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9 HISTOQUMICA

INDICE:
1. INTRODUCCIN
2. CARBOHIDRATOS
2.1. Derivados de monosacridos.
2.1. Polisacridos importantes.
2.3. Mtodos de demostracin de carbohidratos.
A) Reaccin de P.A.S. (periodic acid schiff).
B)Tratamientos enzimticos en la histoqumica de carbohidratos. Mtodo
AMILASA-P.A.S.
C) Deteccin de falsos positivos en el PAS
D) T. basadas en colorantes catinicos. Azul alciano, Metacromasia, Mtodo
de la diaminas de Spicer, Mtodo del hierro coloidal de Hale.
E) Tcnica de la plata metenamina.

3. LPIDOS.
3.1. Introduccin a la qumica de los lpidos.
3.2. Procesamiento histolgico para la deteccin de lpidos.
3.3. Tcnicas de coloracin para lpidos.
4. PROTENAS Y CIDOS NUCLICOS.
4.1. Protenas.
4.2. cidos nucleicos
5. MINERALES Y PIGMENTOS.
5.1. Introduccin.
5.2. Fisiologa del hierro.
5.3. Mtodos para la demostracin de hierro.
a) Mtodo del azul de Perls o azul de Prusia, modificado por Gomori.
b) Mtodo del azul de Turnbull.

5.4. Tcnicas para determinar pigmentos no hemoglobingenos.

Mtodos para determinar melanina.
a) Tcnica de argentafinidad de Masson-Fontana.
b) Tcnica de decoloracin de la melanina.
c) Mtodos histoenzimticos.

6. HISTOENZIMOLOGA.
6.1. Concepto de histoenzimologa.
6.2. Fijacin, inclusin del material y conservacin de la actividad enzimtica.
6.3. Principales problemas de las tcnicas histoenzimolgicas.
6.4. Controles generales en histoenzimologa.
6.5. Aplicaciones de la histoenzimologa

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PTCP UD 9: HISTOQUMICA

1. INTRODUCCIN
La histoqumica es la rama que estudia la naturaleza y composicin de los
tejidos utilizando reacciones qumicas entre el colorante y la sustancia de estudio. Las
tcnicas histoqumicas se pueden dividir en dos grandes grupos:

Aquellas cuyo objetivo es demostrar la presencia de grupos qumicos o

radicales presentes en los tejidos. Se basan en una reaccin qumica entre el
reactivo adicionado por nosotros y la sustancia a demostrar en el tejido dando
como resultado un nuevo compuesto provisto de color.
Aquellas que estudian el contenido enzimtico del tejido (Histoenzimologa),
en este caso la presencia enzimtica se demuestra de forma indirecta por la
transformacin del sustrato suministrado.

En histoqumica uno de los principales problemas es la fijacin ya que aqu es

fundamental no solo la conservacin de la morfologa sino tambin la composicin de
los tejidos. Es imprescindible usar un fijador que no origine nuevos radicales que
puedan dar lugar a falsos positivos o destruya radicales del tejido dando falsos
negativos. La congelacin es el mtodo alternativo, sobre todo en determinadas
tcnicas.
2. CARBOHIDRATOS
2.1. Derivados de monosacridos.
Entre los de inters en Histoqumica vamos a mencionar tan slo los derivados
aminados, de los cuales los ms importantes son la glucosamina y la galactosamina,
resultantes de la reaccin de un grupo amino con el carbono 2 de la glucosa o
galactosa, respectivamente. Ambos se encuentran en componentes azucarados del
organismo animal, como las glicoprotenas y los glicosaminoglicanos.
OH

NH2

Galactosamina

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Otro derivado de importancia es el cido neuramnico, el cual consiste en un

resto manosamina unido al cido pirvico. Los derivados acetilados del cido
neuramnico son los cidos silicos, importantes componentes de las
glicoprotenas y de los glicolpidos en los animales superiores.

2.2. Polisacridos importantes.

Glucgeno. Es especialmente abundante en los hepatocitos y en la clula
muscular y tiene una funcin energtica preponderante. Es un polmero ramificado
de glucosa, forma enlaces 1 4 y cada 8 10 unidades se ramifica mediante enlaces
1 6.

Glicosaminoglicanos unidos a protenas o proteoglicanos. Se encuentran todos

unidos a un eje protico, menos el c. Hialurnico que se da en cadenas polisacridas
libres. Los complejos de GAGs y protenas reciben el nombre de proteoglicanos. Los
restantes GAGs, unidos todos a un eje proteico, son los galactosaminoglicanos,
condroitn sulfatos y dermatn sulfatos y los heparn sulfatos, heparina y queratn
sulfatos. Son seis variantes cuya heterogeneidad se ve aumentada por la localizacin
y el grado de sulfatacin de sus unidades sacridas. Todos los GAGs son polmeros de
un dmero con la frmula general:
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PTCP UD 9: HISTOQUMICA

45

El c. Hialurnico, componente importante del tejido conjuntivo, carece de

grupos sulfatos. Los restantes GAGs estn todos sulfatados, siendo la heparina y el
heparn sulfato los que lo estn en mayor grado. Las funciones de los proteoglicanos
van desde las estrictamente mecnicas hasta la de diferenciacin celular y
morfognesis, pasando por las de adhesin y motilidad.
Glicoprotenas. Generalmente localizadas en las membranas celulares, a las
que atraviesan, tienen una importante misin en el reconocimiento intercelular. Los
restos glucdicos se localizan siempre en el extremo de la protena situada en el
espacio extracelular.
2.3. Mtodos de demostracin de carbohidratos.
Casi todos los mtodos de que disponemos lo son para demostrar restos o
grupos funcionales que, indirectamente, nos hablan de la presencia de las entidades
que los poseen. Sin embargo, puesto que los grupos funcionales pueden encontrarse
a veces en entidades qumicas muy distintas, un resultado positivo nos plantea
nuevas interrogantes. Tenemos necesidad entonces de otros mtodos auxiliares que
nos descarten algunas entidades a favor de otras.
En las hexosas y pentosas encontramos grupos glicoles que pueden ser
oxidados a aldehdos, grupos carboxilos, en los cidos hexurnicos o en los cidos
silios, grupos sulfatos en los dmeros de los glicosaminoglicanos, etc. Contamos con
un mtodo para la demostracin de aldehdos procedentes de la oxidacin de
alcoholes, el PAS, y mtodos para la demostracin de restos cidos o aninicos, los
colorantes catinicos.
Muy recientemente se han aplicado una serie de reactivos para el estudio de
carbohidratos que tienen una gran especificidad por determinados monosacridos,
es decir por unas determinadas conformaciones estricas, las lectinas (se estudiarn
con el tema de Inmunohistoqumica).
Finalmente, como tcnicas auxiliares para completar el estudio analtico del
contenido carbohidratado de un tejido, disponemos de unas tcnicas que utilizan el
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bloqueo de grupos funcionales en cuestin y otras que se valen de tratamientos

