MC ALMA LPEZ GARCA

El presente manual ha sido elaborado con el fin de proporcionar a los estudiantes

el conocimiento sobre el manejo y condiciones adecuadas en las que se debe
trabajar a los microorganismos. El laboratorio de microbiologa general representa
los cimientos que apoyan la formacin del profesional que de desarrollar en las
diferentes disciplinas de esta materia, as que desde este momento el alumno
debe adquirir la mentalidad de que su desempeo debe ajustarse correctamente a
la ejecucin de buenas prcticas de laboratorio.
El orden de este manual va de lo general a lo particular iniciando con el
conocimiento microscpico hasta la revisin de las caractersticas bioqumicas que
identifican a un organismo en particular. Para su realizacin se ha contado con el
apoyo de los diferentes profesores del Departamento de Microbiologa encargados
de impartir la materia, quienes con su experiencia han hecho las aportaciones
necesarias para que este manual represente un verdadero apoyo acadmico para
el alumno de licenciatura.
Para cumplir con un buen desempeo en este laboratorio presentamos la
siguiente:
Gua para el desarrollo del Trabajo en el Laboratorio de Microbiologa
1. La hora de entrada tiene 10 minutos de tolerancia, despus de ese tiempo, se
tomar como retardo, cada retardo equivale a medio punto menos en la
calificacin final del laboratorio.
2. Entrar al laboratorio con la bata puesta y abotonada.
3. Colocar todo su material y ropas en los cajones de las mesas de trabajo o en
las mesas laterales del laboratorio.
4. Lavarse las manos antes y despus de iniciar la sesin prctica.
5. No comer ni fumar en el laboratorio, ni introducir ningn objeto en la boca.
6. Limpiar y desinfectar el rea de trabajo antes y despus de usar.
7. No pasear entre las mesas del laboratorio, el trabajo debe realizarse sentado.
8. Hablar solo lo necesario con los compaeros.
9. Antes de iniciar la prctica lea cuidadosamente las instrucciones, siga
instrucciones del profesor, si no entiende pregunte.
10. El asa utilizada para el cultivo de microorganismos, debe de esterilizarse en la
flama del mechero antes y despus de su uso.
11. Informe al profesor de cualquier accidente que ocurra.

12. Todo el material que va a incubar o desechar, debe colocarse en el sitio

indicado por el profesor.
13. Sea cuidadoso con el material y equipo que se le proporcione, el material de
desecho no contaminado depostelo en los botes de basura, el material
contaminado no lo lave y depostelo donde le indique el profesor.
14. Etiquete todo el material que se va a incubar, con los siguientes datos:

Grupo.
Seccin.
Equipo.
Nombre del alumno.
Fecha

15. Para tener calificacin de laboratorio deber:

Cumplir con un 100 % de asistencia (SIN EXCEPCIN)
Entregar el banco de preguntas a los 8 das de finalizada la prctica, en caso de
no entregarlo se entregar al final del curso restando 0.5 puntos por cada banco
no entregado a tiempo
Aprobar el examen terico y/o prctico

PRACTICA No.1

OBSERVACIN DE GRUPOS MICROBIANOS

Introduccin.
La Microbiologa estudia a los microorganismos desde el punto de vista de su
morfologa, funcin, relacin con el ambiente y los mtodos que nos llevan a su
identificacin. Los estudios de cada grupo en particular corresponden a ramas
especficas de la microbiologa, como son:

Bacteriologa (bacterias).
Micologa (hongos)
Ficologa (algas).
Protozoologa (protozoarios).
Virologa (virus).

En 1969 Whittaker propone un sistema de 5 reinos, basndose en tres puntos

principales: complejidad celular (procariontes y eucariontes), complejidad
tisular(unicelular, multicelular-multinucleados) y nutricin (absorcin, fotosntesis,
ingestin) los cuales son: Monera, Protista, Fung, Vegetal y Animal.
Protozoarios: Son clasificados dentro del reino Protista, siendo microorganismos
unicelulares y eucariotes. Son en tamao mayores a las bacterias y sus
estructuras internas muchas veces fcilmente observables. Por su morfologa se
puede diagnosticar la especie.
Hongos: Son clasificados dentro del reino Fung, siendo organismos
multinucleados y eucariotes, sus nutrientes los obtienen por absorcin. En cuanto
a su tamao es variable, presentan dos tipos de crecimiento: filamentoso y
levaduriforme.
Los hongos filamentosos tienen como unidad funcional a la HIFA, el conjunto de
hifas es denominado MICELIO, el cual puede estar en contacto con el medio y se
le denomina VEGETATIVO, o bien por encima del sustrato denominndose micelio
AEREO. Estos hongos tienen aspecto algodonoso o aterciopelado con crecimiento
radial.
El otro tipo de crecimiento es el levaduriforme, el cual se caracteriza por su tipo de
multiplicacin o divisin llamado GEMACIN. En tamao son mayores a las
bacterias, son unicelulares y no desarrollan filamentos o micelio. Algunos gneros
forman el llamado pseudomicelio, con tinciones apropiadas podemos observar el
ncleo, otros organelos como mitocondrias o inclusiones como grnulos de
volutina, estn presentes en el citoplasma, las colonias de levaduras son de
aspecto cremoso.
Bacterias: Se encuentran dentro del reino Monera, son clulas procariotas y
unicelulares, se reproducen por fisin binaria, pueden ser mviles por la presencia
de flagelos simples, las formas fundamentales de las bacterias son: esfricas

