Introduccin:

El estudio a nivel bioqumico de cualquier biomolcula requiere la utilizacin de tcnicas

analticas que permitan su determinacin cualitativa y cuantitativa, as como su caracterizacin
fsico-qumica y biolgica. Uno de los mtodos ms sencillos, accesibles, tiles y utilizados es la
espectroscopia, en general, y la espectroscopia ultravioleta-visible, en particular. Se pueden
identificar y cuantificar biomolculas en solucin y en muestras biolgicas, con el empleo 1 de
reactivos especficos que reaccionan con el compuesto a analizar y forman un producto
coloreado que permite detectarlo en muestras complejas.
El fundamento de la espectroscopia se debe a la capacidad de las molculas para absorber
radiaciones, entre ellas las radiaciones dentro del espectro UV_ visible. Las longitudes de onda
de las radiaciones que una molcula puede absorber y la eficiencia con la que se absorben
dependen de la estructura atmica y de las condiciones del medio (pH, temperatura, fuerza
inica, constante dielctrica), por lo que dicha tcnica constituye un valioso instrumento para la
determinacin y caracterizacin de biomolculas.
En espectroscopia el trmino luz no slo se aplica a la forma visible de radiacin
electromagntica, sino tambin a las formas UV e IR, que son invisibles. En espectrofotometra
de absorbancia se utilizan las regiones del ultravioleta (UV cercano, de 195-400 nm) y el visible
(400-780 nm).

Objetivos:
Determinar Azul de Timol por espectrofotometra UV_ visible mediante una curva de calibracin
directa; para observar, y analizar; el espectro de absorbancia, la calibracin del
espectrofotmetro, la concentracin de una muestra problema (de Azul de Timol) y determinar
algunos parmetros estadsticos que nos permitan sustentar los valores obtenidos. (Desviacin
estndar, media, CV e intervalos de confianza)

Resultados:
2.2 Obtencin de espectro de absorcin. Determinacin de longitud de onda optima
Tabla 2.2.1 Resultados experimentales del espectro

Espectro de Absorcion

0.8
0.7

Grafico 2.2.1 Espectro de absorcin con respecto a la absorbancia

0.6
0.5

Absprbancia

0.4
0.3
0.2
0.1
0

510 530 550 570 590 610 630 650 670 690
500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700

longitud de onda (nm)

(nm)
500
510
520
530
540
550
560
570
580
590
600
610
620
630
640
650
660
670
680
690
700

Abs
0.236
0.271
0.317
0.369
0.430
0.500
0.569
0.623
0.687
0.754
0.739
0.675
0.523
0.376
0.253
0.159
0.114
0.087
0.075
0.070
0.068

Tabla 2.2.1 Resultados experimentales del espectro

Espectro de Absorcion
de Absorcin
90

Grafico 2.2.2 Espectro de absorcin con respecto a la

80
70
60
50

Absorbancia

40
30
20
10
0
500

520

540

560

580

600

620

640

660

680

700

longitud de onda (nm)

(nm)
500
510
520
530
540
550
560
570
580
590
600
610
620
630
640
650
660
670
680
690
700

%T
58.1
53.6
48.2
42.8
37.2
31.6
27
23.8
20.6
18.4
18.2
21.1
30
42.1
55.8
69.4
77
81.7
84.1
85.2
85.5

2.3 Lectura de absorbancia para cada sistema a la longitud de onda ptima (600nm)
Tabla 2.3 Resultados experimentales
S Concentracin A1
A2
A3
Azul de Timol
(ppm)
1 4.5 ppm
0.2 0.2 0.2
16
07
01
2 9 ppm
0.2 0.3 0.2

para el anlisis
APro K=
Aprom/C
m
0.2
08
0.2

0.046
0.032

13.5 ppm

18 ppm

22.5 ppm

6
p

12ppm
desconocida

Dilucin

79
0.4
62
0.5
41
0.6
63

08
0.5
76
0.4
33
0.7
41

79
0.4
62
0.5
41
0.6
63

0.3
47
1:2
0

0.6
23
1:1
0

0.3
47
1:2
0

88
0.4
62
0.5
11
0.7
14

0.028
0.031

Curva de calibracion de Azul de Timol [M]

0.800
0.700
0.600
0.500

Absorbancia

f(x) = 12805.58x + 0.07

R = 0.95
Linear ()

0.400
0.300
0.200
0.100
0.000
0.000E+00

5.000E-05

1.000E-04

Concentracion M

Curva de calibracion de Azul de Timol en m/ml

0.800
0.700
0.600
0.500

Absorvancia

f(x) = 0.03x + 0.07

R = 0.95

Linear ()
Abs serie 1

0.400

Linear (Abs serie 1)

