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Diagnstico molecular de

doenas infecciosas
Jorge L M Sampaio

Panorama atual
As possibilidades e oportunidades so inmeras
Novas tecnologias com custo elevado
Presso dos pagadores para reduo dos custos em
sade
Reduo da atuao humana com automao da
extrao, amplificao e interfaceamento com sistema
de apoio deciso
Nvel de automao depende do nmero de exames
 consolidao de laboratrios de anlises clnicas
O grande desafio reduzir custos mantendo ou
aumentando a qualidade do resultado

Perguntas
Quais as doenas (excetuando as virais) nas
quais os mtodos moleculares so essenciais?
Que tipos de alvos devem ser
prioritariamente