Вы находитесь на странице: 1из 16

1

UNIVERSIDADE DE BRASLIA
INSTITUTO DE QUMICA
LABORATRIO DE QUMICA ORGNICA
EXPERIMENTO 5. INTRODUO A MTODOS CROMATOGRFICOS
CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA E EM COLUNA
OBJETIVOS

Estudar o comportamento de substncias orgnicas em termos da partio


cromatogrfica - estrutura qumica versus fenmeno adsoro cromatogrfica.
Demonstrar experimentalmente princpios fundamentais da cromatografia.
Empregar a tcnica de cromatografia em camada delgada na anlise uma amostra e
utilizar o Rf na identificao de compostos orgnicos usualmente presentes em diversas
formulaes farmacuticas.
Empregar a tcnica de cromatografia em coluna na purificao de compostos orgnicos.

LEITURA RECOMENDADA
Mtodos de separao, cromatografia, fator de reteno, em livros de Qumica Analtica ou
Qumica Orgnica.
INTRODUO
Os termos cromatografia, cromatograma e mtodo cromatogrfico so atribudos ao
botnico russo Mikhael S. Tswett, que em 1906 utilizou estes termos em dois trabalhos
descrevendo suas experincias na separao dos componentes de extratos de folhas e gema
de ovo. Tswett usou colunas de vidro recheadas com vrios slidos finamente divididos e
arrastou os componentes dos extratos com ter de petrleo. O nome deriva-se das palavras
gregas chrom (cor) e graphe (escrever), embora o processo no dependa da cor, exceto para
facilitar a identificao dos componentes separados.
Existem vrias tcnicas cromatogrficas que vo das mais simples como cromatografia
de coluna e camada fina at as mais sofisticadas e computadorizadas, como a cromatografia
lquida de alta eficincia (CLAE).1 De modo geral, entre os mtodos modernos de anlises, as
tcnicas cromatogrficas, ocupam um lugar de destaque na qumica e bioqumica, na pesquisa
e na indstria, devido a sua facilidade em efetuar a separao, identificao e quantificao
das espcies qumicas presentes em uma amostra, mesmo em misturas muito complexas.
O ponto comum entre as vrias tcnicas cromatogrficas existentes e que caracteriza o
mtodo o fato de os componentes da mistura, ou amostra serem distribudos entre duas
fases. A cromatografia , portanto, um mtodo fsico-qumico de separao dos componentes
de uma mistura, realizada atravs da distribuio destes componentes entre duas fases, que
esto em contato ntimo. Uma das fases permanece estacionria enquanto a outra se move
atravs dela. Durante a passagem da fase mvel pela fase estacionria, os componentes da
mistura so distribudos entre as duas fases, de tal forma que cada um dos componentes
1

Degani, A. L. G.; Cass, Q. B.; Vieira, P. C.; Cromatografia um breve ensaio. Qumica Nova na Escola,
1998, No. 7.

2
seletivamente retido pela fase estacionria, resultando em migraes diferenciais destes
componentes.
Uma delas permanece fixa e por isso chamada de fase estacionria enquanto outra
percola atravs da fase estacionria sendo ento chamada de fase mvel. Esta situao
dinmica resulta numa migrao diferencial, ou seja, os componentes da amostra tm
diferentes velocidades ao passarem pela fase estacionria.
A cromatografia de adsoro baseia-se no grau de partio relativa dos compostos,
entre uma dada fase lquida mvel (eluente) e uma determinada fase slida estacionria,
geralmente slicagel (SiO2.xH2O) ou alumina (Al2O3). Outros materiais que so usados incluem
Florisil (silicato de magnsio, carvo ativo, magnsia, carbonato de clcio, amidas e acar).
O grau de adsoro depende da quantidade de gua presente na fase slida (esta ser mais
reativa quanto menos gua estiver presente), da estrutura do composto (presena de grupos
funcionais polares, capacidade de formar ligaes hidrognio, etc.), da adsoro do solvente ao
ocupar os stios ativos da fase slida e da fora atrativa entre o soluto e o solvente (Figura 1).
Os componentes da amostra so, posteriormente, detectados individualmente por meios
qumicos ou fsicos.
R

Al2O3
O Al

N
H

R
H O

O Al
R
C O
R

O
R

C O

HOAl

Figura 1. Algumas formas de visualizar as interaes entre alumina e componentes orgnicos


de uma amostra. Estruturas similares poderiam ser escritas para a slicagel.