(cocos), alargadas (bacilos), helicoidales (espirilos), los cocos pueden agruparse

en pares, cadenas, racimos o tetradas, dependiendo del gnero.
Un grupo importante de microorganismos son las Archeas cuya forma fundamental
es diferente al de las bacterias, se pueden presentar en forma de estrella o en
forma cuadrangular, la caracterstica principal de este grupo microbiano es su
crecimiento, requieren condiciones especiales extremas, como altas temperaturas
o altas concentraciones de sal.
Objetivo
1. Observar diferentes grupos microbianos, detectando forma y agrupacin,
usando microscopa ptica
Material

Preparaciones fijas de Bacterias, Hongos y Protozoarios.

Microscopio ptico.

Desarrollo
Hacer la observacin microscpica de cada preparacin proporcionada, anotando
el aumento al que se observ.

PRACTICA No.2
MICROSCOPIO
INTRODUCCIN
La observacin por microscopio es el mtodo ms comn utilizado tanto para la
deteccin directa de microorganismos en las muestras mdicas como para la
caracterizacin de microorganismos desarrollados en los cultivos. La microscopa
se define como el empleo de un microscopio para aumentar de tamao objetos
demasiado pequeos que no se pueden observar a simple vista, de modo que
puedan verse con facilidad.
El mtodo empleado para procesar las muestras del paciente est determinado
por el tipo y la fuente corporal de la muestra. Las coloraciones o los colorantes
especficos aplicados a las muestras, combinados con determinados mtodos de
microscopa, pueden ayudar a detectar los agentes etiolgicos de una manera
rpida.
La microscopia tambin desempea un papel clave en la caracterizacin de
microorganismos cultivados en el laboratorio
Objetivos
1. Realizar una tincin simple de bacterias procedentes de distintas muestras
naturales
2. Realizar dos tipos de fijaciones bacterianas y saber en qu casos se
recomienda una u otra.
3. Practicar con el microscopio al mximo aumento y con el correcto empleo del
aceite de inmersin.
Material

Muestras bacterianas de origen natural: yogur, vinagre, sarro dental, suelo,

etc.
Colorantes para tincin:
Microscopio y aceite de inmersin

Bacterias del yogur

El yogurt es un producto lcteo producido por la fermentacin natural de la leche.
A escala industrial se realiza la fermentacin aadiendo a la leche dosis del 3-4%
de una asociacin de dos cepas bacterianas: el Streptococcus termophilus, poco
productor de cido, pero muy aromtico, y el Lactobacillus bulgaricus, muy
acidificante.
En esta preparacin se podrn, observar dos morfologas bacterianas distintas
(cocos y bacilos) y un tipo de agrupacin (estreptococos, cocos en cadenas).

Adems, el tamao del lactobacilo (unos 30 m de longitud) facilita la observacin

aunque no se tenga mucha prctica con el enfoque del microscopio.
1. Realizar el frotis disolviendo una mnima porcin de yogur en una pequea gota
de agua.
2.Fijar con metanol para eliminar parte de la grasa.
3.Teir con un colorante cualquiera de los arriba indicados durante 1-2 minutos.
4.Observar al mximo aumento del microscopio.
Bacterias del sarro dental
El sarro dental es un depsito consistente y adherente localizado sobre el esmalte
de los dientes. Est constituido principalmente por restos proteicos, sales
minerales y bacterias junto con sus productos metablicos. La flora bacteriana de
la cavidad bucal es muy variable dependiendo de las condiciones que se den en el
momento de hacer la preparacin, pero suelen abundar bacterias saprfitas,
pudindose observar gran variedad de morfologas: espiroquetas, cocobacilos,
diplococos y bacilos.
1. Con una aguja enmangada tomar una pequea porcin de sarro dental y
disolverla en una gota de agua sobre el portaobjetos.
2. Dejar secar y fijar con calor.
3. Teir 2-3 minutos, lavar el exceso de colorante y secar.