enzimticos especficos.
A) Reaccin de P.A.S. (periodic acid schiff).
Una de las reacciones ms conocidas de los carbohidratos es la oxidacin de
glicoles (aquellos que tienen dos grupos hidroxi OH
OH consecutivos) y sta reaccin
qumica va a constituir el fundamento
fundament del mtodo a estudiar.
El mtodo completo consiste en una oxidacin de los tejidos con cido
peridico seguida de la aplicacin del Reactivo de Schiff, que es un reactivo ideado
para demostrar la presencia de aldehdos en una muestra y que posee una al
alta
sensibilidad.
Vamos a analizar estos dos pasos con mayor detalle:
A.1. Oxidacin con HIO4
La oxidacin de alcoholes llega hasta la formacin de un cido, a travs de un
aldehdo.
El grado de oxidacin, en este caso, equivale al grado de oxigenacin y
aumenta de izquierda a derecha. Sin embargo, variando las condiciones de
concentracin del cido peridico, temperatura y tiempo de reaccin, podemos
quedarnos en el punto intermedio. As poniendo ya las condiciones adecuadas, la
reaccin tal y como tiene
ne lugar en las hexosas de los polisacridos sera:

A.2. Reaccin del aldehdo formado con el reactivo de Schiff.

El reactivo de Schiff se forma como consecuencia de la reaccin de la fucsina
bsica con el cido sulfuroso (metabisulfito potsico y c.
c. Clorhdrico = K2S2O5
+HCl = KCl + H2SO3), que hace desaparecer el doble enlace existente en el centro de
la molcula, transformndose en una sustancia incolora (reactivo de Schiff). Cuando
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el reactivo de Schiff reacciona con dos grupos aldehdos contiguos franqueados por
los correspondientes radicales OH, aparece de nuevo el doble enlace (grupo
cromforo) y con l, la coloracin rojo-magenta caracterstica.

H
NSO2H

SO3H
NH2 +

H2SO3
C

NSO2H
H
FUCSINA BSICA +

CIDO SULFUROSO = REACTIVO SCHIFF

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El mecanismo de la reaccin para demostrar los grupos glicoles tras oxidacin

con cido peridico y aplicacin del reactivo de Schiff, no se conoce con certeza pero
se puede simplificar de la siguiente manera:

Aparece el
doble enlace

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El reactivo de Schiff slo detecta grupos =O que se encuentren situados en

carbonos contiguos, dando lugar a la coloracin rojo magenta tpica de esta reaccin.
Glcidos positivos al P.A.S.
1. Polisacridos simples: Glucgeno, celulosa, etc.:Hgado
2. Mucopolisacridos neutros (GAGs neutros): Glndulas de Brunner del
duodeno, epitelio gstrico,estmago, colon, cpsulas bacterianas
3. Mucoproteinas:
a. Mucinas y secreciones mucoides del tubo digestivo y del rbol
respiratorio bronquial:Pulmn
b. Gonadotrofinas, hormona estimulante del tiroides.
c. Cilindros renales proteinaceos.
d. Clulas plasmticas.
4. Glucoprotenas:
a. Fracciones de la albmina y globulina del suero que existen en
membranas basales, reticulina y colgenos de algunos tumores
ovricos.
5. Glucolpidos:
a. Ganglisidos de la sustancia gris de S.N.
b. Cerebrsidos de la sustancia blanca del S.N.
6. Algunos pigmentos: ciertas lipofucsinas, ceroides.
Glcidos negativos al P.A.S
Los mucopolisacridos cidos que tienen bloqueados los enlaces 1 y 2
glicol por grupos (SO3H COOH) no pueden ser oxidados por el cido peridico,
son negativos al P.A.S., estos compuestos pueden ser puestos en evidencia a travs
de la utilizacin de colorantes catinicos.
B) Tratamientos enzimticos en la histoqumica de carbohidratos.
Mtodo AMILASA-P.A.S.
La tincin de P.A.S. es una tcnica muy sensible pero con poca especificidad ,
por eso el uso de tratamientos de la muestra con diversas enzimas nos da la
posibilidad de afinar ms en el diagnstico.
Las amilasas (existen en dos formas , ) catalizan la hidrlisis de los enlaces
glucosdicos del glucgeno y del almidn. La forma cataliza la hidrlisis de enlaces
glucosdicos 1-4, separando unidades de glucosa. La forma separa unidades de
maltosa sucesivamente. La forma ataca a los polisacridos no ramificados y a los
ramificados como el glucgeno lo hace dbilmente; la forma , sin embargo, ataca
ambos tipos de polisacridos con rapidez. Visto esto, se comprende que si
previamente a la reaccin del P.A.S., se tratan unos cortes con amilasa, sta romper
las cadenas de glucgeno y la reaccin del P.A.S. ser negativa.
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Este mtodo se utiliza para diferenciar mucopolisacridos, mucoprotenas,

