NITROGEN SOURCES Examples of commonly used nitrogen sources Most

industrially used micro-organisms can utilize inorganic or organic sources of

nitrogen. Inorganic nitrogen may be supplied as ammonia gas, ammonium salts or
nitrates (Hunter, 1972). Ammonia has been used for pH control and as the major
nitrogen source in a defined medium for the commercial production of human
serum albumin by Saccharomyces ceriuisiae (Collins, 1990). Ammonium salts such
as ammonium sulphate will usually produce acid conditions as the ammonium ion
is utilized and the free acid will be liberated. On the other hand nitrates will
normally cause an alkaline drift as they are metabolized. Ammonium nitrate will first
cause an acid drift as the ammonium ion is utilized, and nitrate assimilation is
repressed. When the ammonium ion has been exhausted, there is an alkaline drift
as the nitrate is used as an alternative nitrogen source (Morton and MacMil lan,
1954). One exception to this pattern is the metabolism of Gibberella fujikuroi
(Borrow et al., 1961, 1964). In the presence of nitrate the assimilation of ammonia
is inhibited at pH 2.8-3.0. Nitrate assimilation continues until the pH has increased
enough to allow the ammonia assimilation mechanism to restart. Organic nitrogen
may be supplied as amino acid, protein or urea. In many instances growth will be
faster with a supply of organic nitrogen, and a few microorganisms have an
absolute requirement for amino acids. It might be thought that the main industrial
need for pure amino acids would be in the deliberate addition to amino acid
requiring mutants used in amino acid production. However, amino acids are more
commonly added as complex organic nitrogen sources which are nonhomogeneous, cheaper and readily available. In lysine production, methionine and
threonine are obtained from soybean hydrolysate since it would be too expensive
to use the pure amino acids (Nakayama, 1972a). Other proteinaceous nitrogen
compounds serving as sources of amino acids include corn-steep liquor, soya
meal, peanut meal, cotton-seed meal (Pharmamedia, Table 4.8; and Proflo),
Distillers' solubles, meal and yeast extract. Analysis of many of these products
which include amino acids, vitamins and minerals are given by Miller and Churchill
(1986) and Atkinson and Mavituna (1991a). In storage these products may be
affected by moisture, temperature changes and ageing. Chemically defined amino
acid media devoid of protein are necessary in the production of certain vaccines
when they are intended for human use. Factors influencing the choice of nitrogen
source Control mechanisms exist by which nitrate reductase, an enzyme involved
in the conversion of nitrate to ammonium ion, is repressed in the presence of
ammonia (Brown et al, 1974). For this reason ammonia or ammonium ion is the
preferred nitrogen source. In fungi that have been investigated, ammonium ion
represses uptake of amino acids by general and specific amino acid permeases
(Whitaker, 1976). In Aspergillus nidulans, ammonia also regulates the production of
alkaline and neutral proteases (Cohen, 1973). Therefore, in mixtures of nitrogen
sources, individual nitrogen components may influence metabolic regulation so that
there is preferential assimilation of one component until its concentration has
diminished. It has been shown that antibiotic production by many micro-organisms

is influenced by the type and TABLE 4.8. The composition of Pharmamedia

(Traders Protein, Southern Cotton Oil Company, Division of Archer Dariels Midland
Co.) Component Quantity In shake flask media experiments, salts of weak acids
(e.g. ammonium succinate) may be used to serve as a nitrogen source and
eradicate the source of a strong acid pH change due to chloride or sulphate ions
which would be present if ammonium chloride or sulphate were used as the
nitrogen source. This procedure makes it possible to use lower concentrations of
phosphate to buffer the medium. High phosphate concentrations inhibit production
of many secondary metabolites (see Minerals Section). The use of complex
nitrogen sources for antibiotic production has been common practice. They are
thought to help create physiological conditions in the trophophase which favour
antibiotic production in the idiophase (Martin and McDaniel, 1977). For example, in
the production of polyene antibiotics, soybean meal has been considered a good
nitrogen source because of the balance of nutrients, the low phosphorus content
and slow hydrolysis. It has been suggested that this gradual breakdown prevents
the accumulation of ammonium ions and repressive amino acids. These are
probably some of the reasons for the selection of ideal nitrogen sources for some
secondary metabolites (Table 4.9.). In gibberellin production the nitrogen source
has been shown to have an influence on directing the production of different
gibberellins and the relative proportions of each type (Jefferys, 1970). Other predetermined aspects of the process can also influence the choice of nitrogen
source. Rhodes (1963) has shown that the optimum concentration of available
nitrogen for griseofulvin production showed some variation depending on the form
of inoculum and the type of fermenter being used. Obviously these factors must be
borne in mind in the interpretation of results in media-development programmes.
Some of the complex nitrogenous material may not be utilized by a micro-organism
and create problems in downstream processing and effluent treatment. This can be
an important factor in the final choice of substrate. MINERALS Total solids
Carbohydrate Reducing sugars N o n reducing sugars Protein Amin o nitrogen
Components of amino nitrogen Lysine Leucine Isoleucine Threonine Valine
Phenylalanine Tryptophan Methionine Cystine Aspartic acid Serine Proline Glycine
Alanine Tyrosine Histidine Arginine 9 9% 24.1% 1.2% 1.2% 5 7% 4.7% 4.5% 6.1%
3.3% 3.3% 4.6% 5.9% 1.0% 1.5% 1.5% 9.7% 4.6% 3.9% 3.8% 3.9% 3.4% 3.0%
12.3% Mineral components Calcium Chloride Phosphorus Iron Sulphate
Magnesium Potassium Fat 253 0 ppm 685 ppm 1310 0 ppm 94 ppm 1800 0 ppm 7
360 ppm 1720 0 ppm 4.5% Vitamins Ascorbic acid Thiamine Riboflavin Niacin
Pantotheni c acid Choline Pyidoxine Biotin Folic acid Inositol 32.0 mg kg " 4.0 mg
kg " 4.8 mgkg " 83.3 mg kg - 12.4 mg kg - 327 0 mg kg - 16.4 mg kg - 1.5 mgkg 1.6 mg kg - 1080 0 mg kg" All micro-organisms require certain mineral dconcentration of the nitrogen source in the culture ments for growth and
metabolism (Hughes and Poole, medium (Aharonowitz, 1980). Antibiotic production
1989, 1991). In many media, magnesium, phosphorus, may be inhibited by a
rapidly utilized nitrogen source potassium, sulphur, calcium and chlorine are

essential (NHJ, NO^~, certain amino acids). The antibiotic pro- components, and
because of the concentrations reduction only begins to increase in the culture broth
quired, they must be added as distinct components, after most of the nitrogen
source has been consumed. Others such as cobalt, copper, iron, manganese,
molyb-TABLE 4.9. Best nitrogen sources for some secondary metabolites Product
Main nitrogen source(s) Referenc e Penicillin Corn-steep liquor Moye r and Coghill
(1946) Bacitracin Peanut granules Inskeep et al. (1951) Riboflavin Pancreatic
digest of gelatine Malzahn et al. (1959) Novobiocin Distillers' solubles Hoeksem a
and Smith (1961) Rifomycin Pharmamedia Sensi and Thiemann (1967) Soybean
meal, (NH 4 ) 2S 0 4 Gibberellins Ammoniu m salt and natural Jefferys (1970) plant
nitrogen source Butirosin Dried bee f blood or haemo - Claridge et al. (1974) globin
with (NH 4 ) 2S 0 4 Polyene s Soybean meal Martin and MacDanie l (1977) denum
and zinc are also essential but are usually present as impurities in other major
ingredients. There is obviously a need for batch analysis of media components to
ensure that this assumption can be justified, otherwise there may be deficiencies or
excesses in different batches of media. See Tables 4.7 and 4.8 for analysis of corn
steep liquor and Pharmamedia, and Miller and Churchill (1986) for analysis of other
media ingredients of plant and animal origin. When synthetic media are used the
minor elements will have to be added deliberately. The form in which the minerals
are usually supplied and the concentration ranges are given in Table 4.10. As a
consequence of product composition analysis, as outlined earlier in this chapter, it
is possible to estimate the amount of a specific mineral for medium design, e.g.
sulphur in penicillins and cephalosporins, chlorine in Chlortetracycline. The
concentration of phosphate in a medium, particularly laboratory media in shake
flasks, is often much higher than that of other mineral components. Part of this
phosphate is being used as a buffer to minimize pH TABLE 4.10. The range of
typical concentrations of mineral components (g dm - 3 ) Component Rang e *KH
2P 0 4 1.0-4.0 (part may be as buffer) MgS0 4 -7H 2 0 0.25-3. 0 KCl 0.5-12. 0
CaC0 3 5.0-17. 0 FeS0 4 -4H 2 0 0.01-0.1 ZnS0 4 -8H 2 0 0.1-1. 0 MnS0 4 H 2 0
0.01-0.1 CuS0 4 -5H 2 0 0.003-0.01 N a 2Mo0 4 -2H 2 0 0.01-0.1 * Complex media
derived from plant and animal materials normally contain a considerable
concentration of inorganic phosphate. changes when external control of the pH is
not being used. In specific processes the concentration of certain minerals may be
very critical. Some secondary metabolic processes have a lower tolerance range to
inorganic phosphate than vegetative growth. This phosphate should be sufficiently
low as to be assimilated by the end of trophophase. In 1950, Garner et al.
suggested that an important function of calcium salts in fermention media was to
precipitate excess inorganic phosphates, and suggested that the calcium indirectly
improved the yield of streptomycin. The inorganic phosphate concentration also
influences production of bacitracins, citric acid (surface culture), ergot, monomycin,
novobiocin, Oxytetracycline, polyenes, ristomycin, rifamycin Y, streptomycin,
vancomycin and viomycin (Sensi and Thieman, 1967; Demain, 1968; Liu et al,
1970; Mertz and Doolin, 1973; Weinberg, 1974). However, pyrrolnitrin (Arima et al,