0.300

Abs serie 2

0.200

Linear (Abs serie 2)

Abs serie 3

0.100

Linear (Abs serie 3)

0.000
0 4.5 9 13.5 18 22.5 27

Concentracion en g/ml

Grafico 2.3.2Curva de calibracin de Azul de Timol en m/ml

Tabla 2.3.2 Parmetros estadsticos para la evaluacin del

Parmetros estadsticos
Media

0.445

Desviacin estndar

0.201

Coeficiente de Variacin

0.451

Intervalos de confianza lmite inferior

0.214

Intervalos de confianza lmite superior

0.676

Muestra Problema
Tabla 2.4 Cuantificacin de Azul de Timol

Serie 1

Serie 2

Serie 3

Absorbancia Problema

0.347

0.623

0.347

Concentracin del sistema

9.945

20.018

9.945

Concentracin problema

198.905

200.182

198.905

Promedio de la concentracin problema

199.331

2.5 Prueba de adecuabilidad

*Tabla 2.5.1 Resultados experimentales para el anlisis estadstico ( tomados del grupo
S

Concentracin
Azul de Timol
(ppm)
4.5

13.5

18

22.5

12

desconocida

A1

A2

A3

APro
m

0.1
78
0.3
50
0.5
20
0.7
10
0.8
78
0.4
81
0.6
39

0.2
54
0.3
48
0.5
19
0.6
78
0.9
11
0.4
45
0.6
07

0.1
73
0.3
60
0.5
28
0.6
88
0.8
95
0.4
49

0.1
85
0.3
52
0.5
22
0.6
88
0.8
95
0.4
58

K=
Aprom/C
0.0411
0.0391
0.0386
0.0382
0.0397

*Grafico 2.4.1 Curva de calibracin de Azul de Timol

Cuantificacion de Azul de Timol

1
0.9
0.8
0.7
0.6

Absorvancia

Linear ()

0.5
0.4

Linear ()

0.3
0.2
0.1
0
0

4.5

13.5 18 22.5 27

Concentracion en ppm

*Estos datos fueron tomados de la experimentacin del grupo 2501 seccin A-B, con el fin de
analizar la importancia de la prueba de adecuabilidad, ya que esta no se realiz en el grupo
2501 seccin C-D
2.5 Anlisis de los errores experimentales

Tabla 2.5.1 Resultados experimentales del espectro de Absorcin (respecto al

Espectro de Absorcion
error)
0.03
0.02

Grafico 2.5.1 Espectro de absorcin (respecto al error)

0.02

Absorvancia

0.01
0.01
0

510 530 550 570 590 610 630 650 670 690
500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700

longitud de onda (nm)

(nm)
500
510
520
530
540
550
560
570
580
590
600
610
620
630
640
650
660
670
680
690
700

Abs
0.01
0.01
0.01
0.01
0.01
0.009
0.012
0.017
0.016
0.016
0.015
0.016
0.017
0.018
0.019
0.021
0.022
0.022
0.02
0.017
0.014

Anlisis de Resultados:
El espectro de absorcin es una representacin grfica que indica la cantidad de luz absorbida () a
diferentes valores de . Como se puede observar en el grafico 2.2.1 (Espectro de absorcin con
respecto a la absorbancia).La absorcin hace pasar una molcula desde su estado elctrico
fundamental, a un estado vibracional y rotacional excitado del estado electrnico excitado; es por ello

