Академический Документы
Профессиональный Документы
Культура Документы
Pengikatan protein dengan SDS akan menyebabkan dua hal. Yang pertama
yaitu terputusnya ikatan disulfida yang menentukan protein folding dengan
kata
lain
struktur
sekunder
protein
rusak.
Yang
kedua
yaitu
akan
SDS
sehingga
molekul
protein
akan
terseparasi
semata-mata
elektroforesis adalah:
Suhu : memepengaruhi denaturasi protein , dimana protein dengan
semakin lambat.
Konsentrasi
enzim:
konsentrasi
enzim
bertambah
dengan
Pembuatan Gel
Dalam
praktikum
kali
ini
Hal
yang
pertama
dilakukan
adalah
pembuatan gel. Pada pembuatan gel ini dilakukan 2kali, yaitu pembuatan gel
Separating (gel yang berada dibawah) dan gel Stacking (gel yang berada
diatas). Pada pembuatan gel separating , pertama-tama yang dilakukan
adalah menyiapkan alat dan bahan dahulu setelah itu dilakukan persiapan
bahan APS dengan pertama-tama menimbang ammonium perisulfat yang
diletakkan
dalam
alumunium
foil
(APS
10%)
sebanyak
0.1
gram
sebanyak
2000l
dimasukkan
kedalam
gelas
beaker
yang
glass,
tujuannya
adalah
agar
larutan
homogen.
Setelah
itu
dimasukkan
kedalam
kaca
loading
yang
telah
disiapkan,
membentuk
pori-pori
dalam
gel
agar
protein
dapat
terpisah
Persiapan Sampel
Setelah mempersiapkan separating dan stacking gel, dilanjutkan
dengan pembuatan sampel. Langkah pembuatan sampel ini diawali
dengan mempersiapkan pepsin yang telah terbungkus oleh aluminium
foil
dengan
konsentasi
(0,005;0.0075;0.01;0.0125;0.015),
larutan
yang
buffer,
berbeda-beda
mikropipet,
dan
karena
telah
melakukan
preparasinya
sesuai
dengan
Pewarnaan Protein
Setelah dilakukan pemisahan protein dengan elektroforesis, dilanjutkan
dengan pewrnaan gel. Pewarnaan gel ini bertujuan untuk membantu dalam
pengamatan band protein. Pertama-tama menyiapkan alat dan bahan
terlebih dahulu, kemudian dihentikan listrik pada elektroforesis, diambil kaca
loading dari tank, lalu gel diambil secara perlahan agar tidak sobek sehingga
hasil yang didapatkan nanti maksimal dan diletakkan kedalam sebuah
wadah. Setelah itu dituangkan larutan pewarna bromophenol blue hingga gel
terendam, larutan pewarna ini dibuat dengan mencampurkan 0.125 gram
croomasic brilliant blue, 22.7 ml methanol, 4.6 ml asam asetat glasial, dan
aquabides hingga volume total 50 ml. Setelah dituangkan larutan pewarna
diletakkan diatas shaker selama 15menit, dilakukan shaker pada gel ini
bertujuan agar warnanya meresap kedalam gel . Kemudian, larutan pewarna
dibuang hingga hanya tersisa gel dalam wadah. Selanjutnya, dimasukkan
larutan penghilang warna, yang berfungsi untuk menghilangkan warna dari
larutan pewarna Bromophenol Blue. Larutan penghilang warna dibentuk dari
metanol sebanyak 14 ml, asam asetat glasial 14 ml, dan ditambahkan
aquades hingga volume total 200 ml. Setelah dilakukan penambahan larutan
penghilang warna, wadah berisi gel diletakkan pada shaker kembali selama
10 menit yang bertujuan untuk memaksimalkan dalam penghilangan warna.
Selanjutnya, larutan penghilang warna dibuang dan gel dibilas menggunakan
aquades. Kemudian, larutan pembilas dituang pada gel dan diberi beberapa
potong kertas saring kecil untuk membantu mengikat sisa-sisa pewarnaan
dari Bromophenol Blue tadi kemudian didiamkan selama 10-15 menit.
Terakhir, larutan pembilas yang lama diganti dengan yang baru hingga
terlihat pita-pita protein pada gel,
Coomassie
blue.
Dalam
kondisi
ini
kita
bisa
mengetahui
Protein Marker
BM (Kda)
Panjang Pita
Log BM
Rf
225
1,5
2,352
0,288
150
2,1
2,176
0,403
100
2,7
0,461
75
2,9
1,875
0,557
50
3,2
1,698
0,615
35
3,4
1,544
0,653
25
1,397
0,769
Rumus (RF) =
Perhitungan RF
1. RF =
1.5
=0.288
5.2
2.
RF =
2.1
=0.403
5.2
RF =
2.7
=0.519
5.2
4. RF =
2.9
=0.557
5.2
5. RF =
3.2
=0.615
5.2
6. RF =
3.4
=0.653
5.2
7. RF =
4
=0.769
5.2
3.
RF =
3.3
=0.634
5.2
= -2.081 x + 2.976
= -2.081 (0.634) + 2.976
= 1.656
= log BM
= antilog 1.656
= 45.2 kDA
Kurva standar
Rf
0.288
Log BM
2.352
0.403
2.176
0.461
0.557
1.875
0.615
1.698
0.653
1.544
0.769
1.397
1.500
1.000
0.500
0.000
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
Pembahasan
Dari data hasil praktikum, dapat dilihat bahwa ada 7 protein marker yang
digunakan. Protein marker digunakan sebagai standart untuk menentukan berat
molekul dari sampel. Pada protein marker 1 didapat berat molekulnya sebesar
225 kDA, pada protein marker ke 2 didapatkan berat molekulnya sebesar 150
kDA, lalu pada protein marker yang ke-3 dihasilkan berat molekul sebanyak 100
kDA pada protein marker yang ke-4 berat molekulnya sebesar 75 kDA,
sedangkan pada protein marker yang ke-5 didapat berat molekulnya sebesar 50
kDA, pada protein marker yang ke-6 berat molekulnya sebesar 35 kDA dan yang
terakhir pada protein marker yang ke-7 dihasilkan berat molekul sebesar 25 kDA.
Pergerakan dari protein di dalam gel mengikuti persamaan Rf = 1 / BM (berat
molekul) dimana Rf adalah mobility. Intrepetasi dari SDS-PAGE dapat dibaca
dengan membuat persamaan regresi linier dari pita marker sebagai standart
acuan setelah mendapatkan persamaan regresi linier dari marker. Kita dapat
menghitung berat molekul dari sampel dengan cara memasukkan pada
persamaan tersebut. Persamaan regresi linier dari marker : y = -2.081 x +
2.976. Y menunjukkan panjang jarak dari bagian atas gel sampai pita protein
yang akan diukur. Sedangkan x menunjukkan Rf. Dengan panjang pita sampel
3,3 cm maka dapat kita hitung Rfnya dengan cara :
Dan didapatkan hasil Rfnya sebesar 0,634. Lalu nilai Rf yang didapat ini
dimasukkan ke persamaan y = -2.081 x + 2.976 sehingga diperoleh nilainya
sebesar 1.656. Karena y = log BM, maka untuk mencari berat molekulnya kita
harus menganti log y dan didapatkan antilog y sebesar 45.2 kDA. Lalu dari
kurva hubungan antara berat molekul dan nilai rf dapat kita simpulkan bahwa
semakin besar nilai rfnya maka akan semakin kecil log berat molekulnya.
Literatur:
Pada saat elektroforesis berlangsung, protein akan bergerak dari elektroda
negatif
menuju
poliakrilamid
elektroda
tergantung
positif
pada
sampai
berat
pada
jarak
molekulnya.
tertentu
Semakin
pada
rendah
gel
berat
molekulnya maka semakin jauh pula protein bergerak dengan kata lain
mobilitisnya tinggi. Sebaliknya, protein dengan berat molekul lebih besar akan
bergerak pada jarak yang lebih pendek dengan kata lain mobilitisnya rendah.
Berbagai jenis protein pada suatu sampel akan terseparasi (terpisah-pisah) pada
gel poliakrilamida tergantung pada mobilitasnya. Protein dengan mobilitas tinggi
akan berhenti bergerak pada bagian yang lebih bawah gel, sedangkan protein
dengan mobilitas rendah cenderung berhenti bergerak pada bagian atas gel.
Dengan demikian, pada jalur pergerakan protein akan didapatkan jajaran protein
(disebut sebagai band atau pita protein) yang sudah terseparasi berdasarkan
berat molekulnya (Fatchiyah, 2012).
(Fatchiyah, 2012).
Kesimpulan
Kesimpulan dari praktikum kali ini adalah didapatkan 7 pita yang terbentuk.
Panjang pita masing- masing yang diukur dengan menggunakan penggaris yaitu
1,5 cm, 2,1 cm, 2,7 cm, 2,9 cm, 3,2 cm, 3,4 cm, dan 4 cm. Tiap pita terbentuk
karena adanya perbedaan berat molekul sehingga protein berhenti di posisi
masing- masing sesuai berat molekulnya dan apabila kita lihat grafik yang
terbentuk dapat kita simpulkan bahwa semakin besar nilai rfnya maka akan
semakin kecil log berat molekulnya.
Prinsip elektroforesis SDS-Page adalah memisahkan protein berdasarkan
berat molekul dengan menggunakan matrik penyangga akrilamid, protein
terseparasi
dalam
medan
listrik
dan
melanjutkan
dengan
pewarnaan,
Nilai
30%
akrilamid
2000 L
LGB 1300L
dituang pada cetakan gel dengan mikropipet hingga tinggi tertentu (beri sisa
tempat untuk stacking gel)
Hasil
2. Persiapan sampel
Sampel 0,1 %
Hasil
3.
30%
UGB 625L
akrilamid 400
L
Dimasukkan ke beaker glass dan diaduk
APS 10% 20
L
TEMED 2 L
aduk hingga tercampur merata
sisipkan gigi sisir pada stacking gel dalam perlahan jangan sampai terbentuk
gelembung
Hasil
10 L sampel
gel dijalankan pada tegangan 200 v selama 45 menit atau hingga sampel mencapai
bagian dasar
Hasil
5. Pewarnaan gel
Hentikan listrik
tutup dengan plastik dan letakkan diatas shaker selama 15-30 menit
ganti larutan pembilas dengan yang baru hingga terlihat pada gel adalah pita
protein
Hasil