1965), bicyclomycin (Miyoshi et al, 1972), thiopeptin (Miyairi et al, 1970) and
methylenomycin (Hobbs et al, 1992) are produced in a medium containing a high
concentration of phosphate. Two monomycin antibiotics are selectively produced
by Streptomyces jamaicensis when the phosphate is 0.1 mM or 0.4 mM (Hall and
Hassall, 1970). Phosphate regulation has also been discussed by Weinberg
(1974), Aharonowitz and Demain (1977), Martin and Demain (1980), Iwai and
Omura (1982) and Demain and Piret (1991). In a recent review of antibiotic
biosynthesis, Liras et al. (1990) recognized target enzymes which were (a)
repressed by phosphate, (b) inhibited by phosphate, or (c) repression of an
enzyme occurs but phosphate repression is not clearly proved. A phosphate control
sequence has also been isolated and characterized from the phosphate regulated
promoter that controls biosynthesis of candicidin. Weinberg (1970) has reviewed
the nine trace elemerits of biological interest (Atomic numbers 23-30, 42). Of these
nine, the concentrations of manganese, iron and zinc are the most critical in
secondary metabolism. In every secondary metabolic system in which sufficient
data has been reported, the yield of the product varies linearly with the logarithmic
concentration of the 4 key' metal. The linear relationship does not apply at
concentrations of the metal which are either insufficient, or toxic, to cell growth.
Some of the primary and secondary microbial products whose yields are affected
by concentrations of trace metals greater than those required for maximum growth
are given in Table 4.11. Chlorine does not appear to play a nutritional role in the
metabolism of fungi (Foster, 1949). It is, however, required by some of the
halophilic bacteria (Larsen, 1962). Obviously, in those fermentations where a
chlorine-containing metabolite is to be produced the synthesis will have to be
directed to ensure that the non-chloro-derivative is not formed. The most important
compounds are Chlortetracycline and griseofulvin. In griseofulvin production,
adequate available chloride is provided by the inclusion of at least 0.1% KCl
(Rhodes et al, 1955), as well as the chloride provided by the complex organic
materials included as nitrogen sources. Other chlorine containing metabolites are
caldriomycin, nornidulin and mollisin. Chelators Many media cannot be prepared or
autoclaved without the formation of a visible precipitate of insoluble metal
phosphates. Gaunt et al (1984) demonstrated that when the medium of Mandels
and Weber (1969) was autoclaved, a white precipitate of metal ions formed,
containing all the iron and most of the calcium, manganese and zinc present in the
medium. The problem of insoluble metal phosphate(s) may be eliminated by
incorporating low concentrations of chelating agents such as ethylene diamine
tetraacetic acid (EDTA), citric acid, polyphosphates, etc., into the medium. These
chelating agents preferentially form complexes with the metal ions in a medium.
The metal ions then may be gradually utilized by the microorganism (Hughes and
Poole, 1991). Gaunt et al (1984) were able to show that the precipitate was
eliminated from Mandel and Weber's medium by the addition of EDTA at 25 mg dm
- 3 . It is important to check that a chelating agent does not cause inhibition of
growth of the micro-organism which is being cultured. In many media, particularly

those commonly used in large scale processes, there may not be a need to add a
chelating agent as complex ingredients such as yeast extracts or proteose
peptones will complex with metal ions and ensure gradual release of them during
growth (Ramamoorthy and Kushner, 1975). GROWTH FACTORS Some microorganisms cannot synthesize a full complement of cell components and therefore
require preformed compounds called growth factors. The growth factors most
commonly required are vitamins, but there may also be a need for specific amino
acids, fatty acids TABLE 4.11. Trace elements influencing primary and secondary
metabolism Product Trace element(s) Referenc e Bacitracin Mn Weinberg and
Tonnis (1966) Protease Mn Mizusawa et al. (1966) Gentamicin Co Tilley et /.
(1975) Riboflavin F e , Co Hickey (1945) Fe Tanne r et al. (1945) Mitomycin Fe
Weinberg (1970) Monensin Fe Weinberg (1970) Actinomycin F e , Zn Katz et al.
(1958) Candicidin F e , Zn Weinberg (1970) Chloramphenicol F e , Zn Gallicchio
and Gottlieb (1958) Neomycin F e , Zn Majumdur and Majumdar (1965) Patulin
Fe,Z n Brack(1947 ) Streptomycin Fe,Z n Weinberg (1970) Citric acid F e , Zn, Cu
Shu and Johnson (1948) Penicillin Fe, Zn, Cu Foster et al. (1943) Koffler et al.
(1947) Griseofulvin Zn Grove (1967) 104 Media for Industrial Fermentations or
sterols. Many of the natural carbon and nitrogen sources used in media
formulations contain all or some of the required growth factors (Atkinson and
Mavituna, 1991a). When there is a vitamin deficiency it can often be eliminated by
careful blending of materials (Rhodes and Fletcher, 1966). It is important to
remember that if only one vitamin is required it may be occasionally more
economical to add the pure vitamin, instead of using a larger bulk of a cheaper
multiple vitamin source. Calcium pantothenate has been used in one medium
formulation for vinegar production (Beaman, 1967). In processes used for the
production of glutamic acid, limited concentrations of biotin must be present in the
medium (see Chapter 3). Some production strains may also require thiamine
(Kinoshita and Tanaka, 1972). NUTRIENT RECYCLE The need for water recycling
in ICI pic's continuous-culture SCP process has already been discussed in an
earlier section of this chapter. It was shown that M. methylotrophus could be grown
in a medium containing 86% recycled supernatant plus additional fresh nutrients to
make up losses. This approach made it possible to reduce the costs of media
components, media preparation and storage facilities (Ashley and Rodgers, 1986;
Sharp, 1989). BUFFERS The control of pH may be extremely important if optimal
productivity is to be achieved. A compound may be added to the medium to serve
specifically as a buffer, or may also be used as a nutrient source. Many media are
buffered at about pH 7.0 by the incorporation of calcium carbonate (as chalk). If the
pH decreases the carbonate is decomposed. Obviously, phosphates which are part
of many media also play an important role in buffering. However, high phosphate
concentrations are critical in the production of many secondary metabolites (see
Minerals section earlier in this chapter). The balanced use of the carbon and
nitrogen sources will also form a basis for pH control as buffering capacity can be
provided by the proteins, peptides and amino acids, such as in corn-steep liquor.

