Practica # 2 Fotosntesis, aislamiento de cloroplastos y la

reaccin de Hill
Introduccin
Sin ninguna duda, uno de los problemas ms interesantes y complejos que desafa el
esfuerzo descubridor del hombre en la actualidad consiste en aclarar los misterios de la
fotosntesis. El mecanismo vivo (bacterias fotosintetizadoras y plantas verdes) a aprendido
a capturar un fotn de luz y al utilizar la energa aportada por el para desplazar un electrn
perteneciente a un par de electrones hasta un nivel ms elevado. Esta captura del fotn y la
conversin de su energa lumnica en energa qumica son una propiedad privativa de las
plantas, un proceso llamado fotosntesis.
Desde los antiguos griegos que pensaban que las plantas sacaban alimento directamente de
la tierra, que haban convertido los restos de plantas y animales en substancias fcilmente
absorbibles por las races, hasta la formulacin de la ley de la conservacin de la materia y
de la energa de por Robert Mayer en 1842, se sucedieron un cmulo de brillantes
cientficos, que intentando resolver la incgnita, generaron las bases cientficas para que, en
1905 Blackman sorprendiera a los fisilogos vegetales del mundo al demostrar que la
fotosntesis no es solo una reaccin fotoqumica sino tambin una reaccin bioqumica, y
en 1937, Hill proporcionara pruebas de que el desprendimiento de oxigeno est
relacionado con las reacciones lumnicas y que el O 2 de la fotosntesis procede del agua
y no del anhdrido carbnico.
Objetivo
Conocer la tcnica para aislar cloroplastos de las hojas de las plantas verdes y demostrar la
reaccin de Hill en cloroplastos aislados mediante el uso de un aceptor de electrones
artificial el diclorofenol indofenol.

Materiales y reactivos
-solucin de sacarosa 0.4 M
-solucin de KCl 0.0008 M
-solucin 2, 6 diclorofenol indofenol

-pipeta de 1 ml.
-probeta de 25 ml
-vaso de precipitado de 100 ml

-mortero con pistilo

-4 tubos para centrifuga
-cubo de hielo
-gasa
-8 tubos de ensaye de 10 ml

-hojas de espinaca (Spinacea olecea)

-vaso de precipitado de 500 ml
-gradilla
-embudo de vidrio
-1 matraz erlenmeyer

Procedimiento
I) Aislamiento de cloroplastos
Tome 10 ml de una solucin de sacarosa 0.4 M y pngalo en cubo de hielo. Lave
perfectamente las hojas de espinaca, pese 10 g y llvelas a un mortero con 50 ml de la
solucin de sacarosa helada; muela la muestra y filtre la suspensin pasndola a travs de
una gasa colocada en un embudo de cuello corto. Centrifugue a 500 rpm durante 10
minutos; tome el sobrenadante y centrifguelo a 3000 rpm durante 10 min. Descarte el
sobrenadante y lave el residuo en sacarosa 0.4 M; en esta fraccin se encuentran los
cloroplastos. A continuacin suspenda los cloroplastos en 10 ml de sacarosa 0.4 M helada.
II) Efecto de la temperatura en la fotosntesis
Divida la suspensin en dos partes, conserva una parte en hielo y la otra hirvala y deje
enfriar.
Prepare una solucin con 0.3 ml de solucin amortiguadora fosfato a pH 6.8 + 19 ml de
KCl 0.008 m (a esta se le llamar solucin amortiguadora). Prepare una solucin de 2,6
diclorofenol-indofenol 16mg/100 ml (a esta se le llamara solucin diclorofenol).
III) Demostracin de la reaccin de Hill
Prepare 6 tubos de ensaye de la manera siguiente:
A) 3.5 ml de sol. Amortiguadora +1.5 ml suspensin cloroplastos; b) 3.5 ml sol
amortiguadora +1.5 ml suspensin hervida de cloroplastos.
C) 3.5 ml de sol. Amortiguadora + 0.5 ml sol diclorofenol + 1.5 ml suspensin cloroplastos;
D) 3.0 ml de sol amortiguadora + 0.5 ml sol diclorofenol + 1.5 ml suspensin hervida de
cloroplastos.
E) prepara igual al tubo c
F) prepara igual al tubo d
Los tubos de ensaye a, b, c y d se colocan bajo la luz intensa de preferencia al sol; los tubos
e, f se colocan en la obscuridad a los 10- 15 min. Observa la coloracin de los tubos

Reaccin de Hill

2, 6 dicloro fenol indofenol oxidado y reducido