PRACTICA No.3
PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO
Introduccin
Un medio de cultivo es un sustrato que proporciona los nutrientes necesarios para
el desarrollo del microorganismo a probar. Los microorganismos presentan
diferencias en sus requerimientos nutricionales que son reflejo de la extrema
diversidad bioqumica y fisiolgica. El agua, sales inorgnicas, fuentes de carbono,
fuentes de nitrgeno y metales son necesarios a todos microorganismos. Existen
bacterias que necesitan la presencia de determinado nutriente, sin el cual no
pueden desarrollarse, este nutriente se denomina: factor de crecimiento y las
bacterias que necesitan de ellos se llaman auxtrofos.
Los medios de cultivo con base en su contenido de material gelificante pueden
ser: lquidos, semislidos y slidos (los lquidos carecen de material gelificante).
En
Microbiologa el material gelificante ms utilizado es el agar, qumicamente es un
polisacarido obtenido a partir de algas marinas, presentando entre sus ventajas
que la mayora de los microorganismos no lo utilizan como nutriente. La presencia
y cantidad de ste permite diferenciar los medios semislidos y slidos, de 0.51.5% y una concentracin mayor o igual al 2% respectivamente.
Los medios de cultivo para Microbiologa se fabrican o bien de forma granulada o
de polvo, ambas presentaciones son higroscpicas por lo que deben mantenerse
perfectamente cerradas y en ambientes secos.
Objetivo
1. Preparar diferentes medios de cultivo slidos y aplicar la esterilizacin por calor
hmedo.
Material

Cajas Petri estriles.

Matraz Erlenmeyer.
Pipetas.
Mechero.
Autoclave.
Medios de Cultivo en polvo
Probeta.
Balanza.
Esptula o cuchara.
Parrilla de calentamiento
Guantes para calor.

Desarrollo

La forma en al cual se preparan los medios de cultivo viene indicada en cada

etiqueta y depende del fabricante. Se recomienda lo siguiente:
a) Utilizar un recipiente de volumen 2.5 veces mayor al que se va a preparar.
b) Al medio se le agrega aproximadamente la mitad del agua total a utilizar
dejndolo reposar unos 15 minutos.
c) Si es necesario calentar, el calentamiento debe ser paulatino y agitando
continuamente, evitar el calentamiento prolongado.
Proceso de Esterilizacin
1) Verificar el nivel de agua de la autoclave.
2) Introducir al autoclave los medios de cultivo perfectamente cubiertos, (en el
caso de esterilizar medios de cultivo en tubos con tapn de rosca, estos
deben estar tapados flojamente y cerrados perfectamente despus de
esterilizar).
3) Cerrar la tapa de la autoclave y esperar que se sature de aire caliente antes
de poner vlvula de presin.
4) Esterilizar a 121C (15 lbs. de presin) por 15 minutos.
5) Deben incluirse controles de esterilizacin para autoclave.
6) Compuestos termolbiles no deben ser autoclaveados.

PRACTICA NO. 4

AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS POR ESTRA CRUZADA

Introduccin.
Definicin de aislamiento: Es la separacin de un microorganismo determinado de
las poblaciones mixtas que existen en la naturaleza; el cultivo, es el crecimiento de
las poblaciones microbianas en ambientes artificiales (medios de cultivo) en
condiciones de laboratorio. El proceso mediante el cual se separan los
microorganismos se denomina aislamiento y el microorganismo separado
aislado.
La manera de inocular (sembrar) una muestra depende del tipo de medio de
cultivo
Medio lquido: la inoculacin se efecta mediante el asa bacteriolgica, pipeta o
hisopo.
Medio semigelificado (semislido): con ayuda del asa bacteriolgica recta
Medio gelificado (slido): en caja Petri o en tubos con agar inclinado, la
inoculacin se realiza por estra o picadura.
Un cultivo en el que se desarrolla solamente un tipo poblacin bacteriana se
conoce como cultivo puro o axnico. Un cultivo que tiene ms de una poblacin
bacteriana se conoce como cultivo mixto; en el caso especial de que contenga
slo dos clases de microorganismos, deliberadamente mantenidos en mutua
asociacin se denomina cultivo bimembre.
Objetivo:
Realizar el aislamiento de microorganismos utilizando placas de medio de cultivo
simple, con el asa bacteriolgica por el mtodo de estra cruzada.
Material:

2 Placas con agar nutritivo

Mechero Bunsen.
Asa bacteriolgica
Cepa bacteriolgica: Escherichia coli.
Benzal
Algodn

Desarrollo:
1.
2.
3.
4.
5.