Cromatografia em Camada Delgada


A cromatografia em camada delgada (ccd), um caso particular da cromatografia de
adsoro, tem vrias aplicaes importantes em qumica orgnica, tais como: estabelecer se
dois compostos so idnticos, verificar a pureza de um composto (complexidade e muitas
vezes a natureza), determinar o nmero de componentes em uma mistura, determinar o
solvente apropriado para separao em uma coluna cromatogrfica, monitorar a separao de
uma mistura em uma coluna cromatogrfica ou acompanhar o progresso de uma reao. um
mtodo extremamente conveniente, pois uma tcnica rpida, reproduzvel e necessita
apenas uma quantidade muito pequena de amostra (1-100g).
Existem comercialmente folhas pr-recobertas por alumina ou slicagel para
cromatografia em camada delgada, muitas incorporando material fluorescente. Quando no se
tem folhas ou lminas cromatogrficas comerciais, pode-se preparar com facilidade as placas
de vidro. A fase slida espalhada em camada fina sobre uma placa de vidro ou folha de
alumnio. Para fixar o adsorvente superfcie da lmina usa-se sulfato de clcio (gesso) ou um
polmero orgnico. Uma pequena quantidade de uma amostra orgnica colocada em um
ponto numa das extremidades da placa, sendo adsorvida pela fase slida. A placa
cromatogrfica colocada em uma cmara fechada contendo um eluente que percorre a fase
fixa em movimento ascendente por ao capilar, carreando consigo a amostra orgnica.
Diferentes compostos ascendem a diferentes alturas dependendo de suas estruturas
moleculares. Este procedimento especialmente til no caso de compostos que so sensveis
ao calor ou no so volteis, ou seja, no caso de compostos que no so apropriados
determinao de ponto de ebulio ou cromatografia em fase gasosa. A distncia percorrida
por cada composto em uma amostra, dividida pela frente do solvente conhecido como o Rf

3
(fator de reteno). Comparaes do valor de Rf da amostra com o de um padro um mtodo
qualitativo usado na identificao de um composto.
Instrues Gerais para Execuo da Tcnica de Cromatografia em Camada Delgada
Para se fazer a escolha do solvente de desenvolvimento pode-se proceder da seguinte
maneira: preparam-se vrios tubos capilares e recolhe-se a amostra dissolvida nos vrios
solventes que se deseja testar, as amostras so recolhidas por ao capilar. Faz-se o toque da
pelcula cromatogrfica pelo tubo (Figura 2). Quando o crculo do solvente tiver atingido a
posio final, o solvente apropriado aquele que tiver arrastado a cerca de 0,3 a 0,5 do raio do
crculo do solvente.

Figura 2. Escolha de solvente para a cromatografia em camada delgada


(a) Bom desenvolvimento. (b) Superdesenvolvimento. (c) Subdesenvolvimento.

Na Tabela 1 encontramos uma relao dos solvente mais usuais para a cromatografia
em ordem crescente de polaridade. Podem ser usadas misturas de dois ou mais solvente como
eluente em cromatografia. Talvez, a mistura mais usada seja acetato de etila em ter de
petrleo ou hexano, por ser constituda de solventes razoavelmente baratos, volteis e de
regular ou baixa toxicidade.
Tabela 1: Solventes cromatogrficos em ordem crescente de polaridade a.
ter de petrleo
Ciclohexano
Tetracloreto de carbono
Benzeno
Cloreto de metileno
Clorofrmio
ter etlico
Acetato de etila
Piridina
Acetona
lcool n-proplico
Etanol
gua
cido actico
a
A polaridade, neste contexto, s tem sentido para a cromatografia e no coincide, necessariamente,
com a polaridade medida, por exemplo, pela constante dieltrica.

Uma vez escolhido o eluente adequado, as amostras so aplicadas nas cromatoplacas


na forma de solues (1-10%), em solventes bastante volteis por meio de um tubo capilar. O
tubo capilar introduzido na soluo da amostra e em seguida toca-se a ponta do capilar na
cromatoplaca, cerca de 1cm da base inferior (Figura 3.1), permitindo que a amostra seja

4
adsorvida pela fase estacionria. Alguns cuidados devem ser tomados para evitar que a
camada de adsorvente seja alterada ou que o halo de difuso da amostra seja maior que 2
mm. Um mesmo ponto de aplicao poder sofrer vrias aplicaes, se necessrio uma maior
concentrao da amostra. Aps cada aplicao deve-se esperar a evaporao do solvente.
Mais de uma amostra pode ser aplicada em uma mesma placa mantendo-se uma distncia de
1 cm para evitar contato entre os pontos de cada amostra. Em seguida, a placa introduzida
cuidadosamente em uma cuba fechada (cmara) contendo o solvendo indicado, com a
extremidade semeada para baixo. O nvel do solvente dever ficar abaixo dos pontos de
aplicao das amostras (Figura 3.2). Durante a corrida do solvente o sistema fica fechado para
que a atmosfera esteja saturada pelo vapor do solvente. Facilita-se a saturao colocando-se
um pedao de papel de filtro na parede interna da cmara. A cromatoplaca dever ser retirada
da cuba somente quando a frente do solvente atingir um limite pr-determinado na parte
superior da placa (cerca de 1 cm). Aps o desenvolvimento as cromatoplacas so secadas e
reveladas. Esta ltima etapa consiste em tornar visveis as substncias incolores presentes na
amostra. A visualizao pode ser feita atravs de mtodos fsicos ou qumicos. Muitos
compostos podem ser visualizados atravs de luz ultravioleta, por se tornarem fluorescentes
quando excitados por essas radiaes (cuidado!) vem-se manchas negras nos pontos onde a
fluorescncia obstada. Estas manchas (e quaisquer outras detectadas pelos mtodos
alternativos mencionados abaixo) devem ser marcadas por um pequeno crculo. Para a maior
parte dos compostos orgnicos muito utilizado a exposio da cromatoplaca aos vapores de
iodo, em recipiente fechado (Figura 3.3).

