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2 - MATERIAL E MTODOS

As hortalias foram adquiridas mensalmente no comrcio local, respeitando o


calendrio de comercializao da CEAGEPE no qual indicado o perodo de alta
oferta dos produtos no mercado, e analisadas, quanto ao teor de fenlicos totais e
a capacidade antioxidante, no Laboratrio de Anlises Fsico-qumicas de Alimentos
do Departamento de Cincias Domsticas da UFRPE.
a) Obteno do extrato
Os vegetais foram descascados, conforme a necessidade, e triturados em
multiprocessador. Uma alquota da poro comestvel (15 a 200 g Tabela 1) foi
mantida, por 20 min, sob agitao permanente, em 30 mL de metanol
temperatura ambiente (28 2 C) e, em seguida, filtrada. O resduo foi novamente
submetido ao processo de extrao, acima explicitado, por mais dois perodos de 20
min, totalizando um tempo de extrao de 60 min. Os filtrados resultantes foram
combinados, concentrados sob presso reduzida a 40 C e o volume final aferido
para 50 mL.

b) Fenlicos totais
O extrato metanlico obtido foi utilizado para a determinao dos teores de
fenlicos totais, por mtodo espectrofotomtrico, utilizando o reagente FolinCiocalteau (Merck), segundo metodologia descrita por WETTASINGHE & SHAHIDI
[30] e curva padro de catequina. Os resultados foram expressos em g de
fenlicos totais em equivalente de catequina por mL do extrato.
c) Atividade antioxidante
A atividade antioxidante do extrato foi determinada, isoladamente, em dois ensaios,
a saber:
1) capacidade de seqestrar o radical DPPH, segundo mtodo descrito por BRANDWILLIAMS, COUVELIER & BERSET [2], modificado por MILIAUSKAS, VENSKUTONIS
& VAN BEEK [19]. Alquotas (0,1 mL e 0,2 mL) dos extratos dos vegetais, com
concentraes de fenlicos totais de 26 g a 220 g, foram colocadas em

diferentes tubos de ensaio. Em seqncia, 3,9 mL da soluo de DPPH em metanol


(5 x 10-5 M) foram adicionados e, aps agitao, os tubos foram deixados em
repouso ao abrigo da luz. Ao final de 15, 30, 45 e 60 min, a absorbncia foi medida
a 515 nm e a capacidade de seqestrar o radical, expressa como percentual de
inibio, calculada de acordo com a seguinte equao matemtica:

Onde: Abs controle = absorbncia do controle (soluo de DPPH sem antioxidante)


Abs amostra = absorbncia da amostra a ser testada
2) oxidao acoplada do -caroteno e cido linolico, segundo a metodologia
descrita por MARCO [15], modificada por HAMMERSCHMIDT & PRATT [7], como
segue: a soluo de -caroteno (1 mL), preparada pela dissoluo de 1 mg de caroteno em 10 mL de clorofrmio, foi colocada em um balo de fundo redondo,
contendo 20 mg de cido linolico e 200 mg do emulsificante Tween 20. Aps a
remoo do clorofrmio, em evaporador rotatrio a 50 C, 50 mL de gua destilada
foram adicionados sob agitao vigorosa. Alquotas (5 mL) desta emulso foram
transferidas para uma srie de tubos de ensaios contendo 0,2 mL do extrato dos
vegetais, com concentrao de fenlicos totais de 51 a 220 g. Em seguida, os
tubos foram colocados em banho-maria a 50 C, durante 105 min, e a absorbncia
foi registrada a 470 nm. A atividade antioxidante foi expressa como percentual de
inibio da oxidao, calculada em relao a 100% da oxidao do controle (sem
antioxidante).
Como termo de comparao foram utilizadas a capacidade de seqestrar o radical
DPPH e a atividade antioxidante do BHT (butil hidroxitolueno), determinadas nas
mesmas condies dos dois ensaios acima descritos.
d) Tratamento estatstico dos dados
Todas as determinaes foram efetuadas em triplicata, os dados obtidos foram
submetidos anlise de varincia e Teste de Tukey, ao nvel de significncia de 5%,
utilizando o programa estatstico "STATISTICA for Windows". O coeficiente de
correlao para determinar a relao entre as variveis, teor de fenlicos totais e
atividade antioxidante dos extratos das hortalias, foi calculado e a anlise de
regresso efetuada, usando o mesmo programa estatstico acima citado.