Limpiar el rea de trabajo con benzal y algodn

Flamear el asa bacteriolgica hasta llevarla al rojo vivo.
Dejar enfriar el asa
Destapar el tubo o placa conteniendo la cepa problema
Tomar la muestra con el asa bacteriolgica y volver a tapar el tubo.

6. Hacer las estras sobre la superficie del medio de cultivo, como se

indica en el esquema de trabajo teniendo cuidado de flamear el asa
antes de cada serie de estras y enfriarla en una orilla de la placa.
Con la ltima serie de estras no volver a tocar la primera serie de
estras.

7. Rotular las placas con su nombre, fecha de ingreso y de salida del

material que se va a meter a incubar
8. Colocar las placas en la estufa bacteriolgica y dejarlas durante 24
horas a 37C.
9. Limpiar nuevamente el rea de trabajo con benzal y algodn
10. Evaluar el crecimiento a las 24 horas, identificando la presencia de
colonias aisladas y determinar si hubo cultivo puro o mixto
11. Colocar el material sucio en el cuarto de lavado
Otras de formas para la siembra de cepas con asa bacteriolgica empleadas en
microbiologa son:

PRACTICA No. 5
TINCIN DE GRAM
Introduccin
Los organismos vivos son incoloros y presentan pobre contraste cuando se
observan al microscopio. Cuando los organismos son teidos antes de
observarlos, aumenta en gran medida el contraste de las clulas y su medio. Antes
de teir es necesario hacer un frote y fijarlo. Un frote es una delgada capa de
clulas que cubre un rea de un portaobjetos, este frote debe ser secado al aire y
fijado por calor o qumicamente con alcohol. As los frotes no fijados son lavados
en el proceso de tincin.
Existen varias tcnicas de tincin ocupadas en Microbiologa, por ejemplo:

Tincin simple o directa.

Tincin diferencial.
Tincin de estructuras.
Tincin negativa.
Tincin de material de reserva, etc.

La tincin ms empleada en microbiologa es la de Gram, que es una tincin

diferencial. Los microorganismos difieren entre s desde el punto de vista qumico
y fsico por lo que reaccionan de manera diferente a los colorantes. Las tinciones
diferenciales ocupan dos colorantes, uno primario y otro de contraste o
secundario.
Para la tincin de Gram el colorante primario es cristal violeta mientras la safranina
corresponde al de contraste. La tincin de Gram clasifica a los microorganismos
segn su capacidad de retener el colorante primario (Gram positivas) o el
colorante de contraste (Gram negativas).
Objetivo:
Aprender el fundamento y la tcnica de la Tincin de Gram para determinar la
morfologa microscpica de diferentes cepas.
Material:

Mechero.
Asas bacteriolgicas.
Placas sembradas con diferentes microorganismos.
Portaobjetos.
Colorantes de Gram.
Microscopios.

Desarrollo. Tcnica de Tincin de Gram

1. Hacer un frote de las colonias caracterizadas, tomando con el asa

bacteriolgica una pequea muestra de una colonia aislada y mezclarla
con una gota de agua sobre un portaobjetos. Extender esta suspensin y
dejar secar.
2. Fijar el frote por calor deslizando el portaobjetos sobre la flama del
mechero.
3. Cubrir el frote con cristal violeta y dejarlo actuar por un minuto. Escurrir el
colorante y lavar con chorro suave de agua corriente.
4. Cubrir el frote con lugol, dejarlo actuar por un minuto. Escurrir y lavar.
5. Decolorar el frote con alcohol-acetona, de 5-30 segundos. Escurrir y lavar.
6. Cubrir el frote con safranina y dejarlo actuar por 30 segundos. Escurrir y
lavar.
7. Dejar secar al aire.
8. Observar el frote con objetivo de inmersin.
9. Determinar la morfologa microscpica y la respuesta a la Tincin de Gram
de cada cepa empleada

PRACTICA NO. 6
AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS POR EL MTODO DE DILUCIONES Y
VERTIDO EN PLACA
Introduccin.
Si se pretende conocer el nmero total de microorganismos presentes en una
muestra lquida o slida, es recomendable que se encuentren sta ltima en forma
lquida y homogenizada, adems de utilizar un mtodo apropiado. Es importante
sealar que el nmero no guarda relacin con el tipo de microorganismos
patgenos,
por lo que no puede usarse como ndice de su presencia y slo debe considerarse
como un indicador de las caractersticas higinicas de la muestra.
Adems dependiendo de las caractersticas del medio utilizado y de las
condiciones de incubacin, los microorganismos analizados sern miembros de
poblaciones diferentes. En general se investiga la presencia de microorganismos
aerobios o aerotolerantes aunque en ciertas situaciones puede ser de inters
hacer
recuentos anaerobios totales.
Objetivo:
1. Realizar el aislamiento de microorganismos a partir de muestras problema
utilizando el mtodo de diluciones y vertido en placa.
Material:
Muestra de agua o de alimento.
Mechero bunsen
3 Matraces conteniendo 500 ml de agar nutritivo estril cada uno
30 Pipetas de 10 ml puntas azules estriles y micropipeta con capacidad de
1000 l.
20 Tubos conteniendo 9 ml de solucin salida isotnica estril (diluyente)
30 Cajas petri estriles desechables.
Benzal

 Algodn
Marcador de tinta permanente
Desarrollo
1. Colectar 100 ml de muestra en un frasco estril.
2. Limpiar el rea de trabajo con benzal y algodn
3. Colocar en una gradilla 5 tubos conteniendo 9 ml de solucin salina estril
(diluyente) y numerarlos.
4. Tomar 1 ml de la muestra en condiciones de esterilidad y transferirlo a un tubo
que contenga 9 ml de diluyente, as se obtiene una dilucin 10-1, homogenizar el
contenido.
5. Transferir 1 ml a un tubo de dilucin que contenga 9 ml de diluyente, agitarlo
vigorosamente para homogenizar la muestra y obtener la dilucin 10-2.
6. Realizar sucesivamente las siguientes diluciones, transfiriendo 1 ml de la
muestra
a otro tubo con 9 ml de diluyente para obtener las diluciones 10-3, 10-4, 10-5, 10-6
como se indica en el esquema.
7. Pipetear 1 ml de cada una de las diluciones realizadas y transferirlos por
separado a una caja petri estril vaca.
8. Adicionar inmediatamente en las cajas petri de 10 a 15 ml de agar nutritivo
mezclando el inculo con el medio fundido, con movimientos rotatorios a la
derecha, a la izquierda y de arriba abajo.
9. Dejar gelificar las placas.
10.Rotular las placas indicando la dilucin que contienen y el tipo de muestra,
incluir
su nombre as como la fecha de ingreso y de salida del material.
11.Colocar las placas en la estufa bacteriolgica y dejarlas durante 24 horas a 37
C.
12.Limpiar nuevamente el rea de trabajo con benzal y algodn.
13.Evaluar el crecimiento a las 24 horas, hacer el recuento de las unidades

formadoras de colonias (colonias) con ayuda del contador de colonias, registrar

los resultados.
14.Seleccionar la placa representativa que corresponde a la dilucin que presente
entre 30 y 300 unidades formadoras de colonias (UFC).
15.Multiplicar el No. de UFC por el inverso de la dilucin para obtener el No. de
unidades formadoras de colonias/ ml presentes en la muestra.
16.Colocar el material sucio en el cuarto de lavado.

PRACTICA No.7
EFECTO DE LOS FACTORES FSICOS SOBRE
EL CRECIMIENTO DE LOS MICROORGANISMOS
Introduccin
Para que los microorganismos puedan ser aislados en el laboratorio se deben
satisfacer todos sus requerimientos nutricionales, para ello deben sembrarse en

condiciones de cultivo que aseguren por un lado, el suministro de los sustratos

adecuados y por otro el mantenimiento de las condiciones fsicas optimas, que nos
ayuden a obtener un crecimiento satisfactorio. Los factores fsicos que mas
influyen en
este aspecto y sobre los cuales se debe mantener un control preciso, son:
temperatura,
pH, concentracin de azcares, luz y concentracin de sales.
Temperatura: este factor influye sobre las reacciones metablicas que cada m.o.
realiza, de manera que cada especie se desarrolla mejor en ciertos rangos de
temperatura. As tenemos que los m.o. que crecen a temperaturas menores de
20C se
denominan Psicrfilos. En el otro extremo encontramos a los m.o. que crecen a
temperaturas mayores de 45C y se denominan Termfilos. Otros m.o. crecen en
rangos de 20C a 45C y se les llama Mesfilos. En los rangos, los extremos
superior e
inferior se designan como temperaturas mxima y mnima de crecimiento
respectivamente, sin embargo los m.o. se desarrollan mejor a un valor especfico
de
temperatura que se designa entonces como temperatura ptima de crecimiento.
pH: Segn el pH a la que se desarrollan las bacteria se clasifican en Acidfilos:
Se desarrollan en un rango de pH entre 1 y 5; Neutrfilos: Su rango es entre 5.5 y
8.5
y Basfilos: Crecen entre 9 y 12.
Sales y azcares: Existen organismos que para su crecimiento necesitan de
altas concentraciones de sales y se les denomina halfilos, mientras otros
soportan
esas altas concentraciones denominndose como sal tolerantes, debe entenderse
entonces que en el primer caso se refiere a un requerimiento mientras en el
segundo es
una adaptacin a las condiciones de cultivo.
Objetivos:

1. Determinar las condiciones ptimas de crecimiento de microorganismos

cultivados bajo diferentes variables de temperatura, pH, concentracin de sal y de
azcar.
2. Determinar las diferencias en los parmetros anteriores de acuerdo al grupo
microbiano.
Material
Cepas de Pseudomonas sp, Escherichia coli, Candida sp, Staphylocuccus
aureus
proporcionadas por el profesor.
Tubos con Caldo nutritivo preparados bajo las siguientes variables:
a) pH: 2, 5, 7 y 12.
b) NaCl: 0.85%, 5.0%, 7.0% y 10%.
c) Sacarosa: 2.5%, 5.5%, 10.0% y 20%.
d) Normales para incubacin a diferentes temperaturas.
Desarrollo
1. Formar un grupo de 16 tubos con caldo nutritivo que contengan las cuatro
variables
de cada uno de los factores a probar. Estos 16 tubos se emplearn para analizar
el
comportamiento de una sola cepa.
2. Sembrar una asada de la cepa correspondiente en cada uno de los 16 tubos
anteriores. El procedimiento se ilustra en el esquema de abajo.
3. Incubar todos los tubos de pH, NaCl y Sacarosa a 37C durante 24 hrs.
4. Incubar los tubos con caldo nutritivo preparado normalmente a las siguientes
temperaturas: 4, 25, 37 y 45 durante 24 hrs.
5. Observando el crecimiento de las cepas sembradas, reporte sus resultados en
el
cuadro de reporte.
6. Para el llenado siga el mtodo de las cuatro cruces. Comparando
simultneamente

los cuatro tubos de las variantes de un mismo factor, asigne valores de 1-4 cruces
segn la turbidez presente en el medio. Donde no exista crecimiento asigne 0.

PRACTICA No. 8
EFECTO DE LOS AGENTES QUMICOS SOBRE
EL CRECIMIENTO DE LOS MICROORGANISMOS
Introduccin
Para el control del crecimiento microbiano o la eliminacin total de las poblaciones
microbianas podemos
desinfectantes o

emplear

sustancias

qumicas

conocidas

como

antispticos, que actan sobre el microorganismo por los siguientes mecanismos:

Ruptura de pared.
Alterando la naturaleza coloidal del protoplasma.
Alterando la permeabilidad.
Inactivando enzimas.

 Desnaturalizando protenas.
Disminuyendo la tensin superficial.
Entre los agentes qumicos empleados tenemos: cidos, bases, jabones,
detergentes, alcoholes, metales pesados y colorantes. l termin desinfectante
est
restringido a las sustancias que son aplicadas sobre superficies. La accin
desinfectante se ve aumentada por la temperatura y la concentracin.
Objetivo
1. Observar el efecto de diversos agentes qumicos sobre el crecimiento de los
microorganismos y determinar la diferente susceptibilidad de los organismos.
Material
Placas con agar nutritivo.
Hisopos estriles.
Discos de papel filtro impregnados con los siguientes agentes:
a) Agentes surfactantes: benzal, jabn, detergente y sales biliares.
b) Metales pesados: merthiolate.
c) Desinfectantes: Cloro, yodo.
d) Colorantes: cristal violeta, safranina.
e) Antibioticos.
Pinzas.
Cepas las que proporcione el profesor
Desarrollo:
1. Sembrar las placas con agar nutritivo en forma masiva, empleando hisopos
estriles con cada uno de los microorganismos proporcionados, en la siguiente
forma:

2. Empleando pinzas flameadas en el mechero, colocar adecuadamente

discos de papel filtro impregnados con el agente qumico a probar. La distancia
entre cada disco no debe ser menor a 2 cm.
3. Incubar todas las placas a 37C durante 18-24 horas.
4. Hacer lectura midiendo en mm el dimetro de los halos de inhibicin alrededor
de
los discos de papel filtro impregnados con el agente qumico.