Figura 3. (1) Aplicao da amostra na cromatoplaca (2) Eluio de uma placa cromatogrfica;
(3) Revelao de uma placa cromatogrfica em cuba de iodo

Quase todas as classes de substncias orgnicas (exceto alcanos e haletos alifticos) formam
complexos de transferncia de carga com o iodo. Estes complexos revelam-se como manchas
marrom, tanto mais escuras quanto maior o tempo de exposio e a concentrao da amostra.
A formao desses complexos reversvel (muitas vezes rapidamente), de modo que a
posio das manchas escuras deve ser marcada prestemente. A grande vantagem desse
mtodo que o iodo pode ser eliminado posteriormente, na maioria dos casos, atravs do
aquecimento da placa, a qual pode, ento, ser borrifada com outro revelador (cido sulfrico,
vanilina sulfrica , tricloreto de antimnio, permanganato de potssio/cido sulfrico). Isto
possvel porque o iodo se une apenas fisicamente com as substncias, exceto em compostos
insaturados em que ele pode adicionar s insaturaes.
A literatura qumica traz uma srie de referncias a reveladores para cromatografia em
camada delgada, variando desde os de aplicao muito especfica at os mais gerais, como no

5
caso dos vapores de iodo. Em geral os mtodos qumicos de revelao so destrutivos e
aplicveis a separaes analticas, mas no em separaes preparativas.
Quando as condies de medida so completamente especificadas, o valor do Rf
constante para uma dada substncia, e corresponde a uma propriedade fsica daquele
composto. O valor de Rf pode, ento, ser usado para identificar um composto desconhecido,
mas como muitas substncias podem ter o mesmo valor de Rf, assim com podem ter o mesmo
ponto de fuso, mtodos adicionais devem ser utilizados para identificao inequvoca do
composto.
Para clculo do valor de Rf mede-se a distncia que a substncia deslocou a partir do
ponto de aplicao (x), considerando-se para efeito de medida o centro de gravidade da
mancha, e divide-se pela distncia percorrida pela frente do solvente a partir do ponto original
da amostra (y). A Figura 4 ilustra anlise das fraes recolhidas de uma coluna
cromatogrfica (a) e o clculo do Rf para um componente de uma amostra (b).
Distncia percorrida pela mancha desde a origem (x)
Rf = ----------------------------------------------------------------------------------Distncia percorrida pelo solvente desde a origem (y)
Marca da
frente do
solvente

Marca da
frente do
solvente

Mancha
cromatogrfica
y
Componente 1

Rf = x/y

x
Origem
Componente 2

Origem

(a)
(b)
Figura 4. (a) Cromatograma de uma separao em coluna;
(b) Determinao de Rf no cromatograma em camada fina

EXPERIMENTAL DA PARTE A-I PREPARAO DAS PLACAS CROMATOGRFICAS


EXPERIMENTO DEMONSTRATIVO
Objetivo: Demonstrar experimentalmente a preparao artesanal de placas para uso na
cromatografia em camada delgada.
Procedimento:
1. Lava-se as placas cuidadosamente com detergente e gua corrente. Aps a lavagem, a
superfcie das placas no deve ser mais tocada com os dedos. Em seguida, as placas so
secas em uma estufa, apenas com papel toalha ou ao ar.
2. Mistura-se num bquer 30 g de slica gel com 60 mL de gua destilada at obter uma
suspenso homognea.

6
3. Mantendo-se as placas em posio horizontal, transfere-se uma poro adequada da
suspenso para a superfcie das placas, espalhando-a uniformemente com o auxlio de um
basto de vidro.
4. Logo em seguida, para facilitar a distribuio homognea da suspenso, mantm-se a placa
apoiada sobre a bancada, suspende-se uma das extremidades a cerca de 3 cm de altura e
se solta. Repete-se esta operao com a outra extremidade da placa at que visualmente
toda a superfcie esteja uniforme. A espessura do recobrimento deve ser aproximadamente
0,3 mm.
5. Repousa-se a placa em uma superfcie plana horizontal e deixa-se secar ao ar durante 15 a
30 minutos, quando o adsorvente adquire uma aparncia opaca.
6. Para serem utilizadas, as placas devem ser ativadas por aquecimento em uma estufa a 110
o
C durante 30 minutos . Este processo visa eliminar a gua adsorvida no suporte.
As placas assim preparadas esto prontas para uso e podem ser guardadas em lugar
protegido, tomando-se cuidado para no tocar, contaminar ou ferir a camada de adsorvente
EXPERIMENTAL DA PARTE A.II USO DA CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA
PARA INVESTIGAO DE CAFENA E N-ACETIL-p-AMINOFENOL EM ANALGSICOS
Objetivo: Investigar a presena de cafena e N-acetil-p-aminofenol (paracetamol) em
analgsicos [Tylenol, Saridon, Dorflex, Paracetamol (Genrico), etc.].
Procedimento:
1. Aplica-se em pontos separados, atravs de tubos capilares, uma gotinha das solues de
cafena P.A. (1), N-acetil-p-aminofenol (2) e das amostras de analgsicos (solues 3 a 5)
em uma mesma placa de cromatografia, a 1 cm da borda inferior da placa e mantendo-se
cerca de 1 cm de distncia entre os pontos de aplicao.
2. Transfere-se uma certa quantidade de acetato de etila para a cuba de cromatografia de
modo que o mesmo alcance uma altura de 5 mm.
3. Reveste-se a parede interna da cuba com um papel de filtro encostado no fundo. Cubra o
recipiente com um vidro de relgio e espere alguns minutos para que a atmosfera da cuba
fique saturada com os vapores do solvente de desenvolvimento. Eventualmente o nvel do
lquido dever ser completado.
4. Estando os pontos de aplicao bem secos, introduz-se a placa na cuba de modo que o
nvel do lquido fique abaixo dos pontos de aplicao. Espera-se o desenvolvimento do
cromatograma mantendo-se a cuba fechada.
5. Quando a frente do solvente ficar a 1 cm (registre essa distncia) da borda superior da
placa, retira-se e deixa-se secar totalmente ao ar (10 a 15 minutos).
6. Antes da revelao com iodo, verifica-se o cromatograma na lmpada UV. Marca-se o
contorno das manchas das substncias UV ativas, cuidadosamente, com o auxlio de uma
lapiseira.
7. Para revelao definitiva, insere-se a placa em um recipiente cilndrico e seco de tamanho
adequado contendo um pouco de iodo slido e coberto com um vidro de relgio. Espera-se
o surgimento de manchas na placa.
8. Registrar as distncias percorridas pela frente do solvente e pelos componentes de cada
amostra analisada (cafena e N-acetil-p-aminofenol e solues de analgsico analisadas solues 3 a 5).