The pH may also be controlled externally by addition of ammonia or sodium

hydroxide and sulphuric acid (Chapter 8). THE ADDITION OF PRECURSORS
AND METABOLIC REGULATORS TO MEDIA Some components of a fermentation
medium help to regulate the production of the product rather than support the
growth of the micro-organism. Such additives include precursors, inhibitors and
inducers, all of which may be used to manipulate the progress of the fermentation.
Precursors Some chemicals, when added to certain fermentations, are directly
incorporated into the desired product. Probably the earliest example is that of
improving penicillin yields (Moyer and Coghill, 1946, 1947). A range of different
side chains can be incorporated into the penicillin molecule. The significance of the
different side chains was first appreciated when it was noted that the addition of
corn-steep liquor increased the yield of penicillin from 20 units cm - 3 to 100 units c
m - 3 . Corn-steep liquor was found to contain phenylethylamine which was
preferentially incorporated into the penicillin molecule to yield benzyl penicillin
(Penicillin G). Having established that the activity of penicillin lay in the side chain,
and that the limiting factor was the synthesis of the side chain, it became standard
practice to add side-chain precursors to the medium, in particular phenylacetic
acid. Smith and Bide (1948) showed that addition of phenylacetic acid and its
derivatives to the medium were capable of both increasing penicillin production
threefold and to directing biosynthesis towards increasing the proportion of benzyl
penicillin from 0 to 93% at the expense of other penicillins. Phenylacetic acid is still
the most widely used precursor in penicillin production. Some important examples
of precursors are given in Table 4.12. Inhibitors When certain inhibitors are added
to fermentations, more of a specific product may be produced, or a metabolic
intermediate which is normally metabolized is accumulated. One of the earliest
examples is the microbial production of glycerol (Eoff et al, 1919). Glycerol
production depends on modifying the ethanol fermentation by removing
acetaldehyde. The addition of sodium bisulphite to the broth leads to the formation
of the acetaldehyde bisulphite addition compound (sodium hydroxy ethyl sulphite).
Since acetaldehyde is 105 Principles of Fermentation Technology, 2nd Edn. TABL
E 4.12. Precursors used in fermentation processes Precursor Product Microorganism Referenc e Phenylacetic-acid Penicillin G Pnicillium chrysogenum
Moyer and Coghill and related compounds (1947) Phenoxy acetic acid Penicillin V
Pnicillium chrysogenum Soper et al. (1948) Chloride Chlortetracycline
Streptomyces aureofaciens V an Dyck and de Some r (1952) Chloride Griseofulvin
Pnicillium griseofulvin Rhode s et al. (1955) * Propionate Riboflavin Lactobacillus
bulgaricus Smiley and Stone (1955) Cyanides Vitamin B12 Proprianobacterium,
Mervyn and Smith Streptomyces spp. (1964) /3-Iononones Carotenoids
Phycomyces blakesleeanus Reye s et al (1964) -Amino butyric acid L-Isoleucine
Bacillus subtilis Nakayama (1972b) D-Threonine L-Isoleucine Serratia marcescens
Anthranilic acid L-Tryptophan Hansenula anomala Nucleoside s and Nikkomycins
Streptomyces tendae Vecht-Lifshitz and bases Braun (1989) Dihydronovobionic
Dihydronovo- Streptomyces sp. Walton et al. (1962) acid biocin p-

Hydroxycinnamate Organomycin Streptomyces organonensis Eiki et al. (1992) A

and DL-a -Amin o butyric acid Cyclosporin A Tolypocladium inflatum Kobel and
Traber L-Threonine Cyclosporin C (1982) Tyrosine or p-hydroxy- DimethylvancoNocardia orientalis Boeck et al. (1984) phenylglycine mycin * Yields are not so high
as by othe r technique s no longer available for re-oxidation of NADH2 , its place
as hydrogen acceptor is taken by dihydroacetone phosphate, produced during
glycolysis. The product of this reaction is glycerol-3-phosphate, which is converted
to glycerol. The application of general and specific inhibitors are illustrated in Table
4.13. In most cases the inhibitor is effective in increasing the yield of the desired
product and reducing the yield of undesirable related products. A number of studies
have been made with potential chlorination inhibitors, e.g. bromide, to minimize
Chlortetracycline production during a tetracycline fermentation (Gourevitch et al,
1956; Lepetit S.p.A., 1957; Goodman etal, 1959; Lein et al, 1959; Szumski, 1959).
Inhibitors have also been used to affect cell-wall structure and increase the
permeability for release of metabolites. The best example is the use of penicllin
and surfactants in glutamic acid production (Phillips and Somerson, 1960).
Inducers The majority of enzymes which are of industrial interest are inducible.
Induced enzymes are synthesized only in response to the presence in the
environment of an inducer. Inducers are often substrates such as starch or dextrins
for amylases, maltose for pullulanase and pectin for pectinases. Some inducers
are very potent, such as isovaleronitrile inducing nitralase (Kobayashi et al, 1992).
Substrate analogues that are not attacked by the enzyme may also serve as
enzyme inducers. Most inducers which are included in microbial enzyme media
(Table 4.14) are substrates or substrate analogues, but intermediates and products
may sometimes be used as inducers. For example, maltodextrins will induce
amylase and fatty acids induce lipase. However, the cost may prohibit their use as
inducers in a commercial process. Reviews have been published by Aunstrup et al
(1979) and Demain (1990). One unusual application of an inducer is the use of
yeast mannan in streptomycin production (Inamine et al, 1969). During the
fermentation varying amounts of streptomycin and mannosidostreptomycin are
produced. Since mannosidostreptomycin has only 20% of the biological activity of
streptomycin, the former is an undesirable product. The production organism
Streptomyces griseus can be induced by yeast mannan to produce /3mannosidase which will convert mannosidostreptomycin to streptomycin. It is now
possible to produce a number of heterologous proteins in yeasts, fungi and
bacteria. These include proteins of viral, human, animal, plant and mi- 106 Media
for Industrial Fermentations TABLE 4.13. Specific and general inhibitors used in
fermentations Product Inhibitor Main effect Micro-organism Referenc e Glycerol
Sodium bisulphite Acetaldehyde pro- Saccharomyces Eoff et al. duction repressed
cerivisiae (1919) Tetracycline Bromide Chlortetracycline Streptomyces Lepetit
formation repressed aureofaciens (1957) Glutamic acid Penicillin Cell wall
permeability Micrococcus Phillips et al. glutamicus (1960) Citric acid Alkali
metal/phos- Oxalic acid repressed Aspergillus niger Batti (1967) phate, pH below

2.0 Valine Various inhibitors Various effects with Breuibacterium Uemur a et al.
different inhibitors roseum (1972) Rifamycin Di-ethyl barbiturate Othe r
rifamycins Nocardia Lancini and inhibited mediterranei Whit e (1973) 7-Chloro-6
de- Ethionine Affects one-carbon Streptomyces Neidleman et al. methyltetracycline
transfer reactions aureofaciens (1963) crobial origin (Peberdy, 1988; Wayne
Davies, 1991). However, heterologous proteins may show some degree of toxicity
to the host and have a a major influence on the stability of heterologous protein
expression. As well as restricting cell growth as biomass the toxicity will provide
selective conditions for segregant cells which no longer synthesize the protein at
such a high level (Goodey et al, 1987). Therefore, optimum growth conditions may
be achieved by not synthesizing a heterologous protein continuously and only
inducing it after the host culture has grown up in a vessel to produce sufficient
biomass (Piper and Kirk, 1991). In cells of S. cereuisiae where the Gall promoter is
part of the gene expression system, product formation may be induced by
galactose addition to the growth medium which contains glycerol or low nonrepressing levels of glucose as a carbon source. One commercial system that has
been developed is based on the ale A promoter in Aspergillus nidulans to express
human interferon al (Wayne Davies, 1991). This can be induced by volatile
chemicals, such as ethylmethyl ketone, which are added when biomass has
increase to an adequate level and the growth medium contains a non-repressing
carbon source or low non-repressing levels of glucose. Methylotrophic yeasts such
as Hansenula polymorpha and Pichia pastoris may be used as alternative systems
because of the presence of an alcohol oxidase TABLE 4.14. Some examples of
industrially important enzyme inducers Enzyme Inducer Micro-organism Referenc
e -Amylase Starch Aspergillus spp. Windish and Mhatre (1965) Maltos e Bacillus
subtilis Pullulanase Maltose Aerobacter Wallenfels et al. (1966) aerogenes aMannosidas e Yeast mannans Streptomyces griseus Inamine et al. (1969)
Penicillin acylase Phenylacetic acid Escherichia coli Carrington (1971) Protease s
Various proteins Bacillus spp. Keay(1971 ) Streptococcus spp. Aunstrup (1974)
Streptomyces spp. Asperigillus spp. Mucor spp. Cellulase Cellulose Trichoderma
viride Rees e (1972) Pectinases Pectin Aspergillus spp. Fogarty and Ward (1974)
(beet pulp, apple pomace , citrus peel) Nitralase Isovaleronitrile Rhodococcus
Kobayashi et al. (1992) rhodochrous promoter (Veale and Sudbery, 1991). During
growth on methanol, which also acts as an inducer, the promoter is induced to
produce about 30% of the cell protein. In the presence of glucose or ethanol it is
undetectable. Expression systems have been developed with P. pastons for tumour
necrosis factor, hepatitis surface antigen and -galactosidase. Hepatitis
surface antigen and other heterologous proteins can also be expressed by H.
polymorpha. OXYGEN REQUIREMENTS It is sometimes forgotten that oxygen,
although not added to an initial medium as such, is nevertheless a very important
component of the medium in many processes, and its availability can be extremely
important in controlling growth rate and metabolite production. This will be
discussed in detail in Chapter 9. The medium may influence the oxygen availability

