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VEGETALES
1. Plasticidad vegetal
2. Totipotencia
3. Diferenciacin y desdiferenciacin celular
4. Mtodos de propagacin invitro
4.1. Morfognesis indirec
ta
4.2. Embriones adventicios
4.3. Yemas axilares preexistentes
5. Asepsia
TEMA 1B. FACTORES QUE DETERMINAN EL CRECIMIENTO IN VITRO
1. Caractersticas del material vegetal
1.1. Genotipo
1.2. Edad de la planta, rgano, tejido
1.3. Tipo de explanto
1.4. Posicin del explanto
1.5. Estado fisiolgico y fitosanitario
1.6. Origen
1.7. Tamao del explanto
2. Factores nutricionales y hormonales
2.1. Agua
2.2. Azcares
2.3. Micronutrientes y macronutrientes
2.4. Reguladores del crecimiento
2.4.1. Auxinas
2.4.2. Citoquininas
2.4.3. Giberelinas
2.4.4. cido abscsico
2.4.5. Balance Auxinas/Citoquininas
2.5. Otros compuestos
2.6. Agar
2.7. Potencial osmtico y pH
3. Factores ambientales
3.1. Interaccin de factores
TEMA 1C: TRASPLANTE A CONDICIONES EXVITRO
1. Condiciones de cultivo invitro
1.1. Movimiento del agua en la planta
2. Causas del fracaso en el trasplante de las plantas obtenidas invitro
2.1. Factores que afectan a las relaciones hdricas de las plantas
2.2. Factores que afectan a la fotosntesis invitro.
2.2.1. Factores internos
2.2.2. Factores externos
3. Aclimatizacin previa al trasplante
3.1. Procesos de la aclimatizacin
TEMA 2A: POTENCIAL BIOQUMICO DE LAS PLANTAS. CULTIVO CELULAR
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1. Introduccin
2. Iniciacin y establecimiento de una suspensin celular
3. Cultivo de clulas en suspensin
3.1. Sistemas estticos o cerrados
3.1.1. Dinmica del crecimiento en cultivos estticos
3.2. Sistemas dinmicos o abiertos
4. Cultivos a gran escala: Biorreactores
4.1. Factores a considerar cuando una suspensin celular se cultiva en
grandes volmenes
4.2. Componentes de un biorreactor
4.3. Medio de cultivo
5. Aplicaciones
TEMA 2B: POTENCIAL BIOQUMICO DE LAS PLANTAS
1. Introduccin/Historia
2. Regulacin de la produccin invitro de metabolitos secundarios
2.1. Factores biolgicos
2.1.1. Crecimiento
2.1.2. Diferenciacin
2.1.3. Compartimentacin
2.1.4. Variacin en la actividad biosinttica
2.2. Factores ambientales
3. Optimizacin de la produccin invitro de metabolitos secundarios
3.1. Seleccin clonal
3.2. Precursores
3.3. Elicitores
3.4. Cultivo de clulas inmovilizadas
4. Transformacin gentica
5. Biotransformacin
5.1. Obtencin de rendimientos industriales
6. Avances y perspectivas
TEMA 3A: CULTIVO DE PROTOPLASTOS E HIBRIDACIN SOMTICA
1. Introduccin
2. Aislamiento y purificacin
2.1. Material inicial
2.2. Mtodos de aislamiento
2.3. Purificacin
2.4. Comprobacin de la viabilidad
3. Cultivo y desarrollo
3.1. Medio de cultivo y condiciones fsicas
3.2. Cultivo de protoplastos
4. Mtodos de hibridacin somtica
4.1. Fusin qumica
4.2. Electrofusin
4.3. Factores que determinan la fusin
4.4. Productos de fusin
5. Seleccin tras la fusin
2
2. Totipotencia
Otro concepto importante relacionado con el tema de la plasticidad es la
totipotencia vegetal: es la capacidad que tiene una clula de crecer y multiplicarse
y diferenciarse dando lugar a un individuo concreto.
NO todas las clulas animales son totipotentes, en el caso de las plantas todas
las clulas son totipotentes, es decir, todas las clulas vegetales tienen la informacin
gentica necesaria para poder desarrollar un individuo concreto a partir de ellas
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aunque no lo manifiesten.
Cmo regenerar o generar una planta a partir de una clula? Aislamos una
clula de una zanahoria (por ejemplo) que dar lugar a un embrin y producir, al
cabo de un tiempo, una nueva zanahoria (Fig. 1). Para que esa clula se transforme en
una planta entera es necesaria la presencia de estmulos (por lo general son
compuestos: cules deben ser y a qu concentracin tienen que estar)
organognesis o a la embriognesis.
Procedimiento para la organognesis: sobre la superficie celular del callo
encontramos clulas meristemticas superficiales, a partir de stas clulas se
desarrollan las yemas y tallos. En la organognesis indirecta, en funcin de lo que se
desarrolle, hablamos de: caulognesis o formacin de tallo, y rizognesis o formacin
de races.
Ej: A partir de mdula de tabaco, la sembramos y al cabo de un tiempo tenemos
un callo que producir un tallo (caulognesis)
Caulognesis en tabaco
La embriognesis somtica es la otra variacin morfolgica, adems de la
organognica. En las plantas no se forman de manera natural embriones, pero
podemos obtener embriones a partir de una clula somtica (esto es lo que se conoce
como embriognesis somtica).
La nica diferencia entre la embriognesis cigtica y la somtica es el choque
inductor (de esa embriognesis): para los animales el choque es la fusin de gametos
y para las plantas la presencia de auxinas en el medio de cultivo, que har que un
callo se convierta en un embrin somtico.
Por lo dems son idnticas y las fases de desarrollo son iguales (Fig 2): a partir
de una clula, sta se multiplica y se forma un agregado celular que dar lugar a un
embrin globular, ste a su vez sufre un proceso de polarizacin (va madurando y se
distinguen dos polos: pice radicular y caulinar - se dice que est en fase de corazn
por la forma que tiene). Posteriormente el embrin sigue desarrollndose y la parte
que est debajo de los cotiledones se alarga (fase de torpedo: aqu se empiezan a
diferenciar los diferentes tejidos: como los vasculares, que darn lugar al xilema y
floema). Finalmente se nos formar una planta.
5. Asepsia
La asepsia es uno de las aspectos ms importantes del cultivo invitro. La
contaminacin que nos podemos encontrar en cultivo invitro se debe,
fundamentalmente, a hongos y bacterias. Estos seres son omnipresentes. Si una
bacteria cae sobre un tubo o cultivo, se encontrara en condiciones ideales para crecer,
va a proliferar y va a acabar con nuestra planta (no permiten que el explanto se
desarrolle correctamente).
Por eso es muy importante mantener condiciones de asepsia: hay que
esterilizar los instrumentos y todo el material con el que trabajamos: esterilizar el
medio de cultivo, esterilizar el rea de trabajo (cmara de flujo laminar) y finalmente
desinfectar el material antes de empezar a trabajar con l.
Se suele emplear hipoclorito sdico como agente desinfectante: la
concentracin y tiempo de desinfeccin depende del explanto, del tejido (si es
sensible o no) y tambin depende de su origen (los rganos subterrneos tienen
mayor contenido microbiano y hay que esmerarse ms en desinfectar)
1.6. Origen
2.2. Azcares
Los hidratos de carbono son esenciales porque las clulas no pueden realizar la
fotosntesis mientras estn siendo cultivadas in-vitro, son hetertrofas en ese estado
porque:
- Puede que se est cultivando un explanto que no es fotosintticamente activo
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Los reguladores son compuestos clave que van a permitir el desarrollo del
cultivo hacia una ruta morfognica u otra.
Las hormonas (citohormonas) son compuestos orgnicos que se encuentran
presentes de forma natural en las plantas y que regulan el crecimiento y el desarrollo
de sus rganos. Habitualmente se encuentran en una concentracin muy baja en la
planta, y normalmente ejercen su funcin en un lugar distinto al de su sntesis.
Existen compuestos sintticos con las mismas propiedades que las hormonas
pero que adems tienen otras ventajas: son mucho ms estables (no se degradan con
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facilidad) y ms activos (se requiere menos concentracin), y por ello son mucho ms
usados en los cultivos in-vitro que las hormonas naturales.
El conjunto de hormonas y estos compuestos sintticos anlogos a ellas se
denominan reguladores de crecimiento, y los dos grupos ms empleados son las
auxinas y las citoquininas.
Por otro lado, ya en desuso, se empleaban mezclas indefinidas de sustancias
(zumo de pomelo, leche de coco..) para aadirlas al medio de cultivo porque vean que
funcionaban bien. Son compuestos de composicin desconocida y muy variable, y por
eso su uso no es prctico.
2.4.1. Auxinas
El cido 3-Indolactico (AIA) es la auxina natural que se encuentra en las
plantas (generalmente en el tallo pero ejerce su efecto a nivel de la raz), mientras
que en el cultivo in-vitro se suelen emplear las sintticas (IBA, NAA). El AIA es muy
sensible a las peroxidasas, al pH bajo, etc. sin embargo las sintticas son mucho
menos sensibles y adems son ms eficaces a menor concentracin. Habitualmente
se suelen preparar en soluciones stock. Son insolubles en agua, por lo que es
necesario disolverlas en etanol o agua bsica (con NaOH).
Funciones:
- Inducen el crecimiento de la raz.
- Inducen la dormancia apical. La dormancia es el perodo del ciclo biolgico en el
que las funciones de crecimiento, desarrollo y actividad fsica cesan temporalmente.
- Inducen la divisin y la elongacin celular.
2.4.2. Citoquininas
La Zeatina es la citoquinina natural que se sintetiza en la raz (pero ejerce su
funcin a nivel del tallo). El resto son sintticas y se emplean muchsimo ms (BAP o 6BenzilAminoPurina). Tambin se preparan en soluciones stock y son insolubles en
agua, por lo que hay que disolverlos en agua cida (HCl) a diferencia de las auxinas.
Funciones:
- Inducen la formacin de los tallos adventicios.
- Inhiben la dormancia apical.
- Inducen la divisin celular (especialmente en combinacin con auxinas)
2.4.3. Giberelinas
No son muy habituales en los medios de cultivo. Se emplean en cultivos
especficos.
Funciones:
- Elongacin del tallo.
- Rompen la dormancia de embriones y semillas.
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2.6. Agar
Los medios de cultivo pueden ser lquidos, semislidos o slidos. El agar es un
ejemplo de un medio de cultivo slido.
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hdrico que hace referencia a la fuerza con la que los solutos, presentes en un
medio de cultivo, retienen el agua. El agar contribuye al potencial osmtico
hacindolo muy negativo (0 es poca retencin // muy negativo es indicatorio de
mucha retencin). Es inevitable que el potencial osmtico sea negativo en un
medio de cultivo porque hay muchos nutrientes pero hay que evitar, en la
medida de lo posible, que no se acerque a 0 . La idea es que si el potencial
osmtico es muy negativo, el medio retendr el agua con tanta fuerza que la
planta no va a poder absorberla, por ello es bueno que el potencial osmtico
sea prximo a 0, para que el agua pueda ser absorbida por la planta y no quede
retenida en el medio.
3. Factores ambientales
Los factores ambientales en el interior del recipiente de cultivo son funcin del
exterior. La radiacin en el interior depende de la que haya fuera; lo mismo pasa con
la temperatura.
Por tanto es importante controlar estos factores ambientales ya que afectarn
directamente al desarrollo del cultivo.
Los factores ambientales invitro que tienen efecto en el crecimiento, desarrollo y
morfognesis se pueden dividir en 2:
1.
Factores ambientales de la parte area: luz, temperatura, oxgeno,
etileno, difusin de aire (movimiento), presin.
2.
Factores ambientales de las races: potencial hdrico, temperatura,
difusin de gas en el lquido, compactacin del medio, componentes qumicos, pH,
oxgeno disuelto.
Temperatura: est en torno a los 22C. Hay que tener en cuenta que son
22 en el exterior del tubo. La temperatura en el interior ser 2 o 3 grados ms
que la del exterior (25C aprox). Puede mantenerse constante a lo largo del da
o con termoperiodos: temperaturas diferentes por el da que por la noche (esto
ocurre en la naturaleza). El termoperiodo es crtico en algunas especies: si no
hay termoperiodo no forman races (por ejemplo).
Luz: hay tres aspectos a tener en cuenta. La intensidad (irradiancia), la
calidad (composicin espectral) y el fotoperiodo.
No se sabe demasiado del efecto fotoperiodo en desarrollo
invitro pero se suele mimetizar lo que ocurre en la naturaleza (14h de
luz). Hay procesos que requieren oscuridad total (las primeras fases de la
embriognesis)
La intensidad luminosa o irradiancia es muy baja
habitualmente. No se puede cultivar invitro a la misma intensidad
luminosa que hay en el ambiente exterior por dos motivos: las plantas se
achicharran de calor (adems de que es imposible alcanzar la misma
intensidad lumnica que el sol) y se daa el aparato fotosinttico (se
inhibe la fotosntesis). Si el explanto es fotosintticamente no activo, le
da igual no tener luz (no va a necesitar la fotosntesis), pero si es
fotosintticamente activo, como la patata, nos podemos permitir
aumentar un poco la intensidad luminosa para que realice correctamente
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la fotosntesis
La composicin espectral o la calidad de la luz: afecta a dos
procesos. Afecta a la fotosntesis y a la morfognesis o desarrollo de
rganos. La radiacin ultravioleta tiene efecto fotodestructivo y aumenta
el calor. La radiacin fotosintticamente activa (380-710: rango de
longitudes que la planta emplea para realizar la fotosntesis // 400-460:
azul // 620-680: roja): tiene efecto significativo a nivel de la
morfognesis. El infrarrojo (750-4000) tiene efecto morfognico y
aumenta la temperatura. La longitud de onda que llega al tubo no es
idntica a la de origen (dependiendo de los materiales que tenga que
atravesar, se nos modificar un poco el espectro de luz)
Humedad relativa: si es muy alta no se van a cerrar los estomas. En
invitro es 100% (saturante). En la cmara de cultivo no se suele controlar la
humedad. La humedad que haya en la cmara va a modificar la humedad de los
tubos, pero hay que evitar que no sea excesiva en la cmara porque acarrea
problemas de contaminacin.
El oxgeno: depende de la concentracin exterior (exvitro), de la
velocidad de difusin al tubo (recipiente de cultivo), y de cmo se bifurca en el
agar y en los tejidos. La concentracin en el exterior es elevada y va
disminuyendo a medida que se adentra en el tejido. Para comprobar la
composicin gaseosa se utilizan unos aparatos que agitan la atmsfera para
que el oxgeno se renueve.
El CO2: aumenta por la noche. Cuando realiza la fotosntesis (por el da)
no hay apenas niveles de CO 2 (se utiliza para la fotosntesis). Para que un
cultivo sea auttrofo se requiere un mnimo de 65 micromoles de CO 2. Cuando
amanece, el CO2 acumulado se agota rpidamente porque comienza la
fotosntesis y al no quedar CO2, se para. La planta tendr que esperar hasta la
noche para acumular CO2 y tendr que esperar hasta el siguiente da para
hacer la fotosntesis.
Etileno: los explantos sintetizan etileno de forma natural. El
inconveniente es que su acumulacin es daina para el cultivo.
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El potencial hdrico refleja la fuerza con la que el suelo retiene agua. Tiene 3
componentes: potencial osmtico, de presin y matricial. La suma de estos tres
componentes da lugar a un valor que es siempre negativo (va de 0 a menos infinito).
Cuanto ms negativo es, mayor es la fuerza con la que retiene agua.
El agua siempre se mueve siempre hacia potenciales ms negativos (de
potenciales hdricos cercanos a 0 a otros ms negativos). Esto es lgico ya que si el
potencial hdrico es muy negativo, y por tanto el agua est muy retenida, no ir hacia
sitios donde est menos retenida (precisamente porque est retenida)
El movimiento de agua en la planta siempre ser suelo-planta-atmsfera puesto
que el orden de potencial hdrico es: suelo>raz>tallo>hojas>atmsfera (se cuantifica
siempre el valor absoluto del potencial, es decir, segn ese orden de potenciales, la
atmsfera tiene el potencial hdrico ms bajo, pero no quiere decir que sea cercano a
0 sino todo lo contrario, que es muy negativo. Por el contrario el suelo tendr el
potencial hdrico ms cercano a 0)
Cuanto mayor sea la diferencia entre el potencial hdrico entre el suelo y la
atmsfera, mucho ms fcil se mover el agua a travs de todo el sistema.
A travs de los estomas, el agua sale a la atmsfera. Este proceso se llama
transpiracin. Es necesario que los estomas estn abiertos.
En un ambiente exvitro la diferencia de potencial hdrico entre el aire y el suelo
(es decir, la diferencia entre el potencial hdrico del aire menos el potencial hdrico del
suelo) es de casi 100 megaPascales.
En un ambiente invitro, el potencial hdrico del medio de cultivo no es 0: es 0.4
megaPascales. Hay -1.4 MPa en la parte area (invitro) y -1 MPa en el medio de
cultivo, por tanto: 1.41=0.4 MPa . Como el gradiente de potencial es muchsimo
ms pequeo que en exvitro, hay muy poca transpiracin y hay dificultad para
absorber nutrientes a travs de las races.
transpiracin.
A menor CO2, menor actividad fotosinttica.
A menor intensidad de luz, menor actividad fotosinttica.
La presencia de sacarosa hace que la fotosntesis se vea inhibida.
El potencial osmtico es negativo e inhibe la absorcin de agua y
nutrientes (esta dificultad de absorcin tambin viene favorecida por un bajo
tirn transpiratorio). El tirn transpiratorio se traduce en la velocidad con la
que circula el agua a travs del sistema sueloplantaatmsfera. Cuanto
mayor sea el tirn respiratorio, es decir, cuanto mayor sea la diferencia de
potencial hdrico, tanto mayor ser la velocidad con la que circule el agua.
Tambin hay cambios en la composicin de las ceras: las invitro tienen una
enorme proporcin de lpidos polares en relacin a una exvitro donde la proporcin de
grupos polares es menor. Esto indica que los lpidos invitro son menos hidrfobos y por
tanto ms permeables al agua.
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1. Introduccin
El primer cientfico que intent obtener cultivos celulares fue Haberlandt en 1902
(principios del siglo XX). Este cientfico fue el primero en estudiar esto y fracas
porque empez por lo ms difcil: el cultivo celular (es ms fcil cultivar un callo o un
tejido que iniciar un cultivo celular). No obstante los intentos que realiz sirvieron de
experiencia para el resto de cientficos.
No fue hasta los aos 70 que no se logr obtener el primer cultivo celular.
Aplicaciones (Para qu sirve un cultivo?):
Puede ser un sistema para realizar estudios bsicos de metabolismo
celular.
Puede servir como mtodo de micropropagacin de plantas (obtencin de
rganos y plantas)
Puede ser empleado con fines industriales (obtencin de sustancias de
alto valor aadido). Nos vamos a centrar en esta aplicacin.
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El biorreactor tiene una entrada de medio de cultivo (que lo renueva) y una salida
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5. Aplicaciones
Una vez que tenemos nuestro cultivo, se realiza una seleccin de lneas celulares
(seleccionamos la que nos interese) y la seleccin debe realizarse en base a distintos
criterios (en funcin del objetivo que tengamos):
Un objetivo puede ser obtener plantas con significacin agronmica: obtener
plantas con tolerancia al estrs o para mejorar sus caractersticas nutricionales.
Otro objetivo (ms interesante) es disear lneas celulares aptas o adecuadas
para aplicaciones industriales.
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1. Introduccin/Historia
Las plantas se han empleado para curar enfermedades desde la antigedad
(2500 a.C, el chino Pen tsao). En 1500 apareci el papiro de Ebers con 500 remedios
basados en plantas medicinales.
A principios de siglo XX la industria farmacutica se encontraba dominada por la
sntesis qumica de compuestos.
En la dcada de los 70 irrumpe la biologa molecular en la industria farmacutica
mediante la ingeniera gentica. Gracias a sta se obtienen compuestos que eran muy
complicados de extraer o de sintetizar. En este momento se desarrollan sistemas de
cultivo de levaduras y hongos para la sntesis de estos compuestos.
Ms recientemente se emplean cultivos vegetales para la obtencin de estos
productos. Estos productos vegetales presentan ventajas frente a los animales: no
presentan contaminacin por priones, ventajas en determinados sistemas
microbianos...
En los ltimos aos se utiliza el concepto de plantas como biorreactores para la
sntesis de un amplio abanico de compuestos como vacunas, productos teraputicos,
nutrientes, etc.
Qu tipo de molculas podemos obtener? Por un lado tenemos compuestos
sintetizados de forma natural por las plantas (metabolitos secundarios). Adems de
estos metabolitos secundarios, mediante transformacin gentica (produciendo genes
exgenos a las especies vegetales), podemos hacer que la planta sintetice protenas
recombinantes para vacunas, anticuerpos, frmacos, etc), as como otro tipo de
compuestos como carbohidratos, lpidos de inters biosanitario e industrial (todo
esto se ve en el tema 3).
Nos centramos en la obtencin de metabolitos secundarios. El metabolismo
secundario es aquel que no es primario. El metabolismo primario es aquel que va
dirigido a la sntesis de aminocidos, protenas, nucletidos, cidos nucleicos,
azcares simples, cidos grasos, etc.
En los metabolismo secundario se sintetizan: alcaloides, terpenos, polifenoles,
etc, estos compuestos tienen la particularidad de que son especficos de cada especie,
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2.1.2. Diferenciacin
La diferenciacin celular est estrechamente ligada a la sntesis de metabolitos
secundarios. No obstante, podemos iniciar una suspensin celular de una especie
vegetal y observar que el metabolito secundario que buscbamos no aparece (invitro
no sintetiza el metabolito que buscbamos).
Por qu ocurre esto? En primer lugar, hablbamos de que muchas veces este
tipo de compuestos se sintetizan en rganos especializados (los azcares se sintetizan
en las glndulas; los alcaloides aromticos en la raz...) y en un cultivo celular no hay
rgano ni tejido ni nada.
Las clulas, cuando se encuentran formando parte de un tejido, se encuentran en
un ambiente muy particular y diferente al ambiente que rodea a una clula en un
cultivo celular. Ese cambio de ambiente pueden provocar que el cultivo celular no
sintetice el metabolito que estemos buscando.
La sntesis de metabolitos secundarios est ligada a la diferenciacin
celular, en un cultivo celular no disponemos de tejido diferenciado y esto afecta a
nuestra sntesis.
Uno de los retos actuales es poder desacoplar los mecanismos tan complejos que
regulan o que conexionan la diferenciacin celular con la produccin de metabolitos
secundarios. Una vez desacoplado, podremos cultivar clulas y obtener los
metabolitos que buscamos.
2.1.3. Compartimentacin
La ruta de sntesis de muchos metabolitos secundarios est compartimentada
celularmente e incluso tisularmente, es decir, que parte de la ruta (o toda) puede
darse en varios tejidos.
Ejemplo: los alcaloides indlicos tienen su importancia por su accin tumoral. Su
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1. Condiciones fsicas
a. Luz, temperatura, pH, aireacin y agitacin (especialmente
importante en los biorreactores).
b. Densidad de cultivo: en funcin de la densidad de clulas en
el cultivo el CO2 estar ms o menos limitado, la densidad afecta al
exudado de compuestos al medio y a la disponibilidad de nutrientes (a
mayor nmero de clulas, menor disponibilidad)
2. Formulacin del medio de cultivo
a. Reguladores del crecimiento: influye el tipo y la
concentracin de auxinas y de citoquinas. La sntesis de nicotina est
inhibida por la presencia de auxina, pero est estimulada por la presencia
de citoquinas.
b. Nutrientes presentes en el medio, nitrgeno, carbohidratos,
fsforo.
3. Optimizacin
secundarios
de
la
produccin
invitro
de
metabolitos
3.2. Precursores
3.3. Elicitores
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Los metabolitos secundarios suelen tener una funcin ecolgica (se sintetizan
frente a un estrs, frente al ataque de un patgeno, etc). Los elicitores son
compuestos o factores que interactan con receptores de la planta, activando en
ella respuestas de defensa (generalmente metabolitos, que sern de inters) y la
reaccin de hipersensibilidad. Pueden ser:
1. Agentes abiticos: metales pesados, radiacin UV, presin osmtica
(aadir alta concentracin de sales), ultrasonido, metil violgeno (es una
molcula qumica que se emplea en investigacin porque provoca estrs
oxidativo).
2. Agentes biticos: extractos de paredes de hongos o bacteria. Los
metabolitos secundarios se sintetizaban frente al ataque de una bacteria (la
bacteria o un extracto de la misma sera el elicitor); si aadimos al medio un
extracto de un componente de la bacteria, la planta reconoce esa parte y
sintetiza el metabolito de inters, que ser un antibitico natural frente a esa
bacteria. La ventaja que tiene es que el extracto del componente del hongo o
bacteria no es daino para la planta.
Ancdota: el revidox es un complemento alimenticio que est compuesto a base de
resveratrol (es un compuesto fenlico, es decir, es un metabolito secundario y lo
sintetizan pocas especies vegetales como el cacahuete: Arachis hypogaea). La planta
sintetiza el resveratrol frente al ataque de hongos. Un elicitor potente del resveratrol
es la radiacin UV: la radiacin UV aumenta la produccin de resveratrol.
Este tipo de cultivo no es una suspensin celular. Los hay de dos tipos:
Cultivo en lecho plano: un recipiente con una membrana permeable
sobre la que se disponen las clulas; el medio de cultivo cae por la parte
superior y es recogido en la parte inferior de la membrana (membrana basal).
En el cultivo en columna las clulas se encuentran retenidas en un gel
(funcionamiento similar al anterior. En el cultivo en columna se pueden usar
dos tipos de materiales:
Polimerizacin activa de geles: se emplean geles como el
agar, alginatos, poliacrilamida y agarosa. Se aade agar en polvo a la
suspensin celular y una vez que se disuelve se deja enfriar y solidifica
con las clulas embebidas dentro de l.
Polimerizacin pasiva: se utiliza una espuma de poliuretano
o una membrana de fibra hueca, es decir, un soporte con poros en los
que las clulas van a quedar retenidas.
Ventajas de la inmovilizacin de clulas
Facilidad de manipulacin (el intercambio de medio de cultivo se produce
apenas sin prdidas: no se pierden clulas al ser un sistema cerrado). Adems
permite hacer tratamientos secuenciales de forma ms sencilla (cuando
interesa que las clulas crezcan ponemos medio de cultivo; cuando interesa que
crezca un metabolito concreto se cambia el cultivo, etc. Todo segn lo que se
necesite)
Contacto entre clulas: en estos cultivos de clulas inmovilizadas las
clulas estn en contacto unas con otras y puede haber una comunicacin
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4. Transformacin gentica
Qu estrategias se pueden seguir para aumentar el rendimiento mediante
transformacin?
Podemos completar rutas metablicas mediante insercin de genes
heterlogos: insertamos el gen que codifica enzimas necesarias para el
metabolito.
Amplificar rutas normales (con esto se aumenta el nivel de expresin de
las enzimas de la ruta)
Bloquear rutas alternativas para maximizar el rendimiento (se evita
ramificacin de la ruta principal de inters).
Bloquear rutas de degradacin o catablicas.
Neutralizar mecanismos de retroalimentacin negativa por acumulacin
de producto.
Modificar los mecanismos de secrecin y exportacin: favorecer que el
metabolito salga de la clula.
5. Biotransformacin
No tiene nada que ver con la transformacin gentica. La clula vegetal posee
una maquinaria bioqumica muy compleja de tal manera que puede producir una gran
cantidad de compuestos qumicos.
Algunas de las rutas son imposibles de realizar en el laboratorio (de forma
sinttica) como la glucosilacin. Con la biotransformacin se pretende aprovechar
este potencial bioqumico de la planta que no se puede mimetizar en el laboratorio.
La biotransformacin consiste en la transformacin por parte de la planta (de las
clulas vegetales) de un compuesto orgnico en otro compuesto orgnico ms
complejo y con un mayor valor aadido. Lo interesante de la biotransformacin es que
cuando biotransformamos un compuesto orgnico, ste no tiene porqu estar
presente en la planta (podemos glucosilar un compuesto qumico sinttico, es decir,
que no sea conocido por la planta).
La Papaver somniferum puede transformar codeinona en codena
mediante una hidroxilacin. Si este sistema se realiza en un sistema de clulas
inmovilizadas, se aumenta el rendimiento en un 73%.
La Mallotus japonicus permite transformar el cido saliclico en la salicina
mediante glucosilacin. La salicina tiene una accin mucho ms potente.
6. Avances y perspectivas
El cultivo de clulas vegetales permite la obtencin de compuestos de
inters biosanitario con un rendimiento igual o superior al cultivo invitro.
Se han descubierto nuevas sustancias (no se produce el metabolito que
esperbamos pero se produce otro nuevo que puede ser mejor).
Se ha conseguido obtener compuestos en ausencia de organizacin
celular.
La biotransformacin es una de las reas ms prometedoras de la
biotecnologa vegetal.
A da de hoy podemos encontrar plantas como biofactoras para la sntesis de
compuestos de inters.
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2. Aislamiento y purificacin
2.1. Material inicial
2.3. Purificacin
Tras la digestin se debe pasar por filtros e incubaciones para eliminar restos de
tejido y de pared.
viables)
2. Test de actividad metablica: medicin de niveles de oxgeno
consumidos (electrodos) o de CO2 producido para ver la actividad celular.
3. Observacin de ciclosis: la ciclosis son las corrientes citoplasmticas.
La visualizacin de estas corrientes a microscopio indican protoplastos viables.
3. Cultivo y desarrollo
3.1. Medio de cultivo y condiciones fsicas
4.2. Electrofusin
Consiste en la fusin de los protoplastos mediante descargas elctricas.
Se colocan los protoplastos en una cmara de fusin, con dos electrodos que van
unidos a dos generadores de corriente: uno de corriente alterna y otro de corriente
contnua. En primer lugar se produce una descarga de corriente alterna de baja
intensidad, con esto se consigue que los protoplastos comiencen a migrar dentro de la
cmara de fusin (como en una electroforesis) y se alinean uno detrs de otro
formando una estructura de collar de perlas. Luego se aplica un pulso de corriente
continua de alta intensidad, y eso va a provocar que en las membranas plasmticas se
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formen unos pequeos poros a travs de los cuales se va a dar la fusin de los
protoplastos. Esos poros son reversibles y se forman puntualmente (despus de la
fusin se regeneran). Es mucho ms efectivo que la fusin qumica (40-50%), no hay
problemas de citotoxicidad pero es necesario tener la cmara de fusin.
regenerar la planta.
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3. Plantas biofactora
Dentro de la tercera generacin hablamos de plantas como biofactora que tiene
como objetivo la obtencin de protenas u otro tipo de productos de inters
teraputico o industrial.
Presenta una serie de ventajas: un alto rendimiento (se puede producir
una enorme cantidad de biomasa), permite obtener protenas animales con
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2. Transformacin
Elementos bsicos para la obtencin de plantas transgnicas: genes
caracterizados, promotores potentes, marcadores, construccin del vector y la propia
tcnica de transformacin.
2.3 Marcadores
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del T-DNA del plsmido Ti podan operar perfectamente sin estar en un mismo
plsmido, se desarrollaron los vectores binarios. Tenemos dos plsmidos, que se
insertan en Agrobacterium: el primero es un plsmido Ti desarmado (solo tiene la
regin vir, que es lo que interesa), y por otro lado se tiene un plsmido ms pequeo
en el que se incluye el transgn flanqueado por los bordes izquierdo y derecho que
ser reconocido por las protenas de la regin vir. Una vez interaccione la
acetosiringona y se expresen los genes vir, se cortarn los bordes, se sintetizar la
hebra-T, se formar el complejo con vir-E2, pasar al ncleo vegetal y se expresar el
gen de inters. Ventajas: se emplean plsmidos ms pequeos, por tanto ms
estables y ms fciles de manipular.
Inoculacin
Cmo lo inoculamos en la planta y qu caractersticas tiene que tener el explanto? El
explanto puede ser una suspensin de protoplastos, suspensin celular, un callo, un
rgano, etc.
La inoculacin se puede hacer de varias maneras:
- Herir la planta e infectarla in vivo, o decapitar semillas y sumergirlas en una
suspensin con Agrobacterium. Aqu en la herida se sintetiza acetosiringona.
- Co-cultivo de protoplastos en suspensin con Agrobacterium. Hay que aadir de
forma exgena la acetosiringona en este mtodo y el siguiente.
- Cultivo de protoplastos en suspensin con Agrobacterium.
- Una forma de inoculacin sencilla con Arabidopsis: se puede aplicar una
suspensin de Agrobacterium en la inflorescencia, ah van a desarrollarse las semillas
y la bacteria infectar directamente a los cigotos. Se obtienen semillas transformadas.
2.4.2. Transferencia directa de genes
La principal desventaja del anterior mtodo es que Agrobacterium solamente
infecta a especies dicotiledneas (espectro pequeo, quedan fuera todas las
monocotiledneas). Se idearon otros mtodos que permitieran transformar
genticamente especies monocotiledneas.
Transformacin biolstica
Consiste en bombardear el tejido vegetal, con las clulas vegetales, con unos
microproyectiles (de 0.1 micras de dimetro), suelen ser de oro o tungsteno, y van a
estar recubiertos de DNA (concretamente plsmidos con nuestro transgn). Gracias a
un impulso conseguido con He o H2 se lanzan estos microproyectiles, alcanzando
velocidades de 100 m/s, y penetran en el tejido vegetal hasta el ncleo de las clulas
y depositan ah los plsmidos. Los plsmidos se integran en el genoma vegetal y
comienzan a expresarse. El tejido empleado para esta transformacin puede ser
desde una suspensin de protoplastos, de clulas, fragmento de tejidos hasta una
planta completa o un callo.
Ventajas con respecto al mtodo anterior: permite transformar especies
monocotiledneas.
Desventajas: en primer lugar es que existen especies que son reticentes
a ser atravesadas por estos microproyectiles (con paredes celulares muy
gruesas o con cutculas gruesas); se introducen un elevado nmero de copias
del transgn en cada clula (se bombardean miles de proyectiles con plsmido),
y puede provocarse silenciamiento gnico; y que el porcentaje de
transformacin es muy bajo (eficiencia baja).
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Transformacin de protoplastos
Los protoplastos, al carecer de pared celular, son capaces de incorporar
elementos externos por endocitosis. Existen mtodos para favorecer que los
protoplastos endociten plsmidos del medio de cultivo. Mtodos:
- Electroporacin (recordar fusin de protoplastos mediante corriente
elctricas): En este caso se aplica un pulso de corriente continua de alta intensidad
para formar poros en la membrana, da igual si se alinean o no porque ese no es el
objetivo.
- Tratamiento qumico: se consigue desestabilizar la membrana plasmtica
para favorecer la incorporacin del plsmido. Se aplica PEG, por ejemplo.
Inconvenientes de la transformacin de protoplastos: el principal inconveniente
proviene de la utilizacin de protoplastos, que suelen venir de unas pocas especies
capacitadas, llamadas especies de lite (ya que es una tcnica de cultivo muy
sofisticada); es muy complejo regenerar una planta a partir de un protoplasto, por lo
tanto si se desea transformar un protoplasto para conseguir una planta, va a ser muy
difcil. Tercer inconveniente: la baja eficiencia del proceso.
Microinyeccin
A partir de un porta en el que hay una suspensin de protoplastos o clulas, se va
clula a clula introduciendo los plsmidos en su interior. Inconveniente: tcnica muy
compleja y tediosa, con un bajo porcentaje de transformacin (a diferencia de los
mtodos directos) que puede llevar das y semanas en llevarla a cabo. Adems, si se
emplean protoplastos existen todos los inconvenientes inherentes a ellos.
2.4.3. Mtodos indirectos vs mtodos directos
En el cuadro se reflejan las diferencias principales entre los dos tipos de transferencia
(muy importante).
- Especies a transformar: Agrobacterium permite transformar bsicamente
dicotiledneas y muy pocas monocotiledneas. Sin embargo, el mtodo biolstico
puede aplicarse a cualquier especie vegetal.
- Eficiencia en la transformacin: La eficiencia con Agrobacterium es muy alta, en los
mtodos directos el rendimiento es muy bajo.
- Tipo de integracin del transgn en el genoma vegetal: Con Agrobacterium la
integracin del DNA se realiza al azar en regiones con transcripcin, el nmero de
copias integrado es muy bajo (se colocan de forma independiente en el genoma), y es
precisa (solamente se inserta el T-DNA junto a la protena E2). Con el mtodo biolstico
la integracin es totalmente al azar, el nmero de copias integrado es muy alto
(propensas al silenciamiento gnico) y se colocan en tndem (una copia tras otra), y
es una integracin imprecisa (DNA parcialmente degradado)
- Construccin de vectores: Con Agrobacterium es una construccin compleja
(cointegracin, plsmido grande e inestable) mientras que en el mtodo directo es
mucho ms simple ya que los plsmidos son mucho ms pequeos.
- Dependencia del genotipo vegetal: Con Agrobacterium hay una gran dependencia
porque tiene que haber compatibilidad (dicotiledneas). El mtodo directo tiene
menos restricciones.
Ventajas
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Los plastos son orgnulos con material gentico propio (plastoma), y ste consiste en
mltiples copias de un DNA circular de doble cadena llamado nucleoide (100
nucleoides).
Tipos
de
plastos:
cromoplastos,
leucoplastos
(amiloplastos,
oleoplastos,
proteinoplastos y cloroplastos. Los cloroplastos se han podido transformar de manera
ms efectiva.
2.6.1. Ventajas respecto de la transformacin nuclear
- Hiperexpresin: para una clula que tiene 100 cloroplastos (con 100 nucleoides cada
uno) se obtienen miles de copias del gen por clula (10.000 en este caso).
- No se han descrito casos de silenciamiento gnico en este tipo de transformacin.
- Herencia materna y contencin gnica: los plastos, al igual que el resto de orgnulos,
se hereda va materna. Cuando el grano de polen fecunda al oocito se eliminan los
rganos del polen y as se evita el escape de genes va polen.
- No hay efectos pleiotrpicos: las protenas codificadas por el genoma del cloroplasto
se sintetizan en el propio cloroplasto, ya que tiene sus propios ribosomas, y se quedan
en el orgnulo. As no se produce citotoxicidad celular.
- No hay efectos de posicin: en este caso la insercin del gen NO es al azar sino que
se produce en lugares concretos del nucleoide porque esa insercin se hace por
recombinacin homloga.
Protenas expresadas utilizando transformacin de cloroplastos de tabaco (diapositiva)
2.6.2. Inconvenientes de la transformacin de cloroplastos
- Riesgo de transferencia horizontal de genes a bacterias debido a la homologa que
presentan el genoma bacteriano y cloroplastos. Hay que recordar que las
cianobacterias dieron lugar a orgnulos como los plastos.
- Los cloroplastos no son capaces de llevar a cabo algunas modificaciones posttraduccionales como la glicosilacin. Las clulas vegetales s que son capaces de
glicosilar las protenas cuando la transformacin es nuclear, pero en el cloroplasto esto
no pasa y no se obtiene la protena activa. (Tambin tener en cuenta que no todas las
protenas necesitan modificaciones post-traduccionales)
- No se produce la exportacin de las protenas sintetizadas hacia otros orgnulos o
compartimentos celulares.
- Mtodos de transferencia limitados y baja frecuencia de transformacin.
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4. Purificacin
Los costos de purificacin pueden reducirse explotando caractersticas propias de la
planta:
- Rizosecrecin en cultivos hidropnicos y secrecin en clulas en suspensin: el gen
de inters se fusiona a una secuencia seal de transporte al retculo endoplasmtico
para redireccionar la protena por va secretora para que salga al cultivo hidropnico.
- Acumulacin en semillas u rganos de almacenamiento para la co-extraccin con
productos convencionales como almidn o aceites.
- Produccin directa en partes comestibles de la planta.
- Protenas de fusin a oleosinas: en las plantas oleaginosas las clulas de las
semillas tienen unos orgnulos que se llaman cuerpos grasos, en cuyo interior se
acumulan aceites y que tienen anclados a la membrana unas protenas denominadas
oleosinas (color prpura en dibujo). Lo que se hace es fusionar el gen de inters con el
de la secuencia de codificacin de una oleosina, separado por una secuencia de
reconocimiento para una proteasa. Esto va a hacer que se sinteticen oleosinas
recombinantes (unidas a la protena de inters), ancladas cuerpos grasos. Esto se
hace porque es muy sencillo aislar los cuerpos grasos y con ellos la oleosina
recombinante, que se trata con una proteasa para que separe la oleosina de la
protena de inters.
Protenas recombinantes producidas en sistemas vegetales
Son 3: antgenos vacunales, anticuerpos biofrmacos
a) Antgenos vacunales
1. Hepatitis B, C, agentes causales de diarreas (rotavirus, E.Coli, virus
Norwalk). Se ha logrado expresar antgenos de estos virus en clulas vegetales.
2. Otros se encuentran en fase de ensayo clnico como vacunas comestibles
contra hepatitis B y rabia (lechuga - Antgeno HBsAg). Se han transformado
clulas de lechuga para producir antgenos de este virus. Se hizo un estudio
administrando a varias personas estas hojas de lechuga. Transcurridos unas
semanas se les determinaba la concentracin de Ac contra esos antgenos en
sangre. Al cabo de 10 semanas de recibir la primera dosis de esta vacuna se
observa un aumento muy significativo en 2/3 voluntarios del antgeno.
b) Anticuerpos (planticuerpos)
1. Produccin de anticuerpos
en
clulas
vegetales.
Se
ha
logrado
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- No siempre es posible predecir el efecto que las alteraciones realizadas puedan tener
sobre la va metablica completa. Mecanismos de control positivos y negativos
pueden reorientar la va de formas poco conocidas. Podemos insertar todos los genes
que queramos pero igual luego no vemos el producto que nosotros queremos
- La manipulacin sobre las vas del metabolismo primario, a menudo pueden tener
efectos detrimentales sobre el crecimiento y desarrollo de la planta: Si queremos
manipular el metabolismo de HC o lipdico puede hacer que la planta produzca menos
producto o que crezca menos (disminucin de la biomasa producida. Todo esto no
interesa), etc.
- Por muy bien que la planta transgnica est caracterizada en condiciones
experimentales, los cultivos en el campo estn sujetos a perturbaciones
ambientales que pueden afectar de forma impredecible a la acumulacin del
producto recombinante: Podemos transformar genticamente la planta, la cultivamos
en un invernadero y genera la molcula que necesitamos: se traslada al campo para
producir el compuesto a gran escala y la expresin ya no se da (importancia de
factores climticos)
- Es importante asegurar la correcta expresin espacial y temporal del producto
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