etc., del glucgeno y debe realizarse conjuntamente con un PAS de la muestra sin
tratar. Si la sustancia presente es glucgeno saldr PAS positivo y PAS-Amilasa
negativo (PAS negativo tras tratamiento con Amilasa), si se trataba de otro
polisacrido las dos muestras sern PAS positivo.
Otros enzimas utilizados son la Neuraminidasa y la Hialuronidasa.
C) Deteccin de falsos positivos en el PAS
1.- Existencia de grupos aldehdos en la muestra
Si no se ha realizado el bloqueo de los grupos aldehdos preexistentes como
habitualmente ocurre en la prctica diaria, el primer problema que se plantea en esta
tcnica es la posibilidad de reacciones falsamente positivas debidas a la existencia de
dichos grupos.
En tal caso debe realizarse un control no oxidando el tejido; todo lo coloreado en esta
preparacin no sern enlaces 1,2 glicol oxidados sino grupos aldehdos que ya
estaban presentes. Despus se realiza un PAS oxidando y se comparan los resultados
de ambas preparaciones.
2.- Tcnicas basadas en el bloqueo de grupos funcionales. Bloqueo
mediante acetilacin para grupos 1,2 glicol.
El segundo problema en la tcnica del PAS se plantea cuando se trata de diferenciar
si los grupos aldehdos aparecidos tras la oxidacin lo han hecho sobre grupos
alcohlicos situados en posicin 1,2 glicol o si los oxidados han sido grupos
hidroxiamino primario, hidroxiamino secundarios e incluso hidroxicetonas no
presentes habitualmente en los hidratos de carbono que son PAS positivos.
Para realizar esta distincin se utilizan tcnicas fundamentadas en la negatividad de
la reaccin del PAS despus de la acetilacin de los grupos 1,2 glicol presentes en los
hidratos de carbono. La acetilacin es irreversible para los grupos hidroxiamino
secundarios y moderadamente reversible para los hidroxiamino primarios, mientras
que es totalmente reversible para los grupos alcohlicos en posicin 1,2 glicol, por lo
que si acetilamos y saponificamos a continuacin mediante tratamiento con KOH, el
PAS realizado sobre este tejido deber su positividad a los grupos 1,2 glicol
contenidos en los glcidos.
D) Tcnicas basadas en colorantes catinicos. Azul alciano,
Metacromasia, Mtodo de la diaminas de Spicer, Mtodo del hierro
coloidal de Hale.
Estas tcnicas son utilizadas para determinar mucopolisacridos neutros,
cidos y glucoprotenas. Los abundantes lugares aninicos existentes en los
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PTCP UD 9: HISTOQUMICA

diferentes polisacridos, son en ltima instancia de dos clases, carboxilos y sulfatos,

y, en su conjunto, proporcionan a los sustratos tisulares donde se encuentran la
apetencia que stos manifiestan por fijar colorantes catinicos.
El Azul Alciano se ha usado para demostrar carbohidratos cidos en combinacin
con PAS.

Usado en un amortiguador a pH:

aproximado de 0,5 slo se teirn las reas tisulares que contengan grupos
sulfatos
a pH 1,5 teiremos restos fosfricos y sulfatos
a pH 25 se teirn la mayor parte de mucopolisacaridos cidos.
- GAG cidos: Azul
- GAG neutros y glicoproteinas: Rojo magenta.
La Metacromasia designa el fenmeno mediante el cual el color con el que
se tie un determinado componente tisular difiere suficientemente del color original
del colorante y de su tincin ortocromtica ordinaria como para dar un marcado
contraste de color.
Si teimos un corte de tejido con Azul de toluidina, por ejemplo, algunos
componentes del corte se teirn de azul, pero otros como el cartlago, se teirn de
prpura o rojo. Se podra pensar que el colorante contiene otro derivado de color
rojo, pero esto no es as. El colorante, an con un grado de pureza suficiente, da
colores diferentes en diferentes reas del tejido, que dependen de la densidad de
grupos aninicos presentes en el mismo.
Los sustratos tisulares que producen este fenmeno del desplazamiento del
color, se vio que eran fuertemente cidos, a estos sustratos se les llama cromtropos.
Los sustratos cromtropos ms conocidos son la matriz del cartlago, los grnulos de
las clulas cebadas y las secreciones de algunas glndulas mucosas. Los
responsables de la metacromasia en los sustratos basfilos son los steres sulfricos
(intensa), los fosfricos y los carboxlicos (dbil).
El Mtodo de las diaminas de Spicer utiliza una mezcla de los ismeros
meta y para de la N-N-dimetilfenilendiamina, ms un agente oxidante, el cloruro
frrico. Esta mezcla con elevado contenido en hierro tie slo mucosustancias
sulfatadas y es muy til, combinado con el Azul Alciano, para distinguir
mucosustancias (GAG) neutras de mucosustancias (GAG) cidas.
Finalmente, el Mtodo del hierro coloidal de Hale supone que los grupos
cidos libres del tejido son los responsables de la fijacin del in frrico en forma
coloidal a pH 2, el cual se demuestra posteriormente por la reaccin del Azul de
Prusia. Su especificidad ha sido muy discutida aunque ha sido til en el estudio de las
lesiones cerebrales, donde el acmulo de polisacridos cidos puede demostrarse
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con nitidez, dada la ausencia de otros sustratos positivos en este tejido.

