La vitamina D est presente en los alimentos en concentraciones muy bajas, por lo que su

anlisis resulta difcil. Los mtodos originales eran mtodos biolgicos en las cuales se
administraban extractos liposolubles a animales (ratas o pollos). Las pruebas medan la mejora
(prueba curativa) o el desarrollo (prueba profilctica) de la deficiencia de vitamina D en trminos
del grado de raquitismo producido. Estos mtodos son difciles de aplicar y su precisin era
escasa.
El principal problema con el anlisis de la vitamina D es que casi todas las fuentes de los
alimentos contienen otros lpidos que tienden a interferir. Por ello en la actualidad se han venido
desarrollando diversos mtodos de anlisis de los metabolitos de la vitamina D. La mayora
comprende tres pasos:
1.

Separacin de componentes de la vitamina D de los lpidos que interfieren con su

deteccin. Esto se hace mediante la extraccin con disolventes orgnicos (por ejemplo,
acetonitrilo) y marcaje con marcadores radiactivos para la identificacin y recuperacin.

2.

Separacin cromatogrfica de los metabolitos de la vitamina D. Con cromatografa

liquida de alta resolucin (HPLC).

3.

La identificacin de los diferentes metabolitos de la vitamina D por medio de anlisis de

radioreceptores o de protenas fijadoras.

SAPONIFICACIN Y EXTRACCIN
Si ha de determinarse la vitamina D3, se agrega D2 como estndar interno. Si ha de determinarse
la vitamina D2, se agrega D3 como estndar interno. La vitamina D2 y la vitamina D3 son extradas
de los alimentos mediante saponificacin utilizando una solucin alcohlica de hidrxido de
potasio seguida de una extraccin del solvente. La determinacin de vitamina D 2 y D3 en una
solucin apropiada del extracto de la muestra se realiza mediante HPLC de fase normal
semipreparativa seguida por HPLC de fase reversa analtica. La cromatografa se monitorea por
UV y se logra la identificacin de los picos de acuerdo a los tiempos de retencin y la
cuantificacin se realiza por el mtodo de estndar interno utilizando las reas o las alturas de
los picos.
De 10 a 30g de la muestra se saponifican preferentemente bajo nitrgeno utilizando una mezcla
de etanol o metanol, agua, un antioxidante tal como cido ascrbico, hidroquinona, pirogalol o
BHT e, hidrxido de potasio acuoso. El antioxidante debera agregarse a la muestra antes de la
adicin de la solucin de hidrxido de potasio necesaria para la saponificacin. Si ha de
determinarse vitamina D3, se pipetea una cantidad apropiada de estndar de vitamina D 2 en la
solucin alcohlica dentro del frasco de saponificacin. La cantidad de estndar interno de
vitamina D2 agregada deber ser similar a la cantidad de vitamina D 3 esperada en la muestra y
viceversa. En el Cuadro 5, se muestran ejemplos de la proporcin de reactivos utilizados para la
saponificacin. El tiempo normal de saponificacin es de 20-45 minutos con temperaturas que
fluctan de 80 a 100C (reflujo).
La vitamina D2 y D3 son extradas de la mezcla enfriada de saponificacin por medio de un
solvente adecuado, como ter dietlico, tertbutil metil ter, n-hexano, ter de petrleo o mezclas,
de 3 a 4 veces con volmenes que fluctan de 50-150 ml. Los extractos combinados son lavados
a pH neutro con agua (2-4 veces, 50-150 ml).
Pesa de la
muestra
16 g

Alcohol

Antioxidante

Hidrxido de Potasio

150 ml etanol

1 g pirogalol

30 g KOH + 75 ml H2O

8g
24 g

100 ml etanol
90 ml etanol

1 g ascorbato sdico
0.5 g cido ascrbico

12 G KOH + 50 ml H2O
30 ml (60%)

Cuadro 5: Proporcin de reactivos para saponificacin)

EVAPORACIN Y DILUCIN
Se agregan aproximadamente 2-5mg de BHT al extracto antes de la evaporacin utilizando un
evaporador rotatorio bajo un vaco parcial y a una temperatura que no exceda 50C. Deben
tomarse medidas para remover restos de agua tales como secar con sulfato de sodio, o
destilacin azeotrpica con etanol o tolueno o el uso de papel filtro para separacin de fases.
El residuo es redisuelto utilizando de preferencia la fase mvil del sistema HPLC semipreparativo
u otro solvente compatible con HPLC de tal modo de obtener una concentracin apropiada para
la inyeccin dentro de la columna de HPLC.
HPLC
Sistema semipreparativo (fase normal). Un estndar mixto de vitamina D 2 y D3 es
cromatografiado en el sistema HPLC semipreparativo y la condiciones optimizadas de tal manera
de obtener con un tiempo de retencin reproducible un slo pico de vitamina D y tambin tener
una ptima separacin de otros componentes que interfieren. Esto permite una recoleccin
precisa de la banda de la fraccin de vitamina D.
Sistema analtico (fase reversa). Un estndar mixto de vitamina D2 y D3 deber ser
cromatografiado en el sistema analtico de HPLC ajustando las condiciones cromatogrficas
hasta que la resolucin de la vitamina D 2 y D3 est al menos completada en un 98% y las
vitaminas sean resueltas de todas las interferencias de matriz de los alimentos.
Condiciones y cuantificacin de HPLC. Una alcuota del extracto de la muestra concentrada se
inyecta en el sistema HPLC semipreparativo y la fraccin de la vitamina D es recogida va corte
de bandas. La ventana de tiempo para el corte de banda debe haberse determinado
previamente utilizando una mezcla estndar de vitamina D y debera ser lo ms angosta posible.
La fraccin del corte de banda obtenida en la HPLC semipreparativa debe llevarse a sequedad y
redisolverse en un solvente compatible con la fase mvil del sistema analtico de HPLC analtico.
Se inyectan alcuotas de la solucin obtenida y se identifican y cuantifican los picos de vitamina
D2 y D3 utilizando el mtodo estndar interno. En el Cuadro 6 se presentan las condiciones de los
dos sistemas:
Los estndares y soluciones estndares deberan controlarse espectromtrica-mente en cuanto a
la pureza y utilizar la concentracin corregida para el clculo.
Es importante mencionar claramente las unidades utilizadas para informar los resultados, por
ejemplo en g de vitamina D3/100 g de alimento.

Columna

Sistema de fase normal (FN)

Sistema semipreparativo
Acero inoxidable; 250 x 4.0 nm

Fase estacionaria
Fase mvil

Lichrosorb SI 60 (Merck): 5 um
n-Hexano: 2-Propanol (95:5)

Sistema de fase reserva

(FR) Sistema analitico
Acero inoxidable; 250 x 4.0
nm
VYDAC 201 TP 54
Acetonitrilo: Metanol

Flujo
Presin
Volumen de inyeccin
Deteccin
Tiempo de retencin
(aprox en min)
Estndar
Clculo

1.0 ml/min
70 bar
500 ul
UV: 265 nm
Fraccin de vitamina D: 17

(91:9)
0.8 ml min
35 bar
10 ul
UV: 265 nm
Vitamina D2: 18
Vitamina D3: 21.5
Aprox 0.18 u/ml
Mtodo de estndar interno
Recuento de rea o altura

RADIOINMUNOENSAYO (RIA)
Esta tcnica fue desarrollada por Berson y Yalow en 1960 para determinar la
concentracin de insulina en el plasma sanguneo. Hoy en da, esta tcnica se utiliza
para detectar y cuantificar sustancias que se encuentran en cantidades muy pequeas
y mezcladas con muchas otras.
El fundamento es:
Se mezcla una cantidad constante de antgeno marcado radioactivamente y una
cantidad constante de un anticuerpo para ese antgeno.
Se produce la reaccin entre antgeno (Ag) y anticuerpo (Ac)
Se separa la fraccin de antgeno que se ha unido de la que permanece libre.
Se determina la radioactividad
Si la muestra contiene adems antgeno no marcado, ste competir con el marcado
para unirse al anticuerpo, y se observar un descenso en la medida de la
radioactividad
Este descenso es proporcional a la concentracin de antgeno no marcado en la
muestra
Los procedimientos de radioinmunoensayo son extensiones de las observaciones de
Berson y Yalow de que concentraciones bajas de una hormona antignica pueden
detectarse determinando la capacidad de estos antgenos para unirse a anticuerpos
especficos. Adems, la competicin de molculas de hormona no marcadas con las
marcadas radiactivamente por los mismos lugares de unin en el anticuerpo origina
una disminucin de la entidad desconocida (tal como la insulina en el plasma de un
paciente) debido a que ofrece una competicin por el anticuerpo similar a la de la
molculas de hormona marcada. A medida que aumentan las cantidades de antgeno
no marcado presente, los limitados lugares de unin del anticuerpo se van saturando
progresivamente. En consecuencia, se une menos antgeno marcado. La incubacin de

los componentes del sistema (antgeno no marcado, antgeno marcado y anticuerpo)

permite que ocurra una reaccin de equilibrio. La separacin subsiguiente de las
formas unidas de las no unidas, o libres y la medida de la cantidad de radiactividad
de una o de ambas fases permite la cuantificacin de la reaccin que ha tenido lugar.
Los componentes utilizados en el anlisis aparecen en la figura 1 son una sustancia
marcada que es idntica esencialmente a la sustancia desconocida que se medir mas
tarde. A esto le llamaremos antgeno marcado. Se introduce una cantidad conocida de
este antgeno marcado en una disolucin que contenga un anticuerpo para el antgeno.
A la vez, tambin se introduce una cantidad conocida del duplicado del antgeno no
marcado en la disolucin. Entonces hay una disolucin compleja que contiene antgeno
marcado, antgeno no marcado y anticuerpo. Estos componentes se dejan que
interaccionen, unindose con el anticuerpo tanto las molculas de antgeno marcadas
como las no marcadas. La disolucin resultante contiene por sonsiguiente dos
sustancias ms, el antgeno marcado complejado (o unido) as como el antgeno no
marcado unido. Se efecta despus una separacin de los componentes unidos de los
no unidos (algunos de ellos estn marcados y no marcados) por una variedad de
medios. Tal como la adicin de un material que se una a los antgenos libres que
quedan. Entonces puede medirse la radiactividad presente en ambas formas de la
sustancia, unida o no unida.
Como se observa en el panel inferior de la figura 1, aadiendo cantidades mayores (o
menores) de la disolucin de antgeno original, de concentracin conocida, dar lugar a
la formacin de menos (o ms) forma unida marcada de una sustancia. El exceso de
forma no marcada compite satisfactoriamente contra la menor cantidad de antgeno
marcado por los lugares de unin en el anticuerpo. Entonces es fcil ver que cuanto
ms antgeno original se aade al anticuerpo, menos radiactividad tendr la forma
unida resultante y, cuando se separa de la forma no marcada libre puede medirse
esta diferencia. Puesto que pueden aadirse series de cantidades conocidas, puede
construirse una curva patrn de la cantidad conocida presente comparada con la
cantidad de radiactividad medida en el componente unido para casa cantidad
conocida. la figura 2
En el anlisis por radioinmunoensayo de los metabolitos de la vitamina D se sustituye
la protena ligadora por un anticuerpo especifico producido contra cada uno de los
metabolitos de la vitamina D conjugados con la albumina serica bovina. Tiene la
ventaja sobre el mtodo anterior de no necesitar una purificacin previa, estando mas
al alcance de los laboratorios clnicos tradicionales.

 RADIOCOMPETICION PROTEICA (PB)

El anlisis por unin competitiva proteica aprovecha la existencia de protenas
especificas presenten en el suero (DPB) o en clulas diana como receptoras, con una
afinidad alta por la vitamina D y sus metabolitos, afinidad que no es especifica por lo
que no es necesaria su purificacin previa. As, se han utlizado como protenas
especificas tanto las DPB de sueros humanos de pacientes osteomalcicos y sin
exposicin al sol, como el receptor proteico de intestino de pollo.
Aunque la CPBA o los radioensayos de unin competitiva parecen ser muy similares al
radioinmunoensayo, el ligando en el anlisis de unin competitiva de protenas (CPBA)
se une a una protena el lugar de a un anticuerpo. En consecuencia, no estamos
tratando con el ligando como un antgeno como tal, sino como una sustancia qumica.
Hay protenas de unin especfica para muchas hormonas, tales como la globulina que
une corticolesteroides y la globulina que une tiroxina. Los principios de saturacin y
unin

competitiva,

no

obstante,

son

exactamente

los

mismos

que

los

de

radioinmunoensayo presentados antes. Hay pocas diferencias tcnicas bsicas entre el