7
Discusso:
1. Com base no experimento realizado responda as seguintes questes:
(a) Apresente um desenho do cromatograma e diga quantos componentes foram
detectados em cada amostra aplicada?
(b) Determinar os Rf das substncias puras (cafena e N-acetil-p-aminofenol) e de todos os
componentes das solues de analgsico analisadas (solues 3 a 5).
(c) Voc pode inferir inequivocamente que algumas amostras contm paracetamol? Ou
cafena? Ou nenhum dos dois? Ou outros constituintes? Explique.
(d) Supondo que voc precisa emitir parecer tcnico em relao s amostras analisadas,
com base na tcnica empregada e no formulrio especificaes do fabricante (EM
ANEXO) o que voc poderia inferir no seu parecer?
2. Sobre a tcnica cromatografia em camada delgada, responda:
(a) Quais os fundamentos bsicos?
(b) Cite os usos mais consagrados da tcnica (importncia).
(c) Enumere as vantagens e desvantagens da tcnica.
(d) Que caractersticas deve ter um solvente para ser considerado um bom eluente de
desenvolvimento? No caso em questo voc considera o acetato de etila um bom
solvente de eluio?
(e) Que artifcios podemos utilizar quando suspeitamos que o(s) componente(s) da amostra
a ser analisada pode no ser visvel a olho nu?
3. (Provo 2000) Uma mistura contendo os compostos I, II e III, representados abaixo, foi
analisada pela tcnica de cromatografia em camada fina. A mistura foi aplicada em uma
cromatoplaca de slica sem indicador de fluorescncia. Aps eluio com hexano:ter etlico
(4:1) e revelao sob luz ultravioleta (254nm), a cromatoplaca apresentou o seguinte
aspecto:

(I)

(II)

Rf = 0,77

(III)

Rf = 0,34

Quando a cromatoplaca foi revelada com iodo, foram observadas trs manchas. Pode-se
afirmar que as manchas obtidas nos Rf 0,34 e 0,77 correspondem, respectivamente, s
estruturas:
(a) I e II.
(b) I e III.
(c) II e III.
(d) III e I.
(d) III e II.

Cromatografia em Coluna
A cromatografia em coluna uma tcnica usada para a separao de muitos compostos
orgnicos. Essa tcnica fundamenta-se basicamente na polaridade relativa das molculas
envolvidas. O investigador dever dispor de tubos de vidro compactado com um material polar
finamente dividido (suporte slido ou fase estacionria), em geral, alumina ou silicagel,
empacotado com um solvente orgnico ou uma mistura de solventes. Uma soluo contendo o
composto que se deseja purificar aplicada na superfcie superior da fase estacionria, e aps
eluio coletar fraes com volume predeterminados, as quais muito provavelmente contero
os componentes da mistura separados.
A velocidade na qual um composto eludo da coluna depende de sua polaridade, da
polaridade da fase estacionria e da polaridade do solvente utilizado como eluente. Se o
composto mais atrado pela fase estacionria do que pelo solvente, ele migrar mais
lentamente da coluna. Caso contrrio, se o composto tiver maior afinidade pelo solvente ele
migrar mais rapidamente da coluna, gastando menos tempo e solvente. O xito de uma
coluna depender ento da escolha de um suporte e solvente adequados para a sua
realizao. Em alguns casos possvel visualizar a separao dos componentes de uma
mistura observando o desenvolvimento de manchas diferentes na coluna ou acompanhando
cm uma luz ultravioleta. Entretanto, na maioria das vezes, torna-se necessrio o
acompanhamento da separao dos componentes pela tcnica de cromatografia em camada
delgada (ccd).

Instrues Gerais para Execuo da Tcnica de Cromatografia em Coluna


1. Escolha da fase estacionria e do solvente para uma coluna cromatogrfica
Os slidos e solventes usados em uma coluna cromatogrfica, so normalmente, os
mesmos utilizados na cromatografia em camada delgada. Portanto o suporte e os solventes
que devero ser usados em uma coluna cromatogrfica so escolhidos, previamente, atravs
de uma anlise por cromatografia em camada delgada. Aps se obter uma boa separao dos
componentes de uma mistura por cromatografia em camada delgada, deve-se usar o mesmo
suporte e o mesmo solvente para a coluna cromatogrfica. A quantidade de adsorvente
utilizada depende da quantidade de amostra a ser separada.
2. Empacotamento da coluna
A coluna de vidro a ser utilizada para cromatografia dever conter uma vlvula para
controle de fluxo de solvente. Em alguns casos pode-se utilizar uma bureta em substituio a
uma coluna propriamente dita.
Existem dois mtodos para empacotar uma coluna. Um mtodo no qual o suporte
introduzido na coluna a seco (Figura 5a), e um mtodo no qual o suporte introduzido na
coluna junto com o solvente (Figura 5b). No primeiro caso, coloca-se uma pequena quantidade
de algodo na base inferior da coluna para evitar a passagem do suporte slido. A coluna
preenchida at cerca da metade com solvente, tendo cuidado de retirar as pequenas bolhas de
ar surgidas da sua introduo. Com a ajuda de um funil adaptado na parte superior da coluna
introduz-se lentamente, a fase estacionria que ser empacotada com o solvente. O
empacotamento poder ser auxiliado com a introduo e escoamento de novas quantidades de
solvente. Nunca deve deixar a superfcie do suporte livre de solvente. O segundo mtodo
idntico ao primeiro, exceto que a introduo do suporte slido feita junto com o solvente,

9
portanto, os mesmos cuidados devem ser observados durante a preparao e o
empacotamento da coluna.

Figura 5. Colunas cromatogrficas. (a) Solvente adicionado coluna;


(b) suporte slido sendo introduzido na coluna.

3. Introduo da mistura de compostos a ser separada; eluio dos compostos e


monitoramento da coluna
Quando a coluna estiver totalmente empacotada e restando uma diminuta quantidade
de solvente na base superior, o material que se deseja separar introduzido na coluna. Para
realizar essa transferncia, a mistura dissolvida em uma quantidade mnima de solvente,
normalmente o eluente, e introduzida na superfcie da coluna com a ajuda de uma pipeta de
Pasteur. Se a mistura for lquida ela poder ser introduzida diretamente na coluna. Uma
metodologia alternativa envolve a impregnao da amostra em pequena quantidade de
adsorvente com o auxlio de um solvente, em seguida evapora-se o solvente e introduz-se a
amostra a seco (farofa). Esse procedimento particularmente til quando pelo menos um dos
constituintes da amostra se dissolve apenas em solventes muitos polares.
Nesse procedimento, um funil de separao com o solvente de escolha dever ser
adaptado no topo da coluna. Inicialmente, deixa-se eluir uma frao pequena de solvente,
introduz-se na coluna uma nova quantidade de solvente e repete-se a operao. A coluna ,
ento, preenchida com o solvente e comea-se a eluio propriamente dita.
Durante o processo de eluio, mais solvente adicionado no topo da coluna (Figura 6),
procurando-se manter a mesma velocidade de adio e de escoamento, cerca de 1 a 5 gotas
por segundo. Devero ser coletadas pequenas fraes de solvente em recipientes fechados.
Depois de recolhidas algumas fraes, normalmente, torna-se necessrio uma mudana de
solvente ou simplesmente da polaridade de uma mistura de solventes. Faa um monitoramento
das fraes recolhidas por cromatografia em camada delgada, para verificar se todos os
compostos das misturas foram eludos e para verificar quais as fraes que podem ser
combinadas, pois um composto individual raramente encontra-se em uma nica frao.
Algumas fraes recolhidas contm mais de um composto, essas fraes no devem ser
reunidas com fraes que contm apenas um composto.

10

Figura 6. Coluna cromatogrfica acoplada a um funil de separao


para manter o nvel do solvente na superfcie superior.

Uma vez que as fraes recolhidas encontram-se diludas, torna-se necessrio evaporar
o solvente para obter o composto puro. Em alguns casos, esse processo de evaporao do
solvente indispensvel, mesmo antes da anlise cromatogrfica.

