Una mutacin de ganancia de funcin en la adenilatociclasa

ConfiereresistenciaalIsofluranoenC.elegans
Owais Saifee, MD, Ph.D.3, 4 [Graduate Student], Laura B. Metz, B.Sc.1 [Asistente de
Investigacin],
MichaelL.Nonet,Ph.D.3,4[Profesor],C.MichaelCrowder,MD,Ph.D.[Dr.
Seymour]yRoseT.Brown1,2,4[Profesor]
1 Departamento de Anestesiologa delaUniversidaddeWashingtonEscueladeMedicinadeSt.
Louis,Missouri
2 Departamento de Biologa del Desarrollo, UniversidaddeWashingtonEscueladeMedicinade
St.Louis,Misuri
3 Departamento de Anatoma y Neurobiologa de la Escuela deMedicina de la Universidad de
Washington,St.Louis,Misuri
4 Divisin de Biologa y Ciencias Biomdicas de la Facultad de Medicina dela Universidad de
WashingtonSt.
Louis,Missouri

Resumen
Contexto Los anestsicos generales voltiles inhiben la liberacin de neurotransmisores por
un mecanismo que no se entiende completamente. La evidencia gentica en C. elegans ha
demostrado que un mecanismo principal de accin de los anestsicosvoltiles que actan a
concentraciones clnicas en este organismo es la inhibicin presinptica de neurotransmisin .
Para definir los componentes adicionales de este mecanismode accin,C.elegansmutantes
aislados como supresores fenotpicas de una mutacin en la sintaxina , un componente
esencial de la maquinaria de la liberacin de neurotransmisores , fueron hechos pruebas de
anestesiadefenotiposdesensibilidad.
Mtodos Se midi la sensibilidad a concentraciones de isoflurano en los ensayos de
locomocin enC.elegansadultos.Lasensibilidadalinhibidordelaacetilcolinesterasaaldicarb
se utiliza como un ensayo para el nivel de la liberacin de acetilcolina en C. elegans . Las
comparaciones de la sensibilidad isoflurano (medidos por la EC50 ) fueronhechas por un de
ajustesimultneodecurvasyFtest.
ResultadosEntrelosmutantessupresoressintaxina,js127fueel msresistentealisoflurano
con una EC50 de aproximadamente el triple. El mapeo gentico , secuenciacin, y la
transformacin fenocopia js127 mostr que era un alelo de Acy 1 , que codificaunaadenilato
ciclasa expresado entodo el sistema nervioso C. elegans y enelmsculo.js127secomport
como unamutacinn de ganancia en ACY 1 y aument los niveles de monofosfato de
adenosina cclico . Pruebas de los mutantes simples y dobles junto con la expresin tisular
selectiva de la mutacinjs127 revelado que acia 1actaenlasneuronasdentrodeunG s
PKAvaUNC13dependientederegularelcomportamientoylasensibilidadisoflurano.

Conclusiones La activacin de la adenilato ciclasa neuronal antagoniza la inhibicin de

isofluranolocomocinenC.elegans.

Introduccin
Los anestsicos generales voltiles (AV) tienen un complejo conjunto de acciones sobre la
neurotransmisin que se suman para producir anestesia general . Los AV promueven la
transmisin sinptica inhibitoria por potenciacin de tipo cido aminobutryico A y los
receptores de glicina y disminuyendo las transmisin excitatoria por mltiples mecanismos
potenciales . La liberacin del transmisor se reduce en tanto sinapsis inhibitorias y excitatorias
por el vaso , pero lapotenciaylaeficaciaVAsonmayoresensinapsisexcitatoria.Porlotanto,
el efecto neto de los AV presinpticos debe ser una disminucin en el centro excitabilidad del
sistema nervioso. Las pruebas bioqumicas y electrofisiolgicas han implicado la inhibicin de
los canales de sodio como un mecanismo molecular mediante el cual los AV inhiben la
liberacin de neurotransmisores . Sin embargo , el bloqueo de loscanalesdesodionosetiene
en cuenta para el inhibicin completa de la liberacin del transmisor ,por lo menosenalgunas
sinapsis ms bien, el transmisor deliberacin que se encuentra de manera mecnicadebajo
delcanaldesodioesunbuencandidatocomoelobjetivodeAVresidual.
EnelnematodoC.elegans,seencontrqueunamutacininusualenelgenunc64,elcual
codifica la sintaxina neuronal , bloquearon totalmente los efectos conductuales de las
concentraciones clnicas de isoflurano ( por esto nos referimos a concentraciones que caen
dentro de la gama utilizada para la anestesia humana , hasta 2 veces las concentraciones
alveolares mnimas de isoflurano que se produce concentracin acuosa 0,62 mM CE50
isoflurano contra la locomocin coordinada en C. elegans a 22 C = 0,71%envolumen1%
en volumen de isoflurano a 22 C = 0,58 mM ) . La sintaxina es una de las tres protenas
esenciales SNAREpresinpticos que acta en concierto con otras protenasamediarlafusin
delasvesculassinpticasconlamembranapresinptica .Lamutacininusual,designadaunc
64 ( MD130 ) , produce un syntaxina truncada que antagoniza predominantemente la
sensibilidad de los AV a lo largo de la sensibilidad con que se expresa una reduccin de los
niveles de la sintaxina , lo que resulta en otro fenotipo consistentes con una disminucin de la
liberacin del transmisor excitatorio . Es importante destacar que otros fenotipos deliberacin
del transmisor eran hipersensibles a los AV , por ejemplo , unc 64 ( MD130)tieneun20a30
veces ms alta sensibilidad que la EC50isofluranodelocontrariofenotpicamentesimilaresVA
hipersensibles unc 64 ( md1259 ) y unc 64 ( JS21 ) mutantes. Por lo tanto , la sintaxina
truncada no es indirectamente responsable por antagonizar la reduccin de la liberacin del
transmisor , sino ms bien , los datos sonms consistentes con la interaccin de la syntaxin
conotraprotenaesencialparalasensibilidadalosAV..
Para identificar la protena que interacta con syntaxina correspondiente ( s ) esencial para la
sensibilidad de VA , probamos C. elegans mutantes aislados en una pantalla para supresores
de reduccin de syntaxin. La lgica de la prueba de estos mutantes es que uno o ms de las
mutaciones supresoras podra estar en el supuesto objetivo VA sintaxina que interactan y

pueden ser resistente al VA . En efecto , ya se ha informado de que algunos de estos

supresores eran resistentes , sin embargo , el nivel de resistencia no era tangrande como la
que en unc 64 ( MD130 ) y fue muy probablemente debido a un efecto indirecto sobre la
elevacin de la liberacin del transmisor . Aqu informamos sobre un mutante supresor de
sintaxina adicional cuyo nivel de resistencia es similar a la de los MD130 y define , en parte, el
mecanismoporelqueseregulalasensibilidadVAenC.elegans.

MaterialesyMtodos
CepasdeC.elegansylostransformantes
CepasdeC.elegansmutantesseobtuvierondelCentrodeGenticaCaenorhabditis,quees
financiado por el Centro Nacional de Institutos de Salud Nacional para Recursos de
Investigacin (Bethesda, MD). Las cepas se cultivaron como se ha descritoanteriormente en
medio de crecimiento de nematodos agar 9. N2 var Bristoleralacepadetiposalvajeyelfondo
gentico para todos los mutantes.Las cepas mutantes utilizados para este trabajo son las
siguientes: BIG: unc13(E376), unc13 (E376) acia1 (js127) III,unc13(S69)acia1(js127)III,
unc13 (S69), gsa1 (ce81)LGIII:unc64(E246),acia1(js127),acia1(js127)/+,acia1(js127)
unc64 (E246), acia1 (js127) / + unc64 ( E246),acia1(nu329),acia1(js127)SNB1
( md247)V,acia 1(js127)unc10(md1117)X,CRH1(n3315),acia1(js127 ) CRH
1 ( n3315 ) , UNC 64 ( E246 ) jsEx558[acia1(P260S)Prol6::GFP], unc64(E246)
jsEx570 [ acia 1 (+ ) Prol6::GFP],unc64 ( E246 ) jsEx571[acia1(+)Prol 6::GFP]
, unc 64 ( E246 ) jsEx575[ acia 1(L2444S ) Prol 6 :: GFP ] ,unc64(E246)jsEx579[
Psnb 1 :: acia 1 ( P260S )Prol6::GFP],unc64(E246)jsEx580[Pmyo3 ::acia1(
P260S ) Prol 6 :: GFP ] LGV :SNB 1 ( md247)LGX: unc 10(md1117),kin2 ( ce179).
Slo Extracromosmica : jsEx558 [ acia 1 ( P260S ) Prol 6 :: GFP ] , jsEx570 [ acia 1(+)
Prol 6 :: GFP ] , jsEx571 [acia1(+)Prol6::GFP],jsEx575 [acia1(L2444S)Prol6::
GFP ] , jsEx579 [ Psnb 1 ::acia 1 (P260S)Prol6::GFP],jsEx580[Pmyo3:: acia1(
P260S ) Prol 6 :: GFP ] , jsEx676 [ gsa 1(+ ) Prol 6 :: GFP ] . js127 doble mutantes con
SNB 1 (md247),UNC10(md1117),UNC13(E376),yunc13(S69)fueronconstruido
con RBF1 ( js232)marccepasUnc.RBF1seencuentraenelcentrode cromosomaIIIyse
usa para marcar elcromosomanojs127III.js127l8hombres fueronapareadosenRBF1
Unc hermafroditas ,y(js127homocigticos)progeniehiperactivoseleccionadodelascrasde
animales heterocigotos . La siguiente generacin se examin para la progenia no interaciva (
js127 Unc ) . Se verific la homocigocidad de md247 y md1117 molecularmente mientras
js127sededujoporlaausenciadejs232molecularmente.
La transformacin de la lnea germinal se llev a cabo por la coninyeccion del plsmido de
inters ,ADN pBluescript portador ( 200 g / ml ) , y el marcador de transformacin dominante
prol 6 ::GFP ( pPHGFP1a2035g/ml)10.Lostransformantesseseleccionaronalanotarla
expresin de GFP en un microscopio de diseccin , y la los etables se aislaron . jsEx570 y
jsEx571 se obtuvieron a partir de la inyeccin de pPR1522 en unc 64 ( E246 ) a 15 g / ml .
inyeccin PAC2 ( 10g/ml ) en unc 64 ( E246 ) dio ( 15g/ml )inyeccin jsEx558 y PAC3 en
unc 64 ( E246 ), producido jsEx575 . PAC2 y PAC3 tambin se introdujeron de forma

independiente en el alelo nulo equilibrada ACY 1 ( pk1279 ) / dpy 17 ( e164 ) con el fin de
determinar si estos formas alteradas fueron capaces derescatarletalidadmutantenula.PAC5
y pAC6 eran cada transforman en unc 64 ( E246 ) y las lneas jsEx579 y jsEx580 aislados ,
respectivamente . Una vez que se establecieron lneas estables , las matrices individuales se
cruzaron para eliminar la mutacin unc 64 ( E246 ) . jsEx676 fue creada por la inyeccin
conjuntadepPD118.33ypRP1505.
ContruccionesPlasmidicas
pRP1522,un14kbclongenmicoquecontieneellocusACY111,seobtuvoapartirCeline
Moorman , Ph.D. (Laboratorio Hubrecht , Centro de Gentica Biomdica , Utrecht, Holanda) y
Ronald Plasterk , Ph.D. (Profesor , Laboratorio Hubrecht , Centro de Gentica Biomdica ,
Utrecht , Pases Bajos ) . El nico par debases acia 1 ( js127 ) fue introducidaen este clon
usando el DpnI mediada por mutagnesis dirigida al sitio Protocolo 12 para crear un clon
genmico ( PAC2 ) que codifica la forma mutante de P260S ACY 1 . Especficamente ,
pRP1522semutagenizusandoOL#897(ATTCAGTCTGTGATGTCTAAAAAGGTACGCA)
y OL # 898 ( TGCGTACCTTTTTAGACATCACAGACTGAAT ) .Delmismo modo,pRP1522fue
mutagenizado usando OL # 955 ( TTGGCAAGAAAGGATTCTGAGTTGGAGACACAG ) y OL #
956 ( CTGTGTCTCCAACTCAGAATCCTTTCTTGCCAA ) para crear PAC3 , un clon acia 1
genmico capaz de albergar una lesin L244S en el modelo de la mutacion activa
adenilatociclasa aislada en Dictyostelium 13 . Ambas construcciones se secuenciaron para
verificar la introduccin apropiada de la lesin genomica deseada . El uso de este mismo
mtodo de mutagnesis , unsitioderestriccinBamHIfuediseadoantesdela1aciasitiode
iniciacin
por
mutagnesis
PAC2
usando
OL
#
1026
(
TCTTGTCTTCTGGATCCATGGACGACGATGT
)
y
OL
#
1027
(
ACATCGTCGTCCATGGATCCAGAAGACAAGA ) para producir pAC4 . El acia 1 a
continuacin, promotor fue reemplazado con el promotor del snb 1 sinaptobrevina para
producir un constructo ,PAC5,paralaexpresinselectivadelaformaP260Senlasneuronas.
Esto se logr intercambiando el fragmentodepAC4SacII/ BamHIconelfragmentodelaSacII/
BamHI GTTAGTATCATTCGAAACATACC ) y OL # 1029 ( AGCTTTCCGCGGAAATC TAGG )
amplificacin del SNB 1 promotor de pRM248 . pAC6 fue creado de la misma manera con el
OL # 1028 y OL #1030 ( GCTGCGGCCGCGGGTCGGC ) para amplificar el myo 3promotor
de pPD96.52 para estudiar la expresin selectiva del msculo. pPD118.33 es una Pmyo 2 ::
GFPypRP1505esunadetiposalvajeGSA1constructoyseobtuvodeRonaldPlasterk.
Unc64(E246)supresordepantalla
Una pantalla gentica no clonal se realiz mediante mutagnesis convencional . Se
mutagenizan hermafroditasunc 64 ( E246 ) L4 por etapas durantecuatrohorasen50mMetil
metano sulfonato . Para recuperar mutantes recesivos , segunda generacin de auto progenie
fueron examinados para animales mviles . A partir deunaplacadadadeaproximadamente50
a 150 Progenie F1 , a lo sumo un supresor de candidato F2 se seleccion clonalmente y se
paso . La supresin fue verificada en la prxima generacin y se inici posterior
retrocruzamiento . Estoserealizageneralmenteenelapareamientoconmachosdetiposalvaje

, doble heterocigotos F1 los hombres han sido cruzados en unc 64 ( E246 ) y varios
descendientes hermafroditas Unc clonales . La prximageneracinseproyectparadesplazar
a los animales para reticular la unc 64 Sup dobles mutantes . Despus de al menos dos
rondas de retrocruzamiento , se cruzaban los deunc64 ( E246)conelfindeobtenerelnico
supresor mutante.Presenciadeelsupresorseverific enelesfuerzoporreintroducirelalelode
UNC 64 ( E246 ) y quemuestralaretencindelasupresindelaparlisis.Ensieterondasde
seleccin de un total de 24.000 Se recuperaron genomas haploides , supresores de catorce .
Otrossupresoresaisladasenelpantallasehandescritoenotraparte.
Mapeogenticodelossupresoresylaidentificacinmoleculardelaslesiones
Todas las pruebas de mapeo y la complementacin serealizaronmediantemtodosgenticos
estndar .Los supresoresseagruparoninicialmenteenbaseasufenotipodecomportamientoy
luego posteriormente fueron colocados en grupos de complementacin por ensayos de
complementacin . js127 era un aislar alelo individual y se coloc en el cromosoma III basado
en la vinculacin con lon 1 . Especficamente , js127 E246 machos seaparearon en lon 1
E246 hermafroditas que resulta en js127 E246 / lon 1 E246 cruzada . Esta progenie cruzada
E246 eran homocigotos , pero eran fenotpicamente no Unc por copia js127 , es decir , js127
actu predominantemente a suprimir elfenotipoE246Unc .Apartirdeesteheterocigotostrans,
7 de 31 Lon progenie eran Tambin fenotpicamente no Unctravsdelaadquisicinde unsolo
ejemplar de js127 por recombinacin . Esta localizacin se perfeccionmediantelaasignacin
detresfactoresconlon1ydpy18.lon1dpy18UNC64 secolocsobrejs127E246ylos
18 Lon recombinantes no Dpy no pudo segregar js127, colocando js127cercaoalaizquierda
de lon 1 .La asignacin de estructura fina era realizado utilizando los polimorfismos de
nucletido nicode lacepa de Hawai , CB4856 17. Los polimorfismos de nucletido nicoque
los sitios de reconocimientodeenzimasderestriccinfueronalteradoselegidoparaelanlisis,
ya que podran ser calificados simplemente mediante amplificacin por PCR de ese regin
genmica y la posteriordigestincon enzimasderestriccin.Enprimerlugar,undpy1daf2
js127 lon 1 cepa UNC 64 se construyecolocandodpy1(e1)daf2(e1370ts)entranscon
js127 lon 1 UNC 64 .122Sup Lon Unc progenieclonal fueronpasesy9placascontenaDpy
Daf progenie. Dpy Daf animales Se pasaron entonces a la temperatura permisiva , 20 C
durante daf 2 , a evaluar la locomocin con el fin de verificar la presencia de js127 . A
continuacin , se aparearon machos CB4856 en esta cepa , y los machos cruzada progenie
resultantes se aparearonnuevo en dpy 1daf 2js127lon1unc64hermafroditas,conelfin
de obtener un mximo de un cromosoma recombinante por la progenie . La progenie de este
cruce se le hicieron pruebas deLon no Daf animales , lo queslo elresultadodeuneventode
recombinacin entre el daf 2 y lon 1 . 239 recombinantes se aislaron y luego cada
cromosoma recombinante se homozygosed y anot para js127 por su fenotipo Sup . La
ubicacindecadaeventoderecombinacinsedeterminporanotandoelgenotipodecadasolo
polimorfismos de nucletido . Los cebadores de PCR y la ubicacin de polimorfismos de un
solo nucletido estn disponibles bajo peticin . El examen de la Lon Sup Clase Unc de
recombinantes js127colocaaladerechadelcsmidoF10F2,mientrasquelainformacindela
clase Lon Unc de recombinantes js127 posicionado a la izquierdade csmido C35D10 . este

regin de aproximadamente 273 Kb contena un estimado de82 genes , uno de los cualesera
una adenilato ciclasa gen , ACY 1 . La secuenciacin del 1 acia marcodelecturaabiertade
js127 puesto de manifiesto un cambio de un solo nucletido C > T que resulta en una lesin
P260S en la protena .UnaPCR/ensayodedigestinfuedesarrolladoparaanotarlapresencia
de esta lesin molecular . PCR amplificacin de un producto de 210 pb usando OL # 872 (
TCTTGAAGAGG CCGGATACATT ) y OL # 896 ( AAAATGCATGCGTAGCCTTTTAG ) ,
seguido por la digestin con BglI dio como resultadoenunmodeloderestriccinde192bpy18
pbdetiposalvajeyunfragmentode210pbsindigerirdejs127.
Ensayosdecomportamientoydeladroga
Ensayos de locomocion se realizaron a temperatura ambiente ( 2022 C ) en al menos 20
jovenes adultos hermafroditas mediante la recopilacin de imgenes de la cmara CCD con
una serie de tramas LG3 ( Scion Corporation, Frederick , MD) cada 2,5 a 5 s con un aumento
entre 0,5 X y 0.8X . Los platos estaban tranquilamente colocados en el microscopio durante
cinco a diez minutos antes de iniciar formacin de imgenes . Se recogi una serie de
imgenes de locomocin basal antes de dejar caer una barra de metal desde una altura
constante sobrelasplacasparaservircomounestmulomecnicoparaexcitarla18animales.
Una serie similar deimgenesserecogidespusde esteestmulomecnico.Lavelocidadde
locomocin se calcul entre imgenes sucesivas midiendo el lineal desplazamiento en la
posicin de la cola de cada animal . Velocidades ms de cuatro imagenes consecutivas se
calcularon y se promediaron para evaluar la locomocin tanto basal como estimulada .Los
ensayosserealizaronportriplicado.
La sensibilidad aguda a los inhibidores de acetilcolinesterasa aldicarb se analiz mediante la
transferencia de 2025 animales a placasque contieneelaldicarbyelcontroldelaevolucinen
el tiempo de los animales parlisis. Los animales se cuentan como paralizado si aparecan
hipercontrados y fracasaban para moverse incluso si pinch con un alambre de platino .
Aldicarb , 2 metil 2 [ metiltio ] proprionaldehyde O [ metilcarbamoil ] oxima , se obtuvo a
partir Chem.Services, Inc. (West Chester , PA) y se prepar como una solucin 100 mM de
valores en un 70% etanol . Aldicarb se aadi al medio de agar nutriente de crecimiento
despusdelautoclavado.
Ensayos de dispersin isoflurano se realizaron a 2224 C con jvenes adultos hermafroditas
como fue descrito previamente. Los gusanos fueron transferidosen tampn de S basal a9,5
cm dispersin de agar placas sembradas en su borde con la bacteria E. coli . Placas de
dispersion se colocaron a continuacin en varias concentraciones atmosfricas de isoflurano
(medidosposteriormenteporcromatografadegases)yentoncesalosanimalesselespermite
dispersarse. La fraccin delos adultos (placa deaproximadamente50/ensayo)presentarenel
anillo bacteriana dividido por el nmero total de adultosdespus de 40 min se obtuvo como el
ndicededispersin.

Monofosfatodeadenosinacclico(AMPc)yelensayodeunincompetitiva
Los niveles de cAMP endgeno se miden a partir de animales adultos jvenes utilizando un
ensayo competitivo ELISA de unin ( Amersham Biosciences , Piscataway , NJ ) 21 . Tipo
salvaje , acia 1 ( nu329 ) , y acia 1 ( js127 ) los animales fueron cultivados en la cepa
guanilato ciclasa de E.coli deficientes DHP1 F glnV44 ( AS) recA1 endA1 gyrA96 ( NalR)thi1
hsdR17 spot1 rfbD1 cyaA 22 . Se obtuvieron cultivos sincronizados de los adultos utilizando
mtodos estndar .Aproximadamente200de losadultosenvasados
seresuspendieronen 1ml
de tampn de lisis y se sonic con tres 20 s pulsos utilizando una micropunta . Las
concentraciones de protena se midieron usando un ensayo de Bradford ( BioRad, Hercules ,
CA).Losensayosserealizaronportriplicado.
Anlisisestadstico
Las curvas de concentracin / respuesta se ajustaron por regresin no lineal utilizando la
ecuacin: y = min+(maxmin)/(1+([Iso]/CE50)k).Elmnimosevioobligadoa0.La
CE50 fueron utilizadoscomolamedidadelasensibilidaddelascepasdeisoflurano.EC50sse
compararon con fines estadsticos diferencias por ajuste de curvas simultnea descritos por
Waud 23 utilizando GraphPad Prism 5 Software ( GraphPad Software, Inc. ,SanDiego,CA).
Los valores de error despus de la EC50 los valores son el error del ajuste . Los valores de
error para los nivelesde cAMP fueron SDde ensayos por triplicado . Valores deerror para los
ensayosdealdicarbfueronSEMdeensayosportriplicado.LastasasdelocomocinydeAMPc
niveles se compararon por dos caras de la t prueba . El momento en el que la mitad de los
animales se fueron paralizadoen los ensayos de parlisis aldicarbse compar las diferencias
estadsticas por ajuste de la curva simultnea utilizando GraphPad Prism Software 5 .
estadstica significativa diferencias fueron en la p < 0,05. Para comparaciones mltiples , el
umbraldeimportanciaera<0,05/#decomparaciones.

Resultados
La mutacin js127 se aisl en una pantalla para lasmutaciones que mejoran la locomocinde
los UNC 64 con alelos para la reduccion de sintaxina , E246 . js127 suprime fuertemente la
lenta locomocin no coordinada de unc 64 ( E246 ) ( fig. 1A , B ) .En efecto , despus de la
estimulacin , el js127 E246 cepa mutante doble trasladavelocidadesnosedistinguendelos
animales de tipo salvajey fue elmutante supresor ms fuerte aislado en la pantalla ( fig.1B).
Para probar si esta la supresin delalocomocinseasociconunaumentoenlaliberacinde
acetilcolina , se midieron las sensibilidades al aldicarb . El aldicarb es un inhibidor de la
acetilcolinesterasa que se usa ampliamenteparamedirlosnivelesdelatransmisincolinrgica
en C. elegansmutantesconlasalvedadde que sensibilidadaldicarbesunamedida indirectade
la liberacin del transmisor y solo mide la liberacin de acetilcolina . Los mutantes con una
disminucin de laliberacin de acetilcolina son ms resistentes a la parlisis por elaldicarb,y
esto se puede medir convenientemente mediante ensayos cinticos . js127 E246 fue
significativamente menos resistentes a aldicarb de unc 64 ( E246 ) , consistente con una
mejoradelafuncindelasintaxinaparamediarlafusindevesculassinpticasyeltransmisor
liberar . La mutacin js127 se cruzo con unc 64 (E246)ysusensibilidadisofluranosemidi.

js127 era fuertemente resistente a isoflurano con una CE50 ms de 3 veces la de la cepa de
tiposalvajeytotalmenteresistenteaconcentracionesdeisofluranoenelrangoclnico(fig.1D).
Paraidentificarlalesingenticaresponsabledelosfenotiposenjs127,lasupresindela
lento fenotipo locomocin de E246 se asign genticamente.Elfenotipode supresin asignado
a un intervalo de 273 Kb en el brazo izquierdo del cromosoma III ( fig. 2A ) . El C. elegans
secuencia delgenoma predice 82 genes en esteintervalo , una de las cuales es ACY1,que
codifica una adenilato ciclasa demostrado previamente para regular la liberacin de
neurotransmisores en C. elegansyporsushomlogosmscercanosdelosmamferos2426.
El gen ACY 1 fue secuenciado enlajs127mutantey unC>Ttransicinmutacinseencontr
en el codn 260 que resulta en prolinaaserinalesindesentidoerrneo(fig.2B ) .Proline260
mentiras dentro deunareginaltamenteconservadaenelNterminalextremodeldominioC1a,
uno de los dominios catalticoscitoplasmticas . Para confirmar que la mutacinP260Sfuede
hecho responsablede los js127 fenotipos,unaacia1genmicoplsmidoseconstruyconla
mutacin P260S y animales transgnicos que expresan el plsmido se generaron . El P260S
transgn suprime fuertemente los defectos de locomocin unc 64(E246)anivelessimilares
a los de la js127 E246 ( fig. 2C ) . Del mismo modo el transgn en la ausencia de unc 64 (
E246 ) confiere resistencia isoflurano alto nivel,enrealidadmayorquequeenjs127(p<0,007
vs ACY 1 ( js127 ) ) ( fig. 2D ) . Basndose en el mapeo , la identificacin de unlesin , y
fenocopia por transformacin , llegamos a la conclusin de que el C> T transicin que resulta
en una P260S cambio en ACY 1 es la mutacin js127 . Confirmando nuestra asignacin de
js127 a ACY 1 , Esteidntica ACY 1 ( P260S ) lesin fue aislado de forma independiente en
otro laboratorio de una forma similar pantalla para supresores de una mutacin diferente que
reduce la liberacin de neurotransmisores en C.elegans 25 . Esto sugiere que relativamente
pocasmutacionesenAcy1resultandodeestefenotipo.
La capacidad para reproducirlosfenotiposdejs127portransformacinsugierequeelmutacin
confiere una ganancia de funcin a ACY 1 . Consistente con esta hiptesis , js127
heterocigotos suprimen significativamente la locomocin lenta de unc 64(E246 ) (fig. 3A ) .
js127 tambin confiere un fenotipo dominante hipersensibilidad aldicarb , mientras que el
reductionof funcin alelo ACY 1 ( nu329 ) 27 es el aldicarb resistente ( fig. 3B ) . Lo mismo
sucede conisoflurano, la sensibilidad , el alelo ACY 1 ( nu329)tieneunfenotipohipersensible
isoflurano , opuestaa laque de Acy 1 ( js127 ) ( fig. 3C , D).Sin embargo,adiferenciadela
expresin transgnicade ACY 1 ( P260S ),lostransgenesqueexpresandetiposalvajeACY
1 adicional o ACY 1 con una mutacin previamente demostrado que confiere actividad
constitutiva en Dictyostelium adenilato ciclasa 13 no eran resistente al isoflurano ni estos
transgenes suprimirlenta locomocin de unc 64 ( E246 ) fenotipos ( fig.3D,E).Porlotanto,
P260S parece ser una particularmente fuerte de ganancia de funcin y mutacin . Para probar
directamente la hiptesisde que js127eraunamutacindegananciadefuncin, comparamos
los niveles decAMPen animales enteros acia 1 ( js127 ) , acia 1 ( nu329 ) , y animales de
tipo salvaje. En consonancia con los datos genticos , los niveles de cAMP fueron
significativamente mayores en js127 que en animales de tipo salvajey significativamente ms
bajos en nu329 ( fig. 3F ) . Por lo tanto , se concluye que js127 confiere un aumento en la

actividad1ACYdelaadenilatociclasa.
ACY 1 se expresa en todoelsistemanerviosoC.elegansyenlapareddelcuerpomuscular .
Por lo tanto , es posible que el aumento de la actividadACY 1 en lasclulas musculares en
lugar de neuronases responsabledelosfenotiposjs127.Paraprobarestahiptesis ,ACY 1(
P260S ) fue selectividad se expresa en neuronas o musculares utilizando promotores
especficos de tipo celular. acia 1 ( P260S)impulsada porelpromotorpanneuronalPsnb1
suprimido fuertemente la lenta locomocin de unc 64 ( E246 ),mientrasquelaexpresinenel
msculo con el Pmyo 3 promotor no produjo supresin perceptible ( fig. 4A ) . Del mismo
modo , pan neuronal acia1 ( P260S ) produjeron alto nivel resistencia a isoflurano mientras
quelasensibilidadisofluranodelmsculoACY1(P260S)erasimilaraladetiposalvaje.(fig.
4B,C).LlegamosalaconclusindequeACY1adenilatociclasaactaenlasneuronas
parasuprimirelfenotipomutantesintaxinayregularlasensibilidadisoflurano.
ParadefinirelcaminomedianteelcualACY1regulalaliberacindeltransmisoryelisoflurano
sensibilidad,hemosprobado los fenotipos de las mutaciones en los genes que podra estaren
elcamino.Laadenilatociclasase
estimulanormalmentepor Gs.C.eleganstieneunGsgen,
GSA 1 , el cual se ha demostrado previamente para promover la liberacin del transmisor
colinrgicoyneurodegeneracin14,24,25,27,28.Encontramosquealigual que acia1(js127)
un activador mutacin ,ce81 , 24 en GSA 1erafuertementeresistenteaisoflurano(fig.5A).
Del mismo modo, los animales transformadas con copias adicionales de tipo salvaje gsa 1
tambin fueron resistentes isoflurano ( fig. 5A ) . La protena quinasa A ( PKA ) es una diana
aguas abajo clsica de adenilato ciclasas y tiene previamente implicado en ACY 1 de
sealizacin 25,29 . Probamos un alelo de prdida de funcin de la Kin 2 , que codifica una
subunidad reguladora negativa de la PKA . De acuerdo con ACY 1 sealizacin a travs de
PKA para regular la sensibilidad isoflurano , el kin 2 la prdida de funcin de mutantes era
resistente fuertemente isoflurano ( fig.5A).protenadeuninalelementoderespuestaaAMPc
(CREB ) es un factor de transcripcin que puede seractivadapor fosforilacindePKAyregula
la expresin de numerosos genes 30 . CREB es ms claramente implicado en la plasticidad
sinptica y desarrolloneuronal , perotambin hasidodemostracinparapromoverlaexpresin
de presinptica sintaxina 31 . Por lo tanto , hemos considerado la hiptesis de que ACY 1
podra promover sinptica transmisin y reducir lasensibilidadisofluranomediantelaactivacin
de CREB . Sin embargo , un nulo la nica mutacin en C. elegans homlogo de CREB 32 ,
CRH 1 , tena sensibilidad normala isoflurano y no suprimir la resistencia deisofluranojs127
en el acia 1 ( js127 ) CRH 1 ( null) doble mutante ( fig. 5A ) . La CRH 1 ( null) mutante
resistente a aldicarb coherente con la hiptesis de que la CRH1 favorece el desarrollo de la
neurotransmisin colinrgica ( figura 5B ) , sin embargo , comoparalaresistenciaisofluranola
CRH 1 (nulo ) mutante no suprimi la aldicarb hipersensibilidad fenotipo de Acy 1 ( js127 ) .
Una salvedadnotable a atribuirlaaldicarbfenotipo delaresistenciaalaCRH1(nulo)mutante
es un mutante que slo se prob y el fenotipo no fue rescatado por la transformacin. Por lo
tanto , la resistencia podra ser el aldicarb debido a una mutacin de fondo desconocido . Sin
embargo , los datos no demuestran definitivamente que la C. elegans CREB no acta aguas
abajodeACY1paracontrolarlaneurotransmisinysensibilidadisoflurano.

Por ltimo , la prueba de supresin de js127 fenotipos por reduccin de funcin de las
mutaciones en tres protenas de liberacin del transmisor maquinaria, UNC 10 rab 3 que
interactan las molculas (RIM ) , SNB 1 sinaptobrevina y UNC 13 Munc13 . Para la
resistencia isoflurano y aldicarb la sensibilidad , las mutaciones enlos tres genessuprimidos
fuertemente js127 ( fig. 5A , C , D, E ) .Por lotanto , la activacin delaadenilatociclasajs127
no pasa por alto la fusin vesicular ncleo maquinaria paraproducirresistenciaVAomejorarla
liberacin del transmisor . Sin embargo ,paralostasadelocomocin,slolalocomocindeun
fuerte unc 13 alelos ( s69 )no mejor con js127 ( fig. 5F ) . unc 13 ( E376 ) , unalelo ms
dbil, siendo movido significativamentemejorenel fondodejs127(fig.5F).Delmismomodo,
las tasas de locomocinde tanto la prdida de SNB 1 parcial de funcin y unc 10 mutantes
nulos mejoraron significativamenteen un fondo mutante js127.Porlotanto,UNC10ytalvez
SNB 1 ( la relacin epistatic de SNB 1 aACY 1 no es definitiva dado elalelo SNB 1 no es
nulo ) no son necesarios para la promocin de la locomocin actividad de ACY 1 . Por el
contrario,UNC13,almenosenelniveldesensibilidaddeestosensayos,es
epistticoaACY1(js127).

Discusin
A travs de la deteccin de las mutaciones que suprimen los fenotipos de una reduccin de la
sintaxina funcin mutante , hemos identificado una mutacin de ganancia de funcin de C.
elegans ACY 1 la adenilato ciclasa que antagoniza fuertemente la sensibilidad isoflurano .
Nuestros datos son consistentes con un ACY 1 va de sealizacincomo se muestra en la
Figura 6 . Con respecto a la anestesia mecanismos , la cuestin ms centralqueplanteaeste
estudio es si ACY 1 es un objetivo anestsico y la mutacin js127 bloquea directamente la
inhibicin de anestsico voltil ACY 1 . Esta hiptesis parece poco probable a la luz de
nuestros resultados anteriores .Aunque no es tan VAresistentescomoacia1(js127),otros
mutantes que suprimen unc 64 ( E246 ) tambin son resistentes VA 7 . En general , hemos
encontrado que las condiciones ambientales o mutaciones como ACY 1(js127)quemejorar
la liberacin de neurotransmisores confieren resistencia VA 7,20,33 . Del mismo modo, los
mutantesconreduccindelaneurotransmisinsehanencontradoparaserhipersensiblesaAV
5,20,33 . Porlo tanto,laanestesiafenotipodeAcy1(js127)seexplicaconmayorfacilidadya
quedebidoalaindirectamejoradelprocesoquebloqueAV.
En C. elegans , slo la sintaxina truncada y unc 13 mutantes se han encontrado para
desviarse a partir de la correlacin entre los niveles de liberacin de neurotransmisores y la
resistencia VA 5,34 . La sintaxina truncada acta de manera dominante para bloquear los
efectos del VA sobre la liberacin del transmisor sin otra manera detectable alterar el
comportamiento o laneurotransmisin 5,34 . La resistencia VA del mutantesyntaxinpuedeser
suprimido por la sobreexpresin de tipo silvestre UNC 13 , consistentes con un modeloen el
que lasintaxinatruncadaenundependientesdeladosisbloquesmecanismoVAinhibicindela
actividaddeUNC13.Losunc13mutantes,apesardehaberreducidotransmisor
liberacin , tambin fueron resistentes VA , y una cepa con unamembranaespecficaUNC13

fue VA resistentes ,lo que sugiere queelmodeloAVbloquedeasociacinconlamembrana de