in a number of ways including the following: 1. Fast metabolism. The culture may
become oxygen limited because sufficient oxygen cannot be made available in the
fermenter if certain substrates, such as rapidly metabolized sugars which lead to a
high oxygen demand, are available in high concentrations. 2. Rheology. The
individual components of the medium can influence the viscosity of the final
medium and its subsequent behaviour with respect to aeration and agitation. 3.
Antifoams. Many of the antifoams in use will act as surface active agents and
reduce the oxygen transfer rate. This topic will be considered in a later section of
this chapter. Fast metabolism Nutritional factors can alter the oxygen demand of
the culture. Pnicillium chrysogenum will utilize glucose more rapidly than lactose
or sucrose, and it therefore has a higher specific oxygen uptake rate when glucose
is the main carbon source (Johnson, 1946). Therefore, when there is the possibility
of oxygen limitation due to fast metabolism, it may be overcome by reducing the
initial concentration of key substrates in the medium and adding additional
quantities of these substrates as a continuous or semi-continuous feed during the
fermentation (see Tables 4.1. and 4.15; Chapters 2 and 9). It can also be overcome
by changing the composition of the medium, incorporating higher carbohydrates
(lactose, starch, etc.) and proteins which are not very rapidly metabolized and do
not support such a large specific oxygen uptake rate. Rheology Deindoerfer and
West (1960) reported that there can be considerable variation in the viscosity of
compounds that may be included in fermentation media.
BLE 4.15. Some processes using batch feed or continuous feed or in which they
have been tried Product Additions Referenc e Yeast Molasses, nitrogen sources,
and Mg Harrison (1971) Ree d and Peppie r (1973) Glycerol Sugar, Na 2C 0 3 Eoff
et al. (1919) Acetone-butyl alcohol Additions and withdrawals of wort Soc. Richard
et al. (1921) Riboflavin Carbohydrate Moss and Klein (1946) Penicillin Glucos e
and NH 3 Hosie r and Johnson (1953) Novobiocin Various carbon and nitrogen
sources Smith (1956) Griseofulvin Carbohydrate Hockenhull (1956) Rifamycin
Glucose , fatty acids P an et al. (1959) Gibberellins Glucos e Borrow et al. (1960)
Vitamin B 1 2 Glucos e Beche r et al. (1961) Tetracyclines Glucos e Avanzini
(1963) Citric acid Carbohydrates, NH 3 Shepherd(1963 ) Single-cell protein
Methanol Harrison et al. (1972) Candicidin Glucos e Martin and McDanie l (1975)
Streptomycin Glucose , ammonium sulphate Singh et al. (1976) Cephalosporin
Fresh medium addition Trilli et al. (1977)

Fuentes de nitrgeno Ejemplos de fuentes de nitrgeno utilizados comnmente

utilizados industrialmente ms microorganismos pueden utilizar fuentes
inorgnicas u orgnicas de nitrgeno. El nitrgeno inorgnico puede ser
suministrado como gas amonaco, sales de amonio o nitratos (Hunter, 1972). El
amonaco se ha utilizado para el control de pH y como la principal fuente de
nitrgeno en un medio definido para la produccin comercial de albmina de suero
humano por Saccharomyces ceriuisiae (Collins, 1990). Sales de amonio tales
como sulfato de amonio por lo general se producen condiciones cidas como se
utiliza el in de amonio y el cido libre se liber. En los otros nitratos mano
normalmente causar una deriva alcalina, ya que se metabolizan. El nitrato de
amonio en primer lugar hacer una deriva cido como el ion amonio se utiliza, y la
asimilacin de nitrato es reprimida. Cuando el ion amonio se ha agotado, hay una
deriva alcalina como el nitrato se utiliza como una fuente de nitrgeno alternativa
(Morton y MacMil lan, 1954). Una excepcin a este patrn es el metabolismo de

Gibberella fujikuroi (Borrow et al., 1961, 1964). En presencia de nitrato de la

asimilacin de amoniaco se inhibe a un pH de 2,8-3,0. Asimilacin de nitratos
contina hasta que el pH ha aumentado lo suficiente para permitir que el
mecanismo de asimilacin amoniaco para reiniciar. El nitrgeno orgnico puede
ser suministrado como el cido amino, protena o urea. En muchos casos, el
crecimiento ser ms rpido con un suministro de nitrgeno orgnico, y algunos
microorganismos tienen un requisito absoluto para aminocidos. Se podra pensar
que la principal necesidad industrial de aminocidos puros estara en la adicin
deliberada a los amino cidos que requieren mutantes utilizados en la produccin
de aminocidos. Sin embargo, los aminocidos se aaden ms comnmente
como fuentes de nitrgeno orgnicas complejas que no son homogneos, ms
barato y fcilmente disponible. En la produccin de lisina, metionina y treonina se
obtienen a partir de hidrolizado de soja, ya que sera demasiado caro para utilizar
los aminocidos puros (Nakayama, 1972a). Otros compuestos nitrogenados
protenicos que sirven como fuentes de aminocidos incluyen licor de maz
escarpado, harina de soja, harina de cacahuete, harina de semilla de algodn
(Pharmamedia, Tabla 4.8, y Proflo), solubles de destilera, harina y extracto de
levadura. Anlisis de muchos de estos productos que incluyen aminocidos,
vitaminas y minerales son dadas por Miller y Churchill (1986) y Atkinson y
Mavituna (1991a). En el almacenamiento de estos productos pueden ser
afectados por la humedad, cambios de temperatura y el envejecimiento.
Qumicamente definido aminocido desprovisto de medios de protena son
necesarios en la produccin de ciertas vacunas cuando estn destinados para el
uso humano. Existen factores que influyen en la eleccin de los mecanismos de
control de la fuente de nitrgeno por el cual la nitrato reductasa, una enzima
implicada en la conversin de nitrato a iones amonio, se reprime en presencia de
amoniaco (Brown et al, 1974). Por esta razn, el amonaco o ion amonio es la
fuente de nitrgeno preferida. En los hongos que han sido investigados, ion
amonio reprime la captacin de aminocidos por permeasas de aminocidos
generales y especficos (Whitaker, 1976). En Aspergillus nidulans, el amonaco
tambin regula la produccin de proteasas alcalinas y neutras (Cohen, 1973). Por
lo tanto, en mezclas de fuentes de nitrgeno, los componentes individuales de
nitrgeno pueden influir en la regulacin metablica de modo que no es la
asimilacin preferencial de un componente hasta que su concentracin ha
disminuido. Se ha demostrado que la produccin de antibiticos por muchos
microorganismos est influenciada por el tipo y la TABLA 4.8. La composicin de
Pharmamedia (Traders protena, Southern algodn Oil Company, Divisin de
Archer Dariels Midland Co.) Cantidad Componente En los experimentos de los
medios de comunicacin en matraces agitados, sales de cidos dbiles (por
ejemplo, succinato de amonio) se puede utilizar para servir como una fuente de
nitrgeno y erradicar la fuente de un fuerte cambio de pH cido debido a cloruro o
sulfato de iones que estaran presentes si el cloruro de amonio o sulfato se
utilizaron como fuente de nitrgeno. Este procedimiento hace posible el uso de

