb (Versalovic et Lupski, 1998). Ces squences sont localises en
orientation inverse dans des zones distinctes sur le chromosome bactrien. Ces squences
paraissent hautement conserves chez les souches apparentes et trs distinctes entre les
diffrentes espces ou genres bactriens (Versalovic et al., 1991, 1992). Lamplification
slective des rgions existant entre ces squences conserves a t utilise comme une
mthode stable et rapide pour lidentification des bactries (Versalovic et al., 1998).
Lapplication de la PCR/REP aux rhizobiums a t initie par de Bruijn (1992). Ce dernier a
utilis la PCR/REP chez des souches de S. meliloti en utilisant des amorces de 18 22 pb
conues dune manire complmentaire aux squences inverses (Versalovic et al., 1991).
Depuis, plusieurs auteurs ont adopt cette mthode (Judd et al., 1993 ; Nick et Lindstrm,
1994 ; Laguerre et al., 1996 ; Vinuesa et al., 1998). Le point fort de la PCR/REP est que les
fragments amplifis issus dune cellule cultive en boite, dune prculture, voire mme dun
extrait nodulaire, prsentent des profils lctrophortiques similaires. Ce qui renforce le
caractre stable de cette mthode dans ltude de la diversit des souches, dans lidentification
Revue bibliographique
. 33
des bactries et dans le suivi programm de souches nouvellement introduites dans le sol (de
Bruijn, 1992 ; Schneider et de Bruijn, 1996).
Dans un rapport rcent, Rademaker et al. (2000) ont compar la PCR/REP avec lAFLP et
lhybridation ADN / ADN chez diffrentes espces du genre Xanthomonas. Ils ont conclu que
les diffrentes techniques ont engendr des rsultats comparables et que le pouvoir
discriminant des squences rptitives est obtenu par la combinaison Box, ERIC et REP
autrement dit la BER-PCR.
Lanalyse gntique des squences rptitives, en outre sa rapidit et sa stabilit, peut tre
galement utilise comme un premier moyen dans ltude des relations taxonomiques et
phylogntiques des rhizobiums (Rademaker et al., 2000).
3. 1. 2. 7 Les gnes ribosomiques
Les gnes ribosomiques ont t utiliss comme marqueurs molculaires dans ltude
phylogntique de diffrents organismes en raison de leur universalit, leur abondance, leur
taille convenable aux analyses comparatives (Ludwig et Schleifer, 1999). En effet, la structure
de lADN ribosomique est dune nature mosaque. En effet, les ADNr contiennent des rgions
de squence hautement conserve trs utile pour la dsignation des amorces (Hillis et Dixon,
1991 ; Stahl et Amman, 1991) et dautres rgions de squence suffisamment variable pour
servir comme un excellent moyen taxonomique (Grimont et Grimont, 1986).
Chez les procaryotes, les gnes codant pour les ARN ribosomaux sont organiss en oprons
appels oprons rrn qui contiennent galement des espaces intergniques ainsi que dautres
gnes codant pour les ARNt (figure 2). Il existe trois types de lADN ribosomique : le 5S, le
16S et le 23S (Jensen et Straus, 1993). LADNr 5S est trs peu utilis vu sa petite taille
denviron 120 nuclotides, contrairement lADNr 16S codant pour la petite sous unit
ribosomique (SSU : small subunit) denviron 1500 pb (opron rrs : ribosomal rna small
subunit) et lADNr 23S codant pour la grande sous unit ribosomique (LSU : Large subunit)
denviron 2500 3000 pb (opron rrl : ribosomal rna large subunit) (Grtler et Stanisich,
1996). Lspace intergnique entre ces deux oprons ribosomiques est transcriptionel do la
dsignation ITS (intergenic transcribed spacer) (Normand et al., 1996).
. 34
Revue bibliographique
Espace intergnique
(ITS)
Designation
des gnes
rrs
rrl
rrf
5
Produits
des gnes
3
ARNr 16S
ARNr 23S
ARNr 5S
ARNt
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. 35
Depuis que Woese (1987) a montr que le gne de lADNr 16S est prsent chez tous les
organismes, quil a la mme fonction et que sa structure primaire est conserve, plusieurs
chercheurs lont utilis comme une approche rapide pour valuer la variabilit gntique entre
les souches de rhizobiums (Laguerre et al., 1994 ; Nour et al., 1994b).
Lusage de lADNr 23S a t initialement rapport par Ludwig et Schleifer (1999). Un degr
de divergence gntique plus important peut tre galement obtenu partir de lanalyse de
lITS situ entre les gnes de la SSU et de la LSU (Hillis et Dixon, 1991 ; van Berkum et
Fuhrmann, 2000).
3. 1. 2. 8 Les gnes symbiotiques
3. 1. 2. 8. 1 - Les gnes nif
Les gnes nif existent chez plusieurs bactries dont les rhizobiums (Young et Haukka, 1996).
Ces gnes codent pour la nitrognase rductase. La phylognie des gnes nif H a t rapporte
comme tant en parfait accord avec celle qui drive de lanalyse du gne de lADNr 16S
(Hennecke et al., 1985 ; Dobert et al., 1994), en dpit de quelques exceptions (Eardly et al.,
1992). Ces dernires ont t supposes tre dues aux recombinaisons gntiques et au
transfert latral des gnes nif (Martinez-Romero et Cabarello-Mellado, 1996).
Rcemment, Haukka et al. (1998) ont compar plusieurs squences et ont conclu que la
phylognie rsultant du gne nif H est diffrente de celle de lADNr 16S mais plutt similaire
celle du gne nod A. Ce dernier rsultat est plus logique du fait que les gnes nif et nod sont
troitement lis et sont tous les deux localiss sur des lments transmissibles tels que les
plasmides chez beaucoup despces de rhizobiums ou comme des transposons chez
Mesorhizobium loti (Sullivan et al.,1995; Sullivan et Ronson, 1998). Plus de variabilit a t
galement rvle par lanalyse de lespace intergnique existant entre les gnes nif D et nif K
(Laguerre et al., 1996).
3. 1. 2. 8. 2 Les gnes nod
Les interactions entre les plantes lgumineuses et les rhizobiums varient en degr de
spcificit (Rsnen et al., 1991 ; Pueppke et Broughton, 1999). Cette spcificit est
dtermine par plusieurs lments dont principalement les facteurs Nod cods par les gnes
nod. 13 gnes de nodulation ont t dtermins : le nod D qui est un gne rgulateur et les
oprons nod ABCIJ, nod FEL, nod MNT et le nod O (Perret et al., 2000). La localisation des
Revue bibliographique
. 36
gnes nod varie entre les rhizobiums, elle peut tre soit au niveau chromosomique, soit au
niveau plasmidique dans la majorit des cas (Mercado-Blanco et Toro, 1996). Le transfert
latral de ces gnes entre diffrentes espces de rhizobiums est bien vident par plusieurs
tudes (Ueda et al., 1995 ; Lorenz et Wackernagel, 1994). Les arbres phylogntiques bass
sur lanalyse des squences des gnes nod se sont rvls diffrents de ceux de lADNr 16S,
mais ils montrent toutefois des corrlations informatives avec les spectres dhtes (Haukka et
al., 1998 ; Wernegreen et Riley, 1999 ; Suominen et al., 2001).
3. 1. 2. 9 Le squenage
Les amliorations des techniques du squenage partiel ou total de gnes ont pu renforcer son
usage dans ltude de la taxonomie bactrienne. La squence la plus largement utilise chez
les rhizobiums est celle de lADNr 16S (Weisburg et al., 1991). Lutilisation de la variation
de la squence de lADNr 16S pour un but taxonomique suppose que lvolution du gnome
progresse un taux constant et que les gnes sont hrits de manire stricte dune gnration
une autre sans aucun transfert latral. Llucidation de ce fait par van Berkum et al (2003)
sest base sur la comparaison des squences de lADNr 16S, de lADNr 23S et du ITS 16S23S. Des analyses standard informatises ont t excutes et les donnes des squences ont
t utilises pour construire des arbres phylogntiques. Les rsultats ont montr que les
squences de lITS et de lADNr 23S fournissent des rsultats diffrents de ceux obtenus avec
lADNr 16S. Les trois ensembles de donnes ont produit trois arbres distincts qui ont t
impossible combiner dans un seul arbre. Selon van Berkum et al (2003), cette htrognit
pourrait tre due des vnements de conversions gntiques au sein des rgions squences
variables de lopron rrn.
En 1994, Huber et Selenka-Pobell ont rapport lexistence de multiples oprons rrn chez les
rhizobiums. Plusieurs copies de lADNr 16S peuvent exister chez les souches de la mme
espce, voire mme au sein de la mme souche (Young et Haukka, 1996).
Les donnes des squences de lADNr 16S reste nos jours, le moyen le plus simple et le
plus rapide pour ltude phylogntique des rhizobiums. Toutefois, plusieurs recherches ont
t entames dans le but dvaluer les donnes de squences partir dautres gnes tels que le
gln A, le nod C, et le rec A (Laguerre et al., 2001).
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. 37
Revue bibliographique
. 38
3. 1. 3 Autres marqueurs
Ltude de la diversit des rhizobia emploie galement dautres marqueurs dont les plus
couramment utiliss sont dcrits ci-dessous,
3. 1. 3. 1 - Analyse des protines cellulaires totales par SDS-PAGE
Lisolement des protines cellulaires purifies est une tape critique dans cette analyse.
Lensemble des protines isoles est analys par lectrophorse sur un gel dacrylamide en
conditions dnaturantes par la prsence du SDS.
La SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) des protines
totales a t utilise dans ltude taxonomique de plusieurs souches de rhizobia trs
rapproches (Moreira et al., 1993 ; Vandamme et al., 1996). Cette mthode permet ltude de
la diversit qui existe entre les souches avec un pouvoir de rsolution allant du niveau souche
espce. Dans le cas des rhizobia darbres lgumineux telles que les acacias du sahel, cette
technique sest rvle trs fiable comme un marqueur de discrimination entre les souches (de
Lajudie et al., 1994 ; Dupuy et al., 1994).
3. 1. 3. 2 Le polymorphisme enzymatique (MLEE)
Par la MLEE (Multilocus enzyme electophoresis), plusieurs enzymes solubles peuvent tre
analyses (Selander et al., 1986). Lvaluation de la variabilit enzymatique ncessite en
premier lieu la culture de la bactrie en quantit suffisante pour lextraction du culot
protique. Cette tape prsente un inconvnient pour les bactries ayant un taux de croissance
assez long. La deuxime tape consiste lisolement dun enzyme dtermin chez les
diffrentes bactries analyser, la migration par lectrophorse SDS-PAGE, puis la rvlation
Revue bibliographique
. 39
du polymorphisme par raction colore. Les diffrents types obtenus refltent les variations
relatives chaque enzyme (Barrera et al., 1997).
Les profils isoenzymatiques ont t analyss chez diffrents rhizobia pour estimer la diversit
gntique qui existe entre les souches croissance rapide et celles croissance lente (Young,
1985) et entre les rhizobia appartenant la mme espce telle que Rhizobium leguminosarum
bv. Phaseoli (Pinero et al., 1988) et Rhizobium meliloti (Eardly et al., 1990).
3. 1. 3. 3 - Analyse des acides gras
Les acides gras sont les constituants majeurs de plusieurs varits de lipides et de
lipopolysaccharides. Ils ont t largement utiliss dans ltude de la taxonomie bactrienne
(Vandamme et al., 1996).
-
Lanalyse des acides gras cellulaires ou FAME (fatty acid methyl esters) chez des
souches de Bradyrhizobium japonicum a montr des rsultats en concordance avec ceux
de lhomologie ADN / ADN (Kuykendall et al., 1988). Cette technique est largement
dcrite par Graham et al (1995).
3. 1. 3. 4 La srologie
La diversit srologique chez les rhizobiums a t largement tudie (Caldwell et Vest, 1968 ;
Weber et al., 1989 ; Fuhrmann, 1990). Les tests srologiques sont bass sur des techniques
immunologiques utilisant des anticorps poly- ou monoclonaux et permettent lidentification
des souches suivant des ractions dimmunoagglutination anticorps-antignes. Ces ractions
sont values par immunodiffusion sur gel (Dudman, 1971), par immunofluorescence
(Bohlool, 1987) et gnralement par spectrophotomtrie ELISA (Enzyme Linked
Immunoabsorbent Assay).
Lvaluation de la spcificit srologique est dun grand intrt dans ltude cologique des
rhizobiums (Keyser et Cregan, 1987 ; Damigri et al., 1967). La variation srologique chez les
Revue bibliographique
. 40
3. 1. 4 Etude polyphasique
Le terme de taxonomie polyphasique a t initi par Colwell (1970) cit par Nick (1998). A
lpoque, la classification tait base sur la comparaison de diffrentes analyses
phnotypiques et biochimiques. Cependant la rvolution de diffrentes techniques
molculaires durant les vingt dernires annes dont principalement la PCR (Mullis et Faloona,
1987) a permis la rvision de lapplication de la terminologie polyphasique. Ainsi, Graham et
al. (1991) ont propos les principes standard de la description de nouveaux genres ou
despces sur la base de lanalyse numrique qui est la synthse des rsultats de diffrents
tests phnotypiques et molculaires. Cette nouvelle dfinition de lapproche polyphasique a
permis ltude systmatique approprie de grands groupes bactriens, lvaluation de la
rsolution taxonomique de diffrentes techniques (Vandamme et al., 1996) (figure 3) et
ltablissement de bases de donnes comparables entre diffrents laboratoires de
microbiologie applique (Gillis et al., 2001).
. 41
Revue bibliographique
Famille
Genre
Espce
Souche
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. 42
Par exemple, le genre Bradyrhizobium est reprsent par lespce Badyrhizobium japonicum
qui elle mme est reprsente par la souche USDA 110. La classification permet de regrouper
les espces par des approches molculaires en niveaux taxonomiques plus levs, du genre
la famille puis lordre.
Les rhizobiums sont reconnus comme tant des bactries fixatrices dazote, Gram ngatives,
arobiques et prsentes soit ltat libre et en gnral dans le sol soit en association avec des
lgumineuses. Ils appartiennent la sous classe alpha des protobactries de la grande classe
des eubactries (Maidak et al., 1994).
Les rhizobiums ont t antrieurement dfinis comme des micro-organismes symbiotiques
capables de former des nodosits au niveau du systme racinaire des lgumineuses. Frank
(1879) a rapport que ces micro-organismes taient des champignons en leur affectant le nom
de Schinzia leguminosarum. En 1888, Hellriegel et Willfarth ont fourni une explication
scientifique pour la fixation biologique de lazote. Dans la mme anne, Beyerinck (1888) a
pu isoler une bactrie dune plante lgumineuse et la nomme Bacillus radicicola. Par la
suite, le bacille a t renomm Rhizobium leguminosarum (Frank, 1889). Baldwin et Fred
(1929) ont rapport que la classification des diffrents rhizobiums devrait tre base sur la
spcificit de lespce bactrienne par rapport la plante hte. Ainsi, Fred et al. (1932) ont pu
identifier six groupes de nodulation croise, Rhizobium leguminosarum pour Lathyrus, Pisum,
Vicia et Lens ; R. trifolii pour Trifolium ; R. phaseoli pour Phaseolus ; R. meliloti pour
Glycine max et R. lupini pour Lupinus. Cette premire classification a connu par la suite
plusieurs critiques (Wilson, 1944).
Lohnis et Hansen (1921) ont montr que les rhizobiums prsentent une croissance soit lente
soit rapide dans le milieu synthtique. Le concept du taux de croissance a t repris par Norris
(1965) qui a dfini en plus le critre de laffinit symbiotique. Selon lauteur, les bactries
croissance lente nacidifient pas le milieu de culture et nodulent les lgumineuses des rgions
tropicales, alors que les bactries croissance rapide acidifient le milieu de culture et nodulent
les lgumineuses des rgions tempres. Cependant, plusieurs contre-exemples ont t
rapports. Ainsi, Lupinus et Corallina qui sont des lgumineuses des rgions tempres, sont
nodules par des bactries croissance lente (Allen et allen, 1981). Sesbania et leucaena qui
sont des lgumineuses des rgions tropicales, sont nodules par des bactries croissance
rapide (de Lajudie et al., 1994). Des bactries taux de croissance diffrents peuvent tre
galement isoles partir dune mme espce comme glycine max (Scholla et Elkan, 1984),
Revue bibliographique
. 43
voire mme de la mme plante comme Acacia. En fait, Acacia peut tre nodule par des
Rhizobium (Barnet et al., 1993), des Bradyrhizobium (Dupuy et al., 1994) et par des
Sinorhizobium (de Lajudie et al., 1994).
Les observations discordantes entre la croissance de la bactrie et la gamme dhte ont jet le
doute sur la validit de cette classification. Toutefois, sur la base du taux de croissance,
Jordan (1982) a pu classer les rhizobia en deux genres, le genre Rhizobium pour les souches
croissance rapide et le genre Bradyrhizobium pour les souches croissance lente.
Plusieurs mthodes comparatives comme la srologie, SDS-PAGE des isoenzymes ou des
protines totales, FAME, le coefficient de Chargaff, lhybridation ARN / ADN ou ADN /
ADN, et lanalyse des plasmides ont t adoptes pour la classification des rhizobiums. Mais
ce nest quaprs lidentification en 1987 par Woese que les ADNr 16S des bactries sont
spcifiques ces bactries que la taxonomie des rhizobiums sest considrablement modifie.
La premire squence partielle de lADNr 16S a t publie par Young et al. (1991) pour la
souche Rhizobium BTAi1.
Graham et al. (1991) ont rapport que la description de toute nouvelle espce doit se baser sur
lanalyse gntique (Squence de lADNr, homologie ADN / ADN) ainsi que sur lanalyse
numrique. La combinaison de ces deux analyses a t ensuite reconnue sous le nom de
lapproche polyphasique qui est retenue jusqu nos jours pour tablir la taxonomie des
rhizobiums.
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. 45
La squence de lADNr 16S est une base fiable pour la classification des espces des
niveaux plus levs, mais elle est peu informative aux niveaux souches et individus (Willems
et al., 2001b). A ces niveaux, lhybridation de lADN gnomique savre ncessaire.
Les lignes volutives values sur la base des squences de lADNr 16S des diffrents
genres reconnus des Rhizobiaceae ne semblent gure tre monophyltiques. Ces lignes
regroupent dautres bactries (Sawada et al., 2003) telles que Methylobacterium nodulans (Sy
et al., 2001 ; Knsel, 1984), Ralstonia taiwanansis (Chen et al., 2001), Devosia neptuniae et
Burkholderia qui appartiennent la sous-classe des - protobactries (Moulin et al., 2001).
Il a t rapport que la phylognie tablie actuellement pour les Rhizobiaceae ne peut pas
reflter la vraie phylognie de la famille parce quun seul gne (ADNr 16S) ne constitue pas
une base suffisante pour reprsenter le gnome entier (van Berkum et al., 2003). En outre, une
seule portion des rhizobiums, celles ayant la capacit former des nodosits, a t jusqu' lors
analyse. Cette portion ne peut pas tre reprsentative de la population totale prsente dans le
sol (Bromfield et al., 1995 ; Palmer et Young, 2000).
La phylognie des rhizobiums ne peut pas cependant reflter les traits symbiotiques impliqus
dans la spcificit de lhte cause de la difficult tablir la gamme dhte vu le grand
nombre despces de lgumineuses (Laguerre et al., 2001 ; Debell et al., 1997) mais aussi
cause du transfert latral des gnes symbiotiques (Smalla et al., 2000) qui engendre soit
lacquisition soit la perte de la capacit symbiotique (Young et Haukka, 1996 ; AmabileCuevas et Chicure, 1992).
Petes et Hill (1988) ont rapport que ltablissement des cartes gntiques ainsi que la
reconnaissance des frquences de recombinaisons gntiques entre les diffrentes genres ou
espces de rhizobia pourrait approfondir la base pour une systmatique plus fiable. Selon
Martinez-Romero et Caballero-Mellado (1996), les organismes apparents doivent avoir en
plus de la similitude nuclotidique des squences de gnes bien dfinis, une organisation des
gnes et une taille chromosomique similaire, en dautres termes des cartes gntiques trs
rapprochs.
