I

Anlisis de aguas d
consumo y de recreo

1. Aguas de consumo pblico yaguas de recreo.

Tcnicas de deteccin, recuento e Identificacin
d m'cro rganlsmos Indicadores e ndices
1. 1. Introduccin
Las aguas naturales pueden ser objeto de importantes modificaciones en
su calidad microbiolgica debido a descargas ocasionales de aguas residuales
como resultado de la acllvidad humana o de fenmenos naturales (lluvias to
rrenciales, tifones ... ). Los efluentes residuales contienen un amplio rango de
mIcroorganismos patgenos que pueden ser un riesgo para la salud humana
cuando son vertidosen aguas de consumo pblico o de uso recreativo. Entre los
posibles habitantes del agua, la fiora sanItariamente ms Importante es siempre
la proveniente del medio terrestre; en ella se incluyen muchos microorganismos
que pueden ser patgenos para el hombre, entre los que destacan aquellos que
fOnDan parte de la nora Inlestinal del ser humano y animales de sangre caliente,
la llamada flora fecal.
La fuente de contaminacin reall hacia las aguas marinas y continentales
suelen ser los vertidos
uas residuales sin tratar o Insuficientemente trata
das. El agua residual urbctna es, sin ningn lugar a dudas, la de ms elevado n
dice de contaminacin microbiana, pudiendo albergar cualquier tipo de micro
organismo patgeno para el hombre. Contiene necesariamente flora de aparato
digestivo de todos los Individuos de la comunidad e incluye numerosas especies
bacterianas, aJgunos hongos, viru , y protozoos. La ingesta y el contacto direclo
con estos microorganismos pueden producir patologa en el ser humano.
As pues, la contaminadn del agua de consumo o de recreo por parte de
aguas residuales, conlleva un Importante aumento del riesgo de adquirir en
fermedad, siendo ste mxlmo en el caso del agua de bebida, lo que obliga a
hacer un tratamiento adecuado de la misma para garantizarla como potable,
adems de controlarla peridicamente para detectar cualquier aumento en la
carga microbiolgica permitida. En el caso de las aguas de recreo, la trascen
dencia es menor debido al lipo de contacto. No obstante, la flora presente en
aguas residualM, si se encuentra en elevada concentracin . puede crear proble
mas de importancia en piel y mucosas de los baistas, e incluso, gastroenleritis
y enterocolitis por ingestin accidental de pequea cantidades de la misma.

Auxiliar de Laboratorio Qumico.

Oumico. Anlisis clnicos
clfnicos

84

1.2. Microorganismos indicadores

Son aquellos cuya presencia Indica una posible contaminacin o la exIstenexIsten
cia de patgenos poLenclales.
poLenciales. Muchos microorganismos
microorgani mos o grupos de microormicroor
propuestos como indicadores, y siguen buscndose indicaindica
ganismos han sido propueslos
distintas muestras de agua,
dores ideales para disUnlas
agua. En cualquier caso, un indicador
de contaminacin debe reunir los siguientes requisitos:

<p estar
r.star presentes en heces, aguas de desecho.
desecho, aguas residuales (cual
(cual<1?
quier medio en que los patgenos estn presentes), y ausentes en

aguas sin polucin fecal.

(j)

Los niveles de indicadores deben tener una relacin con la densidad

de patgenos en el medio acutico y ser proporcionales a la magnitud
de la contaminacin.

3 La su
s ervIvenc:1a
ervlvencla de los indIcadores en agua debe ser, al menos, simisimi
lar a la de los patgenos.
resIstencia de lo indicadores a
palgenos. Adems la resistencia
seT similar a la
ta de los
los factores de depuracin y desinfectantes debe ser
patgenos.

4. Los Indicadores deben ser detectables

T
r

mtodos simples,
simples. baratos,

eguros y rpidos.
seguros

5. Lo
Los indicadores pueden no ser patgenos y aplicables a todo tipo de
muestras de aguas que requieran un programa de monitorizacin.

Las
La" camctersUcas
caractersticas de los indicadores deben ser co~jj,\j",,_
coW~oWI_

Deben ser
seT capaces de CreceT
crecer

mnlUpUcarse
mulUplk:arse en el agua.
agua

La calidad microbiolgica y sanitaria de las aguas se ha medldo

medido durante casi
un siglo por anlisis de microorganismos indicadores. Los grupos de microormicroor
ganismos ms ampliamente utilizados son:
-

Colirormes
Coliformes totales.
Coliformes fecales y E.scherlchIa
E.scherichia coU.
eolio

) -

Estreptococos fecales y Bnterococos.

Enterococos.

stos pueden considerarse los indic:a.dores

indicadores tradicionales, aunque existen
otros alternativos que cobran especial Inters para determinadas muestras
de agua:

-1-{ =

Oostridios
C1ostridios sulfito-reductores.

Staphylococcus aureus.
Pseudomonas aeruginosa.

Anlisis de aguas de consumo y de recreo 85

as

1.2.1. Microorganismos indicadores tradicionales

1.2.1.1. Ba er
er

collformes
califa,",
es totales

Son bacterias de moologa bacilar,

bacilar. gramnegativas.
gramnegaUvas, aerobias o anaerobias
facultativas, no fonnadoras de endospoms,
endosporas, oxidasa negativas y que fennentan
cido y gas en 24-48 horas a .36 oc.
oc.
la lactosa con produccin de aado
La definicin de coliformes
colifonnes totales no est basada en criterios
crllerios taxonmicos
estrictos sino en reacciones bioqumicas especficas o en la apariencia de colocolo
nias caractersticas en medios selectivos o diferenciales.

La presencia de estas bacterias en Instalaciones de agua puede compacompa

acuticos, sin embargo son mucho menos
rarse con la de algunos patgenos acuticos.
en el caso de mernos
medios acuticos naturales,
persistentes que virus y protozoos. En
naturales.
especialmente aguas marinas, los colifonnes
colironnes totales presentan una tasa de susu
pervivencia inferior a la de los microorganismos patgenos.
1.2.1.2. Collfonnes
y Escherichla
E.scherichla coll
Colifonnes fecales I:J
Son los
[os coliformes
colifonnes totales ms prximamente relacionados con la contamicontami
nacin fecal. Estas bacterias cumplen todas las caractersticas definidas para los
coliformes totales pero, adems:
Crecen con lactosa y la rennentan
fermentan a 44,5
44,S OC 0,2 oC produciendo cido

y gas en las primeras 48 horas de incubacin.

Son collfonnes
termotolerantes. Incluyen cepas de los gneros Kleb-coIlfonnes terrnotolerantes..
KJeb

sel/a y Escherichia de los que se conoce que estn relacionados

reladonados con

contaminacin fecal procedente de animales de sangre caliente. La leTteT

motolerancia
mololerancia .se
se considera un mecanismo de adaptacin a las elevadas

temperaturas que se encuentran en el tracto entrico

entrlco de los animales,

lo que se basa
basa en una superior estabilidad de las protenas al calor.

Escherlchia
Escherichia coll es el ms til indicador de calidad del agua siendo el ms
collespecfico de la presencia de contaminacin fecal de todo el grupo de los coll
formes fecaJes.
fonnes
fecales.
Problemas del uso de e.
E. coll como Indicador
indicador

Puede detectarse en medios sin contaminacin

contaminadn fecal.

Tiene b:ja
baja capacidad de supervivencia en medios acuticos.

1.2.1..3.
1.2.1.3. &lreptococos
l!slreptococos fe
fecales
ales y ertte:rococos
t:nterococos
Son
80n bacterias cocceas grampositivas, aerobias
aeToblas o anaerobias facullativas,
negativas. Que
que fermentan
fennentan la glucosa con produccin de cido en meme
catalasa negativas,
nos de 48 horas a .37
37 OC.
Son Indicadores muy tiles de polucin fecal en ecosistemas acuticos nana
turales por:
Elewda
Elevada y prxima relacin con riesgo sanitario asociado con bao en
medios marinos y de aguas dulces.
dulces, fundamentalmente por sntomas
snlomas
gastrointestinales.

No son tan ubicuos como los coUformes.

estn
Estn siempre presentes en heces de animales de sangre caliente.

ea

Auxiliar de Laboratorio Oumico. Anlisis e/rnicos

Son incapaces de multiplicarse en aguas residuales.

Su prdida de viabilidad es menos rpida que la de coliformes en aguas
marinas, y su persistencia es similar a aquella de las bacterias patge
nas de origen acutico.
Problemas
falta de una tcnica de deteccin estandarizada para su enumeracin
selectiva a partir de aguas de medlos naturales.
Heterogeneidad taxonmjca: -estreptococos fecales incluye especies
con diferente significado sanitario y caractersLicas de supervivencia.

1.2.2. Microorganismos indicadores alternativos

Ninguno de los tradicionales cumple con Lodos los requisitos del indicador
ideal, por tanto se evaJan otros posibles indJcadores:

1.2.2.1. Clo

dlossulflto-reductores

Pertenecen al gnero Clostrldlum, especialmente la especie C. perfringens.

Constantemente presente en heces de animales de sangre caliente y en aguas
residuales. es ms estable en medios acuticos naturales que la mayora de los
patgenos. Ha sido usado con xito para monitorizar aguas contaminadas con
residuos .
Problemas
Ubicuos en sedimentos acuticos.
Existen problemas de metodologa para la deteccin. lo que limita su
valor potencial como indicadores.
Debido a la gran resistencia y longevidad de las esporas, pueden ser Indica
dores muy tiles de polucin remota.
1.2.2.2. Staph,ylococcu.s aureus
Se relaciona con enrermedades no asociadas a diarrea, especialmente afec
ciones de mucosas muy relacionadas con el bao: conjuntivitis, otitis y proble
mas cutneos.

Es estable y tiene gran resistencia a condiciones medioambientales (espe

cialmente en aguas marinas). Su concentracin en agua ha mostrado ser repre
sentativa de la carga microbiana aportada al agua por los baistas. Los mtodos
para su aislamiento a partir de aguas marinas son asequibles,
1.2.2.:3. Pseudomonas aeruglnosas

Miembros del gnero Pseudomonas se aslan con frecuencia de medios acu

ticos, pero su presencia no implica necesariamente un posible riesgo de sani
dad pblica. Ha sido asociada a Infecclones relacionadas con el uso recreativo
de las aguas y, por lo tanto, se propone como Indicador de calidad en aguas
de uso recreativo. es ms resistente que otros indicadores y microorganismos
patgenos a los procesos de tratamiento del agua y a factores ambientales. es
idnea para control de calidad de aguas de piscina y Jacuzzi.

Anlisis de aguas de consumo y de recreo

reaeo 87

1.2.2.4. Baclerlfagos
Bacterlfagos
Los bacterlfagos son virus que parasltan
parasitan bacterias. Los propuestos como
Indicadores
indIcadores son colifagos
colfagos somticos y F-espedficos RNA bacteri6fagos.
bacterifagos.
Colifagos somUcos:
somtIcos: especficos
eoll. en correlacin directa
Colfagos
especificos de Escherichla eoli.
virus entricos en aguas marinas. ecosistemas de agua duldul
con la presencia de viTU5
ce y efluentes residuales.

f-RM bacterlfagos:
f-RJIIA
bac.teriragos: ms adecuados para estudiar el comportamIento de
virus entricos en agua que como indicadores.
los viras

1.3. TcnIcas de deteccin, recuento e identificacin

de microorganismos Indicadores
indicadores
1.3.1. Tcnicas de procesado de las muestras

JiJJ .3.
.3.1JilTCnlca
MAs Probable (lt1'fP)
Ll1TCnlca del O'Iwero Ms
(lfMP)
'Y!merg

Mtpdo estadstico basado en la dispersin aleatoria de los microorganismos

Mtodo
determinado, es decir. muestras repetidas del mismo
en un volumen
liolumen de agua determioado.
tamallo de un mismo producto.
tamao
producto, por lo que cabe esperar que contengan el mismo
~ cifia
cifra media estimada es el
nmero de microorganismos como promedio. tsta
As, si un lquido tiene 100 microorganismos en 100 mI.
mI,
Nmero Ms Probable. As.
coruener 10 microorganismos; la de 1 mi 1 micromicro
cada muestra de 10 mi debe contener
organismo y la d 0,1 mi slo 1 microorganismo cada 10 muestras; todo ello
organ1smo
eUo
obviamente como promedio.
Si se siembran varios
varlos tubos de medio con muestras de distinto volumen.
volumen, es
posible calcular el NMP de microorganismos en 100 mi
mI de medio con cualquier
combinacin
muestras. La siembra se realiza
c-omblnacin de resultados obtenidos de tales muestras.
por triplicado o quinLuplicado.
guintuplicado. Tras incubar se observa turbidez.
turbidez, cambio de co
color O
o prOduccin
produccin de gas.
gas, segn los casos.
casos, obteniendo un valor numrico Que
que
a lravs
travs de las tabJas.
tablas, Indica
indica la cifra ms probable de microorganismos en la
mueslra,
muestra, sobre la base del nmero de tubos que manifiestan resultado positivo.
mI. 1 mI.
rnJ, y
Y 0.1 mi.
mI.
Existen tablas para muestras de 10 mI,
.-.~En la determinacin existen ---~tres fases: presuntiva.
presuntiva, confirmativa y de anlisis

completo
comp1sLo
Pueden procesarse indistintamente
[ndi5tinlamente muestras claras o turbias.
Inconvenientes
lnc.onvenientes
preclso. sino una estimacin estadstica de
No proporciona Wl recuento preciso.
mIcroorganismo a valorar.
la presenda
presencia de un determinado microorganismo

Se precisan mltiples tubos de fermentacin.

1Qrda
d.as.
'Iflrda de 5 aa 7 das.

p
..3.1.2VUlTacin por Membrana
U.3.1.2Viltracin
Consiste en la concentracin de Jos microorganismos del
dellrquido
lquido hac1ndolo
hacindolo
pasar por un fillro
filtro de membrnna
membrana con poro de 0,2-0,45 I. quedando los micromicro
organismos retenidos en la superficie del mismo.
mJsmo. A continuacin el ftItro
filtro se
coloca sobre una placa dePetri
de Petrl con un medio de cultivo adecuado y se incuba a

ea

Auxiliar de Laboratorio Oulmco.

Oulmfco. Anlisis cJ{nlcos
clfnlcos

la temperatura y el tiempo convenientes. Las

Las sustancias nutritivas, indicadores,
indicadores.
etc.. difunden por capilaridad a travs del filtro.
etc..,
filtro, permitiendo que las bacterias
desarronen durante la incubacin y formen colocolo
presentes en la superficie se desarrollen
nias visibles, efectundose el res;uent0
directamepte sobre la membrana.
recuento directamente

'

p.resepda O a' ':eneja,

Si se busca p'rgepcia
'senda. se puede enrollar e incluir la membrana
liquido y observar la aparicin o no de turbidez.
en un medio de cultivo lquido

bc:!.ias
Permite el examen de grandes volmenes de lquido con poblaciones Ixtias
de microorganismos.
mIcroorganismos, la separacin de stos del medio de cultivo.
cultivo, e incluso el
cambio de los mismos de un medio de cultivo a otro sin interrumpir su ciclo de
crecimiento. Es ms precisa que el NMP.
Inconvenientes

No deben procesarse muestras de agua con turbidez o con partculas en

suspensIn.
suspensin.
Metales y renales
fenoles pueden ser absorbidos en el filtro y limitar
limHar el crecicre<:i
miento de los microorganismos.

1.3.2. Tcnicas
TcnIcas de anlisis de Indicadores
1.3.2.1.
L3.2.1. Determinacin de bacterias eOIl/ormes
collformes totales y fecales

Podemos estudIar
ludiar su presencia y cuantlficar
cuantlflsar su concentracin medlante
mediante las
tOlicas de procesado que hemos comentado (NMP y fM).
fM) , por otra parte.
parte,
dos t01icas
existen tcnicas ms simples que no miden concentracin.
concentracin, pero que permiten
evaluar
evaJuar de forma rpida la presencia/ausencia (P/A) de un determinado micromicro
organismo.

(3)
~

Determlnadn
DetermInacin mediante el mIr.
""-P. La tcnica se desarrolla en tres fdses:

presuntiva: en la que se manifiesta la fermentacin de la

Prueba presuntiva;
Qroducdn de r.s. COnsiste
Consiste en inocular con el agua tres
lactosa con l?roduccin
series (10,
0.1 mi),
[l). de 5 tubos cada una, que contengan un
( O, 1 Y 0.1
medio de cyltivo
cuUivo con lactosa,
lactosa. un inhibidor
lnhibidor del crecimiento de mimi
croorganismos
pN Y una tipana
~.
croorgarusmos Grampostivos,
Grampositivos, un Indicador
indicador de pH
Durham. 1\'as
Tras la Incubacn
incubacin a 36
~ OC 1 OC, los tubos posit:1VOS'(ferposi vos (fer
mentacin y producdn
produccin de gas) se cuentan y se calcula el NMP de
bacterias coUforrnes
coliformes totales por 100 mI.
mJ, utilizando las tablas estadsestads
ticas correspondienles
correspondientes (lIer
(ver esquema de pgina siguiente).

trueba
toaeba conflnnatlva:
confirmativa: consiste en sembrar de nuevo una muestra

,"S.

de lo
los tubos positivos
postUVOS en caldo lactosado e incubar para observaobserva
cin de acldiflCacin
acidifteac.in del medio y produccin de gas. Los tubos po
po.sitivos se cuentan para clculo del nmero ms probable acudiendo
a las tablas correspondientes.
_
-

se siembran muestras de los tubos positivos de la

anterioT en medio slido selectivo para coliformes (agar errno
fNDO
prueba anterior
o Levine EMB)
fMB).. Las colonias tpicas de.
de collformes aparecern redon
redondas,
verde-met:lico. Estas colonias se siembran
das. oscuras y con brillo verde-metlico.
de nuevo en caldo lactosado
tactosado y se observan a microscopa ptica con
tind n de Gram para comprobar que se trata de bacilos gramnegati
grarnnegativos,
fermentadores de lactosa con producdn
produccin de cido y gas.
\/Os. fermentadorec;

Anlisis de aguas de collSumo y de recreo 8e

1O""d&~.

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0,1 mi de muostrn

24

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EMBo 0i00

""""de""

tUb09

Siembra en plaCII con Ler1fne I!.MB o ENDO a!lM" ji patflr

de lo tubos po5ltIWM. Incubar 240 2h a M oC :t ~ oC

7'fncln de Oram: badlos gramnega.iuos

Para la determinacin de ooliformes fecales se sigue el mismo procedi

miento pero. los tubo positivos en la prueba presuntiva. se inoculan de
nuevo en caldo tactosado y se incuban a 44,5 OC 0,2 OC durante 48
horas. Asimismo, la prueba completa incluye la siembra en medio slldo
selectivo para cotiformes (agar eNDO o eMB) o en medio para coliformes
fecales (mfC) con Incubacin a 44,5 OC ~ 0,2 OC.

70

Auxiliar de Laboratorio Oulmlco.

Qu{mico. Anlisis clnicos

Determinacin
Detenn.lnac:.l mediante filtracin por Membrana. La tcnica concon
(normalmente 100
siste en la filtracin de un volumen conocido de agua (noTmalmente
mI) a travs de una membrana de OA5
0,45 OC ]1 m de poro y la posterior
posteor
mi)
siembra de dicho ftltro
filtro en medio slido selectivo para coliformes
coIifonnes (Levine
EMB o ENDO). nas
Tras la incubacin a 36 OC 1 OC, durante 24-48 horas
se realiza el recuento de las colonias caractersticas que aparecen soso
bre el Hltra.
nitro. stas corresponden a colifonnes
coliformes totales. ruede
PUede hacerse una
lactosado y Uncin
tincin de Gram. Para la
confirmacin por siembra en caldo Iactosado
conrormes fecales
fe<:ales se procede del mismo modo pero
determinacin de coliformes
cambiando la temperatura de incubacin, como en el caso del NMP. El
medio selectivo para siembra del rotro
ftltro puede ser mfC.
mFC.
1..3.2.2, Determinacin de 1!streptococos
1...3.2.2.
I!streptococos y Enterococos
Como se ha comentado anteriormente, uno de los problemas acl Jales para
heterogenicidad
la determinacin de este tipo de microorganismos es la gran heterogencidad
grupo, por lo que las tcnicas a emplear estn en revisin
del grupo.
revisin.. No obstante. inin
cluimos aqu dos mtodos estandarizados para su deteccin y recuento.

Detenninacln
Determlnadn mediante la tcnica del Nmero Ms Frobable.
Como en el caso de los coliformes,
COmo
colifonnes, se realiza UDa
una prueba presuntiva con
batera de tubos y tres volmenes de muestra diferentes. El medio
una balera
de cultivo empleado es el de Rothe o el KAA
KM (,Kanamicina
(Kanamicina Aesculina
A2lda),
Azlda), que se Incuba
incuba a 37 OC durante 24--48
24-48 horas. Los
Ws tubos positivos
se detectan por cambio de color (eunoorZiwiepto
(eijnesresiwiepto en el caso del KM).
La prueba confirmativa
con:flnnativa se realiza mediante siembra de una muestra de
slido (KM o Listky). Se
los tubos posltivos
positivos en la superficie del medio sUdo
incuba a 37 OC durante 24-48 horas y se considera positivo el desarrollo
en..fiAA). Una vez confirmaconfirma
de colonias caractersticas (con halo negro en.fiAA).
dos los Lubos
tubos positivos, se realiza la estimacin del NMP consultando las
tablas correspondientes.
Determinacin mediante
medJante Mltradn
fllbacln por Membrana. Se sigue el
mismo procedimiento
pTocedimiento de nitrado de la muestra de agua Que
que se ha c.oco
mentado en el caso de los coliformes.
conformes. La membrana se deposita sobre
la superficie de un medio de cultivo sUdo
slido selectivo (agar KP
KF u otros).
1hIs
ll"as una incubacin de 24-48
24--48 horas a 37 oC se cuentan las colonias de
aspecto caracterstico (rojo ladrllJo
ladrillo en agar KF).
Kf).

.1..3,2..3. DetermLtladn
DetermLnacin de esporas de clostrtdios
1.3.2.3.
cLosbidios sulfito-reductores
Para la determinacin de esporas en muestras de aguas; se proceder de
forma que se destruyan todas las
\as posibles rormas
rorroas vegetativas
vegetatlvas antes de la Incuincu
bacin de la mu
muestra
tra con el medio de culUvo
cultlvo. No podemos olvidar que las bacte
bacterias del gnero Clost.ridlum
Clostridlum son anaerobias estrictas y, por lo tanto, la incubacin
reaH2ar en una atmsfera
atmsrera carenle
carenLe de oxgeno.
oxgeno.
se debe realizar
Existen diversas tcnicas para determinar la presenCia
presencia y cuantificar las espo
esporas de esto microorganismos. La que se expone a continuacin es una tcnica
estandarizada para anlisis de aguas potables.
PUeden procesarse de 20 a 100 mi
mI de agua, dependiendo de los requisitos
Pueden
del anlisis. en
En caso de que se estudien 100 mi se realizar el procedimiento
procedImiento
por Quinluplicado.
quintuplicado.

Anlisis de aguas de consumo y de recreo 7 1

~n primer lugar se calienta el agua problema a 80 OC durante 5 minutos (eli

minacin de fonnas vegetativas) . POsteriormente se e
a
y se moculan
30 mi de medio de cultivo fundido (45 OC), con 20 mi del agua problema en un
tubo estril de 50 ml de capacidad). se homogeniza la mezcla evitando que se
incorporen burbujas de aire. El tubo debe
edar lleno hasta el borde ce do
hermticamente
.o. La incubadn se realiza a
31
urante 24-48 horas; transcurrido este tiempo se observa la presenda de
colonias redondas y negras (como bolas de pimienta) que corresponden al desa
rrollo de colonias por parte de las esporas de c\ostrldios presentes en la muestra
de agua, El nmero de colonias de cada tubo corresponde a la cifra de esporas
por cada 20 mi de agua. El medio de cultivo empleado (TSC u otros) contiene
sulfitos que al reducirse dan el color negro a las colonias.

1.3.2.4. Determinacin de Staphylococcus aUTeUS

Su presencia y recuento puede estudiarse por la tcnica del Nmero Ms

Probable y por filtracin. Los medios selectivos utilizados pueden ser varios,
como el caldo Gioliti Cantoni; el agar Chapman para estafilococos, o el MSA (Ma
nitol sal Agar). Es convenienleconfirmar la determinacin mediante siembra en
medio de Baird Parker con yema de huevo.
1.3.2.5. Determinacin de Pseudomonas aeroginosa

Su presencia uele analizarse por la tcnica de la filtracin por membrana

utilizando como medio selectivo de cultivo el agar Cetrimid44 Pede con Irmarse
la determinacin por demostracin de la formacin de pigmentos caractesti
cos de esta bacteria. Para eUo se siembran las colonias desarrolladas en agar
Cetrirnlde en los medios agar A y B de Klng. El agar A permite demostrar la
presencia de piocianina y el agar B la de pioverdina.

2. Microorganismos patgenos transmlt

CaractersUcas y patologa

por agu

2.1. Introduccin: el agua en la transmisIn de enfermedad

Infecciosa
De los diferentes factores que se han asociado con el riesgo de enfermar
en cualquier poca de la historia, el agua ha sido uno de los que ha despertado
mayor InLers. Algunas de las epidemias ms devastadoras de la hisloria han
sido transmitidas por el agua. y actualmente son muchas las enfermedades in
fecciosas transmisibles por este elemento. aunque \as de mayor trascendencia
son las denominadas gastrointestinales o de transmJsl6n feco-bidrlca. en las
que el agua es el prmdpal mecanismo responsable. Como eLagua no es un buen
medio de cultivo y adems operan mecanismos de autodepuracln, las posibi
lidades de supervivencia y multiplicacin de los microorganismos son escasas,
lo que explica que, por 10 general. las Infecciones de origen hdrico se producen
cuando la transmisin es rpida, es decir, cuando no media mucho tiempo entre
el momento de la contaminadn del agua y su consumo, lo que hace Que las
enfermedades transmitidas POT el agua adquieran una gran importancia cuando
se producen por contaminadn de una red de abastecimiento pblico.

72

Auxiliar de LabOratorio
Laboratorio Qufmico.
Qumico. Anlisis clfnicos
olfnicos

La mayora de las enfermedades humanas asociadas con aguas microbiomicrobio

lgicamente contaminadas estn producidas por microorganismos patgenos
que son aportados al agua mediante contaminacin fet:al
Le de persopersa
fecal proceden
procedente
nas y/o animales.
La Importancia del agua como elemento de transmisin de enfermedades
Infecciosas se basa fundamentalmente en dos factores:
1.. es
Es susceptrble
susceptible de ser contaminada por agentes patgenos.
2. El consumo del agua es universal.
El uso de mayor riesgo es el consumo de agua por ingesta pero tambin
hay que contemplar como posible mecanismo de adquisicin de enfermedades
infecciosas el uso con fines deportivos o recreativos y teraputicos. tanto de las
aguas marinas como
c.amo las continentales. Asimjsmo,
Asimjsmo. otros usos del agua como la
preparacin de compuestos farmacolgicos e induso
incluso como elemento
eJemento de refrirefri
geracin en instalaciones de aire acondicionado, tiene cierto Inters sanitario
como veremos ms adelante.
Epidemiolgicamente, el agua:
Epidernolglcamente.
PUede ser la fuente de infeccin, cuando se transmiten microorganismicroorganis

mos que tienen el agua como hbitat natural.

naturaJ.

Puede
PUede ser la va de dlsemlnacln,
diseminacin, desde la fuente pasa al agua y a

partir de ella se adquiere la lnfeccin,

infeccin.
Las vas de enbada para microorganismos Lransmft1dos
transmitidos por el agua
pueden ser varias, destacando como ms importante la va oraJ,
oral, segui
seguida de la cutneo-mucosa.
Hay que tener en cuenta que el agua participa tambin de forma importante
en la transmisin de enfermedad Infecciosa por vectores, ya que con frecuencia
stos se asocian a los medios acuticos, especialmente los mosquitos.

transmisin de enfermedades Infecciosas

2.2. Mecanismos de transmIsin
por el agua
En cuanto
cuanlo a los mecanismos de transmisin de enfermedad infecciosa por
el agua podemos distinguir dos grandes grupos:
Dm,ct:os:
Directos:
lngesta
Ingesta de agua contaminada.
Contacto directo con piel y mucosas.

indirectos:

Jndlrec.tos:

a)

Ingesta de productos acuticos (animales y vegetales).

ltansmisin por vectores.
1lansmisin
Mecanismos cUreclos:
directos: los mecanismos
mecarusmos de transmisin
tJansmisin directa suposupo
enfer
nen que el hombre contacta con el medio acutico y adquiere la enfermedad por colonizacin
colonlzadn de uno o ms de sus tejidos
t~ldos por parte de la
agua. Dependiendo de la va de entrada del micro
microflora presente en el agua
enferme
organismo en el cuerpo humano, se distinguen dos grupos de enfermeotros dos, segn el t~ido diana en
dades, que a su vez se subdividen en olros
el que se manifiesta la patologa. As, tenemos:
Adquisicin de microorganismos patgenos por ngesta
ingesta de agua.
Es el mecanismo ms frecuente e importante. Las enfermedades

ut+nMII

ut+Y'H1II

Anlisis de aguas de consumo y de recreo 83

intermediario/s. La enfennedad que producen se de

Ina fasclollasJs y se
caracteriza por la afectacin heptica y del sistema biliar.
Los trematodes del gnero Schlstosoma producen la enfermedad denomi
nada esquistosomasis, bilharzfasis o fiebre de los caracoles. estos organIsmos
tienen sexos diferenciados. Una de las fases de su ddo biolgico tiene lugar en
el caracol. del que se eliminan las cercarias infectantes para el hombre. La in
feccin se adquiere por penetracin de estas cercarlas a travs de la pIel intacta
cuando stas nadan en un medjo acuUco. Ona vez en ellnterlor del organismo
van a localizarse en el aparato circulatoria, desarrollndose en el sistema portaJ
Intraheptico. La hembra tiene un cuerpo largo y cilndrico y el macho es ms
corto y plano, con el cuerpo dividido longitudinalmente en dos partes que pue
den plegarse. constituyendo el canal ginecroro, en el que la hembra se acopla
para ser 'rtiLlzada. Unidos recorren el torrente c.irculatorio hasta los plexos me
donde la hembra se libera para pasar a vasos ms estrechos en los
sentr!
que deposita sus huevos, que van a atravesar la pared Intestinal o vesical (segn
la especie). eliminndose al intestino o v~iga de la orina (esquistosomiasis in
testinal o vesical). En esta situacin los gusanos ingieren eritrocItos (hemates) y
la hembra se acopla y desacopla constantemente en el canal ginecforo, siendo
fertilzada de
nera conHnua y liberando huevos en heces u orina sin cesar. La
infeccin puede cronificarse y durar 20 o 30 aos.

2.3.5.2. Nemalodes
Dentro de este grupo existen diversos gusanos redondos. con sexos diferencia
dos. que pueden reiadonarse con una enfermedad adquirida a travs del agua por
desarrollarse alguna de sus lBses de vida en medios hmedos. El contacto directo
de la piel con el agua contaminada puede permitir la penetracin de los gusanos
y su desarrollo. fundamentalmente en el sistema Ilnftico donde pueden producir
bloqueos importantes de cln:uladn de Ilnfa. con el consiguiente engrosamiento y
falla de fund!] de la zona afectada. Lo ms frecuente es que se Instauren en rnlem
bros inferiores y el cuadro clnico que generan se denomina elefantiasis.

3. Aguas de consumo polico yaguas de recreo.

Tcnicas de deteccin, recuento e identificacin de
mlcroorgani mos patgenos
3.1. Aguas de consumo pblico y de uso recreativo
Desde el punto de vista sanitario. se distinguen varios tipos de ag ua que
tienen diferentes requerimientos de caLidad, fundamentalmente definidos por el
uso a que van destinadas. En este sentido existen dos grandes grupos:
a) Aguas de CODSU
pblico. Incluyen las aguas de la red pblica de
abastecimiento. de pozos y depsitos, de manantiales, las utilizadas
como materia prima en la industria alimenticia, cosmtica, farmacutica.
Dentro de este grupo, el estudio microbiolgico del agua tiene el primor
dial inters de permitir declarar el agua como potable o no potable.
b) Aguas de liSO recreativo. Incluyen las de sistemas artificiales como
piscinas. yacuzzi o instalaciones de parques de agua, y las aguas mari
nas de las zonas costeras, fundamentalmente las de las playas.

114

Auxiliar de Laboratorio Ou(mico. Anlisis clfrricos

3.1.1. Calidad del agua para consumo pblico

El agua puede tener sustancias u organismos que hacen que se convierta en
causa de enfermedad cuando se utiliza para satisfacer necesidades biolgicas.
esta realidad. acompaada de la importancia del agua en la vida del hombre.
lleva a las distintas adminlstradones a plantear la necesidad de garantizar a la
pobl.acin un abastecimiento adecuado de agua. Para ello se establecen crite
rios de calidad del agua. Por Ejemplo, la Unin Europea plantea estos criterios
con un sentido orientativo. pennitiendo que cada pas establezca los propios
que vendrn recogidos en las correspondientes legislaciones. As el desarrollo
de una normativa sanitaria para control de calidad del agea se basa:
1. Conocimientos sobre riesgos toxicolgicos e infecciosos de las sustan
cias y microorganismos que se suelen encontrar en el agua.

2. C,alldad de los recursos hdricos disponjbles.

3. Grado de desarrolto econmico y social en el mbito de aplicacin de la
normativa.
La reglamentacin debe ser realista, que intente garantizar una calidad ade
cuada pero de posible cumplimiento teniendo en cuenta los recursos del pas.

Siguiendo con el ~empLo, la ComunIdad Econmica Europea manifiesta

los criterios de calidad a seguir para las aguas destinadas a consumo humano.
f.n esta reglamentacin se establecen las CMAs (Concentraciones Mximas Ad
misibles) para cada uno de los indicadores microbiolgicos y fsico-qumicos
a detectar y cuantificar. Las aguas que superan estos lmites se consideran No
Potables.
Exi ten tambin normativas para la cualificacin sanitaria de las aguas des
tinadas a uso recreativo. l:n este sentido. la CEE estableci unos limites micro
biolgicos para las aguas marinas de zonas de bao, que son los que deben
cumplir las playas para su calificacin como -Playas azules". En cuanto a las
piscinas, yacuzzis y parques de agua, la normaliva a seguir suele venir estable
cida en nuestro pas por cada una de las comunidades autnomas.

3.1.2. Calidad de aguas potables

La Comisin Econmica de las Naciones Unidas habla de la conlaminacin
de las aguas como cualquier a1terac.in en la composicin o estado del agua.
consecuencia directa o indirecta de las actividades humanas hacindola menos
conveniente para su uso.
Los criterios biolgicos para calificar un a
dependen de la
legislacin de cada pas. por ejemplo en Espana, son los siguientes:
NI~"CI gUia

cm

BacLerias aeroblas a S7 OC

10 UFCJml

Bacterias aeroblas a 22 OC

lOO Uf"CJtnl

Detcrmll\iKl6n

CoUformes totales
Collformes fecales
Estreptocoms fecales

<1 (NMP) O (fM)/lOO mI

< l(NMP) O (fMII/ IOO mi

<l(NMP) O (fM)/Il00 mi

.../ ...

Anlisis de aguas de consumo y de recreo 8a

.f...

Clostlidios sulf-reductores

<1(NMP10 (I"M)/n O mi

Parsitos

No

Microorganismos patgenos

No

Anlmculos

No

Algas

No

Dentro de las aguas consideradas potables. hay diferentes tipos y e'Aige un de

tennlnado nivel de calidad para cada una de ellas. Concretamente se dlstinguen:
Aguas de la red pblica de abasteclmiento.
Aguas de bebida envasadas:

MIneromedicinales: emergen espontneamente o se captan. De

ben ser tiles para terapia en el lugar donde emergen y conservar
los efectos despus de envasadas.
Minerales naturales: deben tener una accin favorable fisiolgica
mente sin llegar a ser teraputicas fuera del lugar donde emergen.
De manantial: aguas que emergen espontneamente o se captan
y que cumplen los requisitos de potabilidad.

Potables preparadas: aguas que. previa autorizacin. se tratan

para que cumplan las normas de potabilidad y se envasan.

Los criterios de calidad para las aguas de la red pblica son los expuestos

para aguas potables. En el caso de aguas de bebida envasadas. adems de .s

tos deben cumplir otros requisitos microbIolgicos en el punto donde emergen

y una vez envasadas.

hato ck emergencia

Ea el

Ausencia en 100 mI de:

eftl'lUC

Ausencia en 100 mi de:

Los anteriores y adems:
- Pseudomonas aeruginosa
- Staphylococcus aureus

- Parsitos
- Microorganismo patgenos:
tntuobacteJia.s: 1'::. coU; Salmonella
esporas de closlTldlos sulflto-reductores

3.1.3. Calidad de aguas de recreo

Se ha ido considerando la nec~dad de establecer criterios de calidad para
otras aguas utilizadas con fines recreativos, como son las Instalaciones artificIa
les (piscinas. etc) que dependen de la legislacin de cada pas. por ejemplo en
Espaa son los siguientes:
.3.1..3. Aguas marinas
DetCT1l1lr~~
01110

Collformes totales

100 mi

aceptable

alto

Peligroso

<500

500-10

>100000

Collformes fecales

100 mi

0-10

<100

>100

>2000

fnlerococos

100 mi

0.10

<100

>100

>2000

ea

Auxiliar de Laboratorio Qulmico. Anlisis clfnicos

3.1.3.2. Aguas de Instalaciones artificiales

Existen diversa normativas segn las comunidades autnomas, pero en el
aspecto microbiolgico, en general se exige:
DdeI'1llIaacJ6n

VoIumeo

IIIJleaba

Coliformes totales

loomJ

Coliformes recales

100 mi

CIllA

o
o

Bacl'ertaspatgenas:
- lterocOCOS

100 mJ

- FSeudamonas aertlginosa

PaTsitos

no se especifica

Ause:ncla

Algas

no se espedflc.a

Ausencia

3.2. Anlisis microbiolgico de las aguas de consumo

3.2.1 . Toma de muestras de agua
La toma de muestras debe siempre respetar la composicin microbiolgica
del agua captada. El mateTial utilizado debe ser estril y la muestra de un vo
lumen adecuado segn el mtodo de anlisis a empLear, pero nunca inferior a
250 mi . La tcnjca para tomar la muestra depender del sistema de extraccin
del agua.

Agua de grifo. Retirar filtros u otros aa:esorios, limpiar cuidadosamente

el grifo con agua o alcohol, flamear el extremo con un aJgc:xln empapado
en alcohol. Abrir el grifo d~ando que el agua Huya abundantemente. Des
Iapar eIlasco esterilizado sin tocar la boca ni el interior del tapn y llenar
lo con la muesLra de agua. Volver a cerrar inmediatamente el frasco.
Agua de pozos y depsltos. Si disponen de bomba de captacin se
procede igual que en el caso del grifo. Si no, pueden utilizarse apara
tos especiales lastrados que permiten introducir el rrasco esterilizado y
destaparlo a la profundIdad deseada para llenarlo con la muestra. Si no
se dispone de estos, no es posible obtener una buena muestra repre
sentativa pero se puede proceder de la siguiente forma: Introducir en la
masa de agua el frasco de muestreo lo ms Limpio posible sostenindo
lo con una cuerda; remover con el frasco la superficie del agua antes de
llenarlo con la muestra.

Agua de lagos y ros. Hay que considerar factores como la profundi

dad del caudal, dlstanda a la orilla, etc. La muestra debe tomarse lo
ms IE;ios posible de la orilla, procurando nO remover el fondo y evitan
do los remansos y zonas de estancamiento de agua. SqjetaT el frasco
por el fondo en posicin invertida. sumergirlo completamente y darle la
vuelta en sentido contrario a la corriente (ro) o desplazndolo horizon
talmente en la wreccin de la boca del frasco (lagos).
Agua de manantiales. En manantiales naturales o fuentes de caudal
continuo. sin dispositivos de Intermitencia, se tomar la muestra dlrec
tamente sin adoptar medidas especiales de drenaje.

Anlisis de aguas de consumo y de recreo 87

7

Agua de bocas de riego. Se utlllzarn

utlUzarn acoplamientos
acopiamientos especiales que
permitan tomar la muestra como en el caso de los grifos.
Agua de mar (playas). Preferiblemente tres zonas de toma de muestra
playa, y en tres momentos diferentes a lo largo del da.
en una misma playa.
Debe tomarse una muestra de la masa de agua Que
que entra en contacto
con la mayora de los baistas.
baJstas, introducindose en el mar hasta la cincin
0-15 cm de la supert1cle.
superHcIe.
tura e Introduciendo el frasco hasta unos 10-15

Agua
Isclnas
c.
es de a
La tcnica
tc.rtica. es similar
A ua de Isdnas
a a e los agos y a una profundidad de unos 1530
15-30 cm de la superficie.
l

Es
es necesario neutralizar el efecto de los desinfectantes (cloro) utilizados
utilizad05
aco~a introintro
en el mantenimiento de estas instalaciones. Para ello se aconSE1fa
ducir 0,75 mVI de solucin de Uosulfato
liosulfato sdico al 3% en el envase de
recogida de muestra.

rotuladn.- El tiempo transcurrido entre la toma

1hmsporte,
Transporte, conservacin y rolulacln.de muestras y el procesado de las mismas
mjsmas en el laboratorio debe ser mnimo.
oC) hasta la reaUzacin
realIzacin del
En cualquier caso, se mantendrn rehigeradas
refrigeradas (4 OC)
anlisis. es
es imprescindible Identificar adecuadamente cada una de las muestras
mediante rotulacin del envase.

3.2.2. Tcnicas de deteccin, recuento

microorganismos en agua

e identificacin de

Para detectar microorganismos en agua podemos valemos de sistemas de

medIda cuantitativos, cualitativos o combinaciones
medida
combinadones de ambos, dependiendo de
las necesidade que nos plantee el tipo de agua y el uso a que se va a destinar.
La
ec.dn
eccJn de microorganismos puede considerarse un procedimiento
proced.irnlento
implemente se pretende estimar la masa micromicro
altamente ines
tnes
biana que se encuentra en un volumen determinado de agua; o un procedimJen
procedimiento Il.l
lo
n
se desUna a conocer la presenda,
presencia, e incluso la concenconcen
ltimo caso.
caso,
tracin, de una determInada
determi.nada especie en el mismo medio. En este lUmo
las tcnicas empleadas se denominan tcnicas de Ideo
Identl
en
cln icrobiana,
estas detectan la presencia de una especie o gnero concreto. Cualquier proceproce
dimiento que permita hacer un contqje de microorganismos es una tcnica
tcruca de
recuento aunque se restringe el uso de este trmino a los
Jos sistemas que permiperm
ten contar clulas de un grupo microbiano, familia, gnero o especie concretos.

3
3.2.2.1.
.2.2.L Medidas
MedIdas cuantftatluas
cuantftatlvas
Van a informar.
inform.aT, con mayor o menor precisin, de la concentracin de microormicroor
ganismos que tenemos en una muestra determinada. Estas
estas pueden ser a su vez:

Medidas indirectas
Cuando na se basan en contar microorganismos propiamente dichos,
dichos. sino
en medir sustancias o parmetros que estn directamente relacionados con la
microHora de un ambiente. Algunas de estas tcnicas no diferencian la viabilimicroflora
viabili
dad de los componentes biolgicos y otras si.
s. Las ms Importantes
lmportantes son:
a) Medida de las proteinas
protenas totales. La estimacin del nmero de mimi
croorganismos presentes en un medjo
medio se realiza en base a la concenconcen
tracin global de protenas como componente orgnico principal.
tradn

ea

Auxiliar de Laboratorio Oufmleo. Anlisis el/meas

b)

Medida de la cantidad total de materia OTgnlca. Esta se puede

realizar en base a la medida de la concentracin global de carbono,
nitrgeno o fsforo; a partir de las cuales se extrapola el contenido total
de materia orgnica mediante una fnnula diferente segn el parme
tro elegido.

c'

Jtledlda de la Demanda BJolglca de Oxgeno (D80). Mide el con

sumo de 0 1 que se produce en un medio en un tiempo detenninado,
como consecuencia de la actividad biolgica de los seres vivos que se
encuentran en l. ~vldentemente esta medida ya discJerne entre los or
ganismos vivos y las posibLes clulas muertas que puedan encontrarse
en el medio.

d)

MedJda de la concentracin de nitritos. Los nitritos aparecen en un

medio, fundamentalmente como consecuencia directa del metabolismo
microbiano por reduccin de los nitratos presentes en el ambiente. Los
microorganismos mas directamente implicados en este proceso son las
bacterias.

e)

Medida del pH. La presenta de microorganismos vivos con una ele

vada actividad metablica puede manifestarse por modificaciones del
ptl del medio. Fundamentalmente hay que tener en cuenta, en este
sentido, los procesos de fennentacln de azcares, que suponen una
importante acidificacin del entorno.

lIIed1da de la masa celular por deJllllldad ptica. Este sistema se

basa en relacionar la turbidez de un medio con el nmero de micToor
ganismos en suspensin. Obviamente el sistema ser inefectivo cuando
en dicho medio se encuentren agentes floculantes o cualquier sustancia
que produzca claras alteraciones de la trnsparencia. Este sistema no
discierne entre clulas viables y no viables.

Medidas directas

Encaminadas a contar el nmero de clulas o propgulos de uno o varios

tipos de microorganiSmos presentes en un medio. Estas se denominan tambin
tcnicas de recuento de microorganismos.
a)

Tcnicas de recuento celular dlrecto.- Suponen el cont<\je del n

mero de clulas presentes en un volumen determinado de muestra,
por visualizacin microscpica dIrecta de las mismas (sistemas de re
cuento en cmara) o mediante sensores tipo coulter. No son muyem
pleadas en mlcrobiologfa dado el pequeo tamao de la mayoria de
los microorganismos, su diStribucin no siempre homognea en una
suspensin. la elevada concentradn en que se encuentran en mumos
casos y que no permiten diferencIar entre clulas viabLes y no viables;
adems de que no permiten discernir entre distintos tipos de microor
ganismos con claridad .

b)

Tcnicas de recuento de vlables.- Mediante estas tcnicas se cuentan

nicamente microorganismos vivos y capaces de reproducirse . La ma
yora de ellas se ulilizan en combinacin con los sistemas cuaUlativos
de deteccin de microorganismos en agua , para poder valorar al mismo
tiempo presencia/ausencia de un determinado individuo. as como la
concentracin del mismo. Un requisito impresclndJble para aplicar esta

Anlisis
Anlisis de aguas de consumo y de recreo

as

tcnica es que el mlcroor~anlsmo

microorganismo que vamos a detectar sea cultivable
condicioen medios artificiales. En este caso, se tendrn en cuenta las condicio
crecimiento (Upo de nutrientes que le son 1ndispen
indispennes idneas para su credmiento
sables, temperatura ptima de crecimiento.
crecimiento, pH ptimo y atmsfera que
requiere ... ). 1ambln
Thmbln hay que tener en cuenta quines pueden competir
con l en condiciones similares, para tratar de Inhibirlos o eliminarlos
sin afectar al que nos
DOS Interesa;
interesa: todo ello lo conseguimos con el uso de
medios selectivos y medios de enriquecimiento.
Disponernos
jeas fundamentales
fundamentaJes paTa recuento mediante cuftivo:
aJltivo:
de
Disponemos d
Banco de dUuclones y sle bra en placa. para muestras con alto
contenido en mJcroorganismos. Se
se realizan diluciones seriadas de la
selecdonando al menos tres de ellas, de las que se siembra un
misma. seleccionando
(0.1L
1 mI) en medio slido en
en placa. Basndonos
volumen conocido (0,
en la inmovilidad de las cluJas
clulas sobre el agar, tras la incubacin obserobser
varemos el desarrollo de colonias.
colonias, cada una de las cuales corresponde
corresponder a un solo elemento reproductor
reproduc.tor inlelal
inicial (Unidad rormadora
t'orrnadora de Colo
Colonia-UfC-),
nia-UrC-), por lo que con su recuento podremos extrapolar el nmero
de clulas que Lemamos
temamOS por mililitro de muestra.

filtracin.
fi ltracin. Basada en retener microorganismos en la superficie de una
membrana cuyo tamao de poro es Inferior
tnreror en tamao a los de las cc
lulas que queremos cuantificar. Esta
E8ta tcnica es idnea para muestras
poco concentradas, pudiendo procesar grandes volmenes de agua en
que se encuentren en baja
b<!ja concentracin en
busca de microorganismos Que
ffitracin, las membranas se cultivan en medio slido
la misma. 1rns la rutracin.
o lquido,
liquido. desarrollndose en ella
ellas las clulas retenidas.
Tcnica del "lnero
J'IIDlero Ms Frobable.
P'robable. Tcnica estimativa del nmero
de microorganismos de una especie o grupo
wupo concreto, basada en extra
extrapolaciones estadsticas tras la siembra de volmenes conocidos de la
muestra en diferentes lubos en los que se aprecia
apTecia cambio de color, de
pH o produccin de gas segn los
Los casos.

3.2.2.2. Medidas cualitativas

32.2.2.
COn ellas slo pretendemos detectar la presencia/ausencia
pTesencia/ausencia de un determi
determiplanteanado microorganismo en la muestra correspondiente. Ello conlleva el plantea
miento de un tipo de agua concreto a analizar y un uso
u.so muy especfico al que se
destina Habitualmente, este es el enfoque para anlisis sanitario de aguas, con
microorganismos a detectar y distintos niveles de tolerancia segn el
distintos microo~nismos
uso a que va a destinarse el agua.

Para este tipo de anlisis, distinguimos:

Tipo de microorganismo a detectar.detec:tar.- Por supuesto hay que diferendireren
(Virus, Bacterias,
Hongos, Pro
claramenle entre los grandes grupos (Virus.
ciar claramente
Bacterias. Hongos.
Protozoos, Algas), pero tambin dentro de cada uno. suelen haber tcnicas
tozoos.
o medios muy especificos
especficos para los distintos gneros o especies.
MIcroorganismo cultivable/no cultivable
cultivable..- La balera
batera de tcnicas a
aspecto. siendo gege
emplear ser completamente distinta segn este aspecto,
neralmente ms sencillo cuando el microorganismo es cultivable. En
estos casos se disea
dJsea un sistema dependiente de los requerlmlentos
requerimientos

IK)
80

Auxiliar de Laboratorio Oulmlco.

Oufmlco. Anlisis cllnfcos
cllnicos

del microorganismo a detectar y de los competidores a inhIDir.

inhibir. Cuando
se trata de organismos no cultivables,
cultivables. las tcnicas de deteccin de los
mismos pueden ser fundamentalmenle
fundamentalmente tres:
]].. VisuaJizacin
Visualizacin directa por microscopia.

2. Deteccin de antgenos especficos (tcnicas Inmunolgicas).

3. Deteccin de fragmentos especficos de su genoma (tcnica de la
:5.
PoUmerasa~PCR- .
reaccin en cadena de la Polimerasa-PCR-).
en muchos casos se exige el anlisis cuantitativo de ulla
En
una especie, gnero o
grupo microbiano concreto.
concreto, con lo que debemos aplicar tcnicas cualitativas
cualltativas y
cuantitativas al
aJ mismo tiempo,
tiempo. obteniendo con
contajes
tajes ms o menos precisos de
un microorganismo concreto.

Deteccin
Detecdo de mk.roorganIsmos
mk:roorganIsmos patgenos
patgmos en aguas
agDS de consumo y recreo
En las distintas normativas comentadas para control de calidad de aguas.
~ microorganismos patgenos. no precisando,
precisando.
se contempla la determinacin de
en la mayora de los casos. a qu gneros ni grupos microbianos se refieren.
en principio se consideran como ms importantes a todos los incluidos entre
En
los Indicadores de contaminacin fecal. pero tambin a aJgunos otros.
otros, cuya
presencia en aguas puede suponer un riesgo para la salud de la poblacin.
poblacin. En
concreto,
concreto. para la deteccin. recuento
recuenlo e identificacin de los estos microorganismicroorganis
mos se utilizan los siguientes mtodos:
en el capitulo
caplulo correspondiente a microorganismos indicadores se
col'
feexponen las tcnicas para determinacin de: cgJ.ifOWlWw.a'at.Y
fe
cales' estre
toc9Cos fecales; esporas de clostridios sulfito-reductores.
calif
estreptococos
StaphyJ.o~oc{;US
sy
o onas aeru
Stap
ryJOr:;RCCUS au
BU
S
Y
do

Determinacin de bacterias aeroblas me5fIlas.

me5nJas. Se denominan as
hetertrofas, aeroblas y anaerobias facultativas.
facultativas, mesfilas
mes6fflas
las bacterias hetertroras,
y psicotrficas. capaces de crecer en un medio de agar nutritivo. La
la muestras de agua;
determinacin se realiza por siembra directa de las
para eJlo
ello se procesan dos volmenes distintos de muestra (1 mi y 0,1
0.1
placa. Para
El medio de cultivo empleado es el agar nutritivo en placa,
mi). el
procesar 1 mi se inocula la placa de I"etri
~tri vada y se aade posteriormen
posteriormente el medio licuado y enrriado
enfriado a 45 OC,
OC. Se agita suavemente para homohomo
geneizar la muestra con el medio y se deja solidificar en reposo. Para las
\as
0.1 mI, la siembra se realiza extendiendo este volumen de
muestras de 0,1
agua por la superficie del agar mediante un asa de vidrio estril.
La determinacin de bacterias
bact.erias aeroblas
aerobias mes6fl1as
mesftlas incluye dos grupos
dependiendo de la temperatura de desarroLlo.
desarrollo. As pues,
pues. se sembrarn
siempre dos muestras de 1 mi y dos de 0.1
O.J mi y se incubar una de
cada. a 22 OC Y las otras a 37 OC. La Incubacin a :57
37 OC se mantiene
durante 48 horas y la de 22 OC durante 72 horas.
horas. Se determina la con
contemperatura, por recuento de las caca
centracin de bacterias para cada temperatura.
resul
lonias que se desarrollan en la superficie del agar. expresando el resulagua,
tado en Unidades formadoras de Colonias (Ufq
(Uf'C) por mililitro de agua.

Salmooella. Su deteccin precisa varias fases,

fases. que
Determinacin de Salmonella.
incluyen la preconcenlracin
preconcentracin en caldo.
caJdo. concentracin y deteccin en
medios de cultivo selectivos. y posterior identificacIn
identificacin de las colonias.
colonias.

Anlisis de aguas de consumo y de recreo 91

AnlIsis

La preconcentracin
preconcentradn se realiza por incubacin
Incubacin de la muestra (membra
(membradurante
urante 18-24
na de filtracin) en caldo selenito o caldo de Rappaport d
horas a :57
37 oc.
oC. Posteriormente se realiza siembra en placa a partir del
caldo de enriquecimiento. Los medios utilizados para siembra en plapla
ca 50n
son selectivos y existen
eJdsten varios (Agar verde brillante.
brillante, a9ar
agar sulfito de
bismuto, agar XLD, agar de Hektoen). Las colonias desarrolladas en el
medio slido, que presenten caractersticas
caractersUcas sugestivas de ser SalmoneSalmone
lIa, se procesan mediante pruebas bioqumicas para la identificacin,
l/a.
as como puede realizarse el serotlpado por anlisis inmunolgico.
inmunolgico,

Determinacin de \'lbJ'lo
Vlbrlo cholerae. Se utltiza
utiliza la filtracin por membramembra
enriquecimiento. PosteriormenPosteriormen
na y se siembran los filtros en medio de enriquedmiento.
te se transfiere una muestra de stas
stos a medio slido selectivo en placa
(a~rTCBS)
(aWJr
TCBS)..
Determinacin de Campylobacter. Se utilizan medios selectivos (Cary
Blair) y se incuban
atmsrera mjcroaerfTIa
Blalr)
ncuban en almsfera
microaerfila (con baja tensin de OJ
oxgeno).
Determinacin de Parsitos. Para la determinacin de parsitos no
existe una tcnica estandarizada. No obstante,
obstante. se propone como vlida
la observacin microscpica del cenbifugado de 50 mi de agua. Para
su realizacin se introducen 50 mI de muestra en un tubo estril. Se
centriruga
durante 5 minutos. Se desecha el 5Obresobre
ce.ntriruga a :5.000-5.000
3.000-5.000 rpm dumnte
nadante y se estudia una muestra del precipitado a microscopia ptica.
en
~n I.
la
a observacin se buscan quistes,
quistes. huevos o larvas correspondientes
a parsitos.

Anlisis

de alimento

1. Alimentos. Tcnicas de deteccin, recuento e

identificacin de microorganismos Indicadores e ndice
1.1. Indicadores entricos en alimentos
Para el control microbiolgico de alimentos, el microbilogo neces.ita de
tectar, por una parte. aquellos que han sido mal manipuladgs. y por otra. los
contaminados con bacterias patgenas, generalmente de origen entrico, tales
como: Sionella , Shigella, espedes patgenas del gnero Vlbno y otiBs.

!.as Industrias elaboradoras de alimentos necesitan controlar la calidad mi

crobiolgica de las materias primas destinadas a la preparacin de determi
nados productos y comprobar la eIicaci.a de los sistemas de fabricadn de los
mismos para conseguir un alimento de buena calidad microbiolgica.
Estas son las causas por las cuales se hace necesario recurrir a tcnicas que
descubran fdlmente determinados grupos o especies bacterianas que, ~o
concurren en cifras excesivas, indican defidenclas en el producto como materia
pnma y en Ja:S f'SeS de su ~rocesado, manipulacin o almacenamiento. Estos
grupos o especi.es bacterianas indican, bien una contaminaCin deI alimento
con grmenes patgenos, bien la presencia de otros indeseables que proba
blemente, terminen por alterar el producto. En su col1lunlo se conocen como
microorganismos Indicadores entricos, y se utilizan para regular y controlar la
calidad microbiolgica de los alimentos.

1. 1. 1. Indices O Indicadores de contaminacin fecal

La utilizacin de microorganismos indIcadores tiene su fundamento en que
cada medio (ambiental, orgnico. allmentarjo) se caracteriza por albergar de
termmadas asoci""adOes microbianas. Estas asociaciones pueden contener es
pecles patgenas que se podrn detectar directamente. o bien buscando otras
especies o grupos pertenecientes a la misma asociacin: estos son los ndiCes
o IndJcadores.

Se denominan IadJces de contaminacin fecal aquellos microorganismos

que viven normalmente en el intestino del hombre y de los animales. Su pre~
sencia en un alimento Indica contaminacin fecal del mismo y. por tanto, riesgo

93

94 Auxiliar de Laboratorio Qulmico. Anlisis clfnicos

clnioos

de presencia de grmenes patgenos cuyo hbUat

hbitat es tambin el Intestino. En
microbiologa alimentaria se consideran indicadores de contaminacin fecaJ:
fecal:

...
_

Familia Enterobacteriaceae.
Grupo coliforme.

Grupo coliformes fecales,

recales.

Escherichla eoll.

..
_

Estreptococos
~streptococos fecales
fecaJes y Enterococos.
Clostridios sulfitD-reductores.
sulfito-reductores.

..

Existen
Existen otros microorganismos indicadores de origen no fecal.
fecaJ. cuya presenpresen
cia tiene diferente significado para cada uno:
mes6ma.
Flora aerobia mes6fiJa.
flora anaerobia.
Flora
Plora psicotrfica.
-

Estafilococos.
Los indlcadores
indicadores de contaminacin fec3l
fecal se usaron primeramente para el
conanlisis
ndices se siguen aplicando para el con
anlisIs bacteriolgico del agua. Estos fndices
trol del agua y,
y. actualmente.
actualmente, tambin para el control de alimentos como posi
posibles vehculos
vehk.ulos de transmisin
transmjsin de infecciones
infecdones o intoxicaciones.
En el intestino,
dego, predominan
predomjnan grmenes anaerobios
intestino. sobre todo en el dego.
y microaerfilos que no se usan como indicadores de contaminacin fecal por
la compltfiidad
compltjidad tcnica
tcnjca de su deteccin. Adems es flora propia del intestino,
intestino. la
integrante de la familia
famllia ~terobacteriaceae.
Enterobacteriaceae. los estreptococos fecales y e~o
dostridios yy ~. entre otros.
c~ los clostridlos

1.1.2. Caractersticas que deben reunir los microorganismos

indicadores de contaminacin fecal
-_

Especlftcldad
origen, es decir, que el microorganismo
~speclftcldad en cuanto a su origen.
o grupo de microorganismos
rnlcroorganismos procedern.
procedern , exclusivamente.
exclusivamente, del Intestino
intestino
humano o animal.

Sensfbilldad de deteccin para lo cual el microorganismo o microorSenstbllldad

microor
ganismos elegidos representaran una parte importante dentro de la popo
bladn
blacin de la flora intestinal.
intestinaL La sensibilidad del indicador
indlcador fecal depende
de la abundancia del germen en el intestino, es decir,
decir. est en funcin de
su nmero en la materia Cecal.
rceal.
, ero suficiente para que el germen o grupo indicador
indlcador se pueda de
detectar, incluso,
Incluso. en diluciones muy elevadas.
Resistencia en cuanto a supervivencia en el ambiente externo y per
persumanencia duradera en el
eJ alimento. La resistencia del indicador ser su
perior a la de los grmenes patgenos correspondientes a la asociacin
microbiana comn.
f'.adlldad,
rapidez y fiibQldad de las tcnicas utilizadas en la investiinvesti
r.w~!!!:~.!!~~~JIi~~I;J:d
gacin de cada ndice
ldice o indlcador
indicador de contaminacin fecal para detectar.
incluso,
induso. un pequeo nmero de grmenes.

affmentos 815
8&
Anlisis de alimentos

1.2. Deteccin, recuento e identificacin en alimentos de

microorganismos indicadores de contaminacin fecal
1.2.1. Coliformes.
eoll
Coliformes, coJiformes
coliformes fecales y Escheriehia
Escherichia coll
La investigacin y recuento de estos microorganismos son operaciones
bsicas en microbiologa alimentaria. Como ya se ha expuesto, los collformes
collCormes
constituyen un grupo de bacterias que se definen ms por las pruebas usadas
para su aislamiento que por criterios taxonmicos. ~rtenecen a la familia
familla ~
terobacterlaceae y se caracterizan por su capacidad para feqngntaf
lactosa
lerobacterlaceae
fennentaf la Jctosa
(ver tema 45).
(Nmer M
M
43). el mtodo de deteccin es el mismo que en aguas (N.mef
Probable). Para los alimentos
aUmentos slidos,
slidos. se prepara un triturado de una cantidad
gramo. en solucin
soludn salina fisiolgica ,Nacbo,9%)o
aUmen o
gramo).
'Na}' 0,9%)0
conocida del alimento
agua estril.
diluclones (1:1
([: O;; 1:100;
] :100;
estrU. A partir de esLe
este Lriturado
lriturado se Lrabaja
trabaja con diluciones
1:1(00) procesndose del mismo modo que las muestras de agua. El resultado
1:1000)
se expresa en nmero de microorganismos por mililitro o gramo de alimento.
(La
con(la t<:nica
tcnica detallada viene en el capitulo correspondiente a aguas de con
sumo: tema 4.3).

tl

Los coliCormes
anicoliforrnes se pueden encontrar en el intestino del hombre y de los anI
males. pero tambin en otros ambientes como suelo. plantas. cscara de huehue
va
.. . por lo que, como microorganismos
espeva..
mIcroorganismos indicadores no presentan buena espe
clficidad.
cificidad. A pesar de ella,
ello, se utilizan como ndices
fndices de contaminacin fecal por:
-

Su frecuencia en heces.
Porque se detectan fcilmente.
fdJmente.

Porque poseen unas caractersticas muy semejantes a las de los miem

miembros patgenos de las ilerobacterlaceae
EnterobacterIaceae en ciertos aspectos.

AJ ser necesarjo
necesario hacer una distincin
dislincin entre collformes
Al
collfonpes y t:.
E. coU en cuanto a
sanitario. se ponen en marcha tcnicas de Identlficacfn
su significado sanitario,
Identficacfn para esta
especie. basadas en caractersticas propias de la misma,
misma. como el desarrollo yy
fermentacin de la lactosa a 44.5 OC; la capacidad para crecer en presenda
presencia de
61ltares yy ta proouccJn
prOducan de indol en agua de peptona
sales biliares
pepLgna o caldo Lriplfano.
triplrano.
Estas pruebas se realizan a partir de tubos positivos del ensayo del NMr
NMP
esLos se siembra una muestra sobre medio slido (1S!Y
para coliformes. De estos
(~
L$Yine -eoslna
~osjna azul de metileno-), de forma que se obtengan colonias aisladas.
L$Xine
Dlchas colonias,
colonias. cuando corresponden a E,
fi, coY
Dichas
cpU presentan un centro azul-negro
con brillo metlico verdoso. Las colonias que muestran estas caractersticas se
subcuJUvan
lquido con lriptfano y se incuban durante 24 horas. Pa
subculUvan en medio liquido
Pasado este tiempo se aade al tubo unas gotas de reactivo de KovaSS para lndol.
Indol.
La presencia de esle
este compuesto. metabol lo de la hidrlisis del trlptfano.
trlptfano, se
anjll2 de S;glg;
cglg: mjo
manifiesta por la formacin de un aujllo
mio bermelln en la superficie
del caldo. Otras pruebas que ayudan a la Identificacin
de]
identificacin de Escherlchia coll
eoll son
meUlo; el Voges-PToskauer
Yoges-Proskauer y el citrato.
c.itrato. Las dos ltimas caracLeTfstica
el Rojo metilo;
caracLerfsLicanegativas para esta bacteria.
bacteria, mientras que el Rojo Metilo es positivo.
mente negativa

1.2,2. Estreptococos fecales y Enterococos

1,2.2.
IntesUno humano y el de animales de sangre
Son bacterias que habitan el intestino
contamlnadn fecal ha sido comenta
caliente. Su utilidad como indicadores de contaminacin
comenta-

S8
se AUXiliar
Auxiliar de Laboratorio Qu{mico. Anlisis clinicos
olincos
da en el tema 43. Hay Que aadir aqu que, al ser mucho ms resistentes a las
condicJones
condlcJones ambientales
ambientaJes y tratamientos industrlaJes
industriales que E. coU,
eoil, su uso estara
especialmente indicado en aHmentos
congelados, deshidratados o desecados.
altmentos congelados.
Por otra parte, no es un buen Indicador de riesgo sanitario
sanItario POT
por poseer una resisresis
tencia muy superior a la de microorganismos patgenos como SalmoneUa.
Su presencia en nmero
nUmero elevado significa
ignfica falta de higiene en la elaboradn
elaboracin de
ciertos alimentos o condiciones de conservacin defectuosas.
defectuosas, eJtcepto
excepto en aqueaque.
Uos en los que Intervienen en los procesos de fermentadn
fermenlacin de forma habituaJ.
habitual.
llos
Para su deteccin y recuento se procede de forma similar al anlisis de
aguas. Se puede realizar un estudio de Pr
n ia-A
ncia
cia (P-A) o una cuantifi
cuantifideJ NM
NMP.
P.
cacin por la tcnica del
5n
Ein cualquier caso se realiza en varias etapas:

Prueba presuntiwa: en medio Kanamiclna

Kanamleina Ae.scu1Jna
Ae..scu1ina Azida (MA),
(KAA), incuincu
bando a 37 OC durante 24 horas. ti
~J ennegrecimiento del tubo se consiconsi
dera positivo.

_ Fmeba
el mjsmo
Frueba 'guQngatbl:
'9pftgpatly,: se utilIza
uULlza eJ
mismo medio pero slido (con

agar). Se consjdera positiva la aparicin de colonias rodeadas de halos

negros.
Pruebas OOIIflrmatl\las
confinnaU\IaS acUdonales:
adicionales: Se Investigan
investigan diversos aspectos ca
cacolonias desarrolladas en el medio de <:onfirmacin:
confirmacin:
ractersticos en las <:olonias

Morfologa:
agrupados en cadenas cortas.
Morfologia: cocos gram positivos agnlpados
CataJasa:
Catalasa: es negativa para estos microorganismos.
Crecimiento en medios con bilis (Agar esculina
e.sculina bilis):
bUis): toleran la bilis
e hidrolizan
hlarohzan la
la esculina.

.. Crecimiento
crecimiento en presencia de NaCl
NaO al 6,5%: son tolerantes a la sal y
Y caca
paces de desarrouarse
desarronarse en
con COiit:entraciones
C&l1:entraciones moderadas de la

mecuos con
mechas

misma.
Crectmiepto a 45 OC:
oe,: son capaces de desarrollarse a esta temperatempera
Crecimientg
tura en caldo BHI.

1.2.3. Clostridios
C/ostridios sulfito-reductores
La deteccin
detec.c.in y recuento de Qostriclios
Qoslricllos suLlito-reductores
suLfito-reductores se realiza mediante la
espo
numeracin de formas vegetativas y esporuladas coqIuntamente
corjuntamente o slo de esporuladas.

Como en las muestras de agua, la deteccin se basa en su crecimiento

en medios que contienen suLfito de sodio y en su capacidad para reducir este
sulfito dando lugar, en presencia de hierro, a sulfuro de hierro que presenta
coloradn negra.
que se trata de bacterias anerobias estrlrlas
estrictas y, por tanto,
Hay que recordar Que
oxgeno. Bsto
I'.5to se logra mediante:
exigen una atmsfera carente de oxigeno.
Siembra de las muestras en el"wesilg
elJlledlo S'ido
SHdo 'cuado
'icuado y mantenido a 4545
50 oC (ver tema 43).
4:5).
-

jarra de anaerObios;
anaerobiOS; vertido de una
Cultivo en anaerobiosis: mediante Jarra
capa de parafina en lB:
la superflcie
superficie del medio o siembra en profundidad
en agar contenido en tubos.

Anlisis de alimentos 97

Cuando la deteccin y recuento es slo de formas espoTuladas,

esporuladas. es necesario
tratar previamente la muestra calentando la suspensin del alimento hasta 80 OC;
lo que permite destruir las formas vegetativas.
vegeta Uvas.
utilizados son similares o iguales
jguales a los empleados para la detecLos medios utllizados
detec
pblico.
cin de estas bacterias en aguas de consumo pblico.

1.3.
f .3. Deteccin, recuento e identificacin en alimentos de
microorganismos Indicadores de origen no fecal

1.3.1.
1.3. 1. Flora aerobia mesfila
Son
SOn un co'liunto
co:runlo de microorganismos capacitados para multiplicarse en aeae
robiosis
robios.!!,a temperaturas medias. comprendidas entre 25 OC Y40 oc.
oc . ~
Es un mtomtQ..
do que permite conocer.
conocer, en corijuoto.
col'\iunlo, la calidad microbiolgica
microbIolgica de los alimentos
sin relacionarla con la posible presencia de grmenes patgenos.
patgenos, ya que estos
que permitan
se deben buscar de forma directa por procedimientos especiales Que
conocer la peligrosidad o inocuidad de dichos alimentos.

Se puede concluir que un allmento

alimento cuya nora total es elevada debe ser concon
siderado Impropio para el consumo humano.
El estudio de nora
flora mcsfila
mesfila es Improcedente
lmprocedent.e en determinados casos:
contienen, nornor
_ Cuando se trata de productos fermentados
ermentados ya que estos contienen.
malmente,
malmente. cifras elevadas de grm
grmenes
nes imprescindibles en la fermenfermen
(quesos. vinos,
vinos. cervezas,
cervezas. yogures ... ).
tacin y que forman parte de ella (quesos,
_
En los productos esterilizados hay que tener en cuenta Que
que la ausencia
calidad bacteriolgica de la materia
de grmenes viables no avala la calIdad
prima con
con la Que
que se ha elaborado el producto.
Para la determinacin de flora
nora aerobla mes6fl1a
me8fila se homogeneiza la muestra
muestro
de aUmento
alimento y se preparan diluciones decimales sucesivas de la misma. Para
obtener la dilucin 1:10 se pesa la porcin del producto
produc.to a procesar y su
Su peso se
muJUpUca por 9. El
BI resultado son los milllilros
mililitros de diluyente que hay Que
que aadir.
multiplica
Iiquidos no es
Esta ser la suspensin madre con la que trabajar. En productos lquidos
realizarla, la suspensin madre es el propio producto.
necesario realizarla.
TraosfLrlendo 1 mi
mi de dlluyente,
diluyente. se c.onslgue
consIgue
Transflriendo
mI de suspensin madre a 9 ml
la siguiente dilucin. Esto se repite sucesIvamente en 5-6 tubos para obtener la
diluc.iones decimales.
serie de diLuciones
El recuento propiamente dicho se realiza mediante siembra en superficie en
medIo
sHdo (agar putr!liyO
PlitCe roBgt
medio de culUvo slido
putri"yo O PIafe
muo' gJr).
~r). Se real1za
reaUza una siemsiem
dilucin. 'Tambin puede realizarse la tcnica del NMP mediante
bra para cada dilun.
siembra en caldo nutritivo.
StilphylDcoccus
Staphylococcus aureus
Existen numerosos medios propuestos para la deteccin
de leccin y recuento de eses
tas bacterias en alimentos. 1bdos ellos
eUos llevan incorporados agentes
anentes selecrtivos
selectivos yy
diferenciales para Inhibir la flora distinta a Staphulococcus aureus
aur@s Se emplean.
emplean,
como en otros casos, medios de enriquecimiento y medIos slidos selectivos.
Adems. se pueden aplicar pruebas de confirmacin cuando se djspone de co
coLonias
presencia de esta
esla bacteria.
lonias sospechosas de la presenda

ulwEqnMII
t-JlwE9"~

Auxiliar de Laboratorio Ou(mico.

QuFmico. Anlisis cllnicos

Puede plantearse el
f'resenda-Ausencia en una cantidad o dlludn
eL detectar Presencia-Ausencia
dIlucin
detenninada
determinada del alimento. Para ello se emplea un mtodo de enriquecimiento
en lubo
tubo en el
eJ que se inocula una muestra de la suspensin madre del alimento.
microGeneralmente se emplea cuando se sospecha una cifra pequea de este micro
organismo.
La tcnica del NMP.
Puede realizarse deteccin y recuento mediante la
NM.P. cuando
aUmento contiene una cifra de estafiJococos
se sospecha que el alimento
estafilococos inferior a 100
por gramo o mililitro de alimento.
paTa alsiaJnjento,
ajslamiento,
Se realiza
reaHza el mtodo de disemLnacin
diseminacin en medio slido para
identificacin y recuento, cuando se sospecha que la presencia de S. aureus es
superior a 100
] 00 por gramo o mililitro.
superioT

anmen o .
2. Microorganismos transmlti
transmitido por los anmentos.
Caractersticas
pato logia
Caracterfstlcas y patologfa
2.1. Introduccin
El
microorga~I consumo de alimentos o de aguas contamInadas
contaminadas por ciertos microorga
diferentes enfermedades en el hombre,
nismos puede dar lugar a dlferentes
hombre. por constituir
estos productos un medio nutritivo favorable para la vida yY reproduccin de los
microorganismos.
estas enfermedades pueden englobarse en dos grupos:
Intoxicaciones.
Inloxicaciones.
Infecciones alimentarias.

Se
se entiende por intoxicacin cuando el agente que produce la enfermedad
en
es una toxina elaborada por el microorganismo que ha invadido el alimento. En
las infecciones el agente causal es la Ingestin
ingestin de microorganismos que se han
multiplicado en el propio alimento.
maLas enfermedades transmitidas por las alimentos que se presentan con ma
bacteriano, causadas por
por el consumo de aliyor frecuencia son las de origen bacteriano.
ali
mentos
menlos o de agua contaminados por bacterias patgenas. es decir productoras
enfemledades. o de sus toxinas. I!mplearemos
de enfermedades,
Emplearemos el trmino .toxiinfecd6n
-toxilnfecdn-..
cOl'{unta. tanto las infecciones, como las Intoxicaciones
para designaT.
designar. de forma col'Iunta,
alimentarias.
La caracterstica comn de estas enfermedades es que se producen poco
tIempo
tiempo despus.
despus, desde una hora a pocos das, de haber ingerido un alimento
o una bebida en condiciones no adecuadas para su cOl'lSumo.
consumo, dando lugar a
trastorno , generalmente,
trastornos,
generalmente. de tipo gastrointestinal (vmitos,
(vmitos. diarreas, dolor abab
..),
), aunque no necesariamente,
necesariamen~ , pues en otros caso el cuadro clnico es
dominal. ..
extraintestlnal, por ejemplo: brucelosis, fiebre tlfoidea y botulismo.
extraintestInal,

Las bacterias patgenas que suelen provocar estas enfermedades pueden

las
(otor. sabor,
sabor. coco
no modificar el aspecto, ni otras caractersticas del alimento (olor,
lor...
lor
.. .) por lo que su presencia y multiplicacin no se observa a simple vIsta en
los alimentos crudos, ni en los ya elaborados.

Para que se produzca una toxiinfedn

toxijnfecln alimentaria es necesario que existan
bacteriano. aUmentos
tres elementos bsicos: agente causal. normalmente bacteriano,

t t 2 Auxiliar de Laboratorio Qumico. Anlisis clfnicos

3. AlImentos. Tcnicas de deblCCl6n, recuento e

ldenllflcacln de mlcroornar.....""" Dattlatlft(llS
3.1. Introduccin
El mayor problema de seguridad sanitaria en alimentos es la necesIdad de
detectar rpidamente los microorganismos para poder evitar la transmisin de
enfermedad en un nmero amplio de poblacin. Esto es especialmente impor
tante debido a la distribucin en gran escala de alimentos perecederos.
Las tcnicas estandarizadas de cultivo, de las que hablaremos abundante
mente a continuacin, necesjtan das e induso semanas para una identificacin
positiva de un patgeno. Adems, es frecuente que se compliquen por el bajo
nmero de patgenos en el alimento, en comparacin con una abundante mi
crobiota acompaante. Por otro lado, la composicin qu[mica y flSica de los ali
mentos puede hacer que el aislamiento de microorganismos sea dificultoso.
Para evitar estos problemas se han ido Incorpomndo nuevas tcnicas, basa
das en la inmunologa y biologfa molecular. que estn ofreciendo interesantes
expectativas para una deteccin rpida. incluso presencia de un bUo nmero de
microorganismos. No obstante. en el siguiente tema se exponen fundamental
mente las tcnicas de microbiologa tradicionales que siguen vigentes por estar
ms consolidadas y estandarizadas.

3.2. Salmonella
Gnero perteneciente a la familia de las enter0bacterjas. Son bacilos no
esporulados, mviles mediante flagelos (la mayoTfa). grnm nesati'l,os, aerobios
y anaerobios facultaU~os. Su reservorio primario es el tracto inlestinal de verte
brados e Insectos.
Su transmisIn es fundamentalmente por contaminacin fecal de alimen
~ . Las fuentes ms importantes de SaJmonelTa son los alimentos proteicos de
origen animal. aunque tambin es posible la contaminacin a partir de agua,
vegetales crudos, coco, aditivos y otros productos. Para que se desarroUe en
fermedad con sintomatoJoga dnica se requiere la insesta de UD pron inOClllo
(l()8- lOIO clulas) Cualquiera que sea la fuente, los alimentos causantes de bro
tes de salmonelosis han estado en contacto con heces. directa o lndjrectamen
te, conteniendo una cantidad suficiente de Salmonella para poder desencade
nar la enfermedad. Otras veces, aunque el nmero de bacterias sea escaso, si el
alimento rene las condiciones ptimas para su desarrollo, puede conseguirse
la dosis infectante adecuada.
Las enfermedades producidas por las distintas espedes 5almonella se co

mentan ampliamente en otros capLulos (Temas 44 y 47). Aquellas correspon

dientes a especies ..no tifoideas... se denominan salmonellosis y afectan tanto
al hombre como a los animales. La saJmonelosis humana crea un importante
problema de salud pblica en todo el mundo.

AIslamiento e ldenUficad6n de Salmonena en alimentos

Existen numerosas tcnicas propuestas a lo largo de varios aos para el
aislamiento e identificacin de este microorganismo. La mayora de ellas son

t-JlwfrY'U1fl

Anlisis de alimentos
a/mentos 1 1t 3

tcnicas complE;jas
compl~as y ninguna es ptima para toda clase de alimentos. El prinprin
cipal problema es el hecho de que las clulas de Salmonella se encuentran
mezcladas. en a1imentos
con numerosos microorganismos que,
aljmentos contaminados. COn
que.
en general. soportan mejor
m~or Que
que stas las condiciones ambientales, desarrodesarro
que ellas. Por ello. las tcnicas para
paTa la deteccin de la Salmonella
SalmoneUa
llndose ms Que
se diseian
Favorecer su crecimIento
crecimiento y retardar o suprimir el de la biota
disenan para favorecer
contamjnante que les puede acompaar. PaJa
contaminante
Para obtener buenos resultados es
detaJles de metodologa:
metodolosa:
necesario tener en cuenta ciertos detalles
_
utilizar altos IncuJos:
inculos: se procesan 25 gramos o ms de muestra de
ahmento.
_
Neutralizar Los productos cidos para que el pH se mantenga por endend
made6.
-

utilizar
utlllz.ar medios lquidos
lquldos de enriquecimiento,
enriquecimiento. selectivos.
se.lectivos, que inhiban el
desarrollo de biota competitiva.

Existe un acuerdo unnime en cuanto al establecimiento de unas etapas

dentro de la sistemtica
sislemUca de anlisis para el aislamiento e Identificacin de SalSal
monella:
moneUa:
-

PreepdguectmJento
PreeprlguedmJento en medios lquidos DO
no selectivos. Sirve para
revivificar las
ras mas
C1f]as de Salmonella
salmonella lesionadas y permitir
permil ir su
su recuperarecupera
preparac.in
cin. Especialmente importante en alimentos que en su preparacin
o conservacin han sufrido mitamienlos
tratamientos que comprometen la fisiolofisiolo
ga bacteriana normal (tratamiento trmico, desecacin,
desecacIn, conservantes.
conservantes,
etc.). el medio
medlo ms frecuente es caldo peptona 'aIDpgnado.
'amponado. En
en este
medio se resuspende o se tritura la muestra de alimento,
alimento. consiguiendo
una concentracin]
concentracin 1 :10. Se
5e Incuba a 37 oc.
OC durante 16-20 horas.

en medios lquidos selectivos. faciJltan

Facilitan la multimulti
saImonella e Lnhiben
biota compelidora.
competidora.
plicacin de SaJmonella
inhiben el crecimiento de biola
Estos medios deben ser lo suficientemente selectivos como para prevepreve
nir el credmiento
crecimiento excesivo
ex.cesivo de compeUdores;
competidores; mantener constante su sese
existen caldos
lectividad y ser capaces de recuperar todos los serotipos. Existen
con tetratioDato;
tetralioDato; caldo selenito
selenita y selenjt9=dstina
selenjto-dstjoa y caldo de Rappaport
RappaportVassUladls.
aconsE;ja ullUzar
uUUzar dos de ellos
ellas por cada muestra. Se transtrans
Vassilladls. Se aconseja
preenriquecimiento a cada 100 mi de estos,
fieren ID
10 mi del caldo de preenrfquecimiento
ex.cepto
excepto para el Rappaport-Vasslllsdls
Rappaport-Vassillsdls que se transfiere 0.1
0.1 mi a 10
ID de
medio. Se Incubi'n
Incu~n uno a 43 OC Y el otro a .37
37 OC,
OC. durante24-48
durante~ horas.

AIslamiento
tamlento diferencial sobre medio $Udo selectivo. Son medios
slidos con colorantes,
sajes biliares. antibiticos y/o ustanda
ustancia qurnjcolorantes. sales
qumi
cas que inhiben el crecimiento de llora
flora competitiva. Llevan un sistema
Indicador para diferenciar SalmonelLa,
Salmonella. basndose en la Rroduccin
produccin de
SM, sulfidrico
suLfidrioo Y/o la feqnWliIf;
fermeptad n de rarhpbidRtns
5th
rarhpbjdpk>S (I~,
(I~. sac,w;psa
sac,wpsa
O xIlosa).
xllosa). Los
Los hay desde poco selectivos (Asar Hae
Mac Conkey)
Conkey)., moderamodera
damente selectivos
sele.ctivos (Agar
~9ar salmonela-shisela agar Hektoen) hasta al
altamente selectivos (Agar
(Aqar verde brillante mio
rolo rrgO!
RGA). Se siembran
fimo' -- BOA).
por duplicado a partir del medio de enriquecimiento. La temperatura de
Incubacin
:SOC y el tiempo 24-48 horas.
incubacin son 3JOC

--

Las colonias caractersticas

ca~cterstlcas de Salmonella son de color roJo-rosado.
rojo-rosado.
transparentes con un halo rojo brillante en BOA y verde azuladas con o
sin centro negro en Hektoen.