concentraciones ms bajas de fosfato para tamponar el medio. Las altas

concentraciones de fosfato inhiben la produccin de muchos metabolitos
secundarios (ver Seccin Minerales). El uso de fuentes de nitrgeno complejas
para la produccin de antibiticos ha sido una prctica comn. Se piensa para
ayudar a crear las condiciones fisiolgicas en el trophophase que favorecen la
produccin de antibiticos en el idiophase (Martin y McDaniel, 1977). Por ejemplo,
en la produccin de antibiticos de polieno, harina de soja se ha considerado una
buena fuente de nitrgeno debido a la equilibrio de nutrientes, el bajo contenido de
fsforo y la hidrlisis lenta. Se ha sugerido que esta ruptura gradual evita la
acumulacin de iones de amonio y aminocidos represivas. Estos son
probablemente algunas de las razones para la seleccin de fuentes de nitrgeno
ideales para algunos metabolitos secundarios (Tabla 4.9.). En la produccin de
giberelina se ha demostrado la fuente de nitrgeno a tener una influencia en la
direccin de la produccin de diferentes giberelinas y las proporciones relativas de
cada tipo (Jefferys, 1970). Otros aspectos predeterminados del proceso tambin
pueden influir en la eleccin de la fuente de nitrgeno. Rhodes (1963) ha
demostrado que la concentracin ptima de nitrgeno disponible para la
produccin de griseofulvina mostr alguna variacin dependiendo de la forma de
inculo y el tipo de fermentador se utiliza. Obviamente, estos factores deben ser
tenidos en cuenta en la interpretacin de los resultados en los programas de los
medios de comunicacin para el desarrollo. Parte del material nitrogenado
complejo no puede ser utilizada por un microorganismo y crear problemas en el
procesamiento aguas abajo y de tratamiento de efluentes. Esto puede ser un
factor importante en la eleccin final de sustrato. MINERALES total de slidos de
hidratos de carbono Azcares reductores N en la reduccin de azcares o
componentes de nitrgeno proteico Amin de nitrgeno amino de la lisina Leucina
Isoleucina Valina Treonina Fenilalanina Triptfano Metionina cistina cido asprtico
Serina Proline Glicina Alanina Tirosina Histidina Arginina 9 9% 24,1% 1,2% 1,2%
5% 7 4,7% 4,5% 6,1% 3,3% 3,3% 4,6% 5,9% 1,0% 1,5% 1,5% 9,7% 4,6% 3,9%
3,8% 3,9% 3,4% 3,0% 12,3% componentes minerales Cloruro de Calcio Fsforo
Hierro Sulfato de Magnesio Potasio Fat 253 0 ppm 685 ppm 1310 0 ppm 94 ppm
1800 ppm 0 7 360 ppm 1720 0 ppm 4,5% de cido ascrbico Vitaminas Tiamina
Riboflavina Niacina Pantotheni c cido colina Pyidoxine Biotina cido flico inositol
32,0 mg kg "4,0 mg kg" 4,8 mgkg "83.3 mg kg - 12,4 mg kg - 327 0 mg kg - 16,4
mg kg - 1.5 mg kg - 1.6 mg kg - 1080 0 mg kg "Todos microorganismos requieren
desconcentracin cierto mineral de la fuente de nitrgeno en los mentos de cultivo
para el crecimiento y el metabolismo (Hughes y Poole, medio (Aharonowitz ,
1980). La produccin de antibitico 1989, 1991). En muchos medios, magnesio,
fsforo, puede ser inhibida por una fuente de nitrgeno utilizada rpidamente
potasio, azufre, calcio y cloro son esenciales (NHJ, NO ^ ~, ciertos aminocidos).
Los componentes antibitica, y debido a la reduccin de las concentraciones de
slo comienza a aumentar en el rido caldo de cultivo, deben ser aadidos como
componentes distintos, despus de la mayor parte de la fuente de nitrgeno ha

sido consumida. Otros, como el cobalto, cobre, hierro, manganeso, molyb-TABLA

4.9. Las mejores fuentes de nitrgeno para alguna fuente de metabolitos
secundarios del producto principal de nitrgeno (s) Referenc e penicilina maz
empinada licor Moye ry Coghill (1946) Bacitracina man granulado Inskeep et al.
(1951) La riboflavina pancretico compendio de gelatina Malzahn et al. (1959)
solubles de destilera Novobiocina Hoeksem unos y Smith (1961) Rifomycin
Pharmamedia Sensi y Thiemann (1967) harina de soja, (NH4) 2S 0 4 giberelinas
Ammoniu m sal y Jefferys fuente de nitrgeno (1970) de plantas naturales
butirosina abeja secos f sangre o hemo - Claridge et al. (1974) globina con (NH 4)
2S 0 4 Polyene s harina de soja Martin y MacDanie l (1977) denum y zinc tambin
son esenciales, pero usualmente estn presentes como impurezas en otros
ingredientes principales. Es evidente que hay una necesidad de un anlisis por
lotes de componentes de los medios para asegurar que este supuesto se puede
justificar, de lo contrario puede haber deficiencias o excesos en diferentes lotes de
medios de comunicacin. Ver las Tablas 4.7 y 4.8 para el anlisis de licor de maz
fermentado y Pharmamedia, y Miller y Churchill (1986) para el anlisis de otros
ingredientes de medios de comunicacin de origen vegetal y animal. Cuando se
utilizan medios sintticos los elementos menores tendrn que ser aadido
deliberadamente. La forma en el que los minerales se suministran por lo general y
los intervalos de concentracin se dan en la Tabla 4.10. Como consecuencia del
anlisis de la composicin del producto, tal como se describe anteriormente en
este captulo, es posible estimar la cantidad de un mineral especfico para el
diseo medio, por ejemplo, de azufre en las penicilinas y cefalosporinas, cloro en
clortetraciclina. La concentracin de fosfato en un medio, en particular los medios
de laboratorio en matraces de agitacin, a menudo es mucho mayor que la de
otros componentes minerales. Parte de este fosfato se utiliza como un tampn
para minimizar TABLA pH 4,10. El intervalo de concentraciones tpicas de
componentes minerales (g dm - 3) Componente Rang E * KH 2P 0 4 1,0-4,0 (parte
puede ser como tampn) MgS0 4 7H 2 0 0,25-3. 0 KCl 0,5-12. 0 CaC0 3 5,0-17. 0
FeS0 4 4H 2 0 0,01-0,1 ZnS0 4 8H 2 0 0,1-1. 0 MnS0 4 H 2 0 0,01-0,1 CuS0 4 5H
2 0 0,003-,01 N a * medios Complejo 2Mo0 4 2H 2 0 0,01-0,1 derivados de
materiales vegetales y animales normalmente contienen una considerable
concentracin de fosfato inorgnico. cambia cuando no se est utilizando el
control externo del pH. En los procesos especficos de la concentracin de ciertos
minerales puede ser muy crtico. Algunos procesos metablicos secundarios
tienen un rango de tolerancia inferior al fosfato inorgnico que el crecimiento
vegetativo. Este fosfato debe ser lo suficientemente bajo como para ser asimilado
por el final de trophophase. En 1950, Garner et al. sugiri que una funcin
importante de sales de calcio en medios fermention era para precipitar el exceso
de fosfatos inorgnicos, y sugiri que el calcio mejor indirectamente el
rendimiento de estreptomicina. La concentracin de fosfato inorgnico tambin
influye en la produccin de bacitracinas, cido ctrico (cultivo de superficie), el
cornezuelo, monomycin, novobiocina, oxitetraciclina, polienos, ristomycin,

rifamicina Y, estreptomicina, vancomicina y viomicina (Sensi y Thieman, 1967;

Demain, 1968; Liu et al, 1970; Mertz y Doolin, 1973; Weinberg, 1974). Sin
embargo, pirrolnitrina (Arima et al, 1965), bicyclomycin (Miyoshi et al, 1972),
Thiopeptin (MIYAIRI et al, 1970) y metilenomicina (Hobbs et al, 1992) se producen
en un medio que contiene una alta concentracin de fosfato. Dos antibiticos
monomycin se producen selectivamente por Streptomyces jamaicensis cuando el
fosfato es 0,1 mM o 0,4 mM (Hall y Hassall, 1970). Regulacin de fosfato tambin
ha sido discutido por Weinberg (1974), Aharonowitz y Demain (1977), Martin y
Demain (1980), Iwai y Omura (1982) y Demain y Piret (1991). En una revisin
reciente de la biosntesis de antibiticos, Liras et al. (1990) reconoci que eran
enzimas diana (a) reprimida por fosfato, (b) inhibe por el fosfato, o (c) la represin
de una enzima se produce pero la represin de fosfato no est claramente
demostrado. Una secuencia de control de fosfato tambin se ha aislado y
caracterizado a partir del promotor regulado de fosfato que controla la biosntesis
de candicidina. Weinberg (1970) ha revisado los nueve elemerits traza de inters
biolgico (nmeros atmicos 23-30, 42). De estos nueve, las concentraciones de
manganeso, hierro y zinc son los ms crticos en el metabolismo secundario. En
cada sistema metablico secundaria en la que se ha informado de datos
suficientes, el rendimiento del producto vara linealmente con la concentracin
logartmica de la llave metal 4 '. La relacin lineal no se aplica a concentraciones
de metal que son insuficientes, o txicas, para el crecimiento celular. Algunos de
los productos microbianos primaria y secundaria cuyos rendimientos se ven
afectadas por las concentraciones de metales traza mayores que los requeridos
para el crecimiento mximo se dan en la Tabla 4.11. El cloro no parece jugar un
papel nutricional en el metabolismo de los hongos (Foster, 1949). Es, sin embargo,
requiere de algunas de las bacterias halfilas (Larsen, 1962). Obviamente, en
aquellos fermentaciones donde un metabolito que contiene cloro se va a producir
la sntesis tendr que ser dirigida para asegurar que la no-cloro-derivado no se
forma. Los compuestos ms importantes son clortetraciclina y la griseofulvina. En
la produccin de griseofulvina, cloruro disponible adecuada proporcionada por la
inclusin de al menos 0,1% de KCl (Rhodes et al, 1955), as como el cloruro
proporcionada por los materiales orgnicos complejos incluidos como fuentes de
nitrgeno. Otros metabolitos que contienen cloro se caldriomycin, nornidulin y
mollisin. Quelantes Muchos medios de comunicacin no se pueden preparar o en
autoclave sin la formacin de un precipitado visible de fosfatos de metales
insolubles. Gaunt et al (1984) demostraron que cuando se someti a autoclave el
medio de Mandels y Weber (1969), un precipitado blanco de iones de metal
formado, que contiene todo el hierro y la mayora del calcio, manganeso y zinc
presente en el medio. El problema de fosfato (s) de metal insoluble se puede
eliminar mediante la incorporacin de concentraciones bajas de agentes quelantes
tales como cido etilendiaminotetraactico (EDTA), cido ctrico, polifosfatos, etc.,
en el medio. Estos agentes quelantes forman preferentemente complejos con los
iones metlicos en un medio. Los iones metlicos a continuacin, se pueden