De nos jours, lusage de la squence de lADNr 16S reste loutil principal dans ltude de la
phylognie microbienne. Cependant, de nouvelles techniques molculaires sont rcemment
adoptes. Les plus utilises sont : la technique FT-IR (Fourier-transfom infrared
spectroscopy) qui permet dtudier la diversit des bactries au niveau intraspcifique
Revue bibliographique
. 46
(Oberreuter et al., 2002), la technique du typage par PCR cibl (target PCR fingerprinting)
(Perret et Broughton, 1998) et surtout la technique des puces ADN communment appele
DNA microarrays. Dans cette dernire technique, la conception des puces permet de dtecter
simultanment des milliers de squences voire mme recouvrir lintgralit du gnome dun
organisme (Shalon et al., 1996). Par la mme technique, Rberg et al. (2003) ont pu analyser
la totalit du gnome de Sinorhizobium meliloti. Lensemble de ces techniques peuvent
rvler plus dinformation sur la diversit des rhizobia et peuvent donc fournir plus de
donnes qui seront disponibles pour ltude de la phylognie.
4. 3. 1 - Allorhizobium
Le nom Allorhizobium qui signifie autres rhizobia, a t propos par de Lajudie et al. (1998a)
comme tant un genre non spcifique. La souche type de ce groupe est Allorhizobium
undicola qui a t isole partir dune lgumineuse tropicale endmique du Sngal :
Neptunia natans. La souche montre un linage distinct dans le cluster form par Rhizobium et
Agrobacterium dans larbre phylogntique avec un fort rapprochement dAgrobacterium
vitis (Young et al., 2001 ; Kuykendall et Dazzo, 2003).
4. 3. 2 - Azorhizobium
Azorhizobium caulinodans est la seule espce reconnue de ce genre. Elle se distingue par une
croissance rapide et la prsence dun seul flagelle latral. De plus, elle nodule non seulement
les parties racinaires mais aussi les parties ariennes de Sesbania rostata (Dreyfus et al.,
1988). Une seconde espce Azorhizobium johannae a t propose (Rinaudo et al., 1991).
Cette souche est caractrise par un faible taux dhybridation ADN / ADN par rapport la
souche type du genre. Lanalyse des squences de lADNr 16S a montr que la souche type se
trouve entre-mlange avec des souches du genre Xanthobacter et Aquabacter. Le
regroupement de ces deux derniers genres avec Azorhizobium a t examin sans tre
cependant propos en raison de la grande dissimilitude des caractres phnotypiques (Trinick,
1980 ; Kuykendall et al., 2004a).
. 47
Revue bibliographique
Tableau 1. Classification actuelle des diffrentes espces de rhizobia.
Genres
Espces
Allorhizobium
A. undicola
Azorhizobium
A. caulinodans
Plantes htes
Rfrences
Neptunia natans
Sesbania rostrata
Bradyrhizobium
Br. japonicum
Br. elkanii
Br. liaoningensis
Br. Yuanmingense
Br. betae
Br. canariense
Glycine max
Glycine max
Glycine max
Lespedeza
Betae vulgaris
-
Mesorhizobium
M. loti
M. huakuii
M. ciceri
M. tianshanense
M. mediterraneum
M. plurifarium
M. amorphae
M. chacoense
M. sesptentrionale
M. temperatum
Jarvis et al ., 1982
Chen et al ., 1991
Nour et al ., 1994a
Chen et al., 1995
Nour et al ., 1995
de Lajudie et al ., 1998b
Wang et al ., 1999a
Velasquez et al, 2001
Gao et al., 2004
Gao et al., 2004
Phaseolus vulgaris
Rhizobium
R. leguminosarum
biovar viciae
biovar trifolii
biovar phaseoli
R.galegae
biovar officinalis
biovar orientalis
R. tropici type IIA et IIB
R. etli
biovar mimosae
R. gallicum
biovar phaseoli
biovar gallicum
R. giardinii
biovar phaseoli
biovar giardinii
R. hainanensis
R. huautlense
R. mongolense
R. yanglingense
R. larrymoorei
R. indigoferae
R. sullae
R. loessense
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Revue bibliographique
Sinorhizobium
S. meliloti
S. fredii
biovar fredii
biovar siensis
S. saheli
S. terangae
biovar acaciae
biovar sesbania
S. medicae
S. arboris
S. kostiense
S. xingianense
S. morelense
S. kummerowiae
S. americanum
Dangeard, 1926
Acacia
Sesbania
Medicago truncatula, Melilotus
Acacia, Prosopis
Acacia, Prosopis
Glycine max
Leucaena leucocephala
Kummerowiae stipulaceae
Acacia
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4. 3. 3 - Bradyrhizobium
Lidentification de souches croissance lente remonte 1932 (Fred et al.) mais leur
classification en un seul genre Bradyrhizobium a t tablie par Jordan en 1982. Plusieurs
espces sont nos jours reconnues, Bradyrhizobium japonicum (Jordan, 1982),
Bradyrhizobium elkanii (Kuykendall et al., 1992) et Bradyrhizobium liaoningense (Xu et al.,
1995). Ces trois espces nodulent le soja. Elles ont t ainsi classes sur la base des
hybridations ADN / ADN et sur dautres critres gntiques et phnotypiques. La dernire
espce a t dcrite pour les souches croissance trs lente.
Par ailleurs dautres souches nodulant des lgumineuses autres que le soja, telles que Lupinus
(Barrera et al., 1997), Arachis hypogea (Urtz et Elkan, 1996), Astragalus, Oxytropis et
Onobrychis (Laguerre et al., 1997), Amphicarpaea (Sterner et Parker, 1999) et autres sont
encore non classes. Aussi sont-elles dsignes par Bradyrhizobium sp. suivi du genre de la
plante hte entre parenthses.
Plusieurs auteurs ont rapport lexistence de souches photosynthtiques appartenant au genre
Bradyrhizobium. Ces souches ont t isoles partir des tiges de lespce Aeschynomene
indica. Depuis, plusieurs souches ont t isoles partir dautres espces dAeschynomene
(Ladha et al., 1990 ; Lorquin, 1997b ; Giraud et al., 2000). Toutes ces souches forment un
groupe monophyltique au sein de la branche des bradyrhizobia (Young et al., 1991 ;
Molouba et al., 1999).
Les bradyrhizobia sont groups dans une branche bien individualise dans larbre
phylogntique des bactries symbiotiques (Sawada et al., 2003). Toutefois, dautres genres
de bactries non symbiotiques prsentent des squences de lADNr 16S qui les positionnent
dans la mme branche, cest le cas de Nitrobacter, Rhodopseudomonas, Brucella, Afipia et
Blastobacter (Martinez-Romero et Cabarello-Mellado, 1996). Certains de ces genres
prsentent des caractristiques bien particulires telles que la photosynthse (cas de
Rhodopseudomonas) et le pouvoir pathogne (cas dAfipia) (Wong et al., 1994).
La caractrisation de diffrentes souches de Bradyrhizobium par la comparaison de plusieurs
techniques molculaires a rvl lexistence de 11 gnotypes diffrents dont trois
correspondent aux souches reconnues, alors que les 8 gnotypes restants sont trs distincts
(Willems et al., 2001a, b, c).
Revue bibliographique
. 50
Une nouvelle espce Br. yuanmingene a t rcemment isole du genre Lespedeza (Yao et al.,
2002 ; Euzby et Findall, 2004). Dans la mme anne, une souche de Bradyrhizobium
nodulant une plante sauvage du genre Phaseolus a t rapporte (Parker, 2002). Les autres
espces reconnues de ce groupe sont Bradyrhizobium betae (Rivas et al., 2004) et
Bradyrhizobium canariense (Vinuesa et al., 2005).
4. 3. 4 - Mesorhizobium
Ce groupe se distingue des autres rhizobiums par une flagellation polaire ou sub- polaire, par
des souches croissance intermdiaire entre celles croissance rapide et celles croissance
lente, et par la squence de lADNr 16S. Plusieurs espces ont t proposes:
-
Mesorhizobium loti (Jarvis et al., 1982) a t isole dune large gamme dhtes, Lotus,
Lupinus, Anthyllis, Astragalus, Caragena, Ononis, Genista, Cicer, Leucaena et
Ornithopus (Sahgal et Johri, 2003).
Mesorhizobium huakuii (Chen et al., 1991) a t isole partir dAstragalus mais elle
peut aussi noduler dautres lgumes.
Mesorhizobium mediterraneum (Nour et al., 1995) nodule galement le pois chiche, mais
prsente des caractristiques diffrentes par rapport M. ciceri.
Revue bibliographique
. 51
Les espces du genre Mesorhizobium forment avec dautres espces des genres Aminobacter
et Pseudoaminobacter un seul groupe monophyltique (Sawada et al., 2003 ; Chen et al.,
2004).
4. 3. 5 Rhizobium
Rhizobium leguminosarum a t la premire espce reconnue du groupe (Frank, 1889) avec
trois biovars (Jordan, 1984) : Rhizobium leguminosarum Biovar viciae qui nodule les genres
Pisum, Viciae, Lathyrus et Lens ; Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli qui nodule le genre
Phaseolus et Rhizobium leguminosarum bv. trifolii qui nodule le genre Trifolium. Chez cette
espce, il est important de signaler que les gnes de fixation, de nodulation ainsi que ceux de
la spcificit de lhte sont localiss au niveau du plasmide, par consquent la dsignation
biovar reflte des caractristiques plasmidiques et non chromosomiques.
Rhizobium tropici a t dcrite par Martinez-Romero et al. (1991) sous deux types : type I et
type II. Les souches du type II forme des nodosits sur les racines de Phaseolus vulgaris,
Leucaena esculenta et Leuceana leucocephala. Les souches du type I ont t reclasses par
Segovia et al. (1993) sous le nom de Rhizobium etli. Les souches de ce nouveau genre ont t
reconnues pour noduler exclusivement lespce Phaseolus vulgaris. Cependant un nouveau
biovar a t isol partir de Mimosa sp. et a t nomm par consquent Rhizobium etli biovar
mimosae (Wang et al., 1999b).
Rhizobium galegae biovar orientalis et biovar officinalis ont t isoles respectivement de
Galega orientalis et Galega officinalis (Lindstrom, 1989). Cette espce prsente un ADNr
16S qui est trs diffrent de ceux des autres rhizobia mais rapproch de celui
dAgrobacterium vitis (Terefework et al., 1998, 2001).
Rhizobium gallicum biovar phaseoli et biovar gallicum et Rhizobium giardinii biovar
phaseoli et biovar giardinii ont t proposes par Amarger et al. (1997) sur la base de la
squence du gne de la SSU et des caractristiques phnotypiques pour quelques souches
isoles partir Phaseolus vulgaris et qui prsentent deux groupes distincts par rapport
Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli. Ces deux groupes de souches ont t isoles de
diffrentes rgions gographiques de France et ont t pralablement caractrises par la
mthode de la RFLP (Gniaux et al., 1993), lanalyse de la squence partielle de lADNr 16S
et lhydridation ADN / ADN (Laguerre et al., 1993).
Revue bibliographique
. 52
4. 3. 6 - Sinorhizobium
Sinorhizobium meliloti isole de Melilotus et caractrise initialement par Dangeard (1926) a
t la premire espce reconnue de ce groupe sous le nom de R. meliloti (Skerman et al.,
1980 ; Jordan, 1984).
Dautres recherches ont indiqu lisolement de souches croissance rapide partir des
nodosits de Glycine max (Keyser et al., 1982) et de diffrentes autres lgumineuses (Trinick,
1980). Ces souches ont t inclues dans le genre Rhizobium sous le nom de R. fredii (Scholla
et Elkan, 1984) puis elles ont t reclasses au sein de genre Sinorhizobium en tant que
Sinorhizobium fredii (Chen et al., 1988).
Des donnes molculaires ont indiqu que S. fredii et S. meliloti sont trs similaires (Jarvis et
al., 1992). Par une nouvelle rvision du genre, de Lajudie et al. (1994) ont pu diffrencier
entre quatre espces :
-
Sinorhizobium meliloti, propose initialement par Dangeard (1926) et isole partir des
espces Melilotus, Medicago et Trigonella,
Revue bibliographique
. 53
siensis. Chen et al. (1995) ont mme propos lexistence de deux espces diffrentes :
Sinorhizobium fredii et Sinorhizobium xinjiangensis,
La souche NGR 234 isole de Lablab purpureus a la particularit de possder un grand
spectre dhte. Les squences de lADNr 16S et des gnes nod sont trs rapproches celles
de Sinorhizobium fredii. Des tudes immunologiques ont t galement en faveur de ce
rapprochement (Jarvis et al., 1992). Toutefois, une tude rcente a rapport que les deux
souches ne forment en fait quune seule et mme souche (Saldana et Martinez-Alcantara,
2003).
Dautres nouvelles espces appartenant ce genre ont t caractrises au cours des dix
dernires annes, S. medicae (Rome et al., 1996), S. Kostiense et S. arboris (Nick et al.,
1999), S. Kummerowiae (Wei et al., 2002), S. morolense (Wang et al., 2002) et S.
americanum (Toledo et al., 2003).
Le genre Sinorhizobium forme avec quelques espces appartenant au genre Ensifer un seul
groupe monophyltique (Sawada et al., 2003 ; Willems et al., 2003).
Revue bibliographique
. 54
spcifiques aux diffrentes espces de Vitis spp. Toutefois, des souches de la mme espce
ont t galement isoles dActinidia spp. (Sawada et Ieki, 1992).
Plusieurs autres espces dAgrobacterium ont t isoles. Cependant, leur nomenclature est
trs contreverse (Euzby et Findall, 2004).
De point de vue taxonomique, les espces dAgrobacterium sont classes avec celles du genre
Phyllobacterium (agent causal dhypertrophies chez les plantes) dans larbre phylogntique
des Rhizobiaceae (Knsel, 1984 ; Farrand et al., 2003).
Une tude plus rcente base sur lanalyse comparative des squences de lADNr 16S a
montr que les genres Rhizobium, Allorhizobium et Agrobacterium forment un seul groupe
monophyltique et quil serait judicieux de les regrouper dans un seul genre Rhizobium
(Young et al., 2001, 2003). Dans ce nouveau genre, la souche type du genre Agrobacterium
sera substitue par Rhizobium radiobacter qui regroupe les types pathognes et non
pathognes. Dans une autre tude plus rcente, il a t rapport que les trois genres forment en
effet un seul groupe monophyltique de la sous-classe - protobactries mais chaque genre
est individuellement distinct (Sawada et al., 2003).
Revue bibliographique
. 55
souche ATCC 10319 a t contamine par Br. japonicum. Plusieurs autres mthodes, en
loccurrence FAME (Graham et al., 1995), MLEE et PyMS (Barrera et al., 1997), lanalyse
de lADNr 16S (Xu et al., 1995 ; Laguerre et al., 1994, 1997) ont montr que les
Bradyrhizobium sp. (Lupinus) sont trs rapprochs de Bradyrhizobium japonicum. Ludwig et
al. (1995) ont montr quune souche de lupin est plus rapproche du Bradyrhizobium par la
squence nuclotique aussi bien de la sous-unit ribosomique 16S que de la sous-unit
ribosomique 23S. La majorit de ces tudes ont t bases cependant, sur lanalyse
comparative dun nombre trs limit de souches nodulant le lupin.
Rcemment, Trujillo et al. (2005) ont montr par lanalyse de la squence de lADNr 16S que
deux souches croissance rapide nodulant lespce Lupinus honoratus appartiennent au genre
Ochrobactrum qui fait partie de la branche 2 des Protobactries.
Des souches croissance rapide ont t galement identifies chez le lupin (Jensen, 1967 ;
Jordan, 1982 ; Schlinkert-Miller et Pepper, 1988) mais la caractrisation prcise de ces
souches na pas connu de suite.
Vu le grand nombre despces du genre Lupinus spp. qui existent, approximativement 300
espces, ainsi que leur grande diversit cogographique (Cowling et al., 1998), on pourrait
sattendre une grande diversit au niveau des symbiotes de ces espces. Ltude de la
biodiversit et lanalyse molculaire de ces symbiotes devrait tre entreprise pour dterminer
avec exactitude leur position taxonomique au sein de la grande famille des Rhizobiaceae.
CHAPITRE II
CONSTITUTION DUNE
COLLECTION DE RHIZOBIA
NODULANT LE LUPIN ET
EVALUATION DE SA
DIVERSITE GENETIQUE
PAR PCR/REP
56
.
1 - INTRODUCTION
Au Maroc, il y a eu durant les dernires annes une focalisation importante sur la constitution
dun germoplasme despces fourragres et pastorales autochtones. Parmi ces espces figurent
celles qui appartiennent au genre Lupinus. Suite cette attention, plusieurs tudes ont t
effectues afin de connatre dune part laire dadaptation et de distribution des espces et des
populations spontanes et de mieux dfinir dautre part laire potentiel o ces espces peuvent
tre cultives avec succs (Bounejmate et al., 1993 ; Beale et al., 1991 ; Thami Alami et al.,
2004).
Pour russir linstallation de ces lgumineuses et augmenter substantiellement leur rendement,
des essais dinoculation avec des rhizobia spcifiques haute performance symbiotique
peuvent tre entre autres entrepris en fonction des diffrentes rgions du pays. Au Maroc, les
lupins sont spontanment noduls par des souches autochtones de rhizobia (Birouk, 1990).
Par consquent, lamlioration de la symbiose lupin - rhizobium exige que la conservation et
la connaissance du microsymbiote soient dtermines en parallle avec les efforts de
conservation de la plante hte. Cest ainsi que nous nous sommes fix comme premier
objectif dans cette tude la constitution dune collection de souches de rhizobia nodulant les
diffrentes espces locales de lupin.
De plus, la diversit des bactries symbiotiques est un lment trs important dans les
programmes de slection de souches appliquer comme inoculum et dans ltude de
linteraction ou de la spcificit plante - microorganisme. Lune des techniques molculaires
avance utilise pour ltude de la diversit gntique des rhizobia consiste amplifier
diffrentes classes de squences rptitives (REP, ERIC, et BOX) qui existent en multiples
copies dans le gnome bactrien (PCR-rep) (Versalovic et al., 1991).
Le typage des squences rptitives REP prsente plusieurs avantages par rapport aux autres
techniques damplification par PCR dont principalement le grand pouvoir discriminatif entre
les souches de rhizobia mais galement la facilit et la rapidit, la possibilit de lapplication
sur un grand nombre de bactries et la possibilit de lamplification soit partir dune colonie
en culture pure soit directement partir dun broyat nodulaire (Lupski et Weinstock, 1992 ; de
Bruijn, 1992 ; Nick et Lindstm, 1994).
57
.
En plus de son utilisation dans ltude de la diversit gntique, la PCR/REP est galement
utilise dans ltude cologique de microorganismes nouvellement introduits dans un
environnement dtermin (de Bruijn et al., 1996).
58
ALGERIE
MAROC
MAURITANIE
Rgions
Nombre total
de sites
La Cte atlantique
17
Rgion du Gharb
10
Settat
Rif
Moyen Atlas
Haut Atlas
Rgion de Chaouia
59
pH
(eau)
pH
(KCl)
MO
(%)
P205
K20
(ppm) (ppm)
N
(%)
Sablonneux
7,88
7,46
0,92
25
81
0,0055
Sablonneux en mottes
7,4
7,3
0,78
13
51
0,0055
Sablo-limoneux
7,9
7,5
0,8
38
60
0,111
Sablo-limoneux
7,5
5,72
54
48
0,0047
Sablo-limoneux dur
6,66
5,25
0,91
19
51
0,0147
7,3
5,73
29
102
0,0067
7,2
6,59
1,37
16
66
0,0047
7,44
7,28
1,93
50
187
0,0095
5
6
Sablo-limoneux
6
7
Sablo-limoneux
7,2
5,22
2,75
71
0,0147
Sablo-limoneux dur
7,3
5,59
1,83
12
56
0,0078
argileux
6,4
5,6
10
Limoneux
6,44
5,74
11
Sablonneux
7,5
7,35
12
Sablo-limoneux
7,91
7,34
1,47
90
0,0026
13
7,13
6,48
3,12
57
0,0007
14
8,1
7,24
1,89
19
193
0,0026
15
7,28
6,79
5,53
84
422
16
Argileux
7,46
7,33
1,89
19
193
0,0150
17
6,36
4,05
5,3
172
0,0086
18
7,56
5,37
2,4
81
253
0,0944
19
limoneux
6,32
3,4
73
307
0,0127
20
6,19
22,8
153
0,0143
21
limoneux -sableux
7,21
6,84
9,4
88
0,0110
22
Sablo-limoneux
7,86
7,19
0.60
12
0,0050
60
.
61
.