Coluna Cromatogrfica Rpida (flash-column chromatography)2


A tcnica cromatogrfica mais utilizada pelos qumicos orgnicos para a separao de
uma mistura de compostos a cromatografia rpida ou cromatografia sob presso. Essa
tcnica utiliza colunas cromatogrficas curtas e a eluio realizada sob presso,
possibilitando que a separao dos componentes tendo Rf 0,05 em cromatografia de
camada delgada (ccd) ocorram em um tempo relativamente reduzido (1-3h). Pelo uso de
presses mais elevadas a separao poder ocorrer de maneira mais rpida (10-15min),
entretanto a resoluo moderada (Rf 0,15).
O aparato necessrio para essa tcnica consiste em uma coluna cromatogrfica com
dimetro apropriado, equipada com reservatrio de solventes e uma vlvula de controle de
presso (Figura 7). A presso fornecida proveniente de um cilindro de gs inerte (nitrognio,
argnio, etc.). A quantidade de suporte a ser utilizada normalmente calculada multiplicandose a quantidade de material que se deseja separar por fator de 20-60. A coluna empacotada
dever ter cerca de 10 a 15 cm. O tamanho das partculas da fase fixa afeta substancialmente
na resoluo. medida que o tamanho destas aumenta, ocorre perda de resoluo. A
resoluo poder ser mantida ou melhorada pelo aumento do dimetro da coluna. A escolha do
eluente feita da mesma forma que na coluna normal, por cromatografia em camada delgada,
e recomenda-se o eluente que eleva o componente desejado da mistura ao Rf = 0,35 naquela
tcnica.

Still, W. C.; Kahn, M.; Mitra, A.; Rapid Chromatographic Technique for Preparative Separations with Moderate
Resolution. J. Org. Chem., 1978, 43, 2923.

11

Figura 7. Coluna para cromatografia rpida.

A coluna preenchida com adsorvente e o solvente de escolha eludo sob presso


at que a coluna esteja empacotada. Adiciona-se, ento, a amostra no topo da coluna e
procede-se a eluio sob presso a uma velocidade controlada ( 2 pol/min). Uma separao
tpica por esta tcnica mostrada na Figura 8. Os passos seguintes so realizados como
descrito no procedimento em colunas cromatogrficas comuns (recolhimento de fraes,
anlise e evaporao do solvente, etc.). Por essa tcnica tambm se recomenda no deixar a
coluna secar.

Figura 8. Separao tpica em cromatografia rpida.

A cromatografia rpida um mtodo geral para a separao de componentes de uma


mistura com resoluo moderada, entretanto, operaes sob presso, utilizao de
aparelhagem sofisticada (colunas com vlvula para controle de presso, reservatrio de
solvente, cilindro de gases), necessidade de colunas com dimetros variveis, constituem
fatores limitantes dessa tcnica.
Coluna Cromatogrfica Rpida e a Seco (dry-column flash chromatografy)3
Mais recentemente foi desenvolvido um mtodo cromatogrfico alternativo coluna
cromatogrfica rpida cromatografia rpida a seco. Essa tcnica combina as vantagens da
aparelhagem e da operao. Um fator de distino entre ambas o uso de suco em lugar da
presso positiva. Um segundo fator de diferenciao que os solventes de eluio so
3

Harwood, L. M.; Dry-Column Flash chromatography. Aldrichimica Acta, 1985, 18, 25; (b) Yau, E. K.; Coward, J.
K.; Filtering-Column Chromatography - A Fast, Convenient Chromatographic Method - Aldrichimica Acta, 1988, 21,
106.

12
adicionados em volumes pr-determinados e a coluna vai at a secura, antes da adio de
uma nova frao do eluente. A aparelhagem usada nessa tcnica simples, constituindo-se
apenas de um funil cilndrico sintetizado, adaptado em um balo com saia para uma trompa de
vcuo (Figura 9).

Figura 9. Equipamento para cromatografia rpida a seco.

A tabela abaixo fornece uma orientao para escolha do tamanho do funil sinterizado, a
quantidade de adsorvente, de amostra e do solvente utilizados.
Tamanho do funil (mm)
dimetro/comprimento
30/46
40/50
70/55

Slica
(g)
15
30
100

Quantidade de
amostra
15-500 mg
500 mg 3 g
2-15 g

Frao de solvente
(mL)
10-15
15-30
20-50

O procedimento tcnico envolve o preenchimento do funil com o adsorvente e aplicao


de suco, de forma que se obtenha uma superfcie superior uniforme. Sob vcuo, pr-elua a
coluna com eluente de menor polaridade no qual a mistura dos produtos solvel. Se a coluna
estiver empacotada corretamente, a frente de solvente ser vista descendo em uma linha
horizontal. Se no se observa isto, repita o procedimento de empacotamento da coluna.
Fornea o eluente na superfcie da coluna at que a frente do solvente passe para o frasco
receptor. Nesse momento cesse o fornecimento do eluente e seque adsorvente sob suco.
Introduza a amostra a ser preparada no topo da coluna pelos mtodos usuais, e
proceda a eluio dos produtos por adio sucessiva de pores definidas do solvente,
aumentando a polaridade da mistura de solventes, deixando que a coluna seque a cada adio
(a superfcie do adsorvente no dever ser perturbada durante a adio de solvente).
Geralmente o aumento de polaridade no gradiente do solvente dever ser alterado em uma
faixa de 5-10%. Sob essas condies, o produto usualmente eludo pela mistura de solventes
na qual apresenta Rf = 0,5 em ccd.
Por esse procedimento, com um mnimo de experincia, separaes com eficincia
similar as obtidas em cromatografia em camada delgada so facilmente realizadas. Ocorre uma
perda mnima de material e economiza-se em tempo e solventes. Durante separaes
prolongadas com solventes volteis, mistura atmosfrica pode condensar no aparelho; embora
esse fato no interfira na eficincia da separao, isto pode ser minimizado substituindo por
solventes menos volteis. Nenhum solvente particularmente no recomendado para essa
tcnica, mas combinaes de pentano (hexano), ter, acetato de etila e metanol so
adequados para a maioria das separaes. A baixa difuso das bandas do produto durante a
cromatografia usualmente significa que cada componente eludo em uma ou duas fraes,
resultando em perda mnima do produto em fraes contaminadas.