utilizar gradualmente por el microorganismo (Hughes y Poole, 1991). Gaunt et al

(1984) fueron capaces de demostrar que el precipitado fue eliminado del medio
Mandel y de Weber por la adicin de EDTA a 25 mg dm - 3. Es importante
comprobar que un agente quelante no causa la inhibicin del crecimiento del
microorganismo que est siendo cultivado. En muchos medios de comunicacin,
en particular los utilizados comnmente en los procesos a gran escala, puede que
no haya necesidad de aadir un agente quelante como ingredientes complejas
tales como extractos de levadura o las peptonas proteosa formar un complejo
con iones metlicos y asegurar la liberacin gradual de ellos durante el
crecimiento (Ramamoorthy y Kushner, 1975). FACTORES DE CRECIMIENTO
Algunos microorganismos no pueden sintetizar un conjunto completo de
componentes de la clula y por lo tanto requieren compuestos preformados
llamadas factores de crecimiento. Los factores de crecimiento ms comnmente
requeridas son las vitaminas, pero tambin puede haber una necesidad de
aminocidos especficos, cidos grasos TABLA 4.11. Los oligoelementos que
influyen elemento primario y secundario Traza el metabolismo del producto (s)
Referenc e bacitracina Mn Weinberg y Tonnis (1966) de la proteasa Mn Mizusawa
et al. (1966) Gentamicina Co Tilley et /. (1975) Riboflavina F e, Co Hickey (1945)
Fe Tanne r et al. (1945) Mitomicina Fe Weinberg (1970) monensina Fe Weinberg
(1970) actinomicina F e, Zn Katz et al. (1958) Candicidina F e, Zn Weinberg (1970)
El cloranfenicol F e, Zn Gallicchio y Gottlieb (1958) Neomicina F e, Zn Majumdur y
Majumdar (1965) La patulina Fe, Z n Brack (1947) La estreptomicina Fe, Z n
Weinberg ( 1970) El cido ctrico F e, Zn, Cu Shu y Johnson (1948) Penicilina Fe,
Zn, Cu Foster et al. (1943) Koffler et al. (1947) Griseofulvina Zn Grove (1967) 104
Medios de Fermentaciones Industriales o esteroles. Muchas de las fuentes de
carbono y nitrgeno naturales utilizados en formulaciones de medios contener
todos o algunos de los factores de crecimiento necesarios (Atkinson y Mavituna,
1991a). Cuando hay una deficiencia de vitamina que a menudo se puede eliminar
mediante una cuidadosa mezcla de materiales (Rhodes y Fletcher, 1966). Es
importante recordar que si slo se requiere una vitamina puede ser en ocasiones
ms econmico para agregar la vitamina pura, en lugar de utilizar un mayor ms
grande de una fuente de vitamina mltiple ms barato. Pantotenato de calcio se ha
usado en una formulacin del medio para la produccin de vinagre (Beaman,
1967). En los procesos utilizados para la produccin de cido glutmico, las
concentraciones limitadas de biotina deben estar presentes en el medio (vase el
captulo 3). Algunas cepas de produccin tambin pueden requerir tiamina
(Kinoshita y Tanaka, 1972). NUTRIENTES RECICLAR La necesidad de reciclaje
de agua en continuo-cultura de ICI pic proceso SCP ya ha sido discutido en una
seccin anterior de este captulo. Se demostr que M. methylotrophus podra ser
cultivada en un medio que contiene 86% de sobrenadante reciclado ms
nutrientes frescos adicionales para compensar prdidas. Este enfoque ha
permitido reducir los costos de los componentes de los medios, la preparacin de
medios e instalaciones de almacenamiento (Ashley y Rodgers, 1986; Sharp,

1989). BUFFERS El control de pH puede ser extremadamente importante si la

productividad ptima se ha de lograr. Un compuesto se puede aadir al medio
para servir especficamente como un tampn, o tambin puede ser utilizado como
una fuente de nutrientes. Muchos medios se almacenan a aproximadamente pH
7,0 por la incorporacin de carbonato de calcio (como la tiza). Si el pH disminuye
el carbonato se descompone. Obviamente, los fosfatos que son parte de fuentes.
Otros metabolitos que contienen cloro se caldriomycin, nornidulin y mollisin.
Quelantes Muchos medios de comunicacin no se pueden preparar o en autoclave
sin la formacin de un precipitado visible de fosfatos de metales insolubles. Gaunt
et al (1984) demostraron que cuando se someti a autoclave el medio de Mandels
y Weber (1969), un precipitado blanco de iones de metal formado, que contiene
todo el hierro y la mayora del calcio, manganeso y zinc presente en el medio. El
problema de fosfato (s) de metal insoluble se puede eliminar mediante la
incorporacin de concentraciones bajas de agentes quelantes tales como cido
etilendiaminotetraactico (EDTA), cido ctrico, polifosfatos, etc., en el medio.
Estos agentes quelantes forman preferentemente complejos con los iones
metlicos en un medio. Los iones metlicos a continuacin, se pueden utilizar
gradualmente por el microorganismo (Hughes y Poole, 1991). Gaunt et al (1984)
fueron capaces de demostrar que el precipitado fue eliminado del medio Mandel y
de Weber por la adicin de EDTA a 25 mg dm - 3. Es importante comprobar que
un agente quelante no causa la inhibicin del crecimiento del microorganismo que
est siendo cultivado. En muchos medios de comunicacin, en particular los
utilizados comnmente en los procesos a gran escala, puede que no haya
necesidad de aadir un agente quelante como ingredientes complejas tales como
extractos de levadura o las peptonas proteosa formar un complejo con iones
metlicos y asegurar la liberacin gradual de ellos durante el crecimiento
(Ramamoorthy y Kushner, 1975). FACTORES DE CRECIMIENTO Algunos
microorganismos no pueden sintetizar un conjunto completo de componentes de la
clula y por lo tanto requieren compuestos preformados llamadas factores de
crecimiento. Los factores de crecimiento ms comnmente requeridas son las
vitaminas, pero tambin puede haber una necesidad de aminocidos especficos,
cidos grasos TABLA 4.11. Los oligoelementos que influyen elemento primario y
secundario Traza el metabolismo del producto (s) Referenc e bacitracina Mn
Weinberg y Tonnis (1966) de la proteasa Mn Mizusawa et al. (1966) Gentamicina
Co Tilley et /. (1975) Riboflavina F e, Co Hickey (1945) Fe Tanne r et al. (1945)
Mitomicina Fe Weinberg (1970) monensina Fe Weinberg (1970) actinomicina F e,
Zn Katz et al. (1958) Candicidina F e, Zn Weinberg (1970) El cloranfenicol F e, Zn
Gallicchio y Gottlieb (1958) Neomicina F e, Zn Majumdur y Majumdar (1965) La
patulina Fe, Z n Brack (1947) La estreptomicina Fe, Z n Weinberg ( 1970) El cido
ctrico F e, Zn, Cu Shu y Johnson (1948) Penicilina Fe, Zn, Cu Foster et al. (1943)
Koffler et al. (1947) Griseofulvina Zn Grove (1967) 104 Medios de Fermentaciones
Industriales o esteroles. Muchas de las fuentes de carbono y nitrgeno naturales
utilizados en formulaciones de medios contener todos o algunos de los factores de