E) Tcnica de la plata metenamina.
Radica en la reduccin que sobre las sales complejas de plata realizan los
radicales carbonilo formados por oxidacin (cido crmico, peridico) previa de los
hidratos de carbono, de forma que la plata metlica obtenida precipita sobre las
estructuras que se van a teir.
La tcnica debe realizarse con un control continuo del pH (8,5), de modo que
la precipitacin de la plata no ocurra anticipadamente. Se utiliza para ver membranas
basales, sobre todo de rin (glomerulonefritis), compuestas en gran medida por
glucoprotenas, por tanto P.A.S. positivas. Resultados: Glucgeno, mucinas, hongos,
membranas basales, fibras de reticulina y elsticas de color negro.
3. LPIDOS.
3.1. Introduccin a la qumica de los lpidos.
Se consideran lpidos todas aquellas sustancias orgnicas insolubles en agua parcial
o totalmente, pero solubles en acetona, alcohol, cloroformo, ter, etc., y que en
general son untuosas al tacto. Aunque desde el punto de vista qumico los lpidos se
dividen en simples y compuestos, desde el punto de vista histoqumico es mejor
dividirlos en:
- Lpidos homofsicos: son aquellos que se encuentran en los tejidos en estado puro
y, por ello, estn concentrados en un territorio particular de la clula. Por ejemplo:
una gota de grasa en el citoplasma de la clula. Su determinacin histoqumica es
muy sencilla.
- Lpidos heterofsicos: son lpidos que no est en estado puro, sino mezclados con
otras sustancias, como ocurre con ciertas lipoprotenas. No estn concentrados en un
territorio concreto sino dispersos por determinadas estructuras. Por ejemplo: lpidos
que forman parte de membranas celulares. Su determinacin es muy difcil.
3.2. Procesamiento histolgico para la deteccin de lpidos.
Las grasas son insolubles en agua, pero solubles en ciertos disolventes
orgnicos, por ello, en la tcnica habitual las grasas se disuelven en los lquidos
intermediarios propios de la inclusin en parafina, quedando exclusivamente el tejido
los huecos donde stas se encontraban. Para evitar este problema, es necesario
incluir los tejidos en gelatina o polietilenglicol, o bien realizar los cortes en
congelacin.
El mejor fijador es el formol, es mejor an si se emplea como formol clcico:
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Formol al 4 % (puede no estar tamponado).

Cloruro clcico al 1 %.
De esta forma los iones de calcio estabilizan los lpidos y el formol los fija ms
eficazmente. Otros fijadores que insolubilizan las grasas neutras son el tetraxido de
osmio y los que llevan cromo, que pueden emplearse en lugar del formol.

3.3. Tcnicas de coloracin para lpidos.

Determinan principalmente los lpidos homofsicos, estos mtodos se basan
en que el colorante es ms soluble en los lpidos que en el propio disolvente en el que
va contenido. Son coloraciones por mecanismos fsicos de disolucin. Al baar la
grasa con la solucin del colorante ste tiende a disolverse en la grasa, que se va
cargando de colorante. Todos estos mtodos producen coloraciones progresivas,
pero la inestabilidad de las soluciones colorantes es el principal problema, pues la
evaporacin del disolvente provoca precipitacin del colorante sobre el tejido
inducindonos a error (falsos positivos).
Para evitar falsos positivos:
1. Almacenar el reactivo en lugar fresco y en recipientes cerrados
hermticamente.
2. Emplear,si es posible, soluciones diluidas filtradas.
3. Teir los cortes flotantes antes de rescatarlos del agua.
4. No prolongar la tincin ms de 10 min.
5. Agitar con cierta frecuencia durante la coloracin.
Tcnicas ms usadas.

Tcnica del Sudn IV: los cortes han de ser en congelacin y de 10 (m de

espesor. Tener mucho cuidado porque el colorante precipita. Resultados:
Lpidos: rojo intenso a naranja-rojizo. Ncleos: azul.
Tcnica del Sudn negro: ncleos y citoplasma: rojo. Lpidos: negro. Mielina:
negro.
Coloracin con el azul de Nilo.

Esta coloracin permite distinguir las grasas neutras de las de carcter cido.
El azul de Nilo siempre viene contaminado por rojo Nilo, para teir los lpidos
aprovechamos la propiedad del azul de Nilo de ser qumicamente impuro, de forma
que el azul Nilo es soluble en grasas de carcter cido mientras que el rojo Nilo se
disuelve exclusivamente en las de carcter neutro. De esta forma podemos identificar
los dos tipos de lpidos sin usar tcnicas histoqumicas. Resultados: cidos grasos:
azul oscuro, grasas neutras: de rosa a rojo.
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PTCP UD 9: HISTOQUMICA

4. PROTENAS Y CIDOS NUCLICOS.

4.1. PROTENAS. Estructura qumica de las protenas.
Las protenas son polmeros de unidades bsicas
denominadas aminocidos, stos poseen como
caracterstica comn un grupo cido y otro amino en su
molcula. Los aminocidos se unen entre s a travs de
la formacin de enlaces peptdicos.

ESTRUCTURA QUMICA DE LAS PROTENAS

La unin sucesiva de aa
formar, una larga
cadena con un grupo
amino en un extremo y
un carboxilo en el otro
y, a todo lo largo de la
cadena, cada
aminocido tendr un
resto (R) que es el que
le caracteriza. Esto
constituye la estructura
primaria de la protena.

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La unin sucesiva con otros aminocidos formar, al final, una larga cadena
con un grupo amino en un extremo y un carboxilo en el otro y, a todo lo largo de la
cadena, cada aminocido tendr un resto (R) que es el que le caracteriza. Esto
constituye la estructura primaria de la protena.
HISTOQUIMICA
El estudio de las protenas se suele realizar en material fijado en formol e
incluido en parafina. El formol bloquea los grupos activos de las protenas por
reticulacin, sin embargo, estos bloqueos son reversibles tras el tratamiento con
alcoholes y lquidos intermedios en el proceso de inclusin, siempre que no hayamos
prolongado en exceso el tiempo de fijacin.