62
Tableau 4. Nombre des isolats obtenus partir de chaque espce de lupin et dans chaque
station de collecte
Station
Plantes htes
Nombre
des isolats
L. luteus
16
L. angustifolius
L. cosentinii
L. luteus
7
8
7
L. angustifolius
L. cosentinii
7
3
L. luteus
+
L. cosentinii
L. luteus
10
L. luteus
11
L. luteus
12
L. luteus
13
L. luteus
14
15
L. angustifolius
L. cosentinii
L. pilosus
1
3
7
16
L. angustifolius
17
18
L. luteus
L. pilosus
L. angustifolius
2
5
5
19
L. angustifolius
20
L. angustifolius
21
L. angustifolius
22
L. cosentinii
Pigeage
L. luteus+ L albus
7+2
3
4
5
6
7
63
.
Tableau 5. Nombre des isolats obtenus partir de chaque espce de lupin selon les
prospections menes par lINRA de Rabat.
Localit des sites des campagnes de collecte des plantes de lupin mene par lINRA de Rabat
Plantes htes
Nombre
des isolats
L. luteus
L. albus
L. angustifolius
L. cosentinii
L. luteus
L. albus
L. angustifolius
L. pilosus
L. atlanticus
Settat
L. pilosus
Sehoul
L. luteus
Blad Dandoun
L. albus
Merchouch
L. albus
L. luteus
L. albus
L. angustifolius
L. cosentinii
Rabat
Gharb
Entre Azilah
et Tanger
64
.
Les diffrentes boites ont t incubes 28C pour lobtention de colonies isoles. Les
colonies obtenues ont t repiques sur le mme milieu suivant quatre dix repiquages
successifs afin de les purifier.
Un nombre de 159 isolats a pu tre obtenu via isolement direct partir des nodosits fraches
des plantes prleves au champ ainsi que par pigeage. Le nombre disolats issus de chaque
espce dans chaque station de collecte figure dans les tableaux 4 et 5. Les isolats obtenus ont
fait lobjet du test de Gram (Annexe 3) et ont t identifis comme tant des bacilles Gram
ngatifs.
Ces isolats ont form sur le milieu YEM solide des colonies circulaires de 1 3 mm de
diamtre dun aspect gommeux translucide ou crmeux et ont pu tre visibles en deux trois
jours dincubation 28C.
65
.
. 66
3. 1 Matriel et mthodes
3. 1. 1 - Souches bactriennes et milieu de culture
Des colonies obtenues sur le milieu YEM solide en culture pure de chacun des 159 isolats ont
t prleves et cultives sur le milieu TY (Tryptone Yeast Extract) (Beringer, 1974) dilu
de moiti (Annexe 4). Ce milieu permet de rduire la production des LPS et des EPS
synthtiss par les bactries par rapport au milieu YEM.
. 67
Squence 5 3
Rfrence
REP 1R
5-IIIICGICGICATCIGGC-3
Versalovic et al.,1991
REP 2
5-ICGICTTATCIGGCCTAC-3
Versalovic et al.,1991
Aprs laddition des chantillons dADN, les microtubes sont placs dans un thermocycleur
(Amplitron, Thermolyne Co.). Un microtube dont lADN est remplac par de leau bidistille
strile est utilis en tant que tmoin ngatif. Les mlanges sont alors soumis au processus
damplification tabli par Grundmann et al (1997) selon le programme suivant :
-
35 cycles
. 68
strile pendant 3 min. puis plac sous UV pour tre photographi. Un film de type Polaroid
B/W ISO 3000/36 a t utilis pour la prise des photos.
3. 2 Rsultats et discussion
3. 2. 1 - Qualit de lADN
LADN extrait par la mthode de la lyse alcaline sest rvl dune bonne qualit (figure 6)
En fonction de lpaisseur et de lintensit de la bande obtenue pour les diffrents isolats, on
peut noter que lADN na pas montr de grandes variations quantitatives. Par consquent,
aucune dilution na t effectue pour les ractions damplification par PCR.
. 69
1Kb
MSMC5331
MSMC5330
MSMC5325
MSMC5327
MSMC5510
MSMC5318
MSMC5316
MSMC552
MSMC5158
MSMC522
MSMC521
CN
100pb
1500pb
2000pb
500pb
. 70
. 71
Cluster 6
MSMC 511
MSMC 5113
MSMC 5114
MSMC 5115
MSMC 5145
MSMC 5155
MSMC 555
Cluster 8
MSMC 535
INRA L31
MSMC 548
MSMC 544
MSMC 5418
MSMC 549
MSMC 5141
INRA L24
MSMC 5410
MSMC 5416
MSMC 522
MSMC 5411
MSMC 5129
INRA L23
MSMC 5140
MSMC 5333
MSMC 5510
MSMC 5123
MSMC 557
MSMC 559
MSMC 5117
MSMC 5118
MSMC 5119
MSMC 5413
MSMC 5159
INRA L44
INRA L210
MSMC 5120
MSMC 5150
Cluster 5
MSMC 517
MSMC 5160
MSMC 536
INRA L11
MSMC 518
MSMC 5316
MSMC 5122
INRA L14
MSMC 5424
INRA L19
Cluster 7
MSMC5116
MSMC 5125
MSMC 5412
MSMC 521
INRA L213
MSMC 5146
MSMC 5419
MSMC 531
MSMC 5139
MSMC 5332
MSMC 543
MSMC 5313
MSMC 5142
MSMC 551
MSMC 532
MSMC 5415
MSMC 5420
MSMC 546
MSMC 5423
MSMC 5422
MSMC 5324
MSMC 554
MSMC 5133
MSMC 5327
MSMC 547
MSMC 553
MSMC 5417
MSMC 5143
MSMC 5131
MSMC 533
MSMC 5511
MSMC 5334
MSMC 5156
MSMC 5157
MSMC 5512
MSMC 5130
INRA L34
MSMC 5326
MSMC 5147
MSMC 5322
MSMC 5325
MSMC 5323
MSMC 5126
MSMC 558
INRA L12
INRA L32
Cluster 3
MSMC 5154
MSMC 5158
MSMC 5319
Cluster 2
MSMC 514
INRA L41
MSMC 5310
INRA L29
INRA L38
INRA L17
INRA L 212
INRA L61
INRA L27
INRA L26
INRA L35
INRA L33
Cluster 4
MSMC 512
MSMC 5321
MSMC 515
MSMC 516
MSMC 5110
MSMC 5121
MSMC 5312
MSMC 534
MSMC 538
MSMC 5132
MSMC 5320
MSMC 5149
MSMC 539
MSMC 5153
MSMC 537
MSMC 5124
MSMC 5425
MSMC 5317
MSMC 541
MSMC 5148
MSMC 513
MSMC 5151
INRA L37
MSMC 542
MSMC 545
INRA L43
INRA L28
MSMC 5311
INRA L15
INRA L42
MSMC 5315
MSMC 5152
MSMC 5127
MSMC 5331
MSMC 556
MSMC 5328
MSMC 5329
MSMC 5330
MSMC 519
MSMC 5111
MSMC 5112
MSMC 5318
MSMC 5421
MSMC 552
INRA L36
INRA L51
INRA L52
INRA L13
Cluster 1
INRA L16
INRA L18
INRA L10
INRA L211
100
90
80
70
60
50
% de similitude
Figure 8. Dendrogramme rsultant de lanalyse par PCR/REP des souches nodulant le lupin
. 72
. 73
Tableau 6. Liste des souches slectionnes partir des diffrents clusters dlimits par
lanalyse PCR/REP
L. albus
INRA L 21
INRA L 23
INRA L 29
INRA L 211
INRA L 212
L. angustifolius
MSMC 532
MSMC 536
MSMC 539
MSMC 5319
MSMC 5326
MSMC 5328
INRA L 32
L. cosentinii
MSMC 541
MSMC 5416
MSMC 5419
MSMC 547
MSMC 549
MSMC 5425
INRA L 43
INRA L 44
L. pilosus
MSMC 511
MSMC 513
MSMC 514
MSMC 515
MSMC 516
MSMC 517
MSMC 518
MSMC 5110
MSMC 5111
MSMC 5112
MSMC 5113
MSMC 5114
MSMC 5115
MSMC 5116
MSMC 5119
MSMC 5123
MSMC 5126
MSMC 5127
MSMC 5133
MSMC 5142
MSMC 5143
MSMC 5150
MSMC 5155
MSMC 5156
INRA L 15
INRA L 16
INRA L 17
Souche
MSMC 554
MSMC 556
INRA L 51
INRA L 52
L. atlanticus
L. luteus
Souche
INRA L 61
. 74
. 75
Lamplification des squences rptitives des 14 isolats a pu gnr des profils distincts avec
plusieurs bandes. La grande variabilit mise en vidence prouve que les isolats sont
gntiquement trs diversifis (figure 10).
Le dendrogramme issu de la comparaison des diffrents profils illustre la grande diversit
gntique qui existe entre ces souches (figure 11). A 70% de similarit gntique, les souches
forment deux clusters A et B ainsi que trois linages indpendants. En outre, au sein des deux
groupes A et B, la relation gntique entre les souches semble prsenter une grande
htrognit.
Le typage molculaire par PCR/REP nous a permis de mettre en vidence, et pour la premire
fois, lexistence de plusieurs souches gntiquement distinctes au sein dun mme amas
nodulaire. Or, il est gnralement tabli que les nodosits abritent un nombre singulier de
souches de rhizobia et il est galement bien tabli que les mcanismes de nodulation sont
contrls par une reconnaissance mutuelle hautement spcifique entre la bactrie et la plante
hte (Long, 2001 ; Perret et al., 2000 ; Denari et al., 1996 ). Cette spcificit a t mme
rapport tre diffrentiellement rduite un srogroupe bien dtermin (Somasegaran et
Hoben, 1985). En plus de la spcificit, les rhizobia sont caractriss par leur pouvoir
comptitif (Laguerre et al., 2003). La comptition peut concerner non seulement les lments
nutritifs ou lespace vital (rhizosphre) mais aussi les sites dinfection au niveau des racines
de la lgumineuse.
Autre renseignement qui rsulte de cette analyse est lvidence de la multiple infection
nodulaire. En dautres termes, la capacit de diffrentes souches de rhizobium infecter en
grand nombre le mme endroit de la racine dune mme plante hte et coexister en
harmonie dans la mme nodosit.
Toutefois, il est difficile dexpliquer comment toutes ces souches peuvent coexister dans la
mme structure nodulaire et de dfinir les mcanismes dinfection impliqus dans la
formation dun tel type de nodosits.
Il a t rapport que la dominance dun gnotype particulier dans les nodosits peut rsulter
dune haute abondance dans le sol plutt qu une grande comptitivit de nodulation
(Hartman et al., 1998). Les mmes auteurs ont signal que les causes de labondance dun
microorganisme dans le sol peuvent tre trs variables, en loccurrence la synthse ou la
dtoxification dantibiotiques, la grande sensibilit aux stimuli mis par la plante et la
. 76
1Kb
MSMC5116
MSMC5112
MSMC5111
MSMC5115
MSMC5114
MSMC5113
MSMC5110
MSMC518
MSMC517
MSMC516
MSMC513
MSMC511
CN
100pb
3000pb
1500pb
500pb
Figure 10. Electrophorse des amplifiats obtenus par PCR/REP des souches de lamas
nodulaire
CN: Control ngatif, 100pb et 1Kb = marqueurs molculaires
MSMC511
MSMC5113
Groupe A
MSMC5114
MSMC5115
MSMC5116
MSMC513
MSMC515
MSMC518
Groupe B
MSMC516
MSMC5110
MSMC5111
MSMC5112
MSMC517
MSMC514
95
90
85
80
75
70
65
60
% of similarity
Figure 11. Dendrogramme rsultant de lanalyse par PCR/REP des 14 souches de lamas
nodulaire.
. 77
croissance rapide des souches pour lenvahissement de la rhizosphre. Certains auteurs ont
attribu la nodulation aux facteurs slectifs rgis par lhte dans la rhizosphre (Moawad et
al., 1984) tandis que dautres ont indiqu que la comptitivit pour la nodulation est rgle
par les gnes rhizobials (Brewin et al., 1983 ; Laguerre et al., 2003).
Concernant les mcanismes dinfection, Hirsch et al. (2001) ont signal que les modes
dinfection connus chez les rhizobia et qui aboutissent la formation de nodosits de type soit
dtermin soit indtermin existent tous les deux chez le lupin. Rcemment, un autre mode
dinfection bien particulier a t rapport chez lupinus albus par Gonzalez-sama et al. (2004).
Selon ces auteurs, le rhizobia pntre la racine travers la jonction situe la base du poil
absorbant et la cellule pidermique adjacente. La bactrie envahit directement la zone
corticale sous pidermique. Les cellules infectes se divisent successivement pour former le
noyau central de la nouvelle nodosit. Ce nouveau mode d'infection pidermique direct
aboutit la formation de nodosit de type indtermine. Cependant, aucune indication d'une
possible multiple infection na t signale.
Lexistence dune paire de souches dans la mme nodosit a t signale chez une autre
lgumineuse qui est le soja, ceci a t toutefois rapport non pas sous des conditions
naturelles mais suite une inoculation mixte par ces souches (Linderman et al., 1974). Un
mme rsultat a t obtenu par Johnson et Beringer (1975) dans le cas du pois suite une
inoculation par une paire de souches efficientes de Rhizobium leguminosarum. Deux souches
appartenant mme deux espces diffrentes, Rhizobium leguminosarum bv. trifolii et
Bradyrhizobium ont t identifies dans la mme nodosit dune non lgumineuse Parasponia
andersonii (Trinick et al., 1989). Tous ces travaux indiquent par consquent quune mme
nodosit peut hberger diffrentes souches qui peuvent appartenir une mme espce ou
des espces diffrentes.
Les rsultats de cette analyse permettent de soumettre quelques hypothses thoriques pour
expliquer une telle multiple infection : (i) un haut niveau de compatibilit de l'hte qui
pourrait entrer en symbiose avec plusieurs souches bactriennes afin de couvrir ses besoins en
lments nutritifs azots, (ii) les souches pourraient prsenter des facteurs de reconnaissance
et de nodulation similaires vis--vis de lhte et par consquent une capacit comptitive
identique et (iii) un mode dinfection assez particulier.
CHAPITRE III
CARACTERISATION
PHENOTYPIQUE DES
RHIZOBIA NODULANT LE
LUPIN
Caractrisation phnotypique
.78
1 - INTRODUCTION
La caractrisation phnotypique des diffrentes souches nodulant le lupin nous permettra
dune part de mettre en vidence ltendue des variations phnotypiques qui existent entre les
souches et dautre part dexploiter ces variations pour la slection de candidats pouvant
maintenir une capacit suprieure de fixation dazote sous les variations des facteurs du
milieu. En effet, les facteurs environnementaux affectent tous les aspects de la fixation
symbiotique dazote. Parmi les facteurs les plus importants figurent le pH, la salinit et la
temprature.
Dans le sol, le pH affecte non seulement le dveloppement des bactries mais aussi la
solubilit des diffrents cations mtalliques qui influencent indirectement le dveloppement
bactrien.
Dans les rgions arides ou semi-arides, les tempratures extrmes affectent la survie des
rhizobia. Elles agissent galement sur leur mobilit et sur leur potentiel infectieux en agissant
sur le taux de lhumidit relative du sol (Bordeleau & Prvost, 1994).
La salinit constitue de nos jours une menace srieuse envisager. Elle agit ngativement sur
la persistance et sur le dveloppement des rhizobia (Zahran et al., 1994 ; Graham, 1998).
Pour le bon fonctionnement de la symbiose rhizobia - lupin, une bonne synrgie entre les
deux partenaires symbiotiques et les facteurs dapho- climatiques du milieu est indispensable.
Il est donc primordial didentifier en premier lieu les rhizobia autochtones nouvellement
isols puis slectionner ceux qui peuvent survivre et maintenir une haute performance
symbiotique sous les diffrentes contraintes de lenvironnement.
Dans cette optique, ltude porte sur la dtermination des caractristiques phnotypiques des
souches. Lensemble de ces caractres pourra constituer une base pour ltablissement de
stratgies dinoculations dans diffrentes rgions du pays mais aussi une base dtude de la
diversit phnotypique qui existe entre ces souches autochtones.
Caractrisation phnotypique
.79
2 MATERIEL ET METHODES
Ltude de la diversit phnotypique a t mene pour la caractrisation de 52 souches
nodulant le lupin et qui ont t slectionnes sur la base de la diversit gntique value par
la PCR/REP. La tolrance au pH, la salinit et la temprature a t value pour
lensemble des souches de la collection vu que ces trois paramtres constituent les plus
importants facteurs du stress abiotique. La tolrance ces trois facteurs a t doublement
exploite : dune part pour la slection des candidats les plus tolrants pour des tests
dinoculation de lupin qui seront mens par lINRA de Rabat sur des sols de type calcoalcalins et dautre part dans le cadre de la caractrisation classique tablie pour les rhizobia
nouvellement isols.
Caractrisation phnotypique
.80
relative qui est exprime sous forme du pourcentage de gain en matire sche des parties
ariennes des plantes inocules (PSPi) par rapport aux plantes tmoins non inocules mais qui
ont reu du KNO3 (PSTn) :
ER = PSPi / PSTn x 100
Caractrisation phnotypique
.81
(Difco). Les prcultures frachement prpares ont t utilises pour remplir les puits des
galeries. Les microplaques ont t ensuite places horizontalement 28C pendant 7 jours.
Lutilisation de la source de carbone par la souche se traduit par un trouble bien apparent par
rapport au tmoin.
2. 5 Hydrolyse de lure
Pour chaque souche, 10 l de la prculture frachement prpare dans le milieu YEM ont t
utiliss pour ensemencer des boites contenant le mme milieu solide additionn de 2% dure
et 0,012% de rouge de phnol (Jarvis et al., 1977). Les solutions de ces deux produits ont t
strilises par filtration. Trois rptitions ont t ralises pour chaque souche. Les boites ont
t incubes 28C pendant 24 heures. Les rsultats ont t valus par le changement de la
coloration du milieu. Une coloration rouge indigo indique lhydrolyse de lure alors quune
coloration jauntre indique une raction ngative.
2. 6 Rduction du nitrate
Pour ce test, les souches ont t cultives pendant 5 jours 28C dans du YEM liquide
modifi dpourvu du tampon phosphate mais contenant 0,003% Na2SO4 et une source dazote
sous forme de KNO3 0,1%. Le pH du milieu a t ajust 7 avec du NaOH 5N. Quatre
rptitions ont t ralises pour chaque souche. La rduction du nitrate a t mise en
vidence par laddition de 5 7 gouttes dacide sulphanilique 8 g/l prpar dans de lacide
actique 5N puis quelques gouttes de l-naphthylamine 5 g/l galement prpar dans de
lacide actique 5N. Une raction positive se traduit par une coloration rose ou rouge du
milieu.
Caractrisation phnotypique
.82
2. 9 Tolrance la salinit
La tolrance la salinit a t value pour le NaCl. Le sel a t ajout au milieu avant
autoclavage des concentrations variant de 170 mM 1700 mM. Les boites ont t
ensemences comme dans les tests prcdents et ont t ensuite mises en incubation 28C.
2. 10 Tolrance au pH
Les souches ont t values pour leur tolrance au pH sur du YEM solide 0,1% NaCl aprs
une semaine dincubation 28C et selon la procdure dcrite pour les tests prcdents. Le
pH du milieu a t ajust avec le tampon Homopipes 25 mM pour les valeurs comprises
entre 3 et 5, le tampon MES 20 mM pour les valeurs comprises entre 5 et 7 et par le tampon
phosphate additionn de NaOH 5N pour les valeurs comprises entre 7 et 9,5.
Pour les pH 8,5 ; 9 et 9,5, les tests ont t reconduits sur le milieu YEM liquide pour la
confirmation des rsultats obtenus sur boites.
.83
Caractrisation phnotypique
Control ngatif
Souche
MSMC 5419
Control positif
Figure 12. Photo indiquant des plantes de Lupinus luteus inocules compares au
control ngatif et au control fertilis par du KNO3
Caractrisation phnotypique
.84
2. 11 Tolrance la temprature
Ce test a t ralis comme prcdemment sur du YEM solide 0,1% NaCl, pH 7 et selon la
procdure dcrite prcdemment. La capacit des souches tolrer diffrentes tempratures a
t dtermine aprs une semaine dincubation 4, 10, 15, 20, 30, 35, 38 et 42C.
3 RESULTATS ET DISCUSSION
3. 1 Caractrisation symbiotique
Cette caractrisation a t effectue afin dvaluer la diversit des souches de lupin par leur
potentiel infectieux et fixateur et afin de reprer les souches les plus efficientes.
La capacit symbiotique dune souche de rhizobium est value par deux paramtres : son
infectivit et son efficience. Linfectivit de chaque souche est apprcie par le nombre de
nodosits formes sur la racine de chaque plante. Lefficience est estime par la dtermination
du pourcentage de gain en matire sche de la partie arienne des plantes inocules par
rapport au tmoin azot (figure 12).
Lexprience a t mene en pots pour permettre le bon dveloppement du systme racinaire.
Les plantes ont t dterres au mme stade vgtatif afin que les performances symbiotiques
puissent tre comparables.
.85
Caractrisation phnotypique
A
Petites nodosits en chapelets sur les racines latrales
Souche INRA L 23
Figure 13. Forme des nodosits obtenues sur Lupinus luteus inocul par la souche
MSMC 5419 (A) et la souche INRA L 23 (B).
T0
511
513
514
515
516
517
518
5110
5111
5112
5113
5114
5115
5116
5119
5123
5126
5127
5133
5142
5143
5150
5155
5156
L15
L16
L17
L21
L23
L29
L211
L212
532
536
539
5319
5326
5328
L32
541
5416
549
547
5419
5425
L43
L44
554
556
L51
L52
L61
TN
Efficience relative
T0
511
513
514
515
516
517
518
5110
5111
5112
5113
5114
5115
5116
5119
5123
5126
5127
5133
5142
5143
5150
5155
5156
L15
L16
L17
L21
L23
L29
L211
L212
532
536
539
5319
5326
5328
L32
541
5416
5419
547
549
5425
L43
L44
554
556
L51
L52
L61
TN
Caractrisation phnotypique
.86
120
100
80
60
40
20
Figure 14. Infectivit des souches nodulant le lupin value sur L. luteus
100%
80%
60%
40%
20%
0%
Figure 15. Efficience relative des souches nodulant le lupin value huit semaines aprs
linoculation des plantes.
Caractrisation phnotypique
.87
Les rsultats obtenus montrent que L. luteus a pu tre nodul par toutes les souches testes
mme si elles ont t isoles partir dautres plantes htes. Cette plasticit de nodulation chez
le lupin a t galement rapporte par Jensen et Hansen (1968).
La localisation des nodosits sur le systme racinaire de la plante a montr galement une
grande variabilit. Les nodosits de 7 mm ou plus ont t localises en grande majorit au
dessous du collet alors que les diffrentes nodosits de moindre taille ont t plus dense sur
les racines latrales (figure 13). La forme des nodosits sest rvle galement trs
diversifie tout en refltant les deux formes des nodosits connues : dtermine ou
indtermines (au dessous du collet) et indtermine (sur les racines latrales). En effet, il a
t rapport que les deux formes peuvent exister chez le lupin (Hirsch, 1992, Hirsch et al.,
2001).
Une large variabilit de la capacit infective des souches a t mise en vidence (figure 14).
En effet, mme si linoculation des plantes par les diffrentes souches rapportait un nombre
moyen de bactries de lordre de 108 bact/ml, le nombre moyen des nodosits formes par
plante varie de 8 109. La souche la plus infective est la MSMC 5142 avec 108 nodosits
formes par plante. La souche MSMC 5127, la moins infective, a pu induire la formation de 8
nodosits.
La rponse des plantes linoculation montre diffrentes efficiences relatives (figure 15).
Laugmentation du poids de la matire sche des plantes inocules na dpass en aucun cas
celui des plantes fertilises par lazote minral.
Les efficiences relatives obtenues varient de 35% 87%. Les plus grandes valeurs ont t
obtenues avec les souches MSMC 518 et MSMC 5419 avec 87% et 83% defficience relative
(ER) respectivement. En gnral, les souches se sont rvles trs efficientes. 74% des
souches prsentent une efficience relative suprieure 60%.
Il est important de signaler que toutes les souches qui nont pas t isoles de lespce L.
luteus montrent une efficience suprieure 60%. Alors que les souches isoles de cette espce
prsentent des pourcentages variant de 35% 87%.
Quant aux souches issues de lamas nodulaire, nous remarquons quen dpit de leur prsence
dans la mme structure nodulaire, ces souches prsentent des niveaux trs variables du
potentiel infectieux et il en est de mme pour lefficience relative. La souche la moins
Caractrisation phnotypique
.88
efficiente (MSMC 5115) ainsi que la souche la plus efficiente (MSMC 518) appartiennent
toutes les deux ce groupe. Les souches de lamas nodulaire semblent donc fonctionner en
complmentarit au sein de la nodosit. En outre, lefficience relative de ces souches parat
tre proportionnelle leur capacit infective ( lexception de la souche MSMC 5113) alors
que pour les autres souches de lupin, aucune corrlation entre les deux paramtres
symbiotiques na t enregistre.
Ltude de linfectivit et de lefficience symbiotique a conduit lidentification des souches
qui prsentent le meilleur pouvoir fixateur dazote : MSMC 518, MSMC 5125, MSMC 5126,
MSMC 539 et INRA L 61.
Plusieurs auteurs ont tudi les paramtres symbiotiques de diffrentes souches nodulant le
lupin pour la slection de couples rhizobia - lupin haute performance symbiotique
(Howieson et al., 1988 ; Legocki et al., 1997 ; Kurlovick et al., 1997 ; Hoeflich et al., 1994 ;
Roughley et al., 1993 ; Cheremisov, 1991).
La slection de couples symbiotiques performants de diffrentes espces ou de varits de
lupin et de microsymbiotes complmentaires peut augmenter le rendement de la symbiose. En
effet, Kozhemyakov et al. (2000) ont valu la capacit de la fixation biologique dazote chez
1050 accessions de lupin reprsentant 4 espces dorigine mditerranenne et 16 espces
dorigine amricaine. Les plantes des diffrentes accessions ont t sujettes une inoculation
par diffrentes souches de Bradyrhizobium sp. (Lupinus). Les rsultats ont montr que la
fixation symbiotique dazote varie dune accession une autre et que les souches ont t plus
performantes avec les accessions des plantes sauvages quavec les accessions des plantes
cultives. Dans notre tude, nous avons remarqu que les souches isoles des espces
sauvages de lupin rcoltes au Maroc se sont rvles plus efficientes que celles isoles de
lespce cultive L. luteus.
Rcemment, Younis et al. (2002) ont montr que linoculation de lespce Lupinus varius par
les deux souches TAL 1303 et TAL 1407 de Bradyrhizobium sp. (Lupinus) a permi dobtenir
un bon niveau de nodulation et de fixation dazote sous des conditions de salinit et de stress
hydrique trs accentus en Egypte.
Dans la prsente tude, on sest intress valuer lefficience chez le lupin jaune qui est la
premire espce de lupin au niveau de la culture au Maroc. Toutefois et en raison de la grande
diversit inter- et intraspcifique qui existe entre les diffrentes espces de lupin (Kurlovich,
.89
Caractrisation phnotypique
3h
1h30
1h 15min
1h 15min
2h 30min
1h 15min
1h 15min
45min
45min
45min
1h 45min
1h 45min
1h 15min
1h 15min
1h 10min
1h 30min
1h 55min
1h 25min
1h 40min
1h 5min
1h 25min
2h
1h 35min
2h 10min
2h 5min
1h
1h 5min
6,92
7,1
5,82
5,21
6,96
6,34
6,2
4,86
4,68
4,62
6,76
6,49
7,35
7,22
6,5
5,5
5,4
6,8
6,8
6,2
5,1
5,4
5,4
5,87
6,09
4,96
5,5
INRA L21
INRA L23
INRA L29
INRA L211
INRA L212
2h 5min
1h 50min
4h 45min
1h 50min
1h
7
7,1
6,9
5,3
4,6
L. angustifolius
MSMC 511
MSMC 513
MSMC 514
MSMC 515
MSMC 516
MSMC 517
MSMC 518
MSMC 5110
MSMC 5111
MSMC 5112
MSMC 5113
MSMC 5114
MSMC 5115
MSMC 5116
MSMC 5119
MSMC 5123
MSMC 5126
MSMC 5127
MSMC 5133
MSMC 5142
MSMC 5143
MSMC 5150
MSMC 5155
MSMC 5156
INRA L15
INRA L16
INRA L17
plante Souche
hte
L. Cosentinii
pH
final
L. pilosus
Temps de
gnration
L. atlanticus
L.albus
L. luteus
plante Souche
hte
Temps de
gnration
pH
final
MSMC 532
MSMC 536
MSMC 539
MSMC 5319
MSMC 5326
MSMC 5328
INRA L32
1h 45min
1h 40min
1h 15min
1h 5min
1h 35min
1h 35min
1h 45min
6,4
5,1
6,1
6,5
5,1
6,7
7
MSMC 541
MSMC 547
MSMC 549
MSMC 5416
MSMC 5419
MSMC 5425
INRA L43
INRA L44
1h 25min
1h 25min
1h 25min
1h 20min
1h 30min
1h 25min
2h 15min
1h 15min
5,2
5,4
5,1
5,02
7,5
6,2
6,8
5,2
MSMC 554
MSMC 556
INRA L51
INRA L52
2h 15min
3h 30min
1h 15min
1h 15min
6,18
5,2
5,3
5,3
INRA L61
1h 55min
5,28
Caractrisation phnotypique
.90
1998), il serait ncessaire dvaluer les paramtres symbiotiques des souches bactriennes
avec chaque espce pour slectionner les candidats les plus performants et assurer par
consquent un bon rendement.
.91
Caractrisation phnotypique
% de souches
80
60
40
20
0
G 1h
1h < G 2h
2h < G 3h
3h < G 5h
Temps de gnration
Figure 16. Croissance des souches nodulant le lupin value dans le milieu YEM
Caractrisation phnotypique
.92
est la source de carbone la plus communment utilise dans les diffrents tests de
caractrisation
des rhizobia, on peut noter que nos rsultats sont en accord avec ceux de Jordan (1982). En
outre, les souches de lupin extrmement rapides (MSMC 5110, MSMC 5111, MSMC 5112,
INRA L 16 et INRA L 212) ont t repres comme les souches les plus acidifiantes du
milieu (4.6 pH 4.96).
Il rsulte de ltude de la croissance bactrienne que les rhizobia de lupin croissance rapide
peuvent noduler les diffrentes espces de lupin existantes au Maroc et ceci dans diffrents
sites et rgions du pays. Des rsultats plus ou moins similaires ont t rapports par Pudelko
et Madrzak (1996). Ces derniers ont pu mettre en vidence lexistence de souches croissance
rapide nodulant Lupinus spp. en Pologne. Dautres souches croissance rapide ont t
galement rapportes chez dautres espces de lupin par Schlinkert-Miller et Pepper (1988).
.93
Caractrisation phnotypique
BTB
Plante hte
MSMC 511
MSMC 513
MSMC 514
MSMC 515
MSMC 516
MSMC 517
MSMC 518
MSMC 5110
MSMC 5111
MSMC 5112
MSMC 5113
MSMC 5114
MSMC 5115
MSMC 5116
MSMC 5119
MSMC 5123
MSMC 5126
MSMC 5127
MSMC 5133
MSMC 5142
MSMC 5143
MSMC 5150
MSMC 5155
MSMC 5156
INRA L15
INRA L16
INRA L17
0
0
0
1
0
1
1
1
1
1
0
0
0
0
1
1
1
0
0
1
1
0
0
0
1
1
1
MSMC 521
INRA L211
INRA L212
INRA L21
INRA L23
INRA L29
1
1
0
1
1
1
Souches
BTB
0
0
0
1
0
0
1
MSMC 541
MSMC 547
MSMC 549
MSMC 5416
MSMC 5419
MSMC 5425
INRA L43
INRA L44
1
1
0
1
1
1
1
0
MSMC 554
MSMC 556
INRA L51
INRA L52
1
1
1
0
INRA L61
L. Cosentinii
MSMC 532
MSMC 536
MSMC 539
MSMC 5319
MSMC 5326
MSMC 5328
INRA L32
L. pilosus
Souches
L. atlanticus
L.albus
L. luteus
Plante hte
L. angustifolius
1 reprsente une raction acide ; 0 reprsente une raction neutre ou lgrement alcaline
Assimilation
source de carbone
Figure 17. Assimilation de diffrents substrats carbons par les souches nodulant le lupin
0%
20%
40%
60%
80%
100%
Caractrisation phnotypique
.94
.95
Caractrisation phnotypique
Glucose
78%
Fructose 100%
Galactose 95%
L-Sorbose 0%
Pentoses
Xylose
87%
Rhamnose
68%
Polyols
Glycrol
100%
Mannitol 100%
Inositol
60%
Sorbitol
68%
Saccharose 73%
Cellobiose 78%
Maltose
82%
Melibiose
40%
Raffinose 68%
Melizitose 8%
Hexosans
L-Arabinose 100%
Polysaccharides
Monosaccharides
Mannose 85%
Trisaccharides
Hexoses
Disaccharides
Amidon
8%
Inuline
4%
Glycogne 4%
Glucosides
Amygdaline 32%
Esculine
75%
Caractrisation phnotypique
.96
Toutefois, des souches de Bradyrhizobium raction acide ont t rapportes par Moreira et
al. (1993). De mme, des souches croissance rapide alcalinisant le milieu ont t mises en
vidence (Hernandez et Focht, 1984).
.97
INRA L15
Groupe 3
MSMC 5419
et INRA L43
Groupe 2
Groupe 1
Caractrisation phnotypique
MSMC 511
MSMC 5116
MSMC 513
INRA L21
MSMC 5114
MSMC 5115
INRA L23
MSMC 556
INRA L29
INRA L44
INRA L32
MSMC 516
MSMC 517
INRA L52
MSMC 518
MSMC 5112
MSMC 5111
INRA L17
INRA L212
INRA L51
INRA L16
MSMC 5110
MSMC 5150
MSMC 5142
MSMC 5326
MSMC 554
INRA L211
MSMC 549
MSMC 5416
MSMC 541
MSMC 5425
INRA L61
MSMC 5126
MSMC 5143
MSMC 547
MSMC 5419
INRA L43
MSMC 514
MSMC 536
MSMC 5123
MSMC 5113
MSMC 5119
MSMC 5319
MSMC 5133
MSMC 532
MSMC 5328
MSMC 5155
MSMC 5156
MSMC 539
MSMC 515
MSMC 5127
INRA L15
100
90
80
70
60
50
% de similarit
Figure 18. Dendrogramme indiquant les affinits dassimilation entre les souches nodulant le
lupin
Caractrisation phnotypique
.98
Plusieurs tudes ont rapport la variabilit de la nutrition carbone chez les rhizobia (Graham,
1964 ; Zhang et al., 1991 ; Stowers et Eaglesham, 1984). Ces mmes auteurs ont confirm
lexistence de la variabilit de lutilisation des substrats carbons entre les rhizobia et les
bradyrhizobia. Les souches croissance rapide possdent une prfrence pour les hexoses, les
pentoses, les disaccharides ainsi que les acides organiques (Stowers, 1985 ; van Rossum et al.,
1995). Un mme rsultat a t rapport par Lindstrm et Lehtomaki (1988) pour des souches
de Rhizobium galeagae. Les souches croissance lente prsentent une utilisation rare pour les
monosaccharides et une utilisation variable pour les disaccharides (Jordan, 1984). Des
rsultats similaires ont t rapports par Xu et al. (1995) pour Bradyrhizobium liaoningense et
Bradyrhizobium japonicum.
Lutilisation des sucres et des acides organiques par les rhizobia reprsente un aspect
intressant et essentiel pour la culture au laboratoire. Cependant dans le sol, la croissance des
rhizobia dpend principalement de composs aromatiques. Lutilisation de ces derniers
comme seule source de carbone a t rapporte aussi bien chez les souches croissance rapide
que chez les souches croissance lente. Les bradyrhizobia montrent toutefois une large
utilisation de ces composs (Parke et Ornston, 1984).
Selon Stowers (1985), il existe trois voies principales du catabolisme des substrats carbons
entre les rhizobia croissance rapide de type Rhizobium et Sinorhizobium et les souches
croissance lente de type Bradyrhizobium :
la voie dEntner-Doudoroff, qui est galement la voie principale du mtabolisme
des hexoses.
la voie dEmbden-Meyerhof-Parmas, qui est variable dune souche de rhizobium
une autre. Cette voie repose sur lactivit de lenzyme phosphofructokinase.
la voie du Pentose Phosphate, observe uniquement chez les souches croissance
rapide. Elle dpend principalement de lenzyme 6-phosphogluconate (6-PG) dshydrognase
NADP dpendante.
Les souches tudies ont prsent 100% dassimilation du gluconate ce qui prouve que la 6PG dshydrognase est prsente chez toutes les souches. En outre, lexistence de cet enzyme a
t rapporte uniquement chez les rhizobia croissance rapide. Le rsultat obtenu nous
permet donc de confirmer sur une base mtabolique le taux de croissance rapide des souches.
.99
Caractrisation phnotypique
Tableau 10. Hydrolyse de lure et rduction du nitrate par les souches nodulant le lupin
Nitrate
Plante hte
L.albus
Ure
Souches
Ure Nitrate
MSMC 521
INRA L211
ND
INRA L212
ND
INRA L21
ND
MSMC 513
MSMC 514
INRA L23
ND
MSMC 515
INRA L29
ND
MSMC 516
MSMC 517
MSMC 532
MSMC 518
MSMC 536
MSMC 5110
MSMC 539
MSMC 5111
MSMC 5319
MSMC 5112
ND
MSMC 5326
MSMC 5113
MSMC 5328
MSMC 5114
INRA L32
ND
MSMC 5115
MSMC 5116
MSMC 541
MSMC 5119
ND
MSMC 547
ND
MSMC 5123
MSMC 549
ND
MSMC 5126
MSMC 5416
MSMC 5127
ND
MSMC 5419
MSMC 5133
MSMC 5425
MSMC 5142
INRA L43
ND
MSMC 5143
INRA L44
ND
MSMC 5150
MSMC 5155
MSMC 554
MSMC 5156
MSMC 556
INRA L15
ND
INRA L51
ND
INRA L16
ND
INRA L52
ND
INRA L17
ND
INRA L61
ND
L. cosentinii
L. ngustifolius
MSMC 511
L. atlanticus L. pilosus
L. luteus
1 reprsente une raction positive, 0 reprsente une raction ngative, ND = rsultat indtermin
.100
Caractrisation phnotypique
Il rsulte de cette tude que les souches testes de lupin prsentent une assimilation de sources
de carbone nettement similaire celle des souches croissance rapide.
nitrate rductase
NAD(P)H+H+
NO2-
NAD(P)+
Caractrisation phnotypique
.101
dautres travaux ont montr que le nitrate affecte la comptition des souches de
Bradyrhizobium japonicum pour infecter le soja (Martensson et al., 1989).
Laptitude hydrolyser lure et rduire le nitrate est une caractristique cologiquement
importante dont il faut tenir compte pour la slection dune souche particulire. En fait, un
excs de nitrate dans le sol peut exercer un effet inhibiteur sur ladsorption des rhizobia sur la
surface des racines (Sherwood et al., 1984) ainsi que sur leur capacit infective et effective
(Davidson et Robson, 1986 ; Arreseigor et al., 1997).
.102
Caractrisation phnotypique
80%
60%
40%
20%
0%
Tetr 10
Tetr 50
Strep 10
Strep 50
Spec 10
Spec 50
Spec 100
Chl 10
Chl 50
Chl 100
Kan 10
Kan 25
Amp 100
Amp 200
Nal ac 10
Nal ac 50
Ery 100
Ery 200
% Souches tolrantes
100%
Antibiotiques (g/ml)
Figure 19. Effet des antibiotiques sur la croissance des souches nodulant le lupin
.103
Caractrisation phnotypique
Tableau 11. Rsistance intrinsque des souches nodulant le lupin diffrents types
dantibiotiques.
L. luteus
Plante
hte
Souches
Antibiotiques (g/ml)
Tetr.
Strep.
Spec.
Chl.
Kan.
Amp.
Nal.
Ery.
MSMC 511
< 10
50
100
100
< 10
200
50
200
MSMC 513
< 10
50
100
100
< 10
200
50
200
MSMC 514
50
50
10
100
< 10
200
50
200
MSMC 515
< 10
< 10
50
50
< 10
100
< 10
200
MSMC 516
10
50
100
100
< 10
100
50
200
MSMC 517
< 10
< 10
50
50
< 10
100
< 10
200
MSMC 518
< 10
< 10
50
100
< 10
100
< 10
200
MSMC 5110
50
50
50
100
< 10
200
50
200
MSMC 5111
< 10
< 10
50
50
< 10
200
10
200
MSMC 5112
< 10
< 10
50
50
< 10
100
10
200
MSMC 5113
10
50
50
100
< 10
200
50
200
MSMC 5114
< 10
10
100
100
< 10
200
50
200
MSMC 5115
10
50
100
100
< 10
200
50
200
MSMC 5116
50
50
50
50
25
100
50
200
MSMC 5119
50
50
10
100
< 10
100
50
100
MSMC 5123
10
10
10
100
< 10
200
50
200
MSMC 5126
50
10
100
100
10
200
50
200
MSMC 5127
< 10
< 10
10
50
< 10
200
10
200
MSMC 5133
10
10
100
100
< 10
200
50
200
MSMC 5142
< 10
< 10
< 10
10
< 10
15
10
100
MSMC 5143
50
10
50
100
< 10
200
50
200
MSMC 5150
10
50
50
100
< 10
200
50
200
MSMC 5155
10
10
50
100
< 10
200
50
200
MSMC 5156
10
10
100
50
10
200
50
200
INRA L15
50
< 10
10
50
< 10
200
10
200
INRA L16
50
50
100
50
25
200
50
200
INRA L17
50
10
100
100
< 10
200
50
200
.104
Caractrisation phnotypique
L. atlanticus
L. pilosus
L. cosentinii
L. angustifolius
L. albus
Souches
Antibiotiques (g/ml)
Tetr.
Strep.
Spec.
Chl.
Kan.
Amp.
Nal.
Ery.
INRA L21
< 10
50
100
100
25
200
50
200
INRA L211
10
50
50
100
< 10
15
50
200
INRA L212
10
10
50
100
< 10
15
50
100
INRA L23
50
< 10
< 10
50
< 10
15
50
ND
INRA L29
10
< 10
< 10
50
< 10
15
50
200
MSMC 532
50
50
< 10
100
< 10
200
10
< 25
MSMC 536
50
10
10
100
< 10
200
50
200
MSMC 539
< 10
50
10
100
< 10
200
50
20
MSMC 5319
< 10
50
10
100
< 10
200
50
25
MSMC 5326
50
50
100
100
25
200
50
200
MSMC 5328
< 10
10
10
< 10
10
200
50
25
INRA L32
< 10
50
100
100
25
200
50
200
MSMC 541
10
50
10
100
< 10
200
50
200
MSMC 547
50
10
10
50
< 10
100
< 10
200
MSMC 549
< 10
10
50
100
< 10
200
50
200
MSMC 5416
< 10
< 10
10
50
< 10
< 15
50
100
MSMC 5419
10
10
10
100
< 10
200
< 10
200
MSMC 5425
50
50
100
100
25
200
50
200
INRA L43
50
50
100
100
25
200
50
200
INRA L44
10
< 10
10
50
25
100
50
200
MSMC 554
50
50
100
100
< 10
200
50
200
MSMC 556
< 10
< 10
50
10
< 10
< 15
50
200
INRA L51
10
10
10
50
< 10
200
50
200
INRA L52
50
50
100
100
10
200
50
200
INRA L61
50
10
100
100
10
200
50
200
Caractrisation phnotypique
.105
Paralllement nos rsultats, les trois derniers antibiotiques prcits se sont rvls les plus
inhibiteurs de la croissance de quelques souches croissance rapide de lupin (Schlinkert et
Pepper, 1988). La Kanamycine sest rvle galement lantibiotique le plus inhibiteur de la
croissance de certaines souches de Bradyrhizobium nodulant le lupin en Pologne (Madrzak et
al., 1995) et de quelques souches nodulant diffrentes espces dAcacia au Maroc (Zerhari et
al., 2000).
La sensibilit de diffrentes souches de lupin la streptomycine a t galement rapporte
(Gabor, 1965). La mme sensibilit a t rapporte pour des souches croissance rapide
dAcacia (Mohammed et al., 2000).
Jordan (1984) a montr que les souches croissance rapide sont plus sensibles la
ttracycline et la streptomycine alors que les bradyrhizobia sont plus rsistants aux
antibiotiques. Le mme rsultat a t rapport par Elkan (1992) et Mpepereki et al. (1997).
Cependant, des souches de Rhizobium hautement tolrantes aux antibiotiques ont t isoles
de diffrents sols de Malaisie (Roughley et al., 1992). Paralllement, Odee et al. (1997) ont
montr que les bradyrhizobia sont plus sensibles que les souches croissance rapide vis--vis
de diffrents antibiotiques tests la mme concentration de 40 g/ml.
Lvaluation de la rsistance des souches de lupin aux diffrents antibiotiques tests a montr
que les profils sont gnralement similaires ceux des souches croissance rapide concernant
la kanamycine, la ttracycline et la streptomycine. Toutefois, les souches montrent une grande
tolrance lrythromycine et lampicilline.
La slection de souches prsentant une rsistance multiple aux diffrents antibiotiques est trs
intressante du fait que cette rsistance peut tre utilise comme un important marqueur pour
lidentification des souches et ltude de leur diversit (Josey et al., 1979 ; Shishido et Pepper,
1990 ; Sawada et al, 1990).
.106
Caractrisation phnotypique
Tableau 12. Rsistance intrinsque des souches nodulant le lupin aux mtaux lourds
L. luteus
MSMC 511
Al
400
Mn
400
Zn
400
Cd
30
Hg
40
Co
100
MSMC 513
400
400
400
30
100
MSMC 514
300
400
200
40
< 100
MSMC 515
400
400
400
30
40
100
MSMC 516
400
400
400
30
40
100
MSMC 517
400
400
400
30
40
100
MSMC 518
400
400
400
30
40
100
MSMC 5110
400
400
400
30
40
< 100
MSMC 5111
400
400
400
30
40
100
MSMC 5112
400
400
200
40
100
MSMC 5113
300
400
400
30
40
< 100
MSMC 5114
200
400
400
20
40
< 100
MSMC 5115
400
400
400
40
< 100
MSMC 5116
400
400
< 200
30
40
100
MSMC 5119
400
200
< 200
<5
40
< 100
MSMC 5123
200
400
< 200
40
< 100
MSMC 5126
400
400
400
30
40
< 100
MSMC 5127
400
400
200
40
< 100
MSMC 5133
400
400
300
40
< 100
MSMC 5142
400
200
400
40
< 100
MSMC 5143
400
400
400
30
40
< 100
MSMC 5150
200
200
< 200
40
100
MSMC 5155
300
200
300
30
< 100
MSMC 5156
400
400
< 200
30
< 100
INRA L15
400
200
400
30
< 100
INRA L16
400
200
400
30
< 100
INRA L17
400
400
400
30
100
.107
Caractrisation phnotypique
L. atlanticus
L. pilosus
L. cosentinii
L. angustifolius
L. albus
Mn
Zn
Cd
Hg
Co
INRA L21
400
400
400
30
100
INRA L211
400
400
400
30
< 100
INRA L212
400
400
400
30
100
INRA L23
400
400
400
30
100
INRA L29
400
400
400
30
< 100
MSMC 532
200
400
< 200
40
< 100
MSMC 536
200
400
200
30
40
< 100
MSMC 539
400
400
< 200
40
< 100
MSMC 5319
300
400
300
40
100
MSMC 5326
400
400
200
30
40
< 100
MSMC 5328
300
400
< 200
30
20
< 100
INRA L32
400
400
400
30
100
MSMC 541
400
400
400
30
40
< 100
MSMC 547
400
400
400
30
40
< 100
MSMC 549
400
400
< 200
20
40
< 100
MSMC 5416
400
400
< 200
40
100
MSMC 5419
400
400
200
20
40
< 100
MSMC 5425
400
400
400
30
40
< 100
INRA L43
400
400
400
30
100
INRA L44
400
200
400
30
100
MSMC 554
400
400
400
30
40
< 100
MSMC 556
400
400
400
40
< 100
INRA L51
400
200
400
30
20
100
INRA L52
400
400
400
30
20
100
INRA L61
400
400
400
30
20
100
.108
Caractrisation phnotypique
80%
60%
40%
20%
Co 100
Hg 40
Hg 20
Hg 5
Cd 30
Cd 20
Zn 400
Zn 300
Mn 400
Mn 300
Alu 400
0%
Alu 300
% Souches tolrantes
100%
Caractrisation phnotypique
.109
inhibiteurs pour le dveloppement des souches. Toutefois, les souches de lamas nodulaire
sont majoritairement rsistantes ces deux formes de mtaux. Toutefois, les niveaux de
rsistance aux diffrents mtaux tests taient gnralement similaires entre les diffrentes
souches.
La figure 20 indique que plus de 80% des souches montrent une grande rsistance
laluminium et au manganse la concentration de 400 g/ml. A la mme concentration en
zinc, plus de 60% des souches se sont rvles galement rsistantes. Contrairement nos
rsultats, Zerhari et al. (2000) a montr que les souches dacacia croissance rapide taient
plus sensibles laluminium.
Il a t rapport que laluminium agit au niveau de lADN des souches de Rhizobium
(Johnson et Wood, 1990). Lexposition de ces bactries aux fortes concentrations en
aluminium affecte galement leur mobilit dans le sol et leur capacit infective (Octive et al.,
1994).
Lexposition un excs de manganse affecte la composition de la membrane externe chez
les rhizobia. En fait, Appana (1988) a montr que les fortes concentrations en manganse
peuvent altrer la composition ainsi que le rle des exopolysaccharides chez des souches de
Sinorhizobium meliloti.
Wilson et Reisensauer (1970) ont rapport que le manganse et le zinc affectent ngativement
la croissance des rhizobia. Un excs de zinc exerce un effet inhibiteur non seulement sur la
croissance des rhizobia mais aussi sur leur efficience travers la perte des plasmides
symbiotiques (Casella et al., 1988 ; Giller et al., 1998).
La rsistance des souches de lupin aux diffrentes concentrations testes en cadmium et en
mercure parait tre semblable. Ces deux mtaux ont t tests de faibles concentrations et
les rsultats confirment quils sont les plus inhibiteurs de la croissance. La taille des colonies
formes a t galement et visiblement trs rduite par rapport celle des tmoins.
Actuellement, le cadmium est reconnu comme tant nfaste aussi bien pour les
microorganismes symbiotiques que pour ltablissement de la symbiose (Tiller et al., 1994 ;
Purchase et al., 1997 ; Gusmao-lima et al., 2005).
Le cobalt test 100 g/ml a pu entraner linhibition de la croissance de plus de 50% des
souches. Il a t rapport que les fortes concentrations en cobalt agissent ngativement sur la
Caractrisation phnotypique
.110
croissance des souches de Bradyrhizobium japonicum (Lowe et al., 1960). Ce mtal exerce un
effet ngatif sur la survie des rhizobia de lupin, sur linitiation nodulaire ainsi que sur la
colonisation de la rhizosphre par ces bactries (Riley et Dilworth, 1985).
Les mtaux lourds prsents dans le sol peuvent entraner un disfonctionnement du
mtabolisme cellulaire des rhizobia (Gusmao-lima et al., 2005). Le nombre et la survie de ces
bactries dans les sols contamins peuvent tre svrement affects (Reddy et al., 1983 ;
Obbard et al., 1994).
Angle et al. (1993) ainsi que Tong et Sadowsky (1994) ont rapport que les souches de
Bradyrhizobium sont plus rsistantes aux mtaux lourds puisquils ont la capacit dalcaliniser
le milieu et rendre ainsi les mtaux moins disponibles dans leur environnement. Cependant,
une grande variabilit de rsistance diffrents mtaux lourds a t observe entre les souches
appartenant la mme espce Bradyrhizobium japonicum (Kinkle et al., 1987).
La nature du sol et son pH peuvent influencer la prcipitation ou la solubilit des minraux.
Sous forme ionique, un mtal devient plus mobile et donc plus toxique. Leffet combin du
pH et des mtaux lourds sur une population de Rhizobium leguminosarum et sur son potentiel
fixateur dazote sest rvl plus nfaste sous les conditions dacidit (Ibekwe et al., 1997).
Certaines associations rhizobium lgumineuse sont capables de se maintenir sur des sols
haut contenu en mtaux lourds. En effet, linoculation des graines de trfle cultives sous
stress mtallique par des souches de Rhizobium leguminosarum bv. trifolii efficientes et
rsistantes aux mtaux lourds a pu augmenter le taux de la fixation dazote (Giller et al.,
1989). Linoculation de Glycine max par des rhizobia hautement rsistants a t rapporte tre
bnfique (Dev et al., 1998).
La slection de souches rsistantes aux mtaux lourds prsente un grand intrt pratique.
Plusieurs recherches se penchent actuellement sur lutilisation de la symbiose entre des
rhizobia et des lgumineuses rsistantes comme un moyen efficace de bio-remdiation
contre la contamination des sols par les mtaux lourds. En outre, lutilisation du rhizobium
comme un agent de prvention dans les sols contamins a t rcemment rapporte par Abbes
et Kamel (2004).
Caractrisation phnotypique
.111
3. 8 Tolrance la salinit
Les souches tudies se sont avres trs tolrantes des concentrations leves en NaCl
(Tableaux 13 et Annexe 14). La limite de tolrance des souches au sel stend de 170 mM
avec la souche INRA L52 jusqu 1700 mM avec 9% de souches en loccurrence la MSMC
5124, INRA L 213, INRA L 34, MSMC 5411 et autres. Particulirement, les souches de
lamas nodulaire prsentent diffrentes marges de tolrance qui se situent entre 680 mM et
1530 mM.
La figure 21 montre que la tolrance la salinit diminue progressivement en fonction de
laugmentation de la concentration en sel. Toutefois 80 % des souches peuvent tolrer une
concentration de 850 mM NaCl et presque 60% tolrent plus de 1M NaCl. Des souches
hautement tolrantes (9% des souches) pouvant crotre 1700 mM NaCl ont t galement
identifies.
Raza et al. (2001) ont isol des souches de lupin pouvant tolrer jusqu 1190 mM NaCl.
Paralllement nos rsultats, Zahran et al. (1994) ont rapport des niveaux de tolrance chez
des souches de lupin isoles dEgypte pouvant aller jusqu 1700 mM NaCl. Les rhizobia
darbres lgumineux sont supposs tre plus tolrants la salinit. Des souches nodulant
Acacia, Prosopis et Leucaena se sont rvles tolrantes 500 mM et 850 mM NaCl (Lal et
Khanna, 1995 ; Zerhari et al., 2000). Toutefois, un dveloppement a une concentration saline
de 850 mM et mme plus a t rapport pour diffrentes souches nodulant des plantes
annuelles cultives ou fourragres au Maroc. Matallah et al. (2002) ont pu identifier des
souches nodulant le pois chiche qui tolrent 850 mM NaCl. Des rhizobia nodulant le
funegreck sont capables de crotre une concentration en NaCl aussi leve que 2380 mM
(14%) (Abdelmoumen et al., 1999).
Les limites de tolrance la salinit entre les rhizobia peuvent varier considrablement dune
espce une autre (Elsheikh et Wood, 1989 ; Rai, 1983) et mme entre les souches de la
mme espce (Kassem et al., 1985).
Graham et Parker (1964) ont montr que les souches croissance rapide sont plus tolrantes
la salinit que les bradyrhizobia. Des rsultats similaires ont t galement rapports par
plusieurs auteurs (Jordan, 1984 ; Stowers et Elkan, 1984 ; Elsheikh et Wood, 1989 ; Odee et
al., 1997). Toutefois, des souches croissance lente nodulant le genre Vigna pouvant tolrer
des concentrations leves en NaCl de lordre de 4 % 5,5 % ont t caractrises par
.112
Caractrisation phnotypique
80%
60%
40%
20%
1700mM
1530mM
1360mM
1190mM
1020mM
850mM
680mM
510mM
340mM
0%
170mM
% Souches tolrantes
100%
Concentration en NaCl
Figure 21. Tolrance des souches nodulant le lupin diffrentes concentrations en NaCl
.113
Caractrisation phnotypique
L. luteus
NaCl (mM)
pH (units)
T (C)
850
1360
850
1020
1360
850
1530
1530
1530
850
1530
1530
1020
680
850
680
850
1020
1020
680
680
850
1020
1700
850
850
1530
1360
850
1530
1700
850
850
1530
1530
850
1360
1530
1530
1530
1530
1530
4.5 9,5
3 9,5
4.5 - 9,5
4.5 - 9,5
3 - 9,5
4.5 - 9,5
4.5 - 9,5
4.5 - 9,5
4.5 - 9,5
4 - 9,5
3 9,5
3 9,5
4 9,5
4 9,5
4 9,5
4 9,5
4 9,5
4 9,5
4.5 9,5
5 9,5
4.5 9,5
4.5 9,5
4.5 9,5
3.5 9,5
3.5 9,5
3 9,5
3.5 9,5
3.5 9,5
3.5 9,5
3.5 9,5
3.5 9,5
4.5 9,5
4.5 9,5
3 9,5
4.5 9,5
5 9,5
3 9,5
3 9,5
3 9,5
3 9,5
3.5 9,5
3 9,5
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
15 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
.114
Caractrisation phnotypique
L. albus
L. luteus
Souches
NaCl (mM)
pH (units)
T (C)
MSMC 5143
MSMC 5144
MSMC 5145
MSMC 5146
MSMC 5147
MSMC 5148
MSMC 5149
MSMC 5150
MSMC 5151
MSMC 5152
MSMC 5153
MSMC 5154
MSMC 5155
MSMC 5156
MSMC 5157
MSMC 5158
MSMC 5159
MSMC 5160
INRA L11
INRA L12
INRA L13
INRA L14
INRA L15
INRA L16
INRA L17
INRA L18
INRA L19
1530
1530
1360
1360
1360
1530
850
850
1360
510
1360
680
850
850
1360
680
1020
1190
1700
850
1700
1700
1700
1530
1360
1360
1700
3 9,5
3 9,5
3 9,5
4.5 9,5
3.5 9,5
3 9,5
4.5 9,5
4 9,5
3 9,5
3.5 9,5
3 9,5
3 9,5
3 9,5
4 9,5
3.5 9,5
4.5 9,5
3 9,5
3 9,5
4 9,5
4 9,5
3.5 9,5
3.5 9,5
4 9,5
4 9,5
4 9,5
4 9,5
3.5 9,5
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 35
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
10 42
4 42
4 35
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
MSMC 521
MSMC 522
INRA L21
INRA L210
INRA L211
INRA L212
INRA L213
INRA L23
INRA L24
INRA L26
INRA L27
INRA L28
INRA L29
1190
1020
1530
1530
1360
1190
1700
1530
680
850
680
680
680
3.5 - 9,5
4 9,5
4 9,5
3.5 9,5
4 9,5
4 9,5
3.5 9,5
5.5 9,5
4 9,5
4 9,5
5 9,5
4 9,5
3.5 9,5
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
10 42
4 42
4 42
4 42
10 - 42
.115
Caractrisation phnotypique
L. angustifolius
Souches
MSMC 531
MSMC 532
MSMC 533
MSMC 534
MSMC 535
MSMC 536
MSMC 537
MSMC 538
MSMC 539
MSMC 5310
MSMC 5311
MSMC 5312
MSMC 5313
MSMC 5314
MSMC 5315
MSMC 5316
MSMC 5317
MSMC 5318
MSMC 5319
MSMC 5320
MSMC 5321
MSMC 5322
MSMC 5323
MSMC 5324
MSMC 5325
MSMC 5326
MSMC 5327
MSMC 5328
MSMC 5329
MSMC 5330
MSMC 5331
MSMC 5332
MSMC 5333
MSMC 5334
INRA L31
INRA L32
INRA L33
INRA L34
INRA L35
INRA L36
INRA L37
INRA L38
NaCl (mM)
pH (units)
T (C)
510
340
850
850
850
680
850
1020
1190
680
680
850
850
850
1020
1190
340
1020
680
1530
850
850
850
1020
1020
680
1020
340
850
680
1020
1360
1020
1360
850
1530
680
1700
1360
1700
680
680
3 9,5
3 9,5
4 9,5
4 9,5
4 9,5
4 9,5
3.5 9,5
4 9,5
4 9,5
4 9,5
4 9,5
4 9,5
4 9,5
4.5 9,5
4.5 9,5
3.5 9,5
4.5 9,5
3 9,5
4 9,5
3 9,5
3 9,5
3 9,5
4 9,5
3 9,5
3 9,5
4.5 9,5
3 9,5
4.5 9,5
4.5 9,5
4.5 9,5
3 9,5
4 9,5
3 9,5
4 9,5
3.5 9,5
4 9,5
4 9,5
3.5 9,5
4 9,5
4 9,5
4 9,5
4 9,5
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
10 42
4 35
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
10 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
10 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 35
4 42
4 35
4 35
4 42
4 42
.116
Caractrisation phnotypique
L. atlanticus
L. pilosus
L. cosentinii
Souches
NaCl (mM)
pH (units)
T (C)
MSMC 541
MSMC 542
MSMC 543
MSMC 544
MSMC 545
MSMC 546
MSMC 547
MSMC 548
MSMC 549
MSMC 5410
MSMC 5411
MSMC 5412
MSMC 5413
MSMC 5414
MSMC 5415
MSMC 5416
MSMC 5417
MSMC 5418
MSMC 5419
MSMC 5420
MSMC 5421
MSMC 5422
MSMC 5423
MSMC 5424
MSMC 5425
INRA L41
INRA L42
INRA L43
INRA L44
1360
1360
1190
1190
1360
1360
1190
680
1530
1530
1700
1700
850
1530
1700
1530
1530
680
850
850
510
680
1190
1700
1360
680
680
850
340
3 9,5
3 9,5
4.5 9,5
4.5 9,5
3 9,5
3 9,5
3 9,5
4.5 9,5
4 9,5
3.5 9,5
3.5 9,5
3 9,5
3 9,5
3 9,5
3 9,5
3 9,5
3 9,5
4 9,5
4 9,5
5 9,5
4.5 9,5
3 9,5
3.5 9,5
4 9,5
3 9,5
4 9,5
4 9,5
3.5 9,5
3.5 9,5
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
10 42
4 - 42
MSMC 551
MSMC 552
MSMC 553
MSMC 554
MSMC 555
MSMC 556
MSMC 557
MSMC 558
MSMC 559
MSMC 5510
MSMC 5511
MSMC 5512
INRA L51
INRA L52
1190
340
1530
850
1530
510
1530
1020
1020
1530
1020
1020
1530
170
3.5 9,5
4 9,5
3 9,5
3 9,5
3 9,5
4.5 9,5
3 9,5
3 9,5
3 9,5
3.5 9,5
3 9,5
3 9,5
4 9,5
5 9,5
4 - 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 - 42
10 - 42
INRA L61
1190
5 9,5
4 - 42
Caractrisation phnotypique
.117
Mpepereki et al. (1997). Des tudes ont montr cependant que la tolrance au sel nest pas
corrle avec le taux de croissance (Zerhari et al., 2000) mais dautres mcanismes
physiologiques et biochimiques (Botsford et Lewis, 1990 ; Brhada et al., 1997 ; Gouffi et al.,
1999).
Nous avons not que les souches MSMC 5317 et INRA L 52 qui proviennent des rgions non
irrigues ont t inhibes par les basses concentrations testes de 170 mM et 340 mM NaCl
alors que les souches qui proviennent de sites des rgions irrigues telles que les souches
isoles de L. luteus dans la rgion du Gharb sont toutes tolrantes au sel. Le Gharb est class
comme tant une rgion menace par une salinisation croissante du sol. La tolrance au sel
qui caractrise les souches tudies pourrait tre en rapport avec le taux de salinit du site
disolement. Un rsultat similaire a t rapport par Matallah et al. (2002) pour des souches
de Mesorhizobium nodulant le pois chiche au Maroc et par Mohammed et al. (2000) pour des
souches nodulant Acacia en Libye.
Mpepereki et al. (1997) ont rapport que lexistence de souches tolrantes la salinit dans
les sites salins peut tre une indication dune adaptation au stress osmotique qui est d
laugmentation de la concentration dions et la variation de lhumidit du sol durant les
priodes sches.
Dans cette tude, nous avons not que la majorit des souches prsentent une bonne tolrance
la salinit. Cependant, dans les environnements salins, la symbiose rhizobia - lupin dpend
non seulement du microorganisme mais galement de la plante hte. Il a t rapport que
lespce L. angustifolius peut se dvelopper un niveau de salinit de sol trs lev
(Bordeleau et Prvost, 1994). Cependant, Cette espce est trs riche en alcalodes et se trouve
au Maroc essentiellement ltat sauvage.
La slection de couples symbiotiques tolrants la salinit reste llment essentiel pour
lamlioration de la symbiose sous des conditions de stress salin.
3. 9 Tolrance au pH
Les rsultats de la tolrance aux pH acides et alcalins de lensemble des souches de la
collection sont prsents dans le tableau 13. Les pH alcalins sont plus tolrs que les pH
acides. Les souches, y compris ceux de lamas nodulaire, ont pu toutes tolrer la grande
valeur de pH teste qui est de 9,5. La tolrance lacidit sest rvle par contre trs variable
Caractrisation phnotypique
.118
.119
Caractrisation phnotypique
80%
60%
40%
20%
pH
Figure 22. Tolrance aux pH des souches nodulant le lupin
9,5
4,5
3,5
0%
3
% souches tolrantes
100%
Caractrisation phnotypique
.120
3. 10 Tolrance la temprature
Les rsultats indiquant les marges de tolrance la temprature des souches de lupin sont
reprsentes dans le tableau 13. La totalit des souches de lamas nodulaire et la plupart des
autres souches tolrent des tempratures variant de 4 42C. La souche 5135 ne prsente
aucun dveloppement des tempratures infrieures 15C et 5% de souches sont inhibes
par les tempratures infrieures 10C (INRA L12, INRA L24, INRA L 29, MSMC 536 et
autres). Certaines souches ne peuvent pas tolrer des tempratures suprieures 35C, cest le
cas de 4% de souches telles que la MSMC 5156, INRA L 14, MSMC 537, etc. Il rsulte de ce
Caractrisation phnotypique
.121
test que la majorit des souches prsentent une bonne thermotolrance tant aux basses quaux
hautes tempratures.
La figure 23 montre que toutes les souches prsentent une bonne croissance entre 10C et
35C. En outre, 95 % des souches ont pu crotre 4C et 38C et peuvent mme supporter
une temprature de 42C.
Les souches thermotolrantes peuvent ne pas crotre une temprature leve dtermine
mais peuvent plutt survivre un rythme trs ralenti. Ceci a t mis en vidence par le suivi
de la croissance de la souche MSMC 5110 aux tempratures de 28C et 42C. A 28C, le
temps de gnration a t valu 45min. alors qu 42C la DO ne dpassait gure la valeur
de 0,64 mme aprs 15 jours dincubation.
Graham (1992) a rapport que les rhizobia sont des bactries msophiles qui peuvent se
dvelopper des tempratures se situant entre 10C et 37C et que la temprature optimale de
croissance de la plupart des souches est 28C. Toutefois, il existe des souches qui tolrent des
tempratures extrmes comme celles qui nodulent certaines lgumineuses dans les rgions
arctiques (Lipsanen et Lindstrm, 1989) ou bien celles isoles dans lenvironnement chaud et
sec de la savane du sahel en Afrique et qui peuvent tolrer des tempratures au-del de 40C
(Eaglesham et Ayanaba, 1984 ; Karanja et Wood, 1988).
Des souches de Rhizobium leguminosarum isoles de plantes de lentille dans la valle du Nil
peuvent tolrer jusqu 35C et 40C (Moawad et Beck, 1991). Plusieurs tudes ont rapport
que les rhizobia darbres lgumineux ont laptitude de tolrer une temprature de 40C (de
Lajudie et al., 1994 ; Zahran et al., 1994 ; Missbah El Idrissi, 1996).
Il a t rapport que les bradyrhizobia sont plus thermotolrants que les souches croissance
rapide (Robert et al., 1982 ; Munevar et Wollum, 1981). Une tolrance 48,7C a t
rapporte pour quelques souches de Bradyrhizobium japonicum (Munevar et Wollum, 1981).
Nanmoins, Karanja et Wood (1988) ont montr que quelques souches de Rhizobium phaseoli
peuvent tolrer des tempratures de 45C 47C. Ces mmes auteurs ont rapport que mme
si ces souches peuvent bien tolrer les hautes tempratures, elles perdent en revanche leur
capacit infective.
.122
Caractrisation phnotypique
% souches tolrantes
100%
80%
60%
40%
20%
0%
4
10
15
35
38
42
Temperature (C)
.123
Caractrisation phnotypique
Il a t rapport que les basses tempratures sont parmi les principaux facteurs limitant la
fixation dazote par les rhizobia dans les rgions trs humides ou froides (Zhang et Smith,
1996). Laction similaire des hautes tempratures a t galement rapport (Kishinevsky et
al., 1992 ; Hungria et Franco, 1993).
Lexposition aux hautes tempratures peut mener la perte du plasmide symbiotique et par
consquent la perte de la capacit infective de la bactrie. Les tempratures leves peuvent
mener la rduction du nombre de cellules au dessous du niveau demand pour une bonne
nodulation. Somasegaran et al. (1984) ont pu montr un dclin graduel de la persistance dune
population de souches de Rhizobium incube 37C pendant huit semaines.
Il est vident que les rhizobia peuvent conserver une bonne performance quand elles sont
utilises dans un environnement conditions climatiques similaires leur site dorigine.
Cependant, plusieurs auteurs ont signal quil nexiste aucune corrlation entre la temprature
du site disolement et la tolrance des souches au stress thermique (Zahran et al., 1994 ;
Mohammed et al., 2000). De mme, dans la prsente tude, on a not que les souches isoles
dans les rgions chaudes et arides (Marrakech) tolrent la temprature de 4C et que les
souches isoles dans les rgions plus humides (Rif) peuvent supporter les tempratures
leves de 40C et 42C.
Daprs les rsultats des trois tests prcdents, une grande plasticit de tolrance au pH, la
salinit et la temprature a t note pour lensemble des souches nodulant les diffrentes
espces de lupin malgr leur provenance de rgions trs diffrentes et trs loignes. Par
consquent, la slection de souches hautement tolrantes est trs large. Ainsi, des candidats
ont t slectionns pour les tests dinoculations qui ont t mens par lINRA de Rabat tout
en prenant en considration le site et la plante hte dorigine (Tableau 14).
Tableau 14. Souches slectionnes pour les inoculations
Rgion
Plante hte
Souches
Mnasra
L. luteus
MSMC 5116
L. luteus
MSMC 5134
Guich, Rabat
L. albus
MSMC 522
Gharb
L. angustifolius
MSMC 537
Gharb
L. cosentinii
MSMC 545
Caractrisation phnotypique
.124
3. 11 Analyse numrique
Lanalyse numrique englobe la comparaison des caractristiques morphologiques,
physiologiques et biochimiques entre les souches prises deux deux. Cette mthode danalyse
a t utilise comme une premire mthode de caractrisation et de regroupement de
diffrentes souches non encore identifies (Zhang et al., 1991).
Il a t rapport que lanalyse numrique ne peut tre valable que sur une base comparative
dau moins 50 caractres relatifs aux souches (Sneath, 1984). Cette marge ntait pas toujours
respecte. Cest le cas dans ltude qui a t mene par Schlinkert-Miller et Pepper (1988)
pour la description de quelques symbiotes croissance rapide de lupin.
Il est galement recommand que la caractrisation phnotypique soit effectue sous des
conditions standardises afin que la comparaison avec les souches de rfrence ou mme entre
les souches de diffrents laboratoires soit applicable (Martinez-Romero et al., 1991).
La prsente analyse mene pour ltude des souches de lupin sest base sur 105 caractres
phnotypiques. Ceux-ci ont t tests selon des mthodes dcrites comme rfrences fiables
pour la caractrisation des rhizobia. Les caractres les plus discriminants de cette analyse ont
t groups et reprsents dans le tableau 15. Toutefois, les rsultats de lensemble des
caractres phnotypiques ont t traits par UPGMA. Le dendrogramme qui drive de cette
analyse est reprsent par la figure 24. A 75% de niveau de similarit, les souches se trouvent
rparties en quatre clusters bien dlimits avec deux linages indpendants reprsents par les
deux souches MSMC 5419 et INRA L15. En fait, lanalyse par UPGMA nous a permis de
mettre en vidence des groupes phnotypiques qui renferment une large diversit aussi bien
entre les clusters dtermins qu lintrieur de chaque cluster. En effet, les souches de chaque
cluster prsentent une grande variabilit au niveau de lassimilation des carbohydrates ainsi
quau niveau des profils de rsistance aux diffrents antibiotiques et mtaux lourds tests.
Toutefois, lensemble des souches des quatre diffrents clusters prsente une large gamme de
tolrance au pH et la temprature. En outre, les souches appartenant une mme plante hte
et au mme site gographique peuvent tre groupes dans diffrents clusters, cest le cas des
souches de lamas nodulaire qui se trouvent rparties entre les clusters 1, 2 et 4.
Les deux souches MSMC 5419 et INRA L15 se caractrisent par leur capacit assimiler les
sucres complexes tels que le D- tagatose, linuline, lamidon et lesculine. En outre, la souche
MSMC 5419 prsente dimportants traits phnotypiques. Elle peut tolrer une concentration
.125
Caractrisation phnotypique
Tableau 15. Rsultats des tests phnotypiques diffrenciant entre les souches nodulant le
lupin des diffrents clusters forms par lanalyse UPGMA
Nombre de souches
Plantes htes
Cluster
1
13
Cluster
2
9
Cluster
3
16
Cluster
4
12
MSMC
5419
1
INRA
L15
1
Les 6
L. luteus
Les 6
L. luteus
L.
L.
espces
L. cosentinii
espces
L.
cosentinii
luteus
angustifolius
Caractristiques phnotypiques
Infectivit (nombre de nodosits par plante)
n < 30
30 < n < 50
12
n > 50
% < 60
60 < % < 70
11
% > 70
G < 2h
14
11
G > 2h
Test du BTB
12
Efficience relative
Temps de gnration
12
Fructose
13
16
12
L - Arabinose
13
16
12
Glycrol
13
16
12
Mannitol
13
16
12
Saccharose
12
16
Raffinose
13
16
Amidon
Esculine
13
12
Hydrolyse de lure
13
10
Rduction du nitrate
6 - 6ND
3 - 3ND
8 - 7ND
10 - 1ND
ND
.126
Caractrisation phnotypique
Rsistance aux antibiotiques (g/ml)
Ttracycline 50
12
Streptomycine 50
11
Spectinomycine 50
10
13
Chloramphnicol 100
14
11
Kanamycine 25
Acide nalidixique 50
12
14
11
Ampicilline 200
14
11
Erythromycine 200
12
15
13
14
Manganse 400
12
14
10
Zinc 400
11
13
Cadmium 30
10
14
Mercure 40
Cobalt 100
170
13
16
12
340
13
15
12
510
12
15
10
680
11
15
10
850
14
1020
10
1190
10
1360
1530
1700
3,5
14
4,5
12
15
12
5,5 9,5
13
16
12
Tolrance au pH
12
15
12
10 42
13
16
12
.127
Cluster 2
Cluster 1
Caractrisation phnotypique
Cluster 3
Cluster 4
II
MSMC511
MSMC513
MSMC516
MSMC5114
MSMC5115
MSMC5116
INRAL21
INRAL23
INRAL32
INRAL43
MSMC556
INRAL29
INRAL44
MSMC515
MSMC517
MSMC518
MSMC5111
MSMC5112
MSMC5142
MSMC5127
MSMC549
MSMC5416
MSMC5110
INRAL16
INRAL51
INRAL17
INRAL212
MSMC5126
MSMC541
MSMC5425
INRAL211
INRAL61
MSMC5143
MSMC547
MSMC5150
MSMC5326
MSMC554
INRAL52
MSMC5419
MSMC514
MSMC5123
MSMC536
MSMC5113
MSMC539
MSMC5119
MSMC5319
MSMC5133
MSMC5155
MSMC5156
MSMC532
MSMC5328
INRAL15
100
95
90
85
80
75
70
65
60
% de similarit
Figure 24. Phnogramme indiquant les similarits phnotypiques entre les souches nodulant
le lupin issues de diffrentes rgions du Maroc sur la base de lanalyse numrique.
Caractrisation phnotypique
.128
de 850 mM NaCl et son efficience relative de fixation dazote est trs leve de lordre de
83%. Elle peut galement rduire le nitrate et hydrolyser lure. La souche INRA L 15
prsente galement quelques traits distinctifs. Elle peut tolrer 1700 mM NaCl et montre un
potentiel de fixation dazote de lordre de 74%. Cependant, les tests biochimiques se sont
rvls ngatifs.
Le cluster 1 est form par des souches qui appartiennent diffrentes espces de lupin
(Tableau 15). Toutes les souches de lespce L. luteus sont issues de lamas nodulaire. La
majorit des souches de ce cluster peut tolrer une concentration en sel allant jusqu 1530
mM NaCl. Ce cluster renferme des souches majoritairement moins infectives. Concernant
lefficience relative, les souches de L. luteus sont les moins efficientes et prsentent un
pourcentage qui varie entre 39% et 57% alors que lefficience relative des autres souches
varie de 62% 78%. La moiti des souches prsente un temps de gnration suprieur 2h.
Pour les tests biochimiques, toutes les souches prsentent une activit positive de lurase.
Tandis que pour la nitrate rductase, seules les souches de L. luteus montrent un rsultat
positif. Particulirement, les souches de cette espce se sont rvles toutes rsistantes la
plus forte concentration du chlorure mercurique teste qui est de 40 g/ml. Pour les autres
minraux, les souches se sont rvles gnralement rsistantes.
Le cluster 2 est form par des souches qui appartiennent aux espces L. luteus et L. cosentinii.
Ces souches se distinguent spcialement par leur grande tolrance de fortes concentrations
en sel allant jusqu 1530 mM NaCl. Les souches sont majoritairement moins infectives.
Celles de L. luteus prsentent une efficience relative qui varie entre 51% et 59% sauf pour la
MSMC 518 qui reprsente la souche la plus efficiente (ER = 87%) alors que les souches de L.
cosentinii prsentent une efficience relative qui varie de 62% 74%.Toutes les souches ont un
temps de gnration infrieur 2h. Le tiers seulement de souches prsente des ractions
biochimiques positives. Une grande sensibilit aux antibiotiques a t note. Les fortes
concentrations testes en ttracycline, en spectinomycine et en kanamycine ont pu entraner
une inhibition total des souches. A loppos, pour les mtaux lourds, une rsistance totale a
t not pour les fortes concentrations en aluminium, en manganse et en mercure.
Le cluster 3 reprsente le cluster le plus htrogne avec des souches appartenant au six
diffrentes espces de lupin. Ce cluster est subdivis 77% de niveau de similarit en deux
subclusters I et II. Les souches du subcluster I sont capables de tolrer 1190 mM 1700 mM
NaCl. Lefficience relative des souches varie de 66% 77%. Cependant, les tests
Caractrisation phnotypique
.129
Caractrisation phnotypique
.130
Cette diversit phnotypique nous permet toutefois de slectionner avec prcision les bons
candidats pour tout essai dinoculation de lupin selon les exigences recommandes et selon les
diffrentes conditions pdo climatiques envisages (stress salin, tempratures extrmes,
excs de nitrate, etc.). Ainsi,
-
Pour les sols contamins par les mtaux lourds, on propose les souches MSMC 541,
MSMC 547 et MSMC 5126, qui sont non seulement trs rsistantes aux mtaux lourds
mais aussi diffrents antibiotiques. En outre, elles prsentent des pourcentages
defficience relative allant de 73% 76%.
Pour les sols problmes de salinit et dalcalinit, on recommande les souches INRA
L 61 et MSMC 554 en raison de la grande plasticit de tolrance et de rsistance
quelles prsentent pour lensemble des tests phnotypiques.
CHAPITRE IV
CARATERISATION
MOLECULAIRE
DES SOUCHES PAR
PCR/RFLP DE LADNr 16S
.131
1 INTRODUCTION
Diffrentes approches phylogntiques permettant de classer les bactries fixatrices dazote
ont succd aux moyens dtude traditionnels. Rcemment, la PCR est intensment utilise
pour lanalyse du gne codant pour lARNr 16S (Woese, 1987, Graham et al., 1991).
LADNr 16S possde une taille de 1452 bases nuclotidiques (sauf pour la souche Rhizobium
tropici type II CFN 299 dont le gne est caractris par une insertion dun fragment dADN
de 72 paires de bases (Willems et Collins, 1993). Cette courte taille permet une amplification
rapide du gne par PCR laide damorces spcifiques.
Lanalyse par PCR/RFLP de lADNr 16S chez les rhizobia a t initialement dcrite par
Vaneechoutte et al. (1992). Cette technique connue galement par le terme ARDRA
(Amplified rDNA Restriction Analysis) prsente une grande importance comme approche
phylogntique puisquelle permet de regrouper les souches bactriennes un niveau de
rsolution taxonomique qui stend de lespce au genre (Heyndrickx et al., 1996). Laction
des enzymes de restriction sur le gne de lADNr 16S amplifi engendre la gense de
fragments de diffrentes tailles. Le polymorphisme de restriction peut tre ensuite rvl par
lectrophorse sur un gel dagarose.
Plusieurs tudes ont t menes pour lanalyse de ce gne chez de nombreuses souches et
espces bactriennes fixatrices dazote afin dtablir la relation phylogntique qui existe
entre ces bactries et les diffrents genres de rhizobium connus (van Berkum et Fuhrman,
2000 ; Sawada et al., 1993 ; Willems et Collins, 1993 ; Yanagi et Yamasato, 1993).
Dans ce chapitre, nous nous sommes fix pour objectif ltude de la diversit gntique qui
existe entre les 52 souches reprsentatives des grands groupes dlimits par lanalyse
PCR/REP de toutes les souches de la collection nodulant les diffrentes espces de lupin dans
diffrentes rgions du Maroc, la dtermination du positionnement taxonomique de ces
souches et lvaluation du niveau de rapprochement ou de divergence entre ces souches et les
souches de rfrence appartenant aux diffrents genres des rhizobia.
Souche
ISRA 616
ISRA 601
Bradyrhizobium japonicum
USDA 110
Bradyrhizobium elkanii
ORS 2800
Bradyrhizobium canariense
BTA-1
Mesorhizobium plurifarium
ORS 1032
Mesorhizobium loti
NZP 2213
Mesorhizobium huakuii
ORS1752
Mesorhizobium tianshanense
ORS 2640
Mesorhizobium mediterraneum
ORS 2739
Mesorhizobium ciceri
ORS 2738
ORS 663
ORS 639
ORS 662
Rhizobium giardinii
STM 854
Rhizobium gallicum
STM 853
Rhizobium etli
ORS 645
Rhizobium galegae
STM 1834
Rhizobium mongolensis
STM 246
Rhizobium huautlense
STM 247
Sinorhizobium fredii
USDA 205
Sinorhizobium meliloti
ORS 665
Sinorhizobium arboris
ORS 1755
Sinorhizobium saheli
ORS 100
Sinorhizobium terangae
ORS 1007
Sinorhizobium medicae
ORS 504
Sinorhizobium kostiense
ORS 97
Agrobacterium tumefaciense
ORS 1351
Agrobacterium rhizogene
ORS 1352
Agrobacterium rubi
ORS 1353
Agrobacterium vitis
ORS 2643
Allorhizobium undicola
ORS 992
.132
.133
2 MATERIEL ET METHODES
2. 1 - Souches bactriennes et milieu de culture
Les souches utilises dans cette tude reprsentent les 52 souches slectionnes partir de
lanalyse par PCR/REP et qui ont t caractrises phnotypiquement dans le chapitre
prcdant ainsi que 32 souches types reprsentant les genres Rhizobium, Mesorhizobium,
Sinorhizobium, Bradyrhizobium, Allorhizobium et Agrobacterium (tableau 16).
Lensemble des souches obtenues en culture pure sur le milieu YEM a t repiqu sur le
milieu TY solide pendant 48 h.
Les diffrentes souches de rfrence ainsi que certaines souches nodulant le lupin
productrices de quantits importantes dexopolysaccharides ont t ensuite mises en culture
dans le milieu TY liquide pendant 2 jours.
.134
.135
Tableau 17. Squences des amorces utilises pour lamplification de lADNr 16S
Amorce
Squence 5 3
Rfrence
41f
5-GCTCAAGATTGAACGCTGGCG-3
Herrera-Cervera et al (1999)
1488r
5-CGGTTACCTTGTTCGACTTCACC-3
.136
Les rsultats nous ont permis de retenir quatre enzymes, les plus discriminantes : Msp I, Hinf
I, Hha I et Taq I.
Pour activer laction des quatre enzymes, les mlanges ont t incubs dans un thermoblock
(Bioblock Scientific) pendant une heure 65C pour la TaqI et 37C pour les trois autres
enzymes.
15 l des produits de la digestion de toutes les souches tudies par chaque enzyme ont t
ensuite rvls par lectrophorse sur un gel dagarose 1,8% 70V pendant 4 heures.
Pour chaque gel, 5 l du marqueur de poids molculaire connu, le 100pb (Promega) ont t
mis en migration paralllement avec les chantillons analyser.
Le dpt des chantillons dans les puits a t facilit par laddition de 3 l du tampon de
charge. Ce tampon permet de suivre aisment la migration des chantillons dans le gel.
Aprs migration, les gels ont t mis dans un bain de coloration au Bromure dEthidium 1
mg/ml pendant 20 min. Ensuite, les gels ont t placs sur un trans-illuminateur UV puis
scanns (Perfect Image V.6).
.137
3 RESULTATS
Lanalyse du polymorphisme de la longueur des fragments de restriction du gne de lADNr
16S amplifi par PCR est lune des mthodes les plus utilises pour lidentification des
rhizobia (Young et al., 2001). Elle est rapide, ne ncessite pas de grandes quantits de matire
premire et surtout reproductible (Clark, 1997). Sa rsolution taxonomique qui permet la
distinction entre les diffrentes espces et genres de rhizobia nous a incit lutiliser comme
un premier moyen pour ltude de la phylognie des 52 souches de lupin pralablement
identifies et caractrises gntiquement par PCR/REP.
C CGG
Taq I
T CGA
Hha I
GCG G
Hinf I
G ANTC
Les profils de restriction obtenus pour les 32 souches de rfrence utilises dans cette analyse
(figure 26) ont t valids par la comparaison aux profils de restriction tablis par Neyra et al.
(1998).
M. loti
M. tianshanense
M. plurifarium
M. mediterraneum
M.ciceri
Rh. etli
Rh. gallicum
(C)
M. huakuii
M. ciceri
M. plurifarium
M. mediterraneum
M. tianshanense
100pb
Rh. etli
Rh. gallicum
Rh. giardinii
Rh.mongolensis
Rh. huautlense
Rh. galegae
M. loti
M.ciceri
M. plurifarium
M. mediterraneum
M. tianshanense
Rh. etli
Rh. gallicum
Rh. giardinii
Rh.mongolensis
Rh. huautlense
Rh. galegae
100pb
(A)
Rh mongolensis
Rh. giardinii
Rh. huautlense
Rh. galegae
100pb
M. loti
M. plurifarium
M.ciceri
M. mediterraneum
M. tianshanense
Rh. etli
Rh. gallicum
Rh. giardinii
Rh.mongolensis
Rh. huautlense
Rh. galegae
100pb
100pb
INRA L 61
MSMC 556
MSMC 547
MSMC 541
MSMC 539
MSMC 536
INRA L 212
INRA L 21
MSMC 5111
MSMC 513
1500pb
Figure 25: Profil de la bande de lADNr 16S de quelques souches nodulant le lupin
(B)
(D)
Figure 26. Profils lectrophortiques de la restriction par RFLP de lADNr 16S obtenus pour
quelques souches de rfrence aprs la digestion par les endonuclases HhaI (A), MspI (B),
TaqI (C) et HinfI (D)
.139
Les profils obtenus pour les souches de lupin montrent des bandes de tailles variables. Une
onze bandes ont t obtenues selon la souche et selon lenzyme utilis (figures 27 et 28).
Concernant les souches de lamas nodulaire, lendonuclase Msp I reprsente lenzyme la plus
discriminante indiquant la grande diversit qui existe entre ces souches (figure 27 B). La
diversit est galement bien illustre par les profils de la Hha I (figure 27 A). Les profils
obtenus par ces deux enzymes ainsi que ceux obtenus par la Taq I (figure 27 C) montrent une
nette distinction des souches de lamas nodulaire par rapport non seulement aux souches de
rfrence mais galement aux diffrentes souches nodulant le lupin analyses (figure 28).
Concernant les autres souches de la collection nodulant le lupin, on constate que
lendonuclase Hha I est lenzyme qui rvle le plus de polymorphisme. Sur la base des
diffrents profils lectrophortiques obtenus, la majorit des souches prsente des bandes
intenses de 380 pb et 550 pb (figure 28 A). Alors que les souches de rfrences prsentent des
bandes intenses de tailles diffrentes : 300 pb et 350 pb dans le cas de Rhizobium et 350 pb
dans le cas de Mesorhizobium (figure 26 A).
Les profils de restriction gnrs par lendonuclase Taq I ont permis galement de mettre en
vidence un polymorphisme assez important chez les souches nodulant le lupin (figure 28 C).
Contrairement aux souches de lamas nodulaire (figure 27), les profils lectrophortiques
obtenus par lendonuclase Msp I semblent tre peu diversifis (figure 28 B). Toutefois, ces
profils sont plus proches de ceux des souches de rfrence (figure 26 B).
Les profils obtenus par la Hinf I prsentent galement un monomorphisme apparent. La
majorit de ces profils prsentent des bandes communes dont les tailles sont de 320 pb et 690
pb (figure 28 D). Ces deux bandes figurent galement dans les profils des souches de
Rhizobium (figure 26 D).
Lanalyse lectrophortique de la PCR/RFLP de lADNr 16S nous a permis de rvler la
grande diversit qui existe entre les souches nodulant le lupin. Cette diversit est trs
importante chez les souches de lamas nodulaire.
(A)
.140
(B)
Numros de gauche droite :100pb - MSMC 513 - MSMC 515 - MSMC 516 - MSMC 517 - MSMC
5110 - MSMC 5111 - MSMC 5112 - MSMC 5113 - MSMC 5114 - MSMC 5116 - MSMC 5115
(C)
(D)
Numros de gauche droite : 100pb - MSMC 513 - MSMC 515 - MSMC 516 - MSMC 517 - MSMC
5110 - MSMC 5112 - MSMC 5111 - MSMC 5113 - MSMC 5114 - MSMC 5115 - MSMC 5116
Figure 27 : Profils lectrophortiques de la restriction par RFLP de lADNr 16S obtenus pour
quelques souches de lamas nodulaire aprs la digestion par les endonuclases HhaI (A), MspI
(B), TaqI (C) et HinfI (D)
MSMC 554
MSMC 5419
MSMC 5416
MSMC 5319
MSMC 539
(C)
MSMC 5328
MSMC 5326
INRA L 212
INRA L 212
Rh. giardinii
INRA L 211
INRA L 17
MSMC 5155
MSMC 5156
MSMC 5123
INRA L 29
100pb
100pb
INRA L 61
Rh. Leg. bv. phaseoli
INRA L 51
MSMC 556
INRA L 44
INRA L 32
MSMC 5328
MSMC 5326
MSMC 539
MSMC 536
INRA L 29
INRA L 212
(A)
MSMC 536
MSMC 5156
MSMC 5150
MSMC 5143
MSMC 5127
100pb
M. mediterraneum
Ag. rubi
INRA L 23
INRA L 21
Rh. giardinii
MSMC 547
MSMC 5156
MSMC 5150
MSMC 5133
INRA L 29
100pb
(B)
(D)
Figure 28 : Profils lectrophortiques de la restriction par RFLP de lADNr 16S obtenus pour
des souches nodulant le lupin aprs la digestion par les endonuclases HhaI (A), MspI (B),
TaqI (C) et HinfI (D)
.142
.143
Tableau 19. Groupes de ribotypes des souches de rfrence utilises dtermins par
PCR/RFLP du gne de lARNr 16S.
Souches
Ribotype
HinfI
HhaI
TaqI
MspI
A
A
B
B
B
B
B
B
F
A
A
A
A
A
A
A
A
A
B
B
B
A
A
A
H
A
B
B
B
B
C
G
C
A
H
I
AABB
AABB
BABB
BAAC
BAAG
BAAC
BAHA
BAAH
FABI
Mesorhizobium tianshanense
Mesorhizobium mediterraneum
Mesorhizobium huakuii
Mesorhizobium plurifarium
Mesorhizobium ciceri
Mesorhizobium loti
D
G
C
C
C
C
D
D
E
E
F
F
D
D
E
E
F
F
J
D
D
K
E
E
DDDJ
GDDD
CEED
CEFK
CFFE
CFFE
Sinorhizobium arboris
Sinorhizobium meliloti
Sinorhizobium medicae
Sinorhizobium terangae
Sinorhizobium saheli
Sinorhizobium kostiense
Sinorhizobium fredii
C
D
C
C
C
D
D
G
G
C
C
C
C
C
C
C
I
C
J
K
A
L
M
N
F
F
F
O
CGCL
DGCM
CCIN
CCCF
CCJF
DCKF
DCAO
Agrobacterium tumefaciense
Agrobacterium rhizogene
Agrobacterium rubi
Agrobacterium vitis
B
B
H
I
A
A
A
A
A
B
A
A
A
P
A
A
BAAA
BABP
HAAA
IAAA
Allorhizobium undicola
FHLQ
Bradyrhizobium japonicum
Bradyrhizobium elkanii
Bradyrhizobium canariense
Br.sp. (Arachis) ISRA 601
Br.sp. (Arachis) ISRA 616
E
E
E
E
E
B
B
B
B
B
M
G
N
G
G
R
S
A
A
A
EBMR
EBGS
EBNA
EBGA
EBGA
.144
Tableau 20. Groupes de ribotypes des souches nodulant le lupin dtermins par PCR/RFLP
du gne de lARNr 16S.
Souches
Ribotype
HinfI
HhaI
TaqI
MspI
MSMC 511
NJFE
MSMC 513
HKOX
MSMC 514
ANMZ
MSMC 515
KLMX
OQPA
KLNX
PONE
LKIU
LOIU
LKIU
KLQX
MSMC 5114
MOIW
MSMC 5115
MKIW
MSMC 5116
MOIW
MSMC 5119
BRRT
MSMC 5123
FTLB
MSMC 5126
HBJE
MSMC 5127
AMSS
MSMC 5133
AJLX
MSMC 5142
AJAB
MSMC 5143
AZJX
MSMC 5150
AZKX
MSMC 5155
ANLX
MSMC 5156
FUAX
INRA L15
HBJE
INRA L16
HSHE
INRA L17
HJHT
MSMC 516
MSMC 517
MSMC 518
MSMC 5110
MSMC 5111
MSMC 5112
MSMC 5113
L. luteus
Plante
hte
L. atlanticus
L. pilosus
L. cosentinii
L. angustifolius
L. albus
Plante
hte
Souches
.145
Ribotype
HinfI
HhaI
TaqI
MspI
INRA L211
AJLX
INRA L212
ANWX
INRA L21
HBJT
INRA L23
HBJX
INRA L29
CVBU
MSMC 532
BWAV
MSMC 536
FJAV
MSMC 539
AMAY
MSMC 5319
AMAT
MSMC 5326
AJLZ
MSMC 5328
HSFE
INRA L32
AJLX
MSMC 541
HXKT
MSMC 547
BRTV
MSMC 549
AFFX
MSMC 5416
APAX
MSMC 5419
APAT
MSMC 5425
AJHT
INRA L43
JNBB
INRA L44
AJHX
MSMC 554
JNHT
MSMC 556
ANUX
INRA L51
HJHX
INRA L52
FYVT
INRA L61
AABB
.146
.147
Allorhizobium
Bradyrhizobium
Sinorhizobium
Mesorhizobium
Rh.leg.bv.viciae
Rh.leg.bv.trifolii
Rh.leg.bv.phaseoli
Ag. rhizogene
Rh. giardinii
Rh. etli
Rh. galegae
Rh. mongolensis
Ag. tumefaciense
Ag. rubi
Rh. gallicum
Rh.huautlense
Ag. vitis
M. tianshanense
M. mediterraneum
M. huakuii
M. plurifarium
M. ciceri
M. loti
S. arboris
S. meliloti
S. fredii
S. medicae
S. terangae
S. saheli
S. kostiense
All. undicola
Br. canariense
Br. japonicum
Br.elkanii
Br.sp.ArachisISRA601
Br.sp.ArachisISRA616
100
90
80
70
60
50
% of similarity
Figure 29 : Dendrogramme construit par UPGMA indiquant la position phylogntique
des souches de rfrence utilises sur la base de la PCR/RFLP de lADNr 16S
.148
Les groupements phylogntiques combinant aussi bien les souches de lupin que les souches
de rfrence sont reprsents par la figure 30. Concernant les souches de lupin, au niveau de
similarit de 70%, elles se rpartissent en cinq groupes distincts. Si on se situe un niveau de
similarit de 80%, on remarque que chacun des clusters 2, 3, 4 et 5 se trouve subdivis en 3
4 sub-clusters indiquant ainsi la grande diversit gntique qui existe entre ces souches.
En comparant avec les souches de rfrence, nous avons not que trois souches seulement de
lupin ont un niveau de similitude lev avec les souches de rfrence. Il sagit de la souche
INRA L 61 qui forme un mme et unique linage avec R. leguminosarum bv. viciae et R.
leguminosarum bv. Trifolii ; la souche INRA L 23 rapproche de R giardinii avec un
coefficient de similitude de 88%, et enfin, la souche INRA L 29 rapproche des souches de
Mesorhizobium avec toutefois un niveau de divergence de 25%.
Les souches du cluster 1 forment, un niveau de similarit de 75%, un mme groupe avec les
diffrentes souches de Rhizobium et dAgrobacterium.
Le groupe de souches form par les clusters 2, 3 et 4 se trouve rapproch au groupe de
souches de rfrence appartenant aux genres Rhizobium, .Mesorhizobium et Sinorhizobium
un niveau de similitude de 62% qui correspond la troisime subdivision de larbre
phylogntique.
Le cluster 5 est form par 11 souches de lamas nodulaire. En fait, ces souches forment une
branche spare dans larbre phylogntique et sont classes distinctement de la totalit des
souches analyses ds la premire subdivision de larbre qui se situe un niveau infrieur
55% de similitude.
A travers les groupements phylogntiques, un grand niveau de polymorphisme molculaire a
t dtect au sein des souches nodulant les six espces de lupin et entre ces souches et les
souches de rfrence utilises. Toutefois, la grande diversit obtenue entre les souches
nodulant le lupin ne prsente aucune relation avec la plante hte dorigine puisquon retrouve
des souches nodulant la mme espce dans diffrents clusters (ex. Lupinus luteus). Cette
diversit est galement indpendante de la rgion dorigine puisque les souches issues de la
mme rgion, par exemple du Gharb ou de Rabat, se trouvent rparties dans les diffrents
clusters dlimits. Ceci, lexception des souches de lamas nodulaire qui ont t isoles de
lespce L. luteus dans la rgion de Mnasra et qui constituent par leur positionnement distinct
un cas bien particulier (Tableau 21).
.149
Rhizobium &
Agrobacterium
Mesorhizobium
Sinorhizobium
Bradyrhizobium Allorhizobium
90
80
70
60
50
% de similarit
Figure 30 : Dendrogramme construit par UPGMA indiquant la position phylogntique
des souches nodulant le lupin et des souches de rfrence sur la base de la PCR/RFLP
de lADNr 16S
.150
Tableau 21. Groupes de souches nodulant le lupin formant les diffrents clusters dlimits
par la PCR/RFLP du gne de lADNr 16S par rapport la plante et la rgion dorigine.
Cluster
Souches
Nbr. de
Rgion dorigine
Plante
ribotype
dorigine
MSMC 5119
Gharb
MSMC 5126
Rabat
L. luteus
INRA L 15
Assilah vers Tanger
INRA L 16
9
1
INRA L 21
Rabat
L. albus
MSMC 532
Gharb
L. angustifolius
MSMC 5328
Cherafat
MSMC 541
Gharb
L. cosentinii
MSMC 547
MSMC 511
Mnasra
L. luteus
MSMC 5133
Rabat
MSMC 5142
Sidi Yahya
INRA L 17
Assilah vers Tanger
INRA L 211
Blad dandoun
L. albus
11
2
MSMC 536
Gharb
MSMC 5326
Taza vers Bab Berred L. angustifolius
INRA L 32
Rabat
MSMC 5425
Rabat vers Larache
L. cosentinii
INRA L 44
Assilah vers Tanger
INRA L 51
Gharb
L. pilosus
MSMC 514
Mnasra
MSMC 518
L. luteus
MSMC 5127
Rabat
MSMC 5143
Sidi Yahya
MSMC 5150
Asni
MSMC 5155
pigeage
INRA L 212
Merchouch
L. albus
13
3
MSMC 539
Gharb
L. angustifolius
MSMC 5319
Larache vers Tetouan
MSMC 549
Kenitra vers Larache
L. cosentinii
Rabat
MSMC 5416
MSMC 5419
MSMC 556
Larache vers Tetouan
L. pilosus
MSMC 5123
Gharb
L. luteus
MSMC 5156
pigeage
5
4
INRA L 43
Rabat
INRA L 52
Settat
MSMC 554
Larache vers Tetouan
MSMC 513 - MSMC 515
MSMC 516 - MSMC 517
MSMC5110 - MSMC5111
9
Mnasra
L. luteus
5
MSMC5112 - MSMC5113
MSMC5114 - MSMC5115
MSMC 5116
.151
4 DISCUSSION
Ltude des relations gntiques rvles aussi bien par la PCR/REP que par la PCR/RFLP de
lADNr 16S a permis de mettre en vidence un haut niveau de polymorphisme molculaire
entre les diffrentes souches de lupin. En outre, les deux analyses ont montr que les souches
de lamas nodulaire reprsentent un groupe particulier parmi les souches de lupin tudies.