, 1 4 Auxiliar de Laboratorio Qufmico. Anlisis cl(nicos

Conftnnacln bloquimica de las colonJas sospechosas.- esta con

firmacin se realiza con las colonias sospechosas de los medios selec
tivos. f\.mdamentalmente se estudian dos aspectos:

Producci6n de lisina-de.scarboxtlasa: en caldo lisina descarboxlla

saof'S.tivo para salmonella.
Degradacin de la lactosa: En ONPG investigacin de la presencia
de (--galactosidasa. Negativo para Salmonella.
SionnrmaclOn serol6s&sa de I colonias sospecbosas.- Los sub
cultivos que han dado reacciones bioqumicas tpicas de Salmonella
se someten a pruebas serolgicas confirmalivas. Se utilizan antisueros
comerciales y se enfrentan a las clulas aisladas de la posible Salmone
lIa La aparicin de aglutinacin con un antisuero determinado muestra
una prueba positiva. Se detectan antgenos somticos (O), el antgeno
Vi y antgenos flagelares (TI).
en ocasiones es necesario conocer el nmero de clulas de Salmonella que
contiene el alimento sospechoso; en estos casos hay que adaptar la tcnica para
hacer un recuento.

3.3. Shigella
Tambin pertenece a la familia de las enterobacterlas. Son ~, no
esporulados, inmviles, 9raIn negativos, aerobios y anaerobios rnC!!UaUyps. El
reservorio primario es el Intestino del hombre enfenno o portador y de primates
no humanos. Su difusjn se realiza: directamente a partir de las heces de perso
nas enfermas o portadoras e, indirectamente, veruculadas por aiiietos, agua
y moscas. Los alimentos slo son vectores no especficos Que se contaminan a
partir del hombre. Cualquier alimento, no ~esivamente ddo ni deshidratado,
puede transportar Shige.lla.
Las shigelosis suelen ser sndromes gastroentricos de mayor o menor gra
vedad (disentera bac.ilar) y se comentan en captuJos anleriores.
Aislamiento

e Idenliflcaci6n de Shigella

Como en el caso de Salmonella, para la deteccin de ShigeUa es necesario

hacer enriqueclmiento en medio Ifquido y posterior siembra en medios slidos
selectivos. El procedimiento es similar, por lo que comentaremos nicamente
aquellos aspectos que sean especiales para esta bacteria.
Se procesan 25 g de muestra de alimento que se homogeneizan-trituran
con caldo de enriquecimiento (caldo QN o caldo MosseJ). Se lncu.ba a 37 OC
durante 16-18 horas.

- Aislamiento sobre medios seJecUvos. Partiendo de los caldos de enri

quecimiento, se siembra en la superficie de agar Mac Conkey; agar )(LO (xlIosa
lisina-descarboxilasa) y agar Nektoen. Se incuban las placas a
OC (Jurante
24-48 horas.
Las colonias caractersticas de Shigella en cada uno de los medios son:
Asar Mac Conkey: translddas, sn coloracn.
_
Agar XLD: coJor rosa rodeadas por un halo del mismo color.
A.gar hektoen: color verde.
_

21

Anlisis de alimentos
alImentos t t 5

- Confirmacin
Conflrmacl n bJ~ca
blOCJl1Dl1Ca de las colonias sospechosas.sospecbosas.- Se realizan
reatizan
fundamentalmente las siguientes pruebas:
Siembra en medio glucosa-lactosa-S/1
glucosa-lactasa-Sttl2 (Ifllger
(Kliger lron Agar: fflA).
KIA). En l
se estudia la fermentacin
fermentadn de la glucosa con o sin produccin de gas;
fermentacin de la lactosa y produccin de S~
SH" por degradacin de
aminocidos con azufre. Para Shigella
Shlgefla el resultado caracterstico es:

fermentacin de glucosa sin produccin de gas.

Lactosa negativa.
S~
Sf\

negativo.

Siembra en medios para wesUgacln

investigacin de presencia de determinados
enzimas. 50n caractersticamente negativos para Shigella: ureasa; dd
tocromo-oxidasa; lrlptfano
tocromo-oxida.sa;
trlptfano desaminasa
desamlnasa (Indo!)
(Indol) y capacidad de creci
crecimiento con citrato como nica fuente de carbono.

Existen pruebas adicionales que permiten la Identificacin del subgrupo.

Confirmacin
ConflJ:madn serolglca.serolglc.a.- Se realiza
reaUza como en el caso de Salmonella
Saimonella con
las clulas desarrolladas en un cultivo reciente
redente y enfrentndoJas
enfrentndolas a anUsueros
antisueros
comerciales.
comerdales.

3.4. Escherchla
Escherichla coll
colJ patgeno
Adems de ser un IndlcadOT
indicador de contaminacin fecal, algunas cepas de
este microorganismo son patgenas para el ser humano y transmisbfes
transmisibles por
aUmentos.
alimentos. En esle
este sentido se distinguen cuatro tipos de E. eoll, dependiendependien
do del problema patolgico que desencadenan,
desencadenan , lo cual, a su vez. est muy
B. eoll
eoU
ligado a la produccin de determinadas toxinas. Los cuatro tipos de e.
se denomjnan:
denominan:
E. eoll
eoil enteropatognica.

E.
B. eoll
coll enteroinvasiva.
E. coll
eoll enterotoxignlca.
_

B. coU
eoll enterohemorrgica.

La deteccin
detecdn de cualquiera de ellos sigue previamente el manejo estableci
establecido para detecta.r
detectar la bacteria en alimentos pero.
pero, una vez aislada e identificada a
nivel de especie.
especIe. se puede testar s es de uno de estos grupos mediante tcni
tcnicas serolgicas (similares a las de otras entero
enterobacterias)
bacterias) o ms recientemente.
recientemente,
mediante tcnicas
tcnIcas de biologa
bioJoga molecular
molec.ular que buscan y detectan la presenda
presencia del
gen responsable de la produccin de la toxIna.
toxina.

3.5.
3.5~ C/ostridium
Clostridium
Dentro de este gnero, adems de la consideracin de indicadores o ndices
sulfito. existen especies
de contaminacin para todos los capaces de reducir sulfito,
patgenas transmisibles por alimentos (Clostridium
Clostridium perfrngens
perfrlngens y Clostrldium
botultnum
botulinum son las ms importantes). Las enfermedades que produc.en
producen son toxitoxi
infecciones
inrecciones y han sido comentadas en el tema anterior.

,1 1, e Auxiliar de Laboratorlo
Laboratorio Qufmico. Anlisis cllnlcos
La deteccin especifica
especfica de Oostrldlum
C.losbidium perfr/ngens
perfringens en alimentos
aJlmentos puede ser
necesaria en algunos casos y la tcnica a seguir depender de la finalidad del
anlisis. As:
Casos de presunta Intoxlcac.ln:
lntoldcacln: determinacin cualitativa y cuantitacuantita
tiva del germen.

Otros ca.sos:
casos: determinacin de la Presencia-Ausencia, Nmero Ms
Probable o recuento en placas.
En general, para lograr el aislamiento, numeracin e identificacin, se reQuiere:
Anaerobiosis.
Medios de enriquecimiento (selectivos o no).
Medio de aislamiento en placa para determinar caracteristlcas
caractersticas metabmetab
Medjo
hemllsls, produccin de lecitinasas y reduc
reduclicas idenUflcatlvas
idenUficatlvas como: hemllsis,
ci6n
cin del sulfito.
identificacin. mediante estudio de: re
reMedios pafa
para confirmacin de la IdenUficacin,
duccin de nitritos, movilidad, fermentacin de la lactosa.

Para la deteccin de Clostridium botuilnum,

botullnum, de todas las tcnicas que se
han propuesto para alimentos, la inoculacin In
intraperitoneal
traperitonea I al ratn
rat6n es la
ms fidedigna y sensible. Lo Que
que se persigue es delectar
detectar Presencia-AusenPresencia-Ausen
cia de la bacteria y sus toxinas, siendo de especial inters la deteccin de la
enfermos.
bolullica en los restos de alimentos consumidos por los enfermos.
toxina botulnica
preDetectarla en heces o suero de pacientes no siempre es posible ya que su pre
rase de la enfermedad y el momento en que se loman
sencia depende de la Fase
las muestras. En ocasiones, se dispone del alimento sospechoso u otros del
mismo lote y se puede investigar la presencia de esporas toxignicas y/o de
rormas
formas vegetativas. Para ello hay que recurrir a medios de enriquecimiento y
subcultvo en medio slido con aislamiento selectivo y posterior inoculacin al
subcullivo
ratn de las clulas aisladas.

3.6. Vibrio
Vibr;o
IWsten
existen varias especies de inters en infecciones alimentarias pero, sin duda,
al lamlento
lamienlo e identificacin
idenUficacln de esta especie
la ms importante es V. cholerae. El ai
se basa, principalmenle, en el rpido crecimiento de este microorganismo sobre
agua de peptona alcalina en condiciones
coomdones de aerobiosis. El
el crecimJento
creclmjento se mama
formacin de una pelcula en la superficie del medio
memo a las pocas
nifiesta con la fonnacln
nUiesta
horas de incubacin. La identificacin
identlficacln se realiza partiendo
partiendO de este crecimiento
creclrnlento
caracterstico, desde donde se asla en medio slldo
slido selectivo (agar TCBS).
18-24
24 horas de Incubacin,
incubacin, son
Las colonIas
colonias desarrolladas sobre TCBS, tras 18
de. ::5-4
de
3-4 mm de dimetro, planas,
planas. opacas, lisas, redondas y de
d e color amarillo.

3.7.
3..7. Campylobacter
Concretamente la especie C.jfUTll
C.jfW11 se considera la Que
que ms gastroenteritis
bacteriana causa en humanos. Puede afectar a todas las edades
eelades y muy frecuen -
lemenle
temenle se transmile mediante alimenlos crudos o poco cocinados. Un lxUo
bqjo
inoculo (10 clulas) es suficiente para desencadenar la enfermedad.
Inoculo

Anlisis
Anlss de alimentos 1 1 7

La investigacin de campylobacter (C.

(C.J~WlI
J~wli y C. coli)
eoll) en alimentos, precisa
de medios de enriquecimiento para conseguir su rehabilitacin y asegurar su
deteccin. Para ello se utiliza un caldo base al que se incorporan anUbitlcos
anUbiticos y
crecimienLo de los microorganismos contaminan
contaminan
suplementos que inhiben el crecimiento
tes que puedan acompaar al al1mento.
aUmento. Los caldos de enriqueclmlenLo
enriquecimiento se dede
aLmsfera microaerblca
microaerbica (5% de oxgeno, 10%
J 0% de
ben incubar siempre en una atmsfera
Co.
CO~z y 85% de nitrgeno), a 42 OC, durante 48 horas. nas el enriquecimiento se
cary-Blair o agar selectivo
realiza el aislamiento en medios selectivos como el C3ry-Blair
de Skirrow,
Skirrow. que se Incuban en la misma atmsfera y temperatura durante 24
horas. Se estudia enlonces el desarrollo de colonias caractersticas (depender
(dependeT
de la especie), y se procede a la identillcadn
identificacin por caractersticas morfolgicas
y bioqumicas como son:

1'Iodolog(a:
Morfologia: mediante Uncin de gram se observan bacilos en forma de
S
S con los extremos afilados.

Citooromo-oxJdasa:
Citocromo-oxIdasa: ambas especies son citocromo-oxidasa
citocromo-oxdasa positivas.
Catalasa:
Catalal;a; ambas especies poseen este enzima que desdobla
desdobJa el agua
oxgenada en agua y oxigeno
oxigenada
oxgeno libre.