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PTCP UD 9: HISTOQUMICA

Digestin enzimtica.
Antes de la coloracin hay que realizar la digestin enzimtica de las
protenas. sta es de gran utilidad, pues permite incrementar la intensidad de la
reaccin de ciertos grupos especficos de las protenas, y desenmascarar
determinantes antignicos.
Las proteasas son enzimas capaces de realizar, en condiciones adecuadas, la
degradacin por va hidroltica de las molculas proteicas a polipptidos ms
sencillos. Las principales proteasas utilizadas en histoqumica son:
PEPSINA: es la enzima proteoltica del jugo gstrico, segregada por las clulas
principales de las glndulas fngicas del estmago.
TRIPSINA: es la proteasa caracterstica del pncreas.
PRONASA: es una proteasa aislada del estreptomyces griseus, cuya accin
es parecida a la tripsina.
Mtodos histoqumicos para la coloracin de protenas.
Los mtodos histoqumicos han perdido vigencia a favor de los mtodos
inmunohistoqumicos mucho ms empleados en la actualidad. De forma genrica, las
tcnicas histoqumicas para colorear protenas pueden clasificarse en 3 grupos:

Reacciones generales: pretenden colorear globalmente a las protenas

presentes en un tejido, identificndolas como tales a travs de reacciones que
implican a sus grupos aminos o carboxilos.
Reacciones de grupo: pretenden caracterizar no la molcula proteica
globalmente, sino un corto nmero de grupos reactivos especficos de dichas
sustancias.
Reacciones especficas para grupos qumicos particulares, propios de
determinados aminocidos como grupos sulfhidrilo, fenol, indol, guanidil, etc.
Cada uno de ellos puede estar presente o ausente en una protena concreta,
por lo que estas reacciones pueden ser utilizadas para investigar su
composicin exacta.

4.2. CIDOS NUCLEICOS.

Los cidos nucleicos estn compuestos por largas cadenas de unidades
llamadas nucletidos, enlazadas por uniones covalentes. En general, los nucletidos
estn formados por:
cido fosfrico, implicado en el mecanismo de coloracin fisicoqumico por el cual los
ncleos se tien intensamente con colorantes bsicos como la hematoxilina.
Una pentosa, la ribosa (ARN) o desoxirribosa (ADN).
Bases nitrogenadas, dos pricas -adenina y guanina- y tres pirimidnicas -citosina,
timina y uracilo (sta ltima para el ARN).
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PTCP UD 9: HISTOQUMICA

En condiciones normales, los cidos nucleicos se conjugan con protenas

bsicas para formar nucleoprotenas. Por ello la realizacin de una hidrlisis cida
que los separe del componente proteico puede ser til para demostrarlos.
A fin de conseguir una interpretacin correcta de los resultados, deben
realizarse siempre preparaciones testigos, por lo general a travs de la extraccin
previa del cido nucleico que se desea demostrar.
Extraccin del ADN y del ARN.
Para la extraccin del ADN suele utilizarse la hidrlisis cida con cido
perclrico o tricloroactico, para la extraccin del ARN puede emplearse la extraccin
mediante ribonucleasa o bien la hidrlisis en cido perclrico disminuyendo la
temperatura y alargando el tiempo de incubacin si se desea preservar el ADN. La
extraccin es necesaria para conseguir las preparaciones control.
Tcnicas para detectar
visualizacin de ncleo)

ADN:

Reaccin

de

Feulgen

(Tcnica

de

Este procedimiento de coloracin se realiza en dos fases consecutivas; en la

primera se efecta una hidrlisis cida del ADN, con ella se pretende romper la
estructura del mismo por el lugar en que la pentosa se une a la base nitrogenada, de
forma que sobre cada molcula de azcar reaparezca un grupo carbonilo. Estos
grupos se encuentran situados precisamente a una distancia entre 1 y 1.1 nm. En la
segunda fase se procede a la demostracin de los grupos carbonilos formados
mediante el reactivo de Schiff, de forma anloga a la descrita para la reaccin del
PAS.
Este procedimiento de tincin, que en sentido amplio puede ser considerado
de carcter estequiomtrico (es decir, cada molcula fijada de reactivo de Schiff se
corresponde con una porcin constante y equivalente de molcula de ADN), permite
conocer la cantidad de ADN que contienen las diferentes clulas que componen una
muestra, marcando si sta est en reposo o se encuentra en proceso de duplicacin.
Si est en reposo: cantidad simple de ADN y por tanto color rosado o rojo dbil.
Si est en duplicacin o divisin activa: cantidad doble de ADN y por tanto color rojo
intenso.
La gran ventaja de ste mtodo es que sobre l puede realizarse la
objetivacin de esta informacin mediante espectrofotometra o tcnicas de anlisis
digital de imgenes por densitometra.

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PTCP UD 9: HISTOQUMICA

Tcnicas para la distincin entre ARN y ADN: mtodo del verde

metilo-pironina.
Este procedimiento tcnico se utiliza fundamentalmente para distinguir las
clulas dotadas de una gran capacidad secretora de protenas y, por tanto, ricas en
ARN ribosmico, como, por ejemplo, las clulas plasmticas productoras de
inmunoglobulinas y sus precursores inmediatos.
Fundamento del mtodo: la basofilia de los cidos nucleicos est ligada a la
presencia de grupos cidos ionizables pertenecientes al cido fosfrico. Con pH
adecuado dichos grupos tienen la propiedad de fijar los grupos electropositivos de
ciertos colorantes bsicos, entre los cuales destacan el verde de metilo y la pironina.
Por este motivo, la tcnica del verde metilo pironina no es una coloracin
histoqumica en sentido estricto, aunque la utilizacin de controles adecuados puede
hacerla muy especfica para la coloracin discriminativa de cidos nucleicos.
El verde de metilo es un colorante derivado del trifenilmetano, se fija
selectivamente sobre el ADN. La pironina Y o G es un colorante rojo derivado del
xanteno que tiene apetencia por el ARN. El mecanismo de tincin radica en la
atraccin electrosttica que se produce entre los colorantes bsicos verde metilo y
pironina y los cidos nucleicos, en unas condiciones adecuadas de pH. Resultados:
ncleos, verde (ADN); citoplasmas, rojo (ARN: ribosomas y retculo rugoso). Si los
cortes se tratan previamente con ARNasa, el color rojo de la pironina desaparece.
5. MINERALES Y PIGMENTOS.
5.1. Introduccin.
A menudo tenemos que realizar en el laboratorio tcnicas especficas para
identificar un determinado pigmento detectado en una preparacin teida con
hematoxilina-eosina. Los tipos de pigmentos son:

Artefactos: aparecen como consecuencia de la aplicacin incorrecta de

determinadas tcnicas histolgicas ; por ejemplo: pigmento formlico,
depsitos de sales de mercurio, de cromo, precipitados de plata, etc.
Pigmentos exgenos: proceden del medio ambiente y penetran en el
organismo originando una coloracin particular de los tejidos, pueden
acompaar o no a una patologa. Ejemplos: pigmento antractico (tabaco,
carbn), otros como slice metales, etc, por ingestin de carotenos, por accin
de agentes teraputicos (sales de oro, inyecciones de extractos hepticos,
etc.)
Pigmentos endgenos: son sustancias producidas por nuestro organismo a
partir de materias procedentes del catabolismo, degradacin o sntesis de
diferentes elementos. Tenemos los pigmentos hemoglobingenos
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PTCP UD 9: HISTOQUMICA

procedentes de la degradacin de la molcula de hemoglobina ( hemoglobina

(Hb), hemosiderina, hemofucsina, hematoidina, bilirrubina). Y los no
hemoglobingenos ( melanina, lipofucsina, ceroide, cobre).
El problema con los pigmentos, a excepcin de la Hb, es que todos presentan
una coloracin parduzca, lo que hace imprescindible su identificacin por medio de la
histoqumica.
Nos vamos a centrar en los mtodos para la determinacin del hierro y
pigmentos que lo contienen y en los mtodos para la melanina, porque son los que
usualmente se investigan.
5.2. Fisiologa del hierro.
El hierro se absorbe en el intestino delgado y es transportado por el plasma
unido a una protena, la transferrina, que la libera en los tejidos, principalmente en la
mdula sea donde va a formar parte de la Hb que se forma en los eritroblastos. El
exceso de hierro se almacena en todas las clulas, pero fundamentalmente (60%) en
las hepticas en forma de ferritina. Cuando la cantidad total de hierro en el cuerpo es
mayor que la que puede acomodar el depsito de ferritina parte del mismo se
acumula en la forma menos soluble denominada hemosiderina. La hemosiderina
forma grandes acmulos en las clulas que pueden teirse y observarse al
microscopio.
La hemoglobina es destruida en bazo y ganglios linfticos cuando los glbulos
rojos estn viejos y se libera el hierro frrico, el cual va a circular de nuevo hacia la
mdula sea para volver a ser utilizado.
As el hierro frrico (Fe3+) que teimos, se encuentra normalmente en:
mdula sea, bazo, hgado y ganglios linfticos. Cantidades excesivas de hierro se
encuentran cuando se administra indiscriminadamente (tanto por transfusiones
como por ingestin de preparados de hierro), en enfermedades con aumento y
destruccin de glbulos rojos (anemia hemoltica, hemocromatosis,), en
hemorragias internas, etc.
5.3. Mtodos para la demostracin de hierro.
El hierro en el organismo se puede encontrar en dos formas:
a) Hierro en forma inica: se encuentra formando sales normalmente en forma
de cloruros o hidrxidos.
Iones ferrosos (Fe2+)
Iones frricos (Fe3+) es el ms frecuente en el organismo.
b) Hierro unido a protenas o hierro enmascarado. ste no podemos detectarlo
directamente sino que es necesario someterlo previamente a un proceso de
16
PTCP UD 9: HISTOQUMICA

desenmascaramiento
enmascaramiento por el cual lo transformamos en hierro inico.
Entre los procedimientos para detectar el hierro inico existen tres tcnicas
fundamentales:
Mtodo del azul de Perls, azul de Prusia (mtodo de Gomori), para hierro
frrico.
Mtodo de azul Turnbull,
Tu
para hierro ferroso.
Mtodo de Tirmann-Schmeltzer,
Tirmann chmeltzer, para ambos en general, consiste en
transformar el Fe3+ en Fe2+ y realizar despus la tcnica de Turnbull,
coloreando a la vez ambos iones.
a) Mtodo del azul de Perls o azul de Prusia, modificado por Gomori.
Este va a ser el mtodo de eleccin, porque determina iones Fe3+ que son los
ms abundantes y tambin porque simultneamente los desenmascara de las
protenas.
Se basa en la propiedad que tiene el ferrocianuro potsico o prusiato amarillo
para
ara transformarse, en presencia de hierro frrico (cloruro frrico o similar), en
ferrocianuro frrico o azul de Prusia (de color azul), por accin del cido clorhdrico
que acta como desencadenante de la reaccin.

b) Mtodo del azul de Turnbull.

El Fe2+ es de escasa importancia clnica. Su determinacin se basa en la
reaccin que ocurre al poner en contacto el prusiato rojo o ferricianuro potsico y el
cido clorhdrico en presencia de cloruro ferroso existente en los tejidos, de forma
que se produce
e ferricianuro ferroso o azul de Turnbull, tambin de color azul.

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PTCP UD 9: HISTOQUMICA

5.4. Tcnicas para determinar pigmentos no hemoglobingenos.

Mtodos para determinar melanina.

Los fundamentales son:
a) Tcnica de argentafinidad de Masson-Fontana.
b) Tcnica de decoloracin de la melanina.
c) Mtodos histoenzimticos.
a) Mtodo de Masson-Fontana para la argentafinidad.
Este es un mtodo de impregnacin argntica basado en una reaccin de
argentafinidad. La ARGENTAFINIDAD es la propiedad que tienen algunos tejidos de
reducir el nitrato de plata amoniacal a plata metlica sin intervencin de agentes
reductores externos. Esta propiedad es tpica de determinadas granulaciones
citoplasmticas presentes en clulas cutneas como los melanocitos, que segregan
melanina, y ciertas clulas de secrecin endocrina presentes en el tubo digestivo y
que reciben el nombre de clulas argentafines. Estas clulas se encuentran en las
glndulas pilricas del estmago, criptas de Lieberkhn y mucosa del apndice.
La reduccin de plata amoniacal a plata metlica depende esencialmente del
contenido de sus grnulos de secrecin, por lo cual la imagen que aparece tras la
impregnacin es una imagen granular citoplasmtica. El mecanismo por el que se
produce esta reaccin no se conoce con exactitud.
b) Tcnica de decoloracin de la melanina.
Es ms sencilla. Utiliza agentes oxidantes que decoloran la melanina, por lo
que tambin recibe la denominacin de blanqueamiento de la melanina, pudiendo
ser el agua oxigenada o permanganato potsico.
c) Mtodos histoenzimticos.
Determinan la DOPA-oxidasa, una enzima caracterstica de los melanocitos.

6. HISTOENZIMOLOGA.
6.1. Concepto de histoenzimologa.
Las enzimas son compuestos de naturaleza proteica que se encuentran en los
tejidos y cuya misin consiste en catalizar las reacciones bioqumicas que tienen lugar
en las clulas para que stas puedan realizar sus funciones.

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PTCP UD 9: HISTOQUMICA

La histoenzimologa tiene por objeto demostrar la actividad

enzimtica presente en un tejido. Para ello se emplean diversas
sustancias (cromgenos) que, bajo la accin de la enzima,
adquieren una coloracin determinada indicativa de la presencia
de dicha enzima.
La actuacin ptima de las enzimas se produce a un pH y una temperatura precisas,
que varan para cada una de ellas y lejos de las cuales pierden progresivamente su
actividad, hasta quedar anulada por encima de 45 C y por debajo de 25 C.
6.2. Fijacin, inclusin del material y conservacin de la actividad
enzimtica.
La actividad enzimtica slo est presente en tejidos vivos, y ello nos plantea
graves inconvenientes a la hora de su anlisis histolgico. Los mtodos ideales de
fijacin para realizar estudios histoenzimticos son la criosustitucin y la
criodesecacin.
El 90 % de los estudios se realizan siguiendo un sistema ms sencillo: el corte
en congelacin mediante criostato a -20 C, previa congelacin en nitrgeno lquido
o isopentano a -50 C. Cuando se realizan cortes en criostato es fundamental fijar los
cortes con acetona al 100 %, lo cual sirve para deshidratar y favorecer las ulteriores
tcnicas de coloracin empleadas como contraste, sin modificar sensiblemente la
actividad enzimtica.
En relacin con la inclusin previa a la obtencin de cortes en el microtomo,
existen tres alternativas principales:
1. Imbibicin en un medio hidrosoluble de tipo OCT antes de la congelacin para
obtener los cortes en criostato.
2. Inclusin en gelatina o polietilenglicol que no precisan extraccin del agua
tisular.
3. Inclusin en parafina de bajo grado de fusin (40) : en este caso la actividad
enzimtica se conserva relativamente.
6.3. Principales problemas de las tcnicas histoenzimolgicas.

Falsos negativos
La excesiva rigidez de las condiciones en que hay que realizar las tcnicas,
debido a que las reacciones enzimticas ocurren slo a pH y temperaturas
determinados. Ello plantea que la persona encargada de realizar estas
tcnicas deba tener dominio de los mtodos a utilizar.
Otra causa de falsos negativos puede ser la presencia de elementos naturales
que interfieren bloqueando el sustrato, con lo que la reaccin de coloracin no
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PTCP UD 9: HISTOQUMICA

ocurre.

Falsos positivos
La aparicin de falsos positivos puede estar motivada por:
a. La difusin de enzimas de unos territorios a otros, por lo que se
desplaza el rea de positividad.
b. Contaminacin bacteriana, ya que las bacterias tienen enzimas que
pueden interferir con las tisulares.
c. Adsorcin inespecfica por el tejido de algunos reactivos
(fundamentalmente metales pesados), debido a atraccin en superficie
similar a la que ocurre en determinadas impregnaciones metlicas.

6.4. Controles generales en histoenzimologa.

Se basan en la confeccin de preparaciones que detectan tanto los falsos
positivos como los falsos negativos.
Deteccin de falsos positivos.
1. Eliminando la actividad enzimtica mediante calor. Se incuba la enzima a alta
temperatura (60-90 C) producindose su inactivacin; si en la preparacin
control la tcnica es positiva, lo coloreado en ella no se debe a actividad
enzimtica, sino a otra causa.
2. Bao de incubacin carente de sustrato: si es positiva, el resultado no es
debido a la actuacin de la enzima sobre el sustrato, sino a un falso positivo.
Deteccin de falsos negativos.
Se realiza la misma tcnica al tejido a estudiar y a un tejido control cuya
actividad enzimtica conocemos de antemano. sta ltima preparacin acta como
testigo de una correcta manipulacin tcnica y confirma la validez del mtodo. Si en
el control no sale el resultado esperado, la tcnica no es vlida y por tanto el
resultado no sirve.
6.5. Aplicaciones de la histoenzimologa
La histoenzimologa est perdiendo terreno en favor de la inmuhistoqumica.
Resulta ms sencillo determinar la presencia de una enzima atendiendo a su
estructura antignica por mtodos inmunolgicos que por su actividad biolgica. Sin
embargo, las aplicaciones secundarias de la histoenzimologa para demostrar
mediante anticuerpos marcados especficamente con enzimas la existencia de una
reaccin inmune previa, constituye la base de la inmunohistoqumica, tcnica hoy
da esencial en anatoma patolgica, biologa celular e inmunologa. Todava hoy se
usa en:

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PTCP UD 9: HISTOQUMICA

1. Biopsia de msculo esqueltico.

2. Deteccin de ganglios y tejido nervioso en el diagnstico de la enfermedad de
Hirschprung.
3. Demostracin de defectos enzimticos en la biopsia yeyunal.
4. Identificacin de clulas del sistema hematopoytico.
5. Demostracin de mastocitos.
6. Identificacin de actividad osteoblstica.
7. Realizacin de estudios neurohistolgicos complejos.

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PTCP UD 9: HISTOQUMICA

PRCTICA 1: DEMOSTRACIN DE CARBOHIDRATOS.

TCNICA DEL P.A.S.
Fundamento:
Esta tcnica se basa en la oxidacin de los grupos glicoles de los
carbohidratos, por accin del cido peridico (HIO4) y posterior reaccin con una
base de Schiff. El nuevo complejo formado presenta un color rojo magenta.
Material necesario:
Todo el material necesario para
hacer disoluciones: probetas,
pipetas, balanza, vasos de
precipitado
Papel del filtro, filtros.
Embudos.