crecimiento necesarios (Atkinson y Mavituna, 1991a). Cuando hay una deficiencia

de vitamina que a menudo se puede eliminar mediante una cuidadosa mezcla de
materiales (Rhodes y Fletcher, 1966). Es importante recordar que si slo se
requiere una vitamina puede ser en ocasiones ms econmico para agregar la
vitamina pura, en lugar de utilizar un mayor ms grande de una fuente de vitamina
mltiple ms barato. Pantotenato de calcio se ha usado en una formulacin del
medio para la produccin de vinagre (Beaman, 1967). En los procesos utilizados
para la produccin de cido glutmico, las concentraciones limitadas de biotina
deben estar presentes en el medio (vase el captulo 3). Algunas cepas de
produccin tambin pueden requerir tiamina (Kinoshita y Tanaka, 1972).
NUTRIENTES RECICLAR La necesidad de reciclaje de agua en continuo-cultura
de ICI pic proceso SCP ya ha sido discutido en una seccin anterior de este
captulo. Se demostr que M. methylotrophus podra ser cultivada en un medio
que contiene 86% de sobrenadante reciclado ms nutrientes frescos adicionales
para compensar prdidas. Este enfoque ha permitido reducir los costos de los
componentes de los medios, la preparacin de medios e instalaciones de
almacenamiento (Ashley y Rodgers, 1986; Sharp, 1989). BUFFERS El control de
pH puede ser extremadamente importante si la productividad ptima se ha de
lograr. Un compuesto se puede aadir al medio para servir especficamente como
un tampn, o tambin puede ser utilizado como una fuente de nutrientes. Muchos
medios se almacenan a aproximadamente pH 7,0 por la incorporacin de
carbonato de calcio (como la tiza). Si el pH disminuye el carbonato se
descompone. Obviamente, los fosfatos que son parte de muchos medios de
comunicacin tambin juegan un papel importante en el almacenamiento en bfer.
Sin embargo, altas concentraciones de fosfato son crticos en la produccin de
muchos metabolitos secundarios (ver seccin Minerales anteriormente en este
captulo). El uso equilibrado de las fuentes de carbono y nitrgeno tambin formar
una base para el control del pH como capacidad de amortiguacin puede ser
proporcionada por las protenas, pptidos y aminocidos, tales como en el licor de
maz escarpado. El pH tambin puede ser controlado externamente mediante la
adicin de amonaco o hidrxido de sodio y cido sulfrico (captulo 8). LA
ADICIN DE PRECURSORES Y REGULADORES metablica para MEDIA
Algunos componentes de una fermentacin ayuda medio para regular la
produccin del producto en lugar de apoyar el crecimiento del microorganismo.
Tales aditivos incluyen precursores, inhibidores e inductores, todos los cuales
pueden ser usados para manipular el progreso de la fermentacin. Algunos
productos qumicos precursores, cuando se aade a ciertas fermentaciones, se
incorporan directamente en el producto deseado. Probablemente el ejemplo ms
antiguo es el de mejorar los rendimientos de la penicilina (Moyer y Coghill, 1946,
1947). Una gama de diferentes cadenas laterales se puede incorporar en la
molcula de la penicilina. El significado de las diferentes cadenas laterales se
aprecia primero cuando se observ que la adicin de licor de maz escarpado
aument el rendimiento de la penicilina de 20 unidades cm - 3 a 100 unidades de

cm - 3. Se encontr licor de maz escarpado para contener la feniletilamina que

fue incorporada preferentemente en la molcula de la penicilina para producir
bencilpenicilina (penicilina G). Habiendo establecido que la actividad de la
penicilina estaba en la cadena lateral, y que el factor limitante fue la sntesis de la
cadena lateral, se convirti en la prctica estndar de aadir los precursores de la
cadena lateral para el medio, en particular el cido fenilactico. Smith y Bide
(1948) mostraron que la adicin de cido fenilactico y sus derivados, para el
medio eran capaces de aumentar tanto la produccin de penicilina triple y para
dirigir la biosntesis hacia el aumento de la proporcin de bencil penicilina 0-93% a
expensas de otras penicilinas. El cido fenilactico sigue siendo el precursor ms
ampliamente utilizado en la produccin de penicilina. Algunos ejemplos
importantes de precursores se dan en la Tabla 4.12. Inhibidores Cuando se
aaden ciertos inhibidores de la fermentacin, ms de un producto especfico se
pueden producir, o un intermedio metablico que normalmente se metaboliza se
acumula. Uno de los primeros ejemplos es la produccin microbiana de glicerol
(Eoff et al, 1919). La produccin de glicerol depende de la modificacin de la
fermentacin del etanol mediante la eliminacin de acetaldehdo. La adicin de
bisulfito de sodio al caldo conduce a la formacin del compuesto de adicin de
bisulfito de acetaldehdo (sulfito de sodio hidroxi etilo). Desde acetaldehdo es 105
Principios de la tecnologa de fermentacin, segundo Edn. TABL E 4.12.
Precursores utilizados en procesos de fermentacin Precursor Producto
Microorganismo Referenc e-cido fenilactico Penicilina G Penicillium
chrysogenum Moyer y Coghill y compuestos relacionados (1947) actico Fenoxi
Penicilina V Penicillium chrysogenum Soper et al. (1948) Cloruro clortetraciclina
Streptomyces aureofaciens v Una Dyck y de algunos R (1952) Cloruro
Griseofulvina Pnicillium griseofulvina Rhode s et al. (1955) * propionato
Riboflavina Lactobacillus bulgaricus Smiley y Stone (1955) Los cianuros vitamina
B12 Proprianobacterium, Mervyn y Smith Streptomyces spp. (1964) / 3-Iononones
carotenoides Phycomyces blakesleeanus Reye s et al (1964) -amino butrico-L
isoleucina Bacillus subtilis Nakayama (1972b) D-treonina L-isoleucina Serratia
marcescens cido antranlico L-triptfano Hansenula anomala Nuclesido s y
nicomicinas Streptomyces tendae Vecht-Lifshitz y bases Braun (1989)
Dihydronovobionic Dihydronovo- Streptomyces sp. Walton et al. (1962) biocin
cido p-hidroxicinamato Organomycin Streptomyces organonensis Eiki et al.
(1992) A y DL-a -amin o butrico Ciclosporina A Tolypocladium inflatum Kobel y
Traber L-Treonina ciclosporina C (1982) Tirosina o p-hidroxi DimethylvancoNocardia orientalis Boeck et al. (1984) Mycin fenilglicina * Los rendimientos no son
tan altos como por la tcnica r othe s ya no est disponible para la re-oxidacin de
NADH2, su lugar como aceptor de hidrgeno es tomada por dihydroacetone
fosfato, producido durante la gluclisis. El producto de esta reaccin es el glicerol3-fosfato, que se convierte en glicerol. La aplicacin de los inhibidores generales y
especficos se ilustran en la Tabla 4.13. En la mayora de los casos, el inhibidor es
eficaz para aumentar el rendimiento del producto deseado y reducir el rendimiento