13
EXPERIMENTAL DA PARTE B-I. ESCOLHA DE SOLVENTE DE DESENVOLVIMENTO
PARA SEPARAO DA MISTURA DE NITROFENIS EM COLUNA CROMATOGRFICA
Objetivo: Escolher o solvente de desenvolvimento para uso na separao de o- e p-nitrofenol
por meio uso da cromatografia em camada delgada.
Para esse estudo sero utilizadas a soluo padro 1 (p-nitrofenol PA), a soluo padro 2 (onitrofenol PA) e a soluo 3 (mistura reacional da nitrao do fenol). A soluo 3 foi preparada
diluindo-se o produto bruto resultante da nitrao do fenol (substituio eletroflica aromtica),
previamente realizada pelo instrutor, segundo o esquema abaixo:
OH

OH

OH
HNO3-H2O

NO2
+
NO2

Procedimento:
1. Prepara-se trs cmaras cromatogrficas com alguns mL dos solventes em ensaio
(sugesto: diclorometano, hexano, metanol). Para saturao com vapores do solvente
rapidamente, nas cmaras coloca-se meia folha de papel de filtro encostada parede do
recipiente.
2. Prepara-se trs lminas revestidas com slica gel. Em cada uma das lminas aplicar por
meio de tubo capilar em trs diferentes pontos de aplicao correspondentes a: soluo
padro 1 (p-nitrofenol PA), a soluo padro 2 (p-nitrofenol PA) e a soluo 3 (mistura
reacional da nitrao do fenol), segundo as orientaes do instrutor. A mancha resultante
deve ter um tamanho inferior a 4 mm e estar distanciada da borda inferior cerca de 1 cm.
3. Marca-se a linha desejada para a chegada do solvente - cerca de 1 cm do bordo superior
da placa.
4. Mergulha-se ligeiramente cada lmina em diferente solvente de desenvolvimento de modo
que a zona onde se encontre o ponto de aplicao no fique imersa. Quando o eluente
subir at linha da frente retir-la da cmara.
5. Registrar as distncias percorridas pela frente do solvente nos diferentes solventes
(desenhar as cromatoplacas).
Discusso:
1. Com base nas cromatoplacas escolha o melhor solvente de desenvolvimento.
2. Determine o valor Rf de cada componente detectado no melhor solvente de
desenvolvimento.
3. Voc pode inferir inequivocamente que alm do o- e p-nitrofenol, existe um outro
componente na soluo 3? Em caso afirmativo, que impureza (contaminante) poderia
est presente na soluo reacional? Explique.
4. Qual (ais) dos eluentes testados voc recomendaria para eluir a coluna cromatogrfica?
Justifique.

14
EXPERIMENTAL DA PARTE B-II. SEPARAO DE UMA MISTURA O- E P-NITROFENOL
POR CROMATOGRAFIA EM COLUNA - EXPERIMENTO DEMONSTRATIVO

Objetivo: Separar os constituintes de uma mistura contendo o- e p-nitrofenol por meio da


tcnica de cromatografia em coluna.
A separao do o- e p-nitrofenol constitui-se um bom exemplo do efeito da quelao sobre as
propriedades fsicas dos compostos. No ismero orto, os grupos OH e NO 2 podem associar-se
internamente por meio de ligaes hidrognio formando quelatos de seis tomo, tendo o tomo
de hidrognio como elemento de enlace.
Procedimento
1. Preparao da coluna.
Coloca-se uma fina camada de algodo hidrfilo na base inferior da coluna com o auxlio de

uma vareta e introduz-se o primeiro eluente da srie (diclorometano) na coluna at cerca de


1/4 da altura total desta. Verifica-se o funcionamento da torneira.
Pesam-se aproximadamente 20 g de slicagel para um bquer de 100 mL, a este se adiciona
quanto baste do primeiro eluente, para formar uma papa homognea (slica-solvente),
mistura-se com um basto de vidro.
Abre-se um pouco a coluna deixando-a gotejar para dentro de um frasco Erlenmeyer durante
o processo de enchimento.
Com a ajuda da vareta de vidro deitar de modo contnuo a suspenso de slica na coluna (o
solvente recolhido no frasco Erlenmeyer deve ser introduzido novamente na coluna).
Deixa-se gotejar o solvente 5-10 minutos aps o enchimento da coluna para facilitar a
sedimentao dos grnulos de slica (empacotamento). Fecha-se a torneira deixando o
solvente cobrir a parte superior da coluna.
Coloca-se uma rodela de papel de filtro ou uma fina camada de algodo no topo da coluna
proteger a superfcie, com auxlio da vareta se necessrio.
Deixa-se o solvente eluir por a coluna at este ficar 2-3 mm acima do nvel do algodo.

2. Preparao e aplicao da amostra.


Mede-se cerca de 2 mL da soluo de mistura de nitrofenis e aplica-se a mistura lentamente

no topo da coluna, com auxlio de pipeta ou seringa.


