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Enzimas

Un poco de historia
1700s

Se reconocen catalizadores biolgicos al


estudiar la degradacin de carnes por
secreciones estomacales

1800s

Se observa conversin de almidn a azcar


por saliva y extractos vegetales

1850s

La fermentacin de azcar a
alcohol por levaduras es catalizada
por fermentos que son
inseparables de las clulas vivas
de levadura

Un poco de historia
1897

Buchner: extractos de levaduras pueden


fermentar azcar a alcohol

Khne

ENZIMAS (Gk enzymos = levado)

1926

Sumner: asla y cristaliza ureasa todas


las enzimas son protenas

1930s

Pepsina, tripsina y otras enzimas digestivas


se aslan y cristalizan y son protenas

1930s

Haldane: interacciones dbiles entre


enzima y sustrato podran usarse para
catalizar reaccin

Los Protagonistas

Qu sabemos hoy de las enzimas ?


Exceptuando las ribozimas, son todas protenas
Actividad cataltica requiere protena nativa
Tamao muy variable: PM entre 104 - 106
Algunas requieren componente qumico adicional
para su actividad
COFACTOR

Algunos cofactores son iones metlicos

Otros son molculas orgnicas complejas


COENZIMAS

Coenzimas que
transfieren electrones

Coenzimas que transfieren


grupos de tomos

Coenzimas
que
transfieren
electrones

Coenzimas que
transfieren
grupos de
tomos

Muchas coenzimas son metabolitos de las vitaminas

Qu son las vitaminas ?


Compuestos que son esenciales para la
salud y que no pueden ser sintetizados por el
organismo
Deben ser incorporados en la dieta
Su deficiencia genera enfermedades por carencia
Se dividen en dos grupos de acuerdo con
su solubilidad

Vitaminas
Liposolubles

Vitaminas
Hidrosolubles

Vitaminas
Hidrosolubles

Volvamos a nuestras enzimas

Clasificacin de enzimas

E.C.w.x.y.z.

Un ejemplola hexoquinasa
ATP + D-glucosa ADP + D-glucosa-6-fosfato

E.C.2.7.1.1.
transferasa
fosfotransferasa
P-transferasa con HO como aceptor
D-glucosa como aceptor del P

Las enzimas son catalizadores


extraordinarios

Condiciones de funcionamiento
Especificidad
Magnitud de la aceleracin de la velocidad de reaccin

Cmo funcionan las enzimas ?

Energa Libre (G)


Energa requerida

ST

P
Direccin de Reaccin
T = Estado de transicin
Adapted from Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.166

Qu pasa en presencia de una enzima ?

E +P

La enzima estabiliza el Estado de Transicin


Cambio en Energa

EST

S
ES

EP

Energa disminuye (catlisis)

Energa requerida (no catlisis)

ST

Direccin de Reaccin
Adapted from Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.166

Cmo lo logra ?

Sitio activo

El sitio activo
Proporciona una superficie cataltica
Estabiliza estado de transicin
Transforma el estado de transicin en producto

B
A
A

Superficie cataltica
Juang RH (2004) BCbasics

Cmo estabiliza el sitio activo el estado de


transicin ?

Posee grupos reactivos


Evita influencia del agua

Optimiza interaccin con S

Juang RH (2004) BCbasics

La enzima no es perfectamente complementaria al


sustrato sino al estado de transicin
(Linus Pauling, 1946)

Ajuste inducido
(Koshland, 1958)

Adapted from Nelson & Cox (2000) Lehninger Principles of Biochemistry (3e) p.252

Hexoquinasa

D-glucosa

El sitio activo
Proporciona una superficie cataltica
Estabiliza estado de transicin
Transforma el estado de transicin en producto

B
A
A

Superficie cataltica
Juang RH (2004) BCbasics

Grupos especficos en el sitio activo


contribuyen a la catlisis a travs de
distintos mecanismos
Catlisis covalente
Catlisis con in metlico
Catlisis cido-base

Catlisis cido-base

Mecanismo Cataltico de Quimotripsina


A1
Trada Cataltica
His57
Asp102

H
[HOOC]