3 - RESULTADOS E DISCUSSO
A capacidade de seqestrar o radical DPPH, expressa em percentual de inibio,
exibida pelos extratos metanlicos dos vegetais em estudo, encontra-se na Tabela
2. Com base nestes dados, evidencia-se que o(s) composto(s) ativo(s) dos extratos
atua(m) como doador de hidrognio ao radical, entretanto esta ao diferenciada
entre os vegetais. O extrato metanlico do tomate, couve-flor, couve folha, batata e
espinafre foram, nesta ordem, os mais eficazes em seqestrar o radical livre, cujo
percentual de inibio, aos 15 min da reao, foi superior a 70%. Evidencia-se que
a ao exibida por estes vegetais foi estatisticamente semelhante ao antioxidante
sinttico BHT. Com exceo do extrato metanlico da cebola roxa e da alface
crespa, com ao antioxidante moderada por ter atingido 60-70% de inibio aps
os 15 min da reao, as demais hortalias, com inibio inferior a 60%, exibiram

uma fraca capacidade em seqestrar o radical DPPH. Dentre as hortalias com


menor ao antioxidante destacaram-se o chuchu, pepino e a cenoura com o menor
percentual de inibio.

A capacidade de vrios vegetais de seqestrar radical livre foi avaliada por OU et al.
[21], pelo mtodo ORAC. Estes autores evidenciaram que a maior ao
antioxidante foi exibida pelo extrato metanlico do espinafre seguido pelo da cebola
roxa, couve-flor, cebola branca, tomate, repolho verde e cenoura. MARTINEZVALVERDEet al. [17], no entanto, relatam que o extrato etanlico do tomate exibiu
uma baixa eficincia em seqestrar o radical DPPH.
A eficcia dos extratos em seqestrar o radical DPPH, tambm, foi avaliada
utilizando maior volume do extrato e, conseqentemente, maior concentrao de
fenlicos totais (Tabela 3).

A anlise dos dados permitiu evidenciar que, nos primeiros quinze minutos da
reao, a maior ao, em ordem decrescente, foi exibida pelo extrato metanlico da
couve folha, tomate, batata, couve-flor, repolho verde, espinafre e alface crespa,
todos com percentual de inibio superior a 70%. A capacidade de seqestrar o
radical DPPH destas hortalias foi estatisticamente semelhante ao BHT. Capacidade
moderada de seqestrar o radical (60-70%) foi apresentada pelo extrato
metanlico da vagem, cebola branca e alface lisa, enquanto que a mais fraca
capacidade de seqestrar o radical DPPH (< 60%) foi exibida pela cebola roxa,
cenoura, pepino e chuchu. Aos 30, 45 e 60 min da reao, a couve folha manteve
sua superioridade sem, contudo, diferir estatisticamente do BHT e das demais
hortalias, exceto da cenoura, do chuchu e do pepino que continuaram a exibir a
menor ao.
Na Tabela 3, evidencia-se que o extrato metanlico da couve folha, apesar de
apresentar teor de fenlicos totais inferior ao do extrato do espinafre, couve-flor,
cebola branca, cebola roxa e alface crespa, exibiu a maior capacidade de seqestrar
o radical DPPH. Observa-se, ainda, que a maioria dos extratos exibiu maior
capacidade de seqestrar o radical DPPH ao serem utilizadas alquotas com maior
teor de compostos fenlicos, no entanto, o extrato metanlico da couve-flor,
espinafre e tomate apresentaram leve reduo desta ao (Tabelas 2 e 3). O teor
de fenlicos totais, nos dois ensaios (0,1 e 0,2 mL dos extratos), bem como o
percentual de inibio dos extratos das hortalias apresentou um baixo coeficiente
de correlao (R = 0,60 e 0,52 respectivamente, p < 0,05). Na anlise de
regresso (p < 0,05) evidencia-se que no houve um aumento linear da capacidade
de seqestrar o radical DPPH em funo do teor de fenlicos totais (Figura 1).

Vrios autores tm demonstrado de forma conclusiva que existe uma forte relao
positiva entre o teor de fenlicos totais e a atividade antioxidante de frutas e
hortalias [1, 11, 27, 28], enquanto que outros autores no tm evidenciado esta
correlao [9, 10]. A composio qumica e a estrutura qumica do componente
ativo do extrato so fatores importantes que influenciam a eficcia do antioxidante
natural. A posio e o nmero de hidroxilas presentes na molcula dos polifenis
um fator relevante para esta atividade. Acredita-se que a orto-dihidroxilao
contribui marcadamente para a atividade antioxidante do composto [26]. Assim, a
atividade antioxidante de um extrato no pode ser explicada apenas com base em
seu teor de fenlicos totais, a caracterizao da estrutura do composto ativo,
tambm, necessria [8].
A ao antioxidante do extrato metanlico das hortalias tambm foi avaliado no
sistema modelo -caroteno/cido linolico, cujos resultados variaram de 10,91% a
81,86% de inibio (Figura 2). Evidencia-se, portanto, que a presena do extrato
das hortalias, contendo fitoqumicos antioxidantes, reduziu, em graus diferentes, o
descoramento do -caroteno. Em funo do percentual de inibio exibido, o
espinafre e a couve folha foram classificados como os vegetais com elevada ao
antioxidante (> 70%), no diferindo estatisticamente do BHT. No grupo com
moderada ao antioxidante (60-70%), esto a alface lisa, a cebola branca e a
couve-flor. Os demais vegetais estudados, por exibirem percentual de inibio da
oxidao inferior a 60%, foram considerados com fraca ao antioxidante, dentre
os quais se destacaram o chuchu, cenoura, pepino, tomate e vagem com os
menores percentuais.

Utilizando a oxidao acoplada do -caroteno e cido linolico para avaliar a


capacidade antioxidante de vegetais, KAUR & KAPOOR [11] consideraram elevada a
ao antioxidante do extrato etanlico do tomate, uma vez que atingiu um
percentual de inibio da oxidao superior a 70%. Nesse mesmo ensaio, a ao
antioxidante do extrato etanlico do repolho, variedade capitata, cenoura e batata
foi considerada moderada (60-70% de inibio), enquanto que a do extrato de
cebola, pepino, couve-flor foi baixa (< 60%). Evidencia-se, portanto, que a
intensidade da atividade antioxidante das hortalias deste estudo diferente da
relatada por outros autores. Vrios fatores relacionados ao cultivo do vegetal, a
exemplo das condies climticas e edficas, alm das caractersticas genticas da
planta, influenciam o perfil de compostos fenlicos das hortalias e,
conseqentemente, a sua ao antioxidante.
Na relao entre o teor de fenlicos totais e a atividade antioxidante, apresentada
na Figura 3, evidencia-se uma positiva e significante correlao entre estas
variveis (p < 0,05) (R = 0,7805; R2 = 0,6092). Comportamento semelhante foi
evidenciado por KAUR & KAPOOR [11] usando o reagente Folin Ciocalteau para
determinao de teor de fenlicos e o sistema modelo -caroteno/cido linolico
para avaliar a atividade antioxidante de extrato etanlico de vegetais.

A ao dos extratos das hortalias testadas nos dois ensaios (DPPH e caroteno/cido linolico) foi diferenciada. Enquanto no ensaio do DPPH, o tomate e
a couve folha exibiram a maior atividade de seqestrar o radical, o espinafre e a
couve folha exibiram a maior atividade antioxidante no ensaio -caroteno/cido
linolico. Neste ltimo, o extrato metanlico do tomate apresentou um dos menores
percentuais de inibio da oxidao (28,58%). Estas discrepncias podem ser
inerentes s caractersticas e ao mecanismo de ao do(s) composto(s) bioativo(s)
e a metodologia utilizada para avaliar sua propriedade antioxidante.
Segundo KOLEVA et al. [12], a oxidao lipdica um complexo processo em
cadeia, no qual esto envolvidos vrios tipos de radicais livres de diferentes
reatividades, e a ao antioxidante de um composto bioativo depende do substrato
lipdico, da sua solubilidade e do seu mecanismo de ao. Assim, em ensaios que
contm lipdios como substrato oxidvel, a exemplo da oxidao acoplada caroteno/cido linolico, o papel protetor do antioxidante depende de sua
solubilidade que determina sua distribuio na fase do sistema, incluindo
localizao e orientao. Alm disso, a complexa composio dos extratos de
vegetais pode provocar interaes sinrgicas ou antagnicas entre os compostos
presentes, podendo, tambm, afetar sua partio nas fases do meio e,
conseqentemente, sua ao antioxidante. Ainda, segundo KOLEVA et al. [12], o
exato mecanismo do antioxidante no sistema -caroteno/cido linolico difcil de
ser explicado, especialmente ao testar a ao de matrizes complexas, como os
extratos de vegetais. Por outro lado, o ensaio do DPPH avalia a capacidade do
antioxidante de seqestrar o radical, portanto no est associado degradao
lipdica oxidativa nem hidro/lipossolubilidade do composto antioxidante, pois o
sistema no contm substrato oxidvel, depende principalmente da sua estrutura
qumica. Neste caso, avalia-se a habilidade do antioxidante em doar hidrognio.