Deixa-se gotejar o solvente da coluna at que a soluo a cromatografar desa ao nvel do
algodo. Se necessrio, introduz-se mais solvente para uma melhor penetrao da amostra
na coluna de slica.
3. Eluio dos componentes da amostra.
De um reservatrio de solvente ou funil de decantao (colocada com o auxlio de um anel

metlico sobre a coluna) deixa-se gotejar os eluentes pela ordem seguinte: cerca de 100 mL
de diclorometano; 50 mL de diclorometano:acetato de etila (50:50); 50 mL de acetato de etila
(se necessrio)
Recolhem-se aproximadamente 8 mL de eludo em tubos de ensaio de 10 mL, previamente
numerados.

15
O monitoramento da separao cromatogrfica deve ser realizado por cromatografia em

camada delgada (ccd). A eluio dever ser continuada at a sada total de todos os
componentes da mistura.
As fraes eludas contendo o-nitrofenol e p-nitrofenol puros devero ser reunidas em bales
apropriados e o eluente evaporado com auxlio de rotoevaporador.
Acondicionar os slidos puros em frascos fornecidos pelo instrutor.
4. Controle da pureza/identidade das fraes recolhidas.
Segundo orientao do instrutor, reserve algumas fraes que por ccd apresentam-se
contendo os ismeros puros (um de cada) para que sejam injetadas no cromatgrafo a gs.
Os cromatogramas obtidos pelo uso da cromatografia gasosa (CG) devero ser
posteriormente analisados juntamente com o professor.
Notas:
i. Por vezes torna-se difcil arrastar a suspenso de slica do bquer para
a coluna, a qual poder ser arrastada com a ajuda da vareta de vidro e/ou
pela ajuda de um volume maior de.
ii.Quando se interrompe a adio da suspenso na coluna por algum tempo, a
slica tende a sedimentar e formam-se zonas estratificadas. Uma maneira de
evitar esta situao agitar o solvente na coluna com uma vareta de vidro
entre duas adies sucessivas.
iii. Nunca deixar a superfcie da coluna de slica gel sem eluente, porque
esta se quebra em contacto com o ar.

Discusso:
1.
Com base em argumentos estruturais, comente sobre a separao do o- e p-nitrofenol.
Que outras diferenas em termos de propriedades fsicas desses ismeros tambm podem
ser explicadas usando os mesmos argumentos? Em anexo voc encontrar as propriedades
de todos os ismeros, como descritas no Index Merck (EM ANEXO).
2.
Compare os Rf oriundos da tcnica de cromatografia em camada delgada com os tempos
de reteno observados na cromatografia gasosa (CG) (CROMATOGRAMAS EM ANEXO).
3.
Sobre a tcnica cromatografia em coluna, responda: Quais os fundamentos bsicos? Cite
os usos mais consagrados da tcnica (importncia). Enumere as vantagens e desvantagens
da tcnica.
4.
(Provo 2001) Um qumico deseja separar os compostos abaixo por cromatografia em
coluna, utilizando slica como adsorvente.

CH2CH3

CH2CH3

(X)

(Y)

CH2CH3

(Z)

Para tal, percolou a coluna seqencialmente com os solventes I, II e III, que formam uma
srie eluotrpica. A primeira frao continha o composto X, a segunda frao, o composto Y,
e a ltima frao, o composto Z. Qual dos sistemas de solventes abaixo serve como fase
lquida para justificar a ordem de eluio encontrada?

16

(A)
(B)
(C)
(D)
(E)

Solvente I
hexano
hexano
tolueno
acetonitrila
CH2Cl2

Solvente II
acetonitrila
tolueno
hexano
CH2Cl2
tolueno

Solvente III
tolueno
CH2Cl2
acetonitrila
hexano
hexano

5. (Provo 2001) A cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) um dos mtodos


cromatogrficos mais modernos utilizados em anlise (CLAE analtica) e
separao/purificao de misturas (CLAE preparativa). Abaixo so dados os
cromatogramas X, Y e Z de uma mistura de compostos presentes em analgsicos: aspirina
(A), cafena (B), fenacetina (C) e paracetamol (D), utilizando trs fases mveis diferentes,
no modo isocrtico, em uma mesma coluna.

Avaliando esses cromatogramas, responda s perguntas abaixo.


(a) Qual a fase mvel mais apropriada para ser utilizada em escala preparativa, e a fase mvel
mais adequada para utilizao em escala analtica, considerando um grande nmero de
amostras a serem analisadas? Justifique sua resposta.
(b) Qual o tipo de coluna (fase reversa ou fase normal) utilizada nestes trs experimentos?
Justifique sua resposta.
(c) Sabendo-se que o composto mais polar elui primeiro, qual o composto de maior tempo de
reteno? Justifique sua resposta.
DISPOSIO DOS RESDUOS E INSUMOS
Alguns resduos aquosos podero ser descartados na pia com gua corrente. O demais
resduos lquidos e slidos (solventes, mistura de solventes, slica, etc.) devero ser
acondicionados em frascos apropriados, segundo orientao do instrutor.
Os produtos slidos e lquidos devero ser reservados, aps a purificao, para utilizao
como insumos em prticas posteriores.