C
N

Ser195

N
H

O
C
C

C
N

Chequear especificidad de sustrato

[NH2]

Mecanismo Cataltico de Quimotripsina


A2
His57
Asp102

H
[HOOC]

C
N

N
C H

Ser195

O
C

[NH2]

C
N

Primer Estado de Transicin

Mecanismo Cataltico de Quimotripsina


A3

H
[HOOC]

C
N

H
N
C H

O
C
O

C
C N

Intermediario Acil-Enzima

C
C

[NH2 ]

Mecanismo Cataltico de Quimotripsina


D1

H O
H

O
C
O

[HOOC]

C
N

C
C N

N-H
C H
Intermediario Acil-Enzima Agua

C
C

[NH2 ]

Mecanismo Cataltico de Quimotripsina


D2

H
H

O
C
O

C
C N

Segundo Estado de Transicin

[NH2 ]

Mecanismo de Catlisis de Quimotripsina


D3

O
C
C

Des-acilacin

C
N

[NH2]

CO

Asp 102

HN

HOCH2

C C
H
CH2

Ser
195

His 57

O
COH

Asp 102

Ser Activa

H
N

NH

C C
H
CH2
His 57

OCH2

Ser
195

Adapted from Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.158

Carga en el Sitio Activo

-
O
H

O
C

H
N
C
H O H
H
H

H
N
C
H O H
H
H

Lenta

Rpida

N
H

O
C

H
C
H

Catlisis
Acida

O
C

Catlisis
Bsica

C
Rpida

N
H

O
C

N
H

Catlisis
Acido-base

Ambas

H
N
C
O
H
H
H
H
O

C
Muy rpida

Adapted from Nelson & Cox (2000) Lehninger Principles of Biochemistry (3e) p.252

Especificidad Induce el estado de transicin

Adapted from Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.167

Catlisis Acido-Base

Mecanismo Concertado de Catlisis


Carboxipeptidasa A
(270)
Glu 3
COO +

N
Cadena
peptidica del
Sustrato

H O2
1

His
(196)

O
H

SITIO Sitio para


ACTIVO especificidad

O-

2+

Zn

His (69)

Glu
(72)

COO -

Arg (145)

C-terminal

Chequear por
C-terminal

Juang RH (2004) BCbasics

Bolsillo
del Sitio
Activo

(248)
Tyr

Quimotripsina Tiene Un Sitio de Especificidad

O
O
NCCNCC NCCNCC
R
H R
OC
Ser

Sitio de
Especificidad Sitio Cataltico

Sitio Activo
Juang RH (2004) BCbasics

Especificidad de la Familia de Ser-Proteasas


corta en Lys, Arg

Bolsillo Profundo y Cargado


Negativamente

O
O
CNCCN
C
C
C
C
NH3
+
COOC
Asp

Quimotripsina
corta en Trp, Phe, Tyr
O
O
CNCCN
C

Elastasa
corta en Ala, Gly
O
O
CNCCN
CH3
Bolsillo Poco Profundo
y
no-polar

Bolsillo No-polar

Sitio Activo

Juang RH (2004) BCbasics

Tripsina

Especificidad Espacial

A
sp3

Superficie Enzima

La estructura tetrahdrica
de los orbitales del carbono
tiene una tensin estrica
que conforma la unidad
base de la conformacin
proteica

Estos dos tringulos


no son idnticos
Juang RH (2004) BCbasics

Cintica Enzimtica

V
Vo

Orden 0

ES
Orden 1

[S]

Otra vez un poco de historia


1903

Victor Henri: reaccin E + S ES etapa


necesaria en catlisis enzimtica

1913

Michaelis y Menten: Teora General de la


Catlisis Enzimtica

Las condiciones de M-M

E+S

k1
k2
rpida

ES

k3
k4

E+P

lenta*

ESTADO ESTACIONARIO: produccin y


consumo del complejo ES proceden a la misma
velocidad se mantiene constante la
concentracin de ES

Concentracin

ET
E

ES
Tiempo de reaccin

Juang RH (2004) BCbasics

EE

Vo
Vo = Vm

Vm
Vo = Vm [S]
Km + [S]