que cuan mayor sea la absorbancia a la longitud de onda de excitacin mas molculas pasan al
estado excitado y mayor es la emisin que se observa.
Tal como se puede observar en la tabla 2.2.1 (Resultados experimentales del espectro de absorcin)
y su respectivo grfico, que muestra el aumento en la absorbancia, al aumentar la longitud de onda
hasta llegar a los 600nm donde decae la absorbancia de la muestra (Sln 5)
Estos valores son resultado de la disminucin exponencial de la intensidad del haz de luz
monocromtico, como consecuencia de la interaccin de los fotones con los electrones de la
sustancia (sln 5); en este proceso se transfiere energa a la molcula que provoca una disminucin
en la intensidad de la radiacin electromagntica incidente. Lo que conocemos como transmitancia y
lo cual podemos observar en la tabla 2.2.2 y su respectivo grafico (grafico 2.2.2)
La eficiencia con la que se absorben es consecuencia de la estructura atmica y de las condiciones
del medio (pH, temperatura, fuerza inica, constante dielctrica), y son caractersticos de cada
compuesto.
En lo que respecta a la curva de calibracin, podemos destacar principalmente que es una curva de
calibracin directa, aspecto que ser de gran utilidad conocer, ya que esto quiere decir que el analito
es aquel que da la propiedad, la cual ser proporcional a la concentracin de la muestra en cada
sistema.
Una vez destacado este punto procederemos a analizar los resultados obtenidos en la curva de
calibracin los cuales se encuentran registrados en la Tabla 2.3 (Resultados experimentales para el
anlisis estadstico)
La relacin que existe entre la absorbancia y la concentracin de la muestra es directamente
proporcional tal como se describe en la Ley de Lambert- Beer; al realizar una regresin lineal para
dos variables podremos afirmar que tan estrecha es la relacin entre la absorbancia y la
concentracin de la muestra, para as poder validar o rechazar el mtodo utilizado el cual se puede
ver afectado por distintas variables y consecuentemente llevar a una errnea expresin de los
valores, y por ende una mala determinacin.
La pendiente viene a ser el coeficiente de extincin (en trminos de la Ley de Lambert- Beer) del
Azul de Timol, constante relacionada con el rea de incidencia del cromforo y la probabilidad de que
produzca la absorcin, a la longitud de onda establecida (600nm) que en g/ml ser de
0.0274 g/ml-1 cm-1, o bien 12806 M-1 cm-1 en relacin con mol/L
En lo que respecta al coeficiente de determinacin podemos observar que es del 94.7% lo que nos
indica que la fiabilidad de la relacin entre la absorbancia y la concentracin, es predecible a partir
de la ecuacin obtenida con un 94.7 % de confianza

Por otro lado los intervalos de confianza, los cuales son en el caso del lmite inferior de 0.214 y para
el lmite superior es de 0.676 con relacin a la absorbancia, con un nivel de confianza del 99% es decir
que aquellos valores por encima o por debajo de estos valores, no ser conveniente tomarlos en cuenta
para la validacin de los datos obtenidos puesto que no se encuentran dentro de este parmetro de
seguridad

La prueba de adecuabilidad nos permite verificacin que el sistema opera con base a criterios que
permitan asegurar la confiabilidad de los, y sin interferencias del medio, como se puede observar en el
grafico 2.4.1; el sistema 6 que se prepara con dicha finalidad, rectifica la linealidad del mtodo y nos
permite asegurar que los datos obtenidos en la cuerva de calibracin son fiables para la cuantificacin
( referente a la curva de calibracin de la seccin A-B del grupo 25019)
La inspeccin de los parmetros evaluados anteriormente tiene como finalidad, la determinacin de una
muestra de concentracin desconocida, de ah que se tenga que ser tan cuidadoso en los puntos
anteriores, que abarcan desde la determinacin de la longitud de onda optima, prueba de adecuabilidad,
hasta el anlisis de parmetros estadsticos de la curva de calibracin, ya que cuan ms precisos sean
los pasos antes mencionados, ms exactos sern los resultados obtenidos de las determinaciones de
concentracin desconocida.
Para la determinacin que se llev acabo en el grupo 2501 seccin C-D, se hicieron 2 diluciones distintas
como se puede observar en la tabla 2.3 (Resultados experimentales para el anlisis estadstico) de ah
que se obtuviera primero la concentracin en los sistema problema con ayuda de la ecuacin; producto
de la curva de calibracin previamente realizada, y posteriormente obteniendo su concentracin real en
cada serie de anlisis y determinando el promedio resultante de estos datos, obteniendo as un valor
199.331 ppm para la muestra de hasta ahora concentracin desconocida
Al anlisis el trabajo experimental es de gran importancia resaltar los errores experimentales cometidos
con la finalidad de corregirlos, de ser posible en la sesin experimental, para aumentar en la medida de lo
posible la exactitud y precisin de los valores obtenidos, como se observa en la tabla 2.5.1 t y el grafico
obtenido (grafico 2.5.1) los datos resultantes de la determinacin de la longitud de onda optima, se
encuentran muy fuera de lo esperado ya que al aumentar la longitud de onda la absorbancia no aumente
de manera gradual mente continua, al reflexionar sobre la metodologa usada determinamos que el error
que se presenta en la determinacin es sistemtico y por ello posible de corregir.
El error se presenta por una manipulacin incorrecta del espectrofotmetro, ya que al no posicionar de
manera completa la celda enfrente del prisma, y afectando as la absorbancia de la muestra.

Conclusiones:
Referencias: