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PRTICA DE FOTOCOLORIMETRIA
Recife, 2004
SUMRIO
1 - rf,rTRO])UO
2 - FIJNDA"l\1ENTOS TERICOS
.....................................................................................................
3 - O EQUIPAMENTO
3. 1 - FOTOCOLORMETRO
3.1.1-FontedeLuz
3.1.2 - Filtro
3.1.3 - Cubeta
3.1.4 - Fotoclula
3.1.5 - Miliampermetro
3.2 - ESPECTROFOTMETRO
"
4 - Ul~rr.,IZA..O DO FOTOCOLORlVIETRO
2
E TRANSMIT.NCIA
PRTICO
6 - ClllDADOS
7 - DI:sCUSS.~O
A SEREM OBSERVADOS
DURANTE
OS EXPERIMENTOS
~..............................................................................................................
8 - B1JBLIOGRAFIA ...........................................
2
,
,...............................................................................
1 - INTRODUO
2 - FUNDAMENTOS
TERICOS
Estudos experimentais realizados por Lambert e Beer demonstraram que existe uma relao
direta E) exponencia! entre a concentrao de uma soluo e a luz por ela absorvida, ou seja, tomandose dois recipientes iguais, transparentes, contendo a mesma substncia em soluo, porm com
concentraes
diferentes (C1 e C2), sendo C2 > C1, observa-se que a intensidade deluz emergente do
recipiente 2 (12) menor do que a intensidade de luz que emerge do recipiente 1 O;).
10
C, e C2 = concentrao da soluo
di e d2 = percurso ptico
10
c, =
C.
e
d, >
o,
',< "
(eq. 1)
Esta equao relaciona a luz emergente de uma soluo (I) com a intensidade luminosa
incidente (Is), a sua concentrao (C), o percursoptco (d) e uma constante ele absoro (k), que
caracterstica
de cada substncia.
3 - O EQUIPAMIENTO
3.1 - FOTOCOLORMETRO
l ..
Luz branca
(policromtica)
Luz rnonocrorntica
r==)
I
I
Fonte
de luz
Filtros
Em seguida so descritos
Fotoclula
Cubeta
3.1.1
- Fonte de Luz
.'1,
<
3.1.2 - Filtro
Atravs de filtros pticos possvel retirar (separar) desta luz branca as diferentes cores (luz
monocromtica) que a constituem. Sendo que cada cor corresponde a uma faixa de comprimento de
onda () do espectro de radiaes eletrornaqnticas.
A banda passante tpica de um filtro de vidro de 50 nm, o que significa dizer que no
possvel selecionar faixas do espectro da luz visvel com largura inferior a 50 nm.
Luz visvel
s
Raios
Raios X
I
1 pm
1i! ~
~-1====~~==~i-~~;:~~~~~~~~~
UV
1 nm
IV
400 nm
Q)
"E
750 nm
Microondas
25 11m
Ondas de rdio
1 mm
= 10-
de onda
;.....
h .c
(eq.2)
Onde
e o comprimento
a constante de Plank,
a velocidade da luz
de onda da radiao.
3.1.3 - Cubeta
leituras de amostras, colocadas em diferentes cubetas. Este risco existente na cubeta deve coincidir
com a marca no porta-cubetas.
r-.
I ibJ
~__j~
___~_
~,Jt4
~-~~-i,-L--l_4_)__ ~
3.1.5 - Miliampermetro
o dispositivo que mede a corrente eltrica gerada pela fotoclula. O elemento principal deste
dispositivo um galvanmetro, o qual basicamente constitudo de um m permanente em forma de
ferradura e de uma bobina enrolada em torno de um ncleo cilndrico de ferro, chamada de bobina
mvel (figura 7). A bobiba mvel est localizada entre os plos do m e fixada axialmente, podendo
portanto, girar em torno de seu eixo.
A corrente eltrica a ser medida ( I )passa atravs da bobina criando um campo magntico, que
se ope ao campo
magntico
do m,
fazendo-a
posio,
a qual
digitais.
ESCALA GRADUADA
PONTEIRO
IM PERMANENTE
BOBiNA MVEL
. Fig. 7: Galvanmetro
3.2 - ESPECTROFOTMETRO
Os espectrofotmetros
das radiaes
eletromagnticas
so equipamentos
aos fotocolormetros,
semelhantes
ptico chamado
comprimentos
de onda realizada
(IV) e do
faixas bastante
incidir, por exemplo, um feixe de luz azul atravs de uma soluo, se utilizar uma das tonalidades
azul.
A grade de difrao construda inscrevendo-se
prximas
na superfcie
diferentes
comprimentos
baseia-se
curvam-se
no princpio
funo
muito
dos
do comprimento
de onda.
Assim, em cada linha inscrita no vidro ocorre a refrao da luz e a gerao de um espectro,
um fenmeno de canceiamento
do
havendo
Um anteparo com uma fenda, que se desloca em frente grade, utilizado para separar a faixa
de comprimento
portanto, a
~~~
->-\1'-
.Fenda
---4- .
Fo~e
de luz
'--,
Espelho
cncavo
Feixe
m onocrom
tico
espectrofotmetro
alm de ser utilizado para determinao da concentrao de solues,
tambm utilizado para identificao de substncias em soluo e para determinao do seu grau de
pureza. Arribas aplicaes baseadas no Espectro de Absoro da substncia, grfico que mostra como
a refenida substncia absorve cada um dos comprimentos de onda. A figura 9 apresenta trs exemplos;,
deste orfico.
OXIHEMOGLOBINA
DESOXIHEMOGLOBINA
ca
AZUL DE METILENO
'"'"
'"-e'"
'"e
c:
'ca
c
.o
,ca
ca
o
tn
.c
C/J
Ul
.o
.o
<{
11
IL-+--+- ~
o
'"
'"
8
....
Comprimento
ao
'"
'"
de Onda
Comprimento
ao
'"
o
-e
de Onda
o'
'"
co
o
o
o
. Comprimento de Onda
4 - UTILlZJ\O DO FOTOCOLORMETRO
4.1 - ASPECTO EXTERNO DO FOTOCOLORMETRO
o painel
frontal do fotocolormetro
na figura 10,
do comprimento
incidir sobre a cubeta, girando este controle troca-se o filtro que interposto
cubeta. O filtro selecionado
de
a ser analisada.
O porta-
mecnico interno que bloqueia o feixe de luz sempre que a cubeta for.
PORTA - CUBETAS
T%. ~
.-..
o
100 %
grosso
~
100
0%
410 nm
8 480 nm
o
o
520 nm
660 nm
+ SELETOR
DE FILTRO
580 nm
fino
DE CALlBRAO:
em seu painel. So
T% =
i.100%
(eq. 3)
10
A absorbncia expressa a capacidade que tem uma soluo de absorver uma certa quantidade
de enarqia do feixe de luz incidente e definida matematicamente como o logaritmo da relao entre o
feixe de luz incidente (10) e o feixe de luz emergente (1):
10
log 1
(eq.4)
Baseado nas definies matemticas constatamos que a Transmitncia uma grandeza linear e
varia ele O %, a 100 %. O que significa dizer que 50% est localizado no meio da escala e que se
dividirmos a escala em dez partes iguais cada uma delas representar 10%, conforme figura 11.
T%
a correspondncia
I.,
4.2
RELAO MATEMTICA
ENTRE ABSORBNCIA
E TRANSMITNCIA
10
A - log"-
T%
log l , - log I
~"100
(eq. 6)
10
Aplicando-se
log T% = log
lIo
'\
-100 )
( 1)
=logllo
+logl00
+2
= logl -loglo
= -
(log 10 - log 1) + 2
=-A+2
Assim,
(eq. 5)
2 -logT%
ou
para T%
100
A=O
para T%
10
para T%
=>
=2
=>
nula corresponde
a uma absorbncia
infinita.
(eq. 7)
10
4.3 - CAUBRAO
DO APARELHO
fotocolormetro deve ser calibrado sempre que for ligado, devido a instabilidade dos
componentes pticos e eletrnicos, e durante o uso sempre que o seletor de filtro for acionado, devido
5 - PF~OCEDIMENTO PRTICO
O objetivo desta aula prtica a determinao da concentrao de uma soluo de anilina
utilizando o mtodo fotocolorimtrico, para tal devem ser seguidos o? passos abaixo descritos.
5.1 - PREPARAO
DAS SOLUES
Cinco solues de anilina vermelha, com diferentes concentraes devem ser preparadas a
partir de uma soluo me de concentrao 0,04% (g/100ml).
Sugere-se que seja feita uma diluio seriada com razo dois, seguindo-se o procedimento
abaixo
1) Separar cinco tubos de ensaio;
2) Colocar 5 ml de gua destilada em cada um dos cinco tubos;
3) Colocar 5 ml da soluo de anilina (0,04%) no primeiro tubo obtendo-se uma soluo com volume
final de 10 ml e concentrao 0,02%;
,....
11
concentrao de 0,00125%.
5ml
Diluio seriada
Soluo
me
0.04%
;'
0.02%
0.01 %
0.005%
0.0025% 0.00125 %
5.2 - CONSTRUO
DO ESPECTRO DE ABSORO
Neste item sero obtidos os dados para a construo do grfico Espectro de Absoro
(Absorbncia x Comprimento de Onda). Para isso escolhe-se uma das cinco solues de anilina,
anteriormente preparadas, e mede-se a absorbncia em cada um dos cinco comprimentos de onda
disponveis no fotocolormetro. Deve-se dar preferncia a uma das trs solues intermedirias, pois a
soluo mais diluda e a mais concentrada tendem a apresentar, respectivamente, valores muito baixo e
muito elevado na escala de absrbncia.
Levantados os valores, estes devem ser colocados em uma tabela e depois utilizados para
construo do grfico, em papel milimetrado, conforme modelo abaixo (figura 14).
A
(nm)
410
480
520
580
660
..
12
5.3 - CONSTRUO
DA CURVA PADRO
Neste item sero obtidos os dados para construo da Curva Padro ou Curva de Calibrao,
grfico que relaciona valores de absorbncia com os respectivos valores de concentrao da soluo.
Para isso, fixa-se o comprimento de onda que apresentou maior absorbncia no Espectro de Absoro
(fotopico) e mede-se as absorbncias das cinco solues preparadas anteriormente. Levantados os
valores, estes devem ser colocados na tabela abaixo e depois serem usados para traar o grfico em
papel milirnetrado.
C (g/ 100ml)
0,00125
0,0025
0,005
0,01
0,02
L
c
Fig. 15: Tabela e grfico para Curva Padro.
na determinao
discusso.
de concentraes
5.4 - UTILIZAO
desconhecidas
DA CURVA PADRO
(eq. 8)
..
6 - CUIDJ\DOS
1)
2)
3)
4)
5)
A SEREM OBSE~VADOS
DURANTE
13
OS EXPERIMENTOS
7 - DISCUSSO
Na aula de discusso sero abordados os seguintes tpicos:
1) Construo dos grficos em papel milimetrado.
2) Relao linear entre absorbncia e concentrao: A = kCd.
3) Efeito da concentrao da soluo no Espectro de Absoro.
4) Efeito da utilizao do fotopico na Curva Padro.
5) Rewesso linear.
6) Obteno do Fator de Caiibrao.
8 - BIBLIOGRAFIA
- Campbell,J.M. e Campbell J.B., Matemtica de Laboratrio, 3a ed., Livraria Roca, So Paulo, 1986.
. Carneiro Leo, M.A., Prticas de Biofsica, 2a ed., Editora Guanabara Dois, Rio de Janeiro, 1911,
- Hargreaves, A.B., Mtodos Fsicos de Anlises - Fotocolorimetria e pHmetria - Livraria Atheneu, Rio de
Janeiro, 1D79.
- Heneine, I.F., Biofsica Bsica, Livraria Atheneu, 1993.
- Lehninger, Princpios de Bioqumica, Editora Sarvier, 1995.
Agradecimentos:
Agradecemos
a colaborao, na elaborao desta apostila, das monitoras do Departamento
Biofsica e Radiobiologia: Bianca Samson Reis e Silva e Thayse Neves Santos Silva,
---'---.-- ---_
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