Preparaciones a estudiar
Batera hidratacin
deshidratacin.

Pipetas Pasteur.
Varillas de vidrio con gomas.
Cristalizador.
Cubreobjetos.
Dpx.
Etiquetas.
Microscopio.
Atlas de histologa.

Reactivos:
cido peridico (HIO4).
Fucsina bsica.
Metabisulfito potsico (K2O5S2).
cido clorhdrico (HCl).
Carbn activo.
Agua destilada.
Preparacin de los reactivos:
1. Reactivo de Schiff:
a) En caliente:
Fucsina bsica
Agua destilada c.s.p.
Metabisulfito K
HCl 1 N

1g
200 ml
2g
20 ml

Calentamos la fucsina con el agua a ebullicin,

filtramos. Cuando se enfre 50 C le aadimos
el HCl 1N y cuando se enfre a 25 C le
aadimos el Metabisulfito K.

Dejar reposar 24 horas en oscuridad, aadir 2 g de carbn activo, agitar ( 1 min) y filtrar.

b) En fro:
Agua destilada
HCl concentrado
Metabisulfito Na
Fucsina bsica

192 ml
8 ml
3,8 g
2g

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PTCP UD 9: HISTOQUMICA

Tapar y agitar a intervalos de 2 a 3 minutos hasta que la mezcla sea marrn o negra
parduzca. Aadir 2 g de carbn activo, agitar 2 min. y filtrar. El filtrado tiene que ser
incoloro. Se almacena en frigorfico a 4C.
2. Agua sulfurosa:
Metabisulfito Na K al 10 %
HCl 1 N
Agua

9 ml
8 ml
150 ml

ESTA MEZCLA ES EXTEMPORNEA

Procedimiento:
1. Llevar los cortes al agua.
2. Cubrirlos con HIO4 al 1 % durante 10 min.
3. Lavar con agua destilada.
4. Cubrirlos con reactivo de Schiff 15 min a temperatura ambiente.
5. Lavado con agua sulfurosa y posteriormente lavado abundante con agua del
grifo (3 veces).
6. Lavado abundante con agua destilada.
7. Teir con hematoxilina de Harris acetificada durante 1 min.
8. Lavado con agua destilada y a continuacin introducir en agua alcalina hasta
que vire la hematoxilina.
9. Lavado con agua destilada.
10. Deshidratar llevar a xilol y montar.
Observaciones:
EL REACTIVO DE SCHIFF SE CONSERVA EN OSCURIDAD, ENTRE 0 C Y 4 C. HAY QUE
UTILIZARLO A TEMPERATURA AMBIENTE, POR LO QUE DEBEMOS TENER LA
PRECAUCIN DE SACARLO DEL FRIGORFICO CON TIEMPO SUFICIENTE, ANTES DE
REALIZAR LA TINCIN.

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PTCP UD 9: HISTOQUMICA

PRCTICA 2 : DEMOSTRACIN DE CARBOHIDRATOS.

MTODO DEL P.A.S. AMILASA
Fundamento:
La amilasa (enzima salival) rompe los enlaces glucosdicos del glucgeno,
dando ste por ello la reaccin del P.A.S. negativa, tras el tratamiento con dicha
enzima. Los dems carbohidratos sensibles al P.A.S., darn la reaccin positiva.
Material necesario:
Igual que en la tcnica del P.A.S.
Reactivos:
Adems de los utilizados en la tcnica del P.A.S.:
Amilasa.
Tampn fosfato (KH2PO4-Na2HPO4).
Preparacin de reactivos:
Tampn fosfato:
KH2PO4 1,4 %
Na2HPO4 1,4 %

42 ml
8 ml

Procedimiento:
1. Llevar los cortes al agua.
2. Meterlos en tampn fosfato amilasa 0,1 % en estufa a 37 C durante una
hora, o en bao Mara a 60 C durante 30 min.
3. Realizar la tcnica del P.A.S.

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PTCP UD 9: HISTOQUMICA

PRCTICA 3 : MTODOS PARA LA DEMOSTRACIN DE HIERRO

MTODO DE AZUL DE PERLS (azul de Prusia, modificado por Gomori)
Fundamento:
ste mtodo nos va a demostrar iones frricos (Fe3+) en los tejidos previa
separacin de stos de los tejidos por tratamiento con HCl. Los iones frricos, ya
libres, los hacemos reaccionar con ferrocianuro potsico, dando lugar a ferrocianuro
frrico o azul de Prusia de color azul brillante.
HCl
3[Fe(CN)6]K4+ 4Cl3Fe
[Fe(CN)6]Fe4 + 12ClK
Para contrateir utilizaremos rojo nuclear.
Material necesario:
El mismo que para la tcnica del P.A.S.
Reactivos:
HCl
Rojo nuclear
Al2(SO4)3

Timol
Ferrocianuro-potsico
[Fe(CN)6K4]

Preparacin de reactivos:
a) Solucin de HCl-Ferrocianuro potsico:
HCl al 2 %
MEZCLAEXTEMPORNEA
Ferrocianuro potsico al 10%
b) Rojo nuclear: Disolver 0,1 g de rojo nuclear en 100 ml de una disolucin de
Al2(SO4)3 al 5 % con ayuda de calor. Enfriar, filtrar y aadir unos granos de timol
como conservante.
Se reparte el agua en dos vasos de precipitado, se calientan en dos agitadores y en
cada uno se disuelve una sustancia. Cuando estn disueltos se mezclan los dos y
aadimos un poco de timol como conservante.
Procedimiento:
1. Desparafinar e hidratar hasta el agua destilada.
2. Cubrir con solucin HCl-Ferrocianuro K, 20 min.
3. Lavar con agua destilada.
4. Cubrir con solucin de rojo nuclear durante 5 min.
5. Lavar con agua destilada.
6. Deshidratar, aclarar y montar.
Resultados
Pigmentos con Fe3+
Ncleo
Citoplasma

azul brillante
rojo
rosa

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