Vm
Vo = Vm [S]
Km

Km

[S]

Y siguiendo con la hexoquinasa

Glucosa + ATP Glc-6-P + ADP


Glucosa

Km =

Alosa

Manosa

CHO
H-C-OH
HO-C-H
H-C-OH
H-C-OH
H2-C-OH

CHO
H-C-OH
H-C-OH
H-C-OH
H-C-OH
H2-C-OH

CHO
HO-C-H
HO-C-H
H-C-OH
H-C-OH
H2-C-OH

8.000

5 mM
Juang RH (2004) BCbasics

Cintica Michaeliana

Vo
Vo = Vm

Vm
Vo = Vm [S]
Km + [S]

Vm
Vo = Vm [S]
Km

Km

[S]

Qu pasa con MM cuando reaccin


catalizada tiene ms de un sustrato ?
ATP + D-glucosa ADP + D-glucosa-6-fosfato

Distintos mecanismos posibles

Cmo hacemos en la
prctica para obtener
Vm y Km?

Recopilando
1) Usar una cantidad definida de Enzima E
2) Agregar sustrato en varias concentraciones S
3) Determinar Producto a Tiempo Fijo (P/t) vo
4) Estimar Vmax y Km

1
vo
-1
Km

1/2

Grfico Directo

1
Vmax

Doble recproca

1/S

Km

Juang RH (2004) BCbasics

Vmax
vo

Cmo medimos la cantidad de


enzima?

UNIDAD ENZIMTICA

UNIDAD ENZIMTICA (UE)


Cantidad de enzima que cataliza formacin de
determinada cantidad de producto en la unidad de
tiempo, en condiciones de velocidad mxima
UE

Actividad =
Protena (mg)
Especfica

Cmo puedo comparar la


eficiencia de distintas
enzimas?

E+S

k1
k2

ES

En condiciones saturantes

k3

E+P

Vm = k3 ET

k cataltica
Nmero de recambio

Algunos ejemplos

Constante de especificidad

kcat / km

Inhibicin de la
actividad enzimtica

Algunos inhibidores son irreversibles


Se unen covalentemente (o no) o
destruyen grupo funcional clave para
catlisis
Inhibidores suicidas

Diseo racional de frmacos

Un ejemplo realla Enfermedad del Sueo

Trypanosoma brucei

Difluorometilornitina
Inhibidor suicida de la Ornitn decarboxilasa
primera enzima en biosntesis poliaminas

Y otros inhibidores son


evidentemente reversibles!!!!!

Existen distintos tipos de inhibicin reversible


I

Competitiva

No-competitiva

Ecuacin y Descripcin

Dibujo Gua

Sustrato

Compite por
Inhibidor Sitio activo

Incompetitiva
E

X
I

Sitio diferente

E + S
ES E + P
+
I

EI

E + S
ES E + P
+
+
I
I

EI + S EIS

E + S
ES E + P
+
I

EIS

[I] se une a [E] libre solo,


y compite con [S];
aumento de [S] elimina
la Inhibicin por [I].

[I] se une a [E] libre o [ES]


complejo; aumento de [S] no
elimina [I] inhibicin.

[I] se une al [ES] complejo


Solo; aumento [S] favorece
la inhibicin por [I].
Juang RH (2004) BCbasics

Inhibicin Reversible

Grfico Directo

Competitiva
Vmax

vo

No-competitiva
vo

Km Km

Doble Recproca

[S], mM

Vmax no cambia
Km aumenta
1/vo I

Km = Km

1/ Vmax
1/Km

1/[S]

Incompetitiva

Vmax

Vmax

Vmax

Vmax

[S], mM

Vmax disminuye
Km no cambia
1/vo I

Km Km

Vmax & Km disminuyen


1/vo

1/ Vmax
1/Km

1/[S]

[S], mM

1/ Vmax
1/Km

1/[S]
Juang RH (2004) BCbasics

Una aplicacin clnica y curiosa de la


inhibicin competitiva
Emborrachar a los individuos intoxicados con metanol !

metanol

Alcohol
deshidrogenasa

Formaldehdo

etanol es inhibidor competitivo

Infusin lenta y continuada de etanol

Otra aplicacin clnica importante de la inhibicin


competitva: las sulfamidas
Acido p-aminobenzoico (PABA)

H2N-

-COOH
Acido
flico

Precursor

H2N-

Bacterias necesitan
PABA para
biosntesis de cido
flico

-SONH2

Sulfanilamida

Estructura similar al PABA,


inhibe el crecimiento bacteriano.

Adapted from Bohinski (1987) Modern Concepts in Biochemistry (5e) p.197

Cintica Michaeliana: Resumen


kcat / Km
kcat

Vmax [S]
vo=
Km + [S]

Directo

Significa:

Orden cero
1er orden

Nmero de
recambio

k3 [Et]
UE

Velocidad
Mxima

&

Km

Afinidad con
substrato

Doble recproca

Inhibicin

1 mol
min

Vmax

Competitiva

No-competitiva

Incompetitiva

Juang RH (2004) BCbasics

Enzimas
Regulatorias

Retroalimentacin negativa

Enzimas
Alostricas
Gk: allos = otros
steros = forma

Enzimas Alostricas
Protenas multimricas y complejas
Modulador y S se unen a distintas subunidades
Unin modulador produce cambio conformacional que altera
actividad enzimtica
Modulador puede ser positivo o negativo
Un sitio especfico para cada modulador
Modulador puede ser el mismo S
(homotrpico) o no (heterotrpico)

Un ejemplo real: aspartato transcarbamilasa

12 cadenas polipeptdicas

2 clusters catalticos con 3 cadenas


3 clusters regulatorios con 2 cadenas

Enzima Alostrica Asprtico transcarbamilasa


Forma Activa relajada

COOCH2
HN-C-COOHH

COOO CH2
H2N-C- N-C-COOHH
- - -

Carbamil aspartato

O
H2N-C-O-PO32-

Aspartato

- - -

Carbamil
fosfato

ATCasa
ATP

Juang RH (2004) BCbasics

CTP

CTP

Feedback
inhibicin
CTP

CTP

CTP

CTP

Forma tensa Inactiva

CTP

Metabolismo
Ncleicos

Cintica alostrica

Cooperatividad

Dos modelos para explicar este


comportamiento
Concertado
(Monod)

2 formas R y T en equilibrio que


se desplaza a un lado u otro
segn presencia modulador
S y modulador + slo se unen a R
Modulador slo se une a T

Ajuste inducido
(Koshland)

1 forma nica que va ajustando su


actividad de acuerdo con entrada
modulador

El modulador puede afectar K0.5

El modulador puede afectar Vm

Volvamos a la ATC

Efecto Curva Sigmoidea

vo
ATP

Efector positivo (ATP)


lleva curva sigmoidea
a hiperblica

CTP

Efector Negativo
(CTP) mantiene

vo
Si exageramos
la curva
sigmoidea
Vemos el punto
On/Off
claramente

Una enzima alostrica


puede detectar la
concentracin en el
ambiente y ajustar su
actividad

Off

[Sustrato]

On
Juang RH (2004) BCbasics

Enzimas reguladas por


clivaje proteoltico
Protelisis expone sitio activo
Regulacin irrversible
Se necesita otro mecanismo para inactivar
Inhibidor que se une fuertemente a sitio activo

Enzimas reguladas por


modificacin covalente
Grupos de tomos unidos o removidos generalmente
por otras enzimas

Fosforilaciones catalizadas por proten


quinasas especficas

Fosforilacin tiene que ser reversible


Fosfo proten fosfatasas

Un ejemplo: la glucgeno fosforilasa


(glucosa)n + Pi (glucosa)n-1 + glucosa-1-P

A veces una misma enzima tiene varios


sitios de fosforilacin

GP
(glucosa)n-1 + glucosa-1-P

(glucosa)n + Pi
GS

Rpida Respuesta a Concentracin Azcar en Sangre


Actividad Enzimtica

Glucgeno fosforilasa

Glucgeno sintasa

Glucosa

4
6
Tiempo (min)

Adapted from Stryer (1995) Biochemistry (4e) p.597