Академический Документы
Профессиональный Документы
Культура Документы
(downstream processing)
(CONCENTRACION Y PURIFICACION)
Dr. Blgo. Carlos Villanueva Aguilar
Microbiologa Industrial y Biotecnologa Microbiana
La recuperacin del producto , es un trmino colectivo, referido a todas las etapas que
se requieren para recuperar o separar los productos tiles de un proceso industrial.
Una etapa de recuperacin cambia la concentracin y/o la pureza de un metabolito.
En el proceso ideal de recuperacin se optimizan ambos parmetros.
No existe una operacin nica, ideal o universal, ni secuencias de operaciones que puedan
ser recomendadas; las operaciones individuales unitarias deben ser combinadas de la forma ms
adecuada para cada problema particular.
Figura 3.
Metodologas utilizadas en los procesos de SP
ETAPAS DE RECUPERACION
A. Separacin de las partculas (SEPARACIN DE SLIDOS DEL LQUIDO)
El producto final deseado puede ser el propio microorganismo, sin embargo, en la mayor parte
de los procesos a gran escala el producto deseado es un metabolito que est presente extra o
intracelularmente.
Metabolitos extracelulares: aminocidos, cido ctrico, alcohol, algunos enzimas (amilasas
y proteasas) y la mayor parte de antibiticos (penicilina, estreptomicina).
Metabolitos intracelulares: cidos nucleicos, vitaminas, enzimas y ciertos antibiticos
(griseofulvina).
Si el metabolito a aislar es intracelular, debe ser liberado de las clulas antes de proceder a
las siguientes etapas. Una vez el metabolito ha sido separado de las clulas, la seleccin de
etapas adicionales de purificacin depender del producto deseado.
Metabolitos en las clulas y en el filtrado del cultivo: En pocos casos se encuentran (Ej.
vitamina B12).
1.
Floculacin y flotacin
2.
Filtracin
En la primera etapa en el proceso de recuperacin, lo mas frecuente es llevar a cabo algn tipo
de proceso de filtracin. Los dos principales tipos de filtros son:
Un filtro en profundidad se construye a partir de una matriz filamentosa (lana de vidrio o papel de
filtro), la filtracin es debido a que las partculas a ser removidas quedan atrapadas en la matriz.
Las partculas filtradas son frecuentemente ms pequeas que los poros del filtro, pero a pesar
de ello son separadas a medida que pasan a travs de los intersticios retorcidos del filtro.
Los filtros en superficie son membranas en las que el tamao de los poros es ms pequeo que
las partculas que van a ser filtradas. Las partculas son, por consiguiente, separadas sobre las
superficies de los filtros.
Los hongos filamentosos se filtran frecuentemente a travs de filtros profundos. Los cultivos
bacterianos deben ser filtrados en superficie. En cualquier caso, la velocidad de filtracin, es decir
el volumen de filtrado que puede ser recogido en un tiempo determinado, est influenciada por
numerosos factores: tamao de los microorganismos, su morfologa, la viscosidad del fluido,
temperatura, etc.
Una mejora considerable en el flujo que pasa por el filtro se consigue por filtracin en
contracorriente: los slidos que no pasen a travs del filtro son mantenidos en suspensin
mediante un flujo turbulento a travs de la membrana o ajustando palas mviles o mediante un
impulsor en el interior del filtro. El filtrado pasa a travs de la membrana y la biomasa se separa
del filtro y se transfiere con el material que se retiene. Con este mtodo puede obtenerse un
aumento de la velocidad de filtracin de 100 veces en comparacin con la filtracin esttica.
Dependiendo del tamao de las partculas que sean filtradas se reconocen tres tipos principales
de procesos de filtracin:
Osmosis reversa, para partculas de 0,0001 a 0,001 m
Ultrafiltracin, para partculas de 0,001 a 0,1 m
Microfiltracin, para partculas de
0,1 a 10 m
3. Centrifugacin
Las bacterias son normalmente demasiado pequeas para ser separadas con filtros sencillos. Su
separacin por centrifugacin tambin es difcil debido a las pequeas diferencias en densidad
entre las partculas y la suspensin.
La centrifugacin no slo se utiliza para separar partculas slidas de la fase lquida sino tambin
para la separacin de fluido/fluido.