radioinmunoensayo y los anlisis de unin competitiva de protenas. Debido a que los
sistemas de RIA generalmente tienen constantes de afinidad ms altas comparadas
con las CBPA, los sistemas RIA tienen mayor sensibilidad para medir niveles bajos de la
sustancia. Tambin los anticuerpos son altamente especficos, pero las protenas de
reaccin cruzada u otros receptores que interfieren en el CBPA pueden eliminarse.
HPLC (Cromatografia liquida de alta resolucin)
En la HPLC el compuesto pasa por la columna cromatogrfica a travs de la fase
estacionaria (normalmente, un cilindro con pequeas partculas redondeadas con
ciertas caractersticas qumicas en su superficie) mediante el bombeo de lquido (fase
mvil) a alta presin a travs de la columna. La muestra a analizar es introducida en
pequeas cantidades y sus componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de
las interacciones qumicas o fsicas con la fase estacionaria a medida que adelantan
por la columna. El grado de retencin de los componentes de la muestra depende de la
naturaleza del compuesto, de la composicin de la fase estacionaria y de la fase mvil.
El tiempo que tarda un compuesto a ser eluido de la columna se denomina tiempo de
retencin y se considera una propiedad identificativa caracterstica de un compuesto
en una determinada fase mvil y estacionaria. La utilizacin de presin en este tipo de
cromatografas incrementa la velocidad lineal de los compuestos dentro de la columna
y reduce as su difusin dentro de la columna mejorando la resolucin de la
cromatografa. Los disolventes ms utilizados son el agua, el metanol y el acetonitrilo.
El agua puede contener tampones, sales, o compuestos como el cido trifluoroactico,
que ayudan a la separacin de los compuestos.

Una mejora introducida a la tcnica de HPLC descrita es la variacin en la composicin

de la fase mvil durante el anlisis, conocida como elucin en gradiente. Un gradiente
normal en una cromatografa de fase reversa puede empezar a un 5% de acetonitrilo y
progresar de forma lineal hasta un 50% en 25 minutos. El gradiente utilizado vara en
funcin de la hidrofobicidad del compuesto. El gradiente separa los componentes de la
muestra como una funcin de la afinidad del compuesto por la fase mvil utilizada
respecto a la afinidad por la fase estacionaria. En el ejemplo, utilizando un gradiente
agua/acetonitrilo los compuestos ms hidroflicos eluirn a mayor concentracin de
agua, mientras que los compuestos ms hidrofbicos eluirn a concentraciones
elevadas de acetonitrilo. A menudo, hace falta realizar una serie de pruebas previas
con tal de optimizar el gradiente de forma que permita una buena separacin de los
compuestos.

Es el mtodo mas til disponible, consta de una fase preliminar en la cual se elimina
gran parte de interferencias de otros lpidos. La muestra de alimento se saponifica
VENTAJAS Y DEVENTAJAS DE LOS METODOS

El ensayo de unin de protenas competitivo ensayo evala los niveles circulantes

de 25-hidroxivitamina D usando una protena de unin a la vitamina D (vitamin D
binding protein o DBP). Aunque este mtodo es vlido y til para investigacin, es
complicado para utilizar como mtodo de deteccin clnica de deficiencia de
vitamina D. La muestra debe ser extrada en un solvente orgnico, secada con
nitrgeno y purificada mediante cromatografa. Las caractersticas liposolubles de
la molcula hacen que su medicin sea an ms complicada mediante ensayos de

unin a protenas, adems la hace vulnerable a los efectos de la matriz donde se

realiza el ensayo. Los factores de la matriz cambian la habilidad de la protena de
unin para unirse a la vitamina D, disminuyendo as la validez del ensayo.

Los mtodos de medicin directa para la deteccin de 25-hidroxivitamina D

incluyen los procedimientos HPLC, basados en el uso de cromatografa lquida.
HPLC se refiere a un mtodo de separacin mediante cromatografa lquida de alto
rendimiento, que separa y cuantifica las fracciones D2 y D3 y la posterior deteccin
mediante luz U.V. Este mtodo es altamente reproducible y es considerado
actualmente como un buen patrn de oro para deteccin de vitamina D. Sin
embargo, es dispendioso y requiere muestras muy grandes como estndar
internacional.

Los inmunoensayos son ms fcilmente automatizados, con tiempo ms corto para

la obtencin de resultados y los equipos estn disponibles a menor costo. En
contraste, los mtodos cromatogrficos son ms complejos, arrojan resultados en
un mayor tiempo y requieren personal entrenado para su manejo, as como equipos
ms costosos. Adicionalmente, los inmunoensayos detectan los niveles totales de
25-hidroxivitamina D y estn sujetos a problemas relacionados con la matriz,
mientras

que

los

mtodos

cromatogrficos

cuantifican

por

separado

las

fracciones D2 y D3 con alta precisin. Finalmente, los inmunoensayos requieren

calibradores, mientras que los mtodos cromatogrficos utilizan estndares
primarios. Los inmunoensayos son ms ampliamente usados por laboratorios
clnicos por las ventajas mencionadas, mientras que los mtodos cromatogrficos
son ms utilizados en grandes laboratorios de referencia.