de productos indeseables. Un nmero de estudios han sido realizados con

inhibidores de cloracin potenciales, por ejemplo, bromuro, para minimizar la
produccin de clortetraciclina durante una fermentacin tetraciclina (Gourevitch et
al, 1956; Lepetit SpA, 1957; Goodman et al, 1959; Lein et al, 1959; Szumski,
1959). Inhibidores tambin se han utilizado para afectar a la estructura de la pared
celular y aumentar la permeabilidad para la liberacin de metabolitos. El mejor
ejemplo es el uso de penicllin y tensioactivos en la produccin de cido glutmico
(Phillips y Somerson, 1960). Inductores La mayora de las enzimas que son de
inters industrial son inducibles. Enzimas inducidas se sintetizan slo en respuesta
a la presencia en el medio ambiente de un inductor. Los inductores son a menudo
sustratos tales como almidn o dextrina para amilasas, maltosa para pululanasa y
pectina para pectinasas. Algunos inductores son muy potentes, tales como la
induccin de isovaleronitrile nitralase (Kobayashi et al, 1992). Anlogos de sustrato
que no son atacados por la enzima tambin pueden servir como inductores
enzimticos. La mayora de los inductores que estn incluidos en los medios de
comunicacin enzima microbiana (Tabla 4.14) son sustratos o anlogos de
sustrato, pero los productos intermedios y a veces pueden ser utilizados como
inductores. Por ejemplo, maltodextrinas inducirn cidos grasos de amilasa y
lipasa inducen. Sin embargo, el costo puede prohibir su uso como inductores en
un proceso comercial. Comentarios han sido publicados por Aunstrup et al (1979)
y Demain (1990). Una aplicacin inusual de un inductor es el uso de manano de
levadura en la produccin de estreptomicina (Inamine et al, 1969). Durante la
fermentacin cantidades variables de estreptomicina y mannosidostreptomycin se
producen. Desde mannosidostreptomycin tiene slo 20% de la actividad biolgica
de la estreptomicina, el primero es un producto indeseable. El Streptomyces
griseus organismo de produccin puede ser inducida por manano de levadura
para producir / 3-manosidasa que convertir mannosidostreptomycin a la
estreptomicina. Ahora es posible producir una serie de protenas heterlogas en
levaduras, hongos y bacterias. Estos incluyen las protenas de origen viral,
humano, animal, vegetal y Mi- 106 Medios de Fermentaciones Industriales TABLA
4.13. Los inhibidores especficos y generales utilizados en Inhibidor
fermentaciones Producto Efecto principal micro-organismo Referenc e glicerol
sodio bisulfito acetaldehdo pro- Saccharomyces Eoff et al. produccin reprimida
cerivisiae (1919) Tetraciclina Bromuro Clortetraciclina Streptomyces Lepetit
formacin reprimido aureofaciens (1957) glutmico penicilina permeabilidad de la
pared celular Micrococcus Phillips et al. glutamicus cido oxlico (1960) El cido
ctrico de metal alcalino / fosfato reprimido Aspergillus niger Batti (1967) fosfato,
pH por debajo de 2,0 Valina Varios Varios efectos inhibidores con Breuibacterium
Uemur una et al. diferente roseum inhibidores (1972) Rifamicina Di-etil
barbitrico OTRA S rifamicinas Nocardia Lancini e inhibido mediterranei Whit e
(1973) 7-cloro-6 de- etionina Afecta a un carbono Streptomyces Neidleman et al.
methyltetracycline reacciones de transferencia de aureofaciens (1963) origen
microbianas (Peberdy, 1988; Wayne Davies, 1991). Sin embargo, las protenas

heterlogas pueden mostrar cierto grado de toxicidad para el husped y tienen aa

importante influencia en la estabilidad de expresin de la protena heterloga.
Adems de restringir el crecimiento celular como la biomasa de la toxicidad
proporcionar condiciones selectivas para las clulas segregantes que ya no
sintetizan la protena en un nivel tan alto (Goodey et al, 1987). Por lo tanto, las
condiciones ptimas de crecimiento se pueden conseguir no la sntesis de una
protena heterloga continuamente y slo despus de la induccin de la cultura de
acogida ha crecido en un recipiente para producir suficiente biomasa (Piper y Kirk,
1991). En las clulas de S. cereuisiae donde el promotor Gall es parte del sistema
de expresin de genes, la formacin de producto puede ser inducida mediante la
adicin de galactosa a la medio de crecimiento que contiene glicerol o bajos
niveles no represoras de la glucosa como fuente de carbono. Un sistema
comercial que se ha desarrollado se basa en el promotor ale A en Aspergillus
nidulans para expresar al interfern humano (Wayne Davies, 1991). Esto puede
ser inducida por productos qumicos voltiles, tales como etilmetil cetona, que se
aaden cuando la biomasa tiene aumento a un nivel adecuado y el medio de
crecimiento contiene una fuente de carbono no reprimir o bajos niveles no
represoras de la glucosa. Levaduras metilotrficas tales como Hansenula
polymorpha y Pichia pastoris se pueden utilizar como sistemas alternativos debido
a la presencia de un alcohol oxidasa TABLA 4.14. Algunos ejemplos de
industrialmente importantes inductores enzimticos inductor de enzimas de
microorganismos Referenc e -amilasa Almidn Aspergillus spp. Windish y Mhatre
(1965) Maltos e Bacillus subtilis Pululanasa maltosa Aerobacter Wallenfels et al.
(1966) aerogenes a-Mannosidas e mananos levadura Streptomyces griseus
Inamine et al. (1969) La penicilina acilasa cido fenilactico Escherichia coli
Carrington (1971) de la proteasa s Varios protenas de Bacillus spp. Keay (1971)
Streptococcus spp. Aunstrup (1974) Streptomyces spp. Asperigillus spp. Mucor
spp. Celulosa celulasa de Trichoderma viride e Rees (1972) pectinasas pectina
Aspergillus spp. Fogarty y Ward (1974) (pulpa de remolacha, pulpa de manzana,
cscara de ctricos) Nitralase Isovaleronitrile Rhodococcus Kobayashi et al. (1992),
el promotor rhodochrous (Veale y Sudbery, 1991). Durante el crecimiento en
metanol, que tambin acta como un inductor, el promotor es inducido a producir
alrededor de 30% de la protena celular. En la presencia de glucosa o etanol es
indetectable. Los sistemas de expresin se han desarrollado con P. Paston para el
factor de necrosis tumoral, antgeno de superficie de la hepatitis y galactosidasa. Antgeno de superficie de la hepatitis y otras protenas
heterlogas tambin se pueden expresar por H. polymorpha. REQUISITOS DE
OXGENO A veces se olvida que el oxgeno, aunque no se aade a un medio
inicial como tal, es sin embargo un componente muy importante del medio en
muchos procesos, y su disponibilidad puede ser muy importante en el control de la
tasa de crecimiento y la produccin de metabolitos. Esto se discutir en detalle en
el captulo 9. El medio puede influir en la disponibilidad de oxgeno en un nmero
de maneras, incluyendo las siguientes: 1. metabolismo rpido. El cultivo puede ser

oxgeno limitado debido suficiente oxgeno no puede estar disponible en el

fermentador si ciertos sustratos, tales como azcares metabolizados rpidamente
que conducen a una alta demanda de oxgeno, estn disponibles en altas
concentraciones. 2. La reologa. Los componentes individuales del medio puede
influir en la viscosidad del medio final y su posterior comportamiento con respecto
a la aireacin y agitacin. 3. Antiespumantes. Muchos de los antiespumantes en
uso actuarn como agentes activos de superficie y reducir la tasa de transferencia
de oxgeno. Este tema ser considerado en una seccin posterior de este captulo.
Metabolismo rpido factores nutricionales pueden alterar la demanda de oxgeno
de la cultura. Penicillium chrysogenum utilizar la glucosa ms rpidamente que la
lactosa o sacarosa, y por lo tanto tiene una tasa especfica ms alta de absorcin
de oxgeno cuando la glucosa es la fuente principal de carbono (Johnson, 1946).
Por lo tanto, cuando existe la posibilidad de limitacin de oxgeno debido a un
metabolismo rpido, puede ser superada mediante la reduccin de la
concentracin inicial de sustratos clave en el medio y la adicin de cantidades
adicionales de estos sustratos como una alimentacin continua o semi-continua
durante la fermentacin (ver Tablas 4.1 y 4.15;. Captulos 2 y 9). Tambin se
puede superar mediante el cambio de la composicin del medio, la incorporacin
de los hidratos de carbono ms altos (lactosa, almidn, etc.) y protenas que no se
metabolizan muy rpidamente y no son compatibles con una gran velocidad de
absorcin de oxgeno, tal especfico. Reologa Deindoerfer y West (1960)
informaron de que no puede haber una variacin considerable en la viscosidad de
los compuestos que pueden incluirse en los medios de fermentacin.
BLE 4.15. Algunos procesos que utilizan la alimentacin por lotes o continua de
alimentacin o en el que se han intentado Melaza de levadura Producto Adiciones
Referenc E, fuentes de nitrgeno, y Mg Harrison (1971) Ree d y peppier (1973)
El glicerol Azcar, Na 2C 0 3 Eoff et al. (1919) Adiciones alcohol acetona-butilo y
retiros de Soc mosto. Richard et al. (1921) La riboflavina Carbohidratos Moss y
Klein (1946) Penicilina Glucos correo y NH 3 Hosie r y Johnson (1953)
Novobiocina Diversas fuentes de carbono y nitrgeno Smith (1956) Griseofulvina
Carbohidratos Hockenhull (1956) Rifamicina glucosa, cidos grasos P un et al.
(1959) Las giberelinas Glucos e Borrow et al. (1960) La vitamina B 1 2 Glucos e
Beche r et al. (1961) Las tetraciclinas Glucos e Avanzini (1963) cido ctrico
carbohidratos, NH 3 Pastor (1963) de protena unicelular Metanol Harrison et al.
(1972) Candicidin Glucos e Martin y McDanie l (1975) Estreptomicina glucosa,
sulfato de amonio Singh et al. (1976) cefalosporina Fresh adicin de medio Trilli et
al. (1977)