La conclusion la plus intressante qui drive de lanalyse par PCR/RFLP de lADNr 16S est
que les souches de lupin tudies sont totalement distinctes des souches du genre
Bradyrhizobium. En outre, ces souches ne prsentent pas un statut taxonomique prcis et par
consquent leur classification phylogntique exacte reste dterminer.
En fait, le positionnement taxonomique des souches nodulant le lupin reste jusqu prsent
trs controvers vu lisolement de souches croissance rapide et de souches croissance lente
rapport dans diffrentes recherches. Lisolement de souches croissance rapide a t
rapport par Corich et al. (1981) (cit par van Berkum et Eardly, 1998) ainsi que par Jordan
(1984) chez L. densiflorus. La souche LUP 43 isole dune autre espce de lupin dans la
rgion de Baja California au Mexique prsentait galement un temps de gnration de 3,6
heures (Schlinkert-Miller et Pepper, 1988). Toutefois, ces souches nont t caractrises que
sur la base du temps de gnration et de quelques caractres phnotypiques. Cependant, sur la
base des mmes caractres, dautres recherches ont pu classer les souches de lupin en tant que
des bradyrhizobia (Jordan, 1982 ; Bottomley et al., 1994). Xu et al. (1995) ont rapport, sur la
base de 191 caractres phnotypiques, que la souche Bradyrhizobium sp (Lupinus) G13
originaire dArgentine prsentait une grande similitude de lordre de 90% avec des souches de
Bradyrhizobium japonicum originaire de Chine.
De point de vue gntique et sur la base de la PCR/RFLP de lADNr 16S, Laguerre et al.
(1994, 1997) ont rapport que la souche MSDJ 718 isole de L. luteus en France ainsi que la
souche VK7,VK4 isole de Lupinus sp. en Afrique du Sud se sont rvles trs proches des
souches de Bradyrhizobium. En outre, sur la base de lanalyse aussi bien de lADNr 16S que
de lADNr 23S, la souche DSM 30140 nodulant le lupin a montr un positionnement
taxonomique au sein des bradyrhizobia (Ludwig et al., 1995). De plus, Barrera et al. (1997)
ont pu caractriser 41 souches de lupin isoles de L. campestris, L. montanus et L. exaltatus
originaires du Mexique par lanalyse de la squence complte de lADNr 16S. Les rsultats
ont montr que lensemble des souches a t regroup avec la souche Bradyrhizobium
japonicum USDA 6.
.152
Cependant, une tude rcente mene par Jarabo-Lorenzo et al. (2003) a montr travers la
PCR/RFLP de lADNr 16S et par lanalyse de la squence de ce gne, lexistence de 9
gnotypes diffrents chez 45 souches nodulant le lupin dans les les des Canaries. 69% de ces
souches possdent des gnotypes qui se sont rvls trs distincts de ceux des souches de
rfrence nodulant le soja.
Rcemment, Trujillo et al. (2005) ont montr sur une base comparative de la squence
complte de lADNr 16S que des souches croissance rapide de lupin LUP 21 et LUP 23
isoles de Lupinus honoratus ont t classes avec les espces du genre Ochrobactrum et ont
prsent un niveau de similitude de 99,5% avec lespce Ochrobactrum antropi. Ces deux
souches appartiennent par consquent au genre Ochrobactrum qui appartient la famille des
Brucellaceae faisant partie de la sous-classe 2 des Protobactries. Cette dcouverte a permis
aux auteurs de conclure quil existe une dynamique trs active entre les bactries du sol via le
transfert de plasmides porteurs de gnes symbiotiques de nodulation et de fixation.
En effet, durant les quatre dernires annes, plusieurs bactries, autres que les rhizobia, ont
t rapportes comme tant des bactries pouvant tablir des relations symbiotiques avec
diffrentes lgumineuses. Parmi ces bactries, on trouve quelques espces du genre
Methylobacterium (Sy et al., 2001) et Devosia (Rivas et al., 2002, 2003) qui appartiennent
la sous-classe des Protobactries ainsi que dautres espces du genre Ralstonia (Chen et
al., 2001) et Burkholderia (Moulin et al., 2001 ; Vandamme et al., 2003) qui appartiennent
la sous-classe des Protobactries.
CONCLUSION
GENERALE
ET PESPECTIVES
.153
.154
.155
prsentes dans les diffrents sols marocains. Cette croissance rapide est dune grande
importance pratique surtout dans les stratgies de production dinoculums.
Lutilisation des diffrents substrats carbons a montr galement un profil dassimilation trs
similaire celui des souches croissance rapide.
Laptitude des souches hydrolyser lure ou rduire le nitrate a rvl une grande
variabilit. Cependant, les souches croissance trs rapide ont montr des rsultats ngatifs et
par consquent, un excs dure ou de nitrate exogne dans le sol pourrait affecter le caractre
symbiotique de ces souches.
Disposer dune bonne collection de souches nodulant le lupin est essentiel pour la cration de
symbioses complmentaires et efficaces. Les souches indignes sont plus comptitives et plus
adaptes pour survivre sous les contraintes daphiques locales (salinit, acidit, alcalinit,
temprature, etc.) en labsence de la plante hte.
Ainsi, nous avons valu la tolrance de toutes les souches de la collection vis--vis des
principaux facteurs de stress, en loccurrence la salinit et principalement le NaCl qui
reprsente le sel le plus rpandu Maroc, le pH et les tempratures extrmes.
Losmotolrance sest rvle trs importante pouvant aller jusqu 1190 mM et 1700 mM
NaCl. Les souches ont t capables galement de pousser sur une gamme assez large de pH
allant de 4,5 9,5. Cependant, Tang et Robson (1996) ont rapport que des valeurs de pH audessus de 6 ont un effet inhibiteur sur la nodulation chez le lupin. Quant la temprature, la
tolrance totale stend de 10C 35C.
Dans le sol, la salinit et les variations du pH sont accompagnes gnralement par la toxicit
minrale. Nous avons donc apprci le degr de linhibition de la croissance des souches par
six diffrents mtaux sous formes de chlorure. Linhibition sest rvle plus importante selon
lordre suivant Cd > Hg > Co > Zn > Al > Mn. La rsistance des souches aux huit diffrents
antibiotiques tests a indiqu une grande rsistance lrythromycine et lampicilline contre
une sensibilit bien marque la kanamycine.
Lanalyse combine de toutes les donnes phnotypiques nous a permis de reprer des
souches trs performantes. En fait, les souches ont prsent une htrognit suffisante pour
permettre de slectionner des souches adaptes des conditions environmentales trs
variables. A travers la mme analyse, on a pu dduire que lhtrognit des souches ne peut
.156
tre due ni aux diffrentes espces de lupin ni aux diffrents sites gographiques dorigine
puisquon retrouve dans un mme cluster des souches isoles partir de diffrentes espces et
de diffrents sites.
La mthode molculaire adopte pour valuer la position taxonomique des souches est la
PCR/RFLP du gne de lADNr 16S. La dimension et le degr de conservation de ce gne font
de lui un marqueur phylogntique idal. Les rsultats obtenus ont montr que les souches
sont galement sur le plan gntique trs htrognes et sont rparties dans cinq clusters trs
distincts de ceux des souches de rfrence utilises. En outre, onze souches de lamas
nodulaire ont t groupes dans un mme cluster (cluster 1) qui est largement distinct par
rapport aux autres clusters (53 % de similitude). Quelques souches se sont rvles toutefois
plus rapproches certaines souches de rfrence. Cest le cas de INRA L 61 avec R.
leguminosarum, INRA L 23 avec R. giardinii et INRA L 29 avec le genre Mesorhizobium.
La conclusion la plus importante qui drive de lanalyse ARDRA est que les souches de lupin
tudies sont parfaitement et totalement distinctes du genre Bradyrhizobium. Ce rsultat
confirme par ailleurs le taux de croissance rapide des souches. Cependant, la plupart des
souches nont pu tre rattaches aux souches de rfrence utilises et par consquent leur
classification phyltique exacte reste dterminer.
Les diffrents rsultats obtenus dans cette tude ouvrent dintressantes perspectives sur le
plan appliqu et pourraient galement servir de base gntique pour les travaux ultrieurs.
Sur le plan appliqu, on peut noter :
-
.157
REFERENCES
BIBLIOGRAPHIQUES
Rfrences bibliographiques
.158
Rfrences bibliographiques
.159
Rfrences bibliographiques
.160
Rfrences bibliographiques
.161
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Rfrences bibliographiques
.188
Rfrences bibliographiques
.189
ANNEXES
190
.
Annexes
ANNEXE 1
Paramtres climatiques des sites chantillonns
Localit des sites dchantillonnage
Numro de
la station
Altitude
Pluviomtrie
Mnasra
15
500
50
500
30
594
10
500
50
523
55
523
60
523
65
523
Ourika, Marrakech
800
400
Asni, Marrakech
10
11
50
500
12
25
530
13
50
500
14
50
500
15
40
550
16
610
1000
17
1000
380
18
60
600
19
600
600
20
600
600
Dardara
21
60
600
22
55
600
191
.
Annexes
ANNEXE 2
Composition du milieu YEM
Mannitol
: 2,5g
: 0,12g
MgSO4, 7H2O
: 0,46g
NaCl
: 0,1g
Agar
: 15g
ANNEXE 3
Coloration de gram
1- Dposer une goutte deau sur une lame bien propre
2- Prlever un chantillon de colonie laide dun pique en bois et mlanger avec la
goutte deau, strier et scher par passage rapide sur la flamme dun bec benzne
3- Couvrir le frottis par du violet de gentiane pendant 60 secondes
4- Laver lexcs du colorant avec de leau distille
5- Couvrir de lugol pendant 30 secondes
6- Laver leau distille pendant 5 secondes
7- Rincer immdiatement le frottis avec le mlange alcool - actone ou avec de lthanol
en inclinant la lame et par goutte goutte jusqu disparition complte de la coloration
violette
8- Laver leau distille pendant 5 secondes
9- Couvrir avec de la fuschine (ou safranine) pendant 60 secondes
10- Laver leau distille pendant 10 secondes et mettre la lame incline sur du papier
absorbant
11- Dposer une goutte dhuile immersion sur le frottis et observer au microscope un
fort grossissement.
Les cellules Gram+ absorbent la couleur du violet de gentiane et demeurent bleues
violettes en apparence, contrairement aux cellules Gram- qui apparaissent distinctement
rostres.
192
.
Annexes
ANNEXE 4
Composition du milieu TY
Tryptone
: 2,5g
CaCl2
: 0,35g
: 12g
ANNEXE 5
Prparation des solutions du tampon de lyse
- Solution de SDS 10% : dissoudre 2g de SDS dans 16ml H2O sous agitation magntique,
complter 20ml avec du H2O.
- Solution de NaOH 5N : dissoudre 5g de NaOH dans 16ml H2O sous agitation magntique,
complter 20ml avec du H2O.
Prparer une solution de NaOH 0,1N et 0,5% SDS en prlevant 10l de NaOH 5N et 25l de
SDS 10% et complter avec de leau bidistille strile 500l.
Le mlange doit tre chaque fois frachement prpar.
ANNEXE 6
Composition du tampon Tris-EDTA (10 :1)
Prparer des solutions de 1M Tris (pH 8,0) et 0,5M EDTA.
Pour une solution TE (10 :1), mlanger - 1ml de Tris 1M
-
193
.
Annexes
ANNEXE 7
Composition du tampon de charge
Prparer en mlangeant les composs suivants :
-
50% glycrol
Conserver -20C.
ANNEXE 8
Composition du tampon Tris Borate EDTA (solution 10x concentre)
Prparer en mlangeant:
- 109g de Tris
- 55,7g dacide borique
- 9,3g du EDTA
Mlanger les diffrents poids dans 1 litre H2O bidistille, Striliser 121C pendant 20min. et
conserver temprature ambiante.
ANNEXE 9
Prparation du Bromure dEthidium (1mg/ml)
Dissoudre 10mg de Br Eth. Dans 10ml deau bidistille. Mettre la prparation dans une
bouteille noire ou envelopper avec du papier aluminium.
Conserver temprature ambiante ou 4C.
Attention : ce produit est trs cancrigne, mettre des gants et un masque avant toute
manipulation en vitant les courants dair car la poudre est trs lgre.
194
.
Annexes
ANNEXE 10
Composition de la solution nutritive sans azote
Solution
Produit
Elment
Quantit (g/l)
CaCl2, 2H2O
Calcium
294,10
KH2, PO4
Phosphore
136,10
MgSO4, 7H2O
Magnsium
194,21
K2SO4
Potassium
87,00
MnSO4, H2O
Manganse
0,338
H3BO3
Bore
0,247
ZnSO4, 7H2O
Zinc
0,288
CuSO4, 5H2O
Cuivre
0,1
CoSO4, 7H2O
Cobalt
0,056
Na2MoO4, 2H2O
Molybdne
0,048
Na2FeEDTA
Fer
6,48
Prendre 5ml de chaque solution 1 5 et les mlanger dans 5 litres deau distille. Le pH doit
tre ajust entre 6,6 et 6,8 avec du NaOH 1N. Complter ensuite le volume jusqu 10 litres.
Pour la solution nutritive azote, ajouter du KNO3 0,05% (w/v) de la solution nutritive
prpare.
ANNEXE 11
Prparation de la solution du BTB
Mlanger 0,5g de BTB dans 100ml dthanol, puis striliser le mlange par filtration.
Conserver cette solution 4C.
Ajoutez 5ml de la solution dans 1 litre de YEM pralablement strilis.
La concentration finale du BTB dans le milieu est de 25ppm.
195
.
Annexes
ANNEXE 12
Mthode de prparation des solutions dantibiotiques et leur mode daction
Antibiotique
Solubilit dans
Stockage
Mode daction
Ttracycline
70% Ethanol
-20C
Inhibe llongation en
bloquant lattachement de
lARNt au ribosome
Spectinomycine
H2O
0 5C
Inhibe llongation en
bloquant la translocation
peptidique par lARNt
Streptomycine
H2O
0 5C
Chloramphnicol
Mthanol
Temprature
ambiante
ou 0 5C
Inhibe llongation en
bloquant ltape de la
transpeptidation
Kanamycine
H2O
0 5C
Inhibition de la translocation
par attachement au niveau des
sous units ribosomiques
30/70S
Erythromycine
70% Alcool
Temprature
ambiante
Ampicilline
H2O
0 5C
Inhibition de la synthse de la
paroi bactrienne
Acide nalidixique
0,35 N NaOH
0 5C
Inhibition de la synthse de
lADN par inhibition de la
gyrase
196
.
Annexes
ANNEXE 13
Profil dassimilation de 49 substrats carbons par les souches nodulant le lupin
Control
Glycrol
Erythritol
D-Arabinose
L-Arabinose
Ribose
D-Xylose
L-Xylose
Adonitol
-Methyl Xylose
Galactose
D-Glucose
D-Fructose
D-Mannose
L-Sorbose
Rhamnose
Dulcitol
Inositol
Mannitol
Sorbitol
-Methy D-mannoside
-Methy D-glucoside
N acetyl glucosamine
Amygdaline
Arbutine
Esculine
Salicine
Cellobiose
Maltose
Lactose
Mellibiose
Saccharose
Trehalose
Inuline
Melezitose
D-raffinose
Amidon
Glycogene
Xylitol
-Gentiobiose
D-turanose
D-lyxose
D-tagatose
D-fucose
L-fucose
D-arabinose
L-arabitol
Gluconate
2ceto-gluconate
5ceto-gluconate
MSMC511
MSMC513
MSMC514
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201
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Annexes
MSMC547 MSMC541 MSMC5425 INRAL43 INRAL44 MSMC554 MSMC556 INRAL51 INRAL52 INRAL61
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1
1
202
.
Annexes
ANNEXE 14.
Tolrance des rhizobia nodulant le lupin diffrentes concentrations du NaCl.
L. luteus
Souches
MSMC 511
MSMC 512
MSMC 513
MSMC 514
MSMC 515
MSMC 516
MSMC 517
MSMC 518
MSMC 519
MSMC 5110
MSMC 5111
MSMC 5112
MSMC 5113
MSMC 5114
MSMC 5115
MSMC 5116
MSMC 5117
MSMC 5118
MSMC 5119
MSMC 5120
MSMC 5121
MSMC 5122
MSMC 5123
MSMC 5124
MSMC 5125
MSMC 5126
MSMC 5127
MSMC 5128
MSMC 5129
MSMC 5130
MSMC 5131
MSMC 5132
MSMC 5133
MSMC 5134
MSMC 5135
MSMC 5136
MSMC 5137
MSMC 5138
MSMC 5139
MSMC 5140
MSMC 5141
MSMC 5142
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NaCl (mM)
680 850 1020 1190 1360 1530 1700
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+++ :trs bonne croissance ; ++ : bonne croissance ; + : croissance normale ; -: pas de croissance
203
.
Annexes
NaCl (mM)
L. albus
L. luteus
Souches
0
170
340
510
680
MSMC 5143
MSMC 5144
MSMC 5145
MSMC 5146
MSMC 5147
MSMC 5148
MSMC 5149
MSMC 5150
MSMC 5151
MSMC 5152
MSMC 5153
MSMC 5154
MSMC 5155
MSMC 5156
MSMC 5157
MSMC 5158
MSMC 5159
MSMC 5160
INRA L11
INRA L12
INRA L13
INRA L14
INRA L15
INRA L16
INRA L17
INRA L18
INRA L19
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MSMC 521
MSMC 522
INRA L21
INRA L210
INRA L211
INRA L212
INRA L213
INRA L23
INRA L24
INRA L26
INRA L27
INRA L28
INRA L29
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204
.
Annexes
NaCl (mM)
Souches
L. angustifolius
0
MSMC 531
MSMC 532
MSMC 533
MSMC 534
MSMC 535
MSMC 536
MSMC 537
MSMC 538
MSMC 539
MSMC 5310
MSMC 5311
MSMC 5312
MSMC 5313
MSMC 5314
MSMC 5315
MSMC 5316
MSMC 5317
MSMC 5318
MSMC 5319
MSMC 5320
MSMC 5321
MSMC 5322
MSMC 5323
MSMC 5324
MSMC 5325
MSMC 5326
MSMC 5327
MSMC 5328
MSMC 5329
MSMC 5330
MSMC 5331
MSMC 5332
MSMC 5333
MSMC 5334
INRA L31
INRA L32
INRA L33
INRA L34
INRA L35
INRA L36
INRA L37
INRA L38
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170
340
510
680
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-
205
.
Annexes
L. atlanticus
L. pilosus
L. cosentinii
Souches
NaCl (mM)
MSMC 541
MSMC 542
MSMC 543
MSMC 544
MSMC 545
MSMC 546
MSMC 547
MSMC 548
MSMC 549
MSMC 5410
MSMC 5411
MSMC 5412
MSMC 5413
MSMC 5414
MSMC 5415
MSMC 5416
MSMC 5417
MSMC 5418
MSMC 5419
MSMC 5420
MSMC 5421
MSMC 5422
MSMC 5423
MSMC 5424
MSMC 5425
INRA L41
INRA L42
INRA L43
INRA L44
0
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170
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340
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MSMC 551
MSMC 552
MSMC 553
MSMC 554
MSMC 555
MSMC 556
MSMC 557
MSMC 558
MSMC 559
MSMC 5510
MSMC 5511
MSMC 5512
INRA L51
INRA L52
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INRA L61
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510
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680
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+
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+++ +++ ++ ++
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+
+
++
-
+
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+
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+
Annexes
206
.