PRACTICA No. 9
CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS GRAMNEGATIVOS
EN DIFERENTES MEDIOS DE CULTIVO
Introduccin
El grupo de bacterias Gram negativas incluye una amplia variedad de tipos
bacterianos. Se encuentran en ambientes como el suelo, mucosas de diversos
hospederos como parte de su flora normal o hasta contaminando alimentos.
Independientemente de su respuesta a la tincin de Gram, los microorganismos
poseen complejidad bioqumica y fisiolgica con caractersticas que se hacen
evidentes al emplear medios de cultivo de composicin qumica especial, que
ponen de
manifiesto alguna propiedad metablica.
Dependiendo de su composicin y de su empleo los medios de cultivo pueden
ser: Diferenciales: aquellos que sirven para la clasificacin de microorganismos en

base a una caracterstica bioqumica individual; Selectivos: contienen inhibidores

que
impiden el crecimiento de un tipo de bacterias pero no de otras; Enriquecidos:
carecen de inhibidores y son abundantes en su contenido de nutrientes por lo que
en
ellos se puede aislar a la mayora de las bacterias; De enriquecimiento: son
medios
que favorecen el crecimiento de un tipo bacteriano sin que necesariamente impida
el de
otros; De transporte: sirve para preservar una muestra en las condiciones
originales y
se emplea cuando existe demora entre la toma y el procesamiento.
Objetivo
1. Manejar los medios de cultivo adecuados para bacterias Gram negativas e
interpretar los cambios bioqumicos presentados en ellos.
Material
Placas de Petri preparadas con los medios de cultivo: Mac Conkey, EMB, Verde
Brillante y Sulfito de Bismuto.
Mechero Bunsen
Asa bacteriolgica
Cepas: las que proporcione el profesor
Desarrollo
1. Sembrar por el mtodo de estra cruzada cada uno de los medios, con la cepa
proporcionada por el profesor.
2. Incubar las placas sembradas a 37C por 18-24 hrs.
3. Hacer la lectura detallando el tipo de crecimiento en cada uno de los medios
sembrados y determinar el medio de cultivo ptimo para el aislamiento de cada
cepa.
PRACTICA No. 10
OBSERVACIN DE MORFOLOGA COLONIAL

Introduccin
Las muestras sembradas en los medios adecuados y bajo las condiciones
ambientales ptimas crecern como un agregado macroscpico de muchas e
idnticas
clulas provenientes de una, formando una colonia en la superficie de un medio de
cultivo slido. Una vez aisladas las colonias los pasos a seguir para llegar a la
identificacin del tipo bacteriano son:
a) Determinar las caractersticas de la morfologa colonial.
b) Determinar la pureza de las cepas por medio de tinciones.
c) Observacin de cambios alrededor de las colonias, que reflejan alguna actividad
metablica.
d) Realizar pruebas metablicas diferenciales.
Morfologa Colonial.
Las caractersticas que determinan la morfologa colonial son:
1. Tamao de las colonias en milmetros.
2. Color de las colonias.
3. Forma: puntiforme, circular, irregular, filamentosa
4. Elevacin: plana, elevada, convexa, pulvinada, embonada, umbicada
5. Superficie: lisa, rugosa, granular
6. Aspecto: hmedo, seco.
7. Bordes: enteros, ondulados, filamentosos
8. Luz reflejada: brillante o mate.
9. Luz transmitida: opaca, translcida, transparente.
10. Consistencia: suave (butirosa, mucoide o friable) o dura.
Objetivo:
1. Aprender a leer la morfologa colonial.
Material:
Mechero.
Asas bacteriolgicas.

 Placas sembradas con diferentes microorganismos.

Procedimiento.
Identifique las caractersticas morfolgicas de las colonias crecidas en los
diferentes
agares
PRACTICA No. 11
CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS GRAMPOSITIVOS
EN DIFERENTES MEDIOS DE CULTIVO
Introduccin
El grupo de bacterias grampositivas comprende un espectro muy amplio de tipos
morfolgicos, la mayora son hetertrofos que crecen como saprfitos viviendo de
materia orgnica muerta. Las bacterias grampositivas generalmente abundan en el
suelo aunque un nmero importante de ellas son patgenos de plantas y
animales. Un
nmero menor de las bacterias grampositivas son auttrofas y producen cido
actico a
partir de dixido de carbono e hidrgeno. Dentro de las bacterias grampositivas
tambin
se ha descrito un grupo fotosinttico, las heliobacterias.
Las bacterias grampositivas contienen mayor cantidad de pptido glucana que las
bacterias gramnegativas, y sus paredes carecen de lipopolisacrido, componente
caracterstico en las gramnegativas.
Objetivo
1. Manejar los medios de cultivo adecuados para bacterias Gram positivas e
interpretar los cambios bioqumicos presentados en ellos.
Material
Placas de petri preparadas con los medios de cultivo: Sal y Manitol; Gelosa
Sangre
y Gelosa Chocolate.
Mechero

 Asa bacteriolgica
Cepas: las que proporcione el profesor
Desarrollo
1. Sembrar por el mtodo de estra cruzada cada uno de los medios, con la cepa
proporcionada por el profesor.
2. Incubar las placas sembradas a 37C por 18-24 hrs.
3. Hacer la lectura detallando el tipo de crecimiento en cada uno de los medios
sembrados y determinar el medio de cultivo ptimo para el aislamiento de cada
cepa.
4. Para el caso del medio Gelosa Sangre, determinar el patrn de hemlisis
presentado por cada cepa de acuerdo al siguiente criterio:
Alfa-hemlisis: parcial aclaramiento alrededor de la colonia con
decoloracin verde en el medio.
Beta-hemlisis: zona de completo aclaramiento debido a la lisis total de los
glbulos rojos.
Gamma-hemlisis: no hemlisis.
PRCTICA 12
OBSERVACIN DE MORFOLOGA COLONIAL
Introduccin
Las observaciones preliminares basadas en la morfologa colonial de una placa
inoculada deben ser confirmadas por las tinciones, las cuales proporcionan la
siguiente
informacin:
Tamao y forma microscpica.
Agrupacin microscpica.
Presencia de estructuras especficas u organelos.
Caractersticas tintoriales.
Para llegar a la identificacin final de una bacteria deben usarse pruebas basadas
en

caractersticas metablicas
Morfologa Colonial.
Tomando en cuenta los mismos parmetros morfolgicos de la prctica 8, realizar
la
lectura de las placas inoculadas.
Objetivo:
Aprender a leer la morfologa colonial.
Material:
Mechero.
Asas bacteriolgicas.
Placas sembradas con diferentes microorganismos.
Procedimiento.
Identifique las caractersticas morfolgicas de las colonias crecidas en los
diferentes
agar
Practica 13
PRUEBAS METABLICAS
Introduccin
El aislamiento de bacterias de productos biolgicos es un procedimiento de rutina
en un laboratorio clnico, que tiene como finalidad encontrar al agente causal de
algn
cuadro infeccioso. El xito del aislamiento de bacterias depende en un principio de
la
correcta toma de la muestra, que deber ser representativa del estudio deseado
(exudado faringeo, coprocultivo, urocultivo, exudado de herida, exudado otico,
hemocultivo, cultivo de liquido cefalorraquideo, etc), el siguiente paso es la
seleccin de
los medios de cultivo adecuados, que debern ser selectivos diferenciales y/o
enriquecidos dependiendo de los microorganismos buscados.

Una vez que se obtienen los cultivos puros, el siguiente paso, generalmente para
la identificacin de los microorganismos son las pruebas metablicas o pruebas
bioqumicas, las cuales se basan en la determinacin de enzimas, productos
finales del
metabolismo, etc. Dichas pruebas son caractersticas de cada genero y especie,
para
esto se siembra a los microorganismos en medios que contienen un sustrato
especifico,
un indicador de pH, y los nutrientes necesarios para su crecimiento (en algunas
ocasiones es necesario agregar algunos reactivos al medio donde se ha
desarrollado el
microorganismo para visualizar la reaccin bioqumica).
Objetivos:
Conocer el fundamento de las pruebas metablicas
Material
Tubos con agar TSI
Tubos con agar LIA
Tubos con agar MIO
Tubos con agar Citrato
Tubos con agar Urea
Reactivos para la prueba de Catalasa
Reactivos para la prueba de Oxidasa
Colorantes de Gram
Portaobjetos
Asa bacteriolgica
Mechero
Microscopios
Cepa: la proporcionada por el profesor
Desarrollo:
Pruebas metablicas

Al trmino de la incubacin pasar a la identificacin de bacterias de inters

mdico,
para lo cual se utilizarn las pruebas metablicas o bioqumicas, de la siguiente
manera:
Realizar tincin de Gram.
Con la ayuda de un aplicador estril tomar una colonia de inters y colocarla en
un
portaobjetos con una gota de perxido de hidrogeno al 10% (prueba de catalasa.
De igual forma hacer prueba de oxidasa
Con el asa bacteriolgica estril en punta tomar una colonia y depositarla en el
tubo
con agar TSI.
Con la misma asa sin esterilizar sembrar los tubos con el resto de las
bioqumicas.
Poner atencin a las indicaciones del maestro para la siembra de estos tubos.
Rotular e incubar a 37C por 18-24 hrs.
Leer e interpretar las pruebas bioqumicas para la lectura de produccin de indol
agregar una gota de reactivo de Kovacs, (apyese en la siguiente Tabla para la
identificacin de enterobacterias)