La separacin eficiente de las clulas por centrifugacin se ve favorecida por un tamao grande
de las partculas, una gran diferencia entre la densidad de las partculas y el lquido, una baja
viscosidad del lquido, un radio elevado del rotor de la centrfuga y una alta velocidad angular.
Tanto el tamao de las partculas, su densidad as como la viscosidad del lquido normalmente no
se pueden controlar. Adems, el radio del rotor de la centrfuga no puede incrementarse
indefinidamente ya que el estrs mecnico incrementa con el cuadrado del radio por lo que los
lmites de seguridad se alcanzan fcilmente. Por todo esto y cuando se trabaja con grandes
volmenes se debe recurrir a centrfugas de flujo continuo. En este tipo de centrfugas la
separacin de partculas es ms eficiente cuanto ms lento sea el flujo de la suspensin a
clarificar ya que se incrementa el tiempo que cada partcula est expuesta a la fuerza centrfuga.
Algunos tipos de rotores: cmara tubular, recipiente de cmara mltiple y centrfuga de rotor de
discos. Todos los diseos tienen desventajas individuales a las que deben ser aadidas las
generales del coste (incluyendo el mantenimiento), consumo de energa y (exceptuando las que
incorporan refrigeracin) elevacin de la temperatura.
4. Decantacin:
B.
Etapa en que los microorganismos son fragmentados por procedimientos qumicos, fsicos o
biolgicos, en los casos que se requiera para la recuperacin del producto.
La seleccin del mtodo depende principalmente de la naturaleza de las clulas. Aunque las
membranas celulares no ofrecen especial resistencia a la ruptura, las paredes celulares varan
ampliamente a la rotura.
Las bacterias Gram + y hongos son mucho ms difciles de romper que las bacterias G- debido
a la composicin de la pared celular. Incluso dentro de un mismo microorganismo las clulas
varan significativamente en sensibilidad a la ruptura dependiendo de su estado fisiolgico.
La desintegracin no debe destruir el producto de inters. Por ejemplo, pueden utilizarse cidos
para romper muchos microorganismos pero no pueden ser utilizados si el producto es lbil a los
cidos.
1. Mtodos qumicos
La lisis bacteriana con lcalis puede realizarse a gran escala y bajo costeo siempre y cuando el
producto sea estable a pH: 10,5-12,5. Por ejemplo, la hormona de crecimiento humano
recombinante se libera fcilmente de Escherichia coli por tratamiento con hidrxido sdico a pH:
11.
Los detergentes permeabilizan las clulas bacterianas al solubilizar las membranas celulares. Asi
se originan agujeros por donde salen al exterior protenas y otras molculas. Sin embargo los
detergentes son caros, desnaturalizan la mayora de las protenas y a menudo aparecen como
contaminantes en el proceso subsecuente de purificacin.
2. Mtodos biolgicos
La pared celular de las bacterias Gram + se hidroliza con el enzima lisozima que se aisla de
la clara de huevo. La pared celular de las bacterias Gram - se hidroliza con lisozima y EDTA.
La pared celular de las levaduras se hidroliza con una combinacin de uno o ms de los
enzimas (1,3)-glucanasa, (1,6)-glucanasa, mananasa y quitinasa.
Los tratamientos enzimticos son muy especficos y las condiciones para la lisis son suaves.
En la actualidad, los costes limitan el uso de los enzimas como agentes lticos celulares en la
industria.
Una variante que se utiliza en levaduras es la autolisis en la cual los enzimas autolticos
endgenos de las levaduras llevan a cabo la destruccin de su propia pared celular. La adicin de
cloruro sdico, acetato de etilo o cloroformo y la incubacin durante 24h a 45C aumenta la
velocidad del proceso autoltico.
Otro mtodo fsico incluye repetidos ciclos de congelacin y descongelacin pero en este caso
muchas de las clulas permanecen intactas. Industrialmente los mtodos fsicos ms empleados
de desintegracin celular suponen la accin mecnica.
Los molinos de bolas llevan a cabo la ruptura de las clulas mediante la accin de bolas de vidrio.
Las clulas y las bolas de vidrio se mezclan juntas y se someten a una alta velocidad de
mezclado en una vasija de reaccin. La ruptura se produce cuando una bola de vidrio fuerza una
clula contra las paredes de la vasija. Con este mtodo se consigue una velocidad mxima de
ruptura de aproximadamente el 80% de las clulas.
Una vez lisadas las clulas, los restos celulares se retiran por centrifugacin de gran
capacidad a baja velocidad o por filtracin en membrana.
Al final obtenemos un lquido libre de clulas que es el que sufre los tratamientos posteriores para
aislamiento y en su caso purificacin del producto de inters.
El uso de mtodos cromatogrficos implican unas de las etapas ms caras en la recuperacin del
producto
Tales mtodos son de especial valor para la purificacin de materiales biolgicos sensibles y
encuentran un amplio uso en la preparacin de materiales farmacuticos, reactivos de
diagnstico y reactivos para investigacin.
Los distintos mtodos cromatogrficos que existen segn su mecanismo de separacin son:
filtracin en gel (peso molecular), cromatografa de adsorcin (interacciones hidrofbicas),
cromatografa de intercambio inico (carga), cromatografa de afinidad (actividad biolgica) y
electroenfoque (punto isoelctrico).
2. Extraccin
El caldo acuoso de fermentacin que contiene el producto deseado se mezcla con un solvente
inmiscible en el que se disuelva preferentemente y del que pueda ser ms fcil y especficamente
recuperado.
Una vez se ha concentrado el producto deseado en la fase solvente puede ser adicionalmente
purificado.
Para la separacin de enzimas en estado activo no pueden ser utilizados los solventes orgnicos
pero s pueden ser utilizados sistemas acuosos en fase mltiple preparados en una solucin de
sales con polmeros hidroflicos (polietilenglicol-dextrano). En ambas fases el agua es el
componente principal, pero ambas fases no son miscibles por lo que los enzimas pueden
separarse fcilmente sin prdida de actividad.
Desecacin
Secado del material biolgico. Es en muchos casos el mtodo final. Los productos son llevados
a una forma estable adecuada para su manejo y almacenamiento.
La sensibilidad al calor de la mayor parte de los productos biolgicos significa que los nicos
mtodos que pueden ser utilizados son los que conducen a la eliminacin de agua con elevacin
mnima de la temperatura.
E. Rendimiento
Las prdidas en la recuperacin dependen de la sensibilidad de las sustancias al proceso y del
nmero de etapas de purificacin.
El promedio de prdidas atribuidas a la purificacin est en torno al 20% pero en casos extremos,
con ciertos tipos de metabolitos intracelulares, puede llegar a ser el 90%.
El rendimiento final es solamente un factor, ya que el coste de los productos qumicos, el equipo
y los salarios deben ser considerados en el clculo global.
Los productos que resultan de los proceso biotecnolgicos pueden ser muy variados. La variedad
estar dada por:
a. La naturaleza qumica del mismo: sustancias simples (alcoholes, cidos orgnicos); protenas,
sustancias con actividad teraputica (antibiticos, hormonas) etc.
b. El volumen de produccin y la concentracin del producto en el caldo de fermentacin: los
llamados commodities (etanol, cido ctrico, etc.) se obtienen de a cientos o miles de ton./ao
En la Fig. 2 vemos como tanto volumen (2.a) como concentracin (2.b) inciden en los precios
finales de estos productos.
Por supuesto la ubicacin de un producto en este grfico no es fija.
El mejor ejemplo son los antibiticos. La concentracin de los mismos en los caldos fue
incrementndose a medida que se conoca ms del producto, se mejoraba la productividad de las
cepas, se desarrollaban nuevas metodologas de produccin y as fue aumentndose el volumen y
bajando los precios.
Lo mismo puede ocurrir con los agentes teraputicos de ltima generacin.
1. Conocer las propiedades fsicas y qumicas bsicas del principio activo y caractersticas
del producto final (por ejemplo definir pureza requerida). El uso determina la pureza. Para
agentes teraputicos se requiere un alto grado de pureza del principio activo. Se tolera un
mximo de 100 ppm de impurezas de 10 pg/dosis, adems de estar libre de pirgenos.
Como podemos observar, la economa de los procesos biotecnolgicos depende en gran medida
de las operaciones de bioseparacin que involucran, de tal manera que la correcta seleccin de estas
operaciones tiene un fuerte impacto en el xito del proceso.
Referencias bibliogrficas
1. Biotecnologa - Bioprocesos II. Introduccin a los procesos biotecnolgicos Separacin y
purificacin en Biotecnologa (Downstream processing)