la UNC 13 34 . Por lo tanto , hemos propuesto anteriormente que la UNC 13 es un objetivo
presinpticaparalaconcentracinclnicadelosAVenC.elegans
TalUNC13serunblancodirectodePKAyasofrecerunahiptesiscomprobableparala
inusualmente fuerte resistencia VA de Acy 1 ( js127 ) ? En efecto , entre los mecanismos de
liberacin mutantes probados , slo los fuertes unc 13 alelos, s69 , se encontr que era
incompetente para js127 supresin de la locomocin sin coordinacin. Sin embargo, poco
espontnea o evocada exocitosis se detecta a partir delas neuronas motorascolinrgicasunc
13 ( S69 ) por electrofisiolgico ensayos de 3537.Porlotanto,mientrasquelainterpretacin
formal de nuestros experimentos genticos epistasis es que UNC 13 se encuentra aguas
abajo de ACY 1 , este resultado puede derivar del hecho de que unc 13 ( S69 ) no tiene
esencialmentelaliberacindeltransmisorparaACY1paramejorarenlugardeserUNC13de
la objetivo directo de la GSA 1 ACY1vaPKA.Adicionalmente,tieneUNC13/mUNC13no
se ha informado que es un objetivo de la PKA . Es ms probable que la PKA fosforila algunos
objetivo intermedio cuya actividad requiere UNC 13 . UNC 13 es un diacil glicerol de unin
protena presinptica que interacta con syntaxin , RIM , calmodulina , y otra presinptica
protenas parapromover laliberacin de neurotransmisores 38 .Un objetivo razonable es PKA
candidato UNC 10 RIM. En los mamferos , la PKA ha demostrado fosforilar RIM , y esto
fosforilacin es necesaria para la potenciacin a largo plazo presinptica PKA dependiente
ratn neuronas del cerebelo 3941 . Interaccin con RIM Munc13 es necesario para el normal
primingvesculasinpticaenlasneuronasdelhipocampoderatones42yRIMuninaMunc13
sehademostradoparareducirlosnivelesdeMunc13homodmeros,quesonautoinhibitory43.
Adems de desinhibicin de Munc13 , RIM se ha demostrado recientemente para promover
presinptica localizacin de P ylos canales de calcio de tipo Q cercadelazonaactivaydesu
interaccin con otras protenas presinpticas incluyendo Rab3 y pueden cumplir una funcin
andamios 39,44,45 .Sin embargo , en C. elegans , si UNC 10RIM eselobjetivoACY1/PKA,
no es un objetivo esencial, ya ACY 1 ( js127 ) es capaz de mejorar significativamente la
locomocin deunmutanteunc10nulo.Lo mismosucedeconelmecanismopresinpticaVA,
UNC10esnoesencialcomounc10nulosmutantessonnormalmentesensiblesaisoflurano.
Un mecanismo ACY1/PKA alternativo o adicional compatible con UNC 13comolaAVobjetivo
eslaregulacindeladegradacindelproteasomadependientedelaUNC13.EnDrosophila
neuronas, Dunc 13 (Drosophila UNC 13 ) los niveles sinpticos resultaron ser positiva
regulado por AMPcyPKA46.LainhibicindelaAMPc/PKAsealizacinresultenunarpida
y reduccin sustancial de los niveles Dunc 13 en la sinapsis , y esta disminucin podranser
bloqueados con inhibidores del proteasoma . Sin embargo, el mecanismo por el cual la va
cAMP/PKAregulaladegradacinproteasomalaparentedeDunc13esoscuro.
Es el C. elegans y su mecanismo presinptico descrito aqu relevante para los mamferos
como mecanismo de anestesia ?Como se indic anteriormente , la inhibicinpresinptica de
liberacion exitatoria de neurotransmisores se ha demostrado en una variedad de modelos de
mamferos . Por lo tanto , una contribucin de los efectos anestsicos presinptica a la

anestesia general, parece probable. la maquinaria presinptica en C. elegans esta altamente

conservada en humanos, yel AV en concentraciones alas que los mutantes en la maquinaria
presinptica se confieren resistencia estn en el rango clnico . As, el mecanismo C. elegans
VA podra aportar de forma razonable a la anestesia general en los mamferos. Un soporte
experimental para esta conjetura se ha informado recientemente . Unsintaxina truncada sobre
la base de la C. elegans VA resistente mutante se expresa en una lnea de clulas
neuroendocrinas en la rata y en el hipocampo y encontrado paraantagonizarlosefectosdelas
concentraciones clnicas de isoflurano en neurosecrecin y la liberacindeltransmisor . Estos
resultados sostienen que al menos algunos aspectos de la C. elegans presinptica se
conservanenlosorganismossuperiores.
Una cuestin importante aconsiderar cuando sehabladelaposiblepertinenciadelapropuesta
de C. elegans presinpticacomomecanismodeanestesiademamferosescmoconciliarlala
funcinfundamentaldelaUNC13sconlainhibicindiferencialvoltilanestsicosdeliberacin
del transmisor de distinta neuronal . En otras palabras , si UNC 13 y su funcion en
todas las
sinapsis y son importantes objetivos anestsicos presinptica , cmo pueden ciertos
anestsicos voltilesuinhibirmaspotentementelassinapsisexcitadorasencomparacinconel
efecto inhibidorquese muestra antes ? Los mamferos UNC 13homlogos,Munc131,2y
3 tienen roles funcionalesdiferentes que podran contribuir a losefectos selectivos sinapsis de
AV.
Laliberaciondelamayoradelosterminalesglutamatrgicosenelhipocampodelratnrequiere
Munc131 mientras que la isoforma Munc131 y Munc132 funciona redundantemente en la
liberacion GABArgica por lo menos en la corteza cerebral y el hipocampo.En elcerebro de
rata, la Munc131 se expresaen todo el sistema nervioso central, mientrasquealexpresionde
Mnc132 est restringida a la corteza cerebral y el hipocampo. Munc133 parece ser
expresado exclusivamente en el cerebelo. Curiosamente, Munc131y2Munc13 es mediada
por la liberacin diferente en su potenciacin por diacilglicerol Munc131 es es mucho menos
eficaez en su potencia. Estas observaciones sugieren la hiptesis de que Munc131, el
homlogo ms cercanoa C. elegans UNC13, pueden ser ms sensiblesa los AV ya su dbil
potenciacin es ms eficazmente bloqueada por el AV encomparacinconladeMunc132.La
prueba de esta hiptesis es experimentalmente factible conladisponibilidadderatn para cada
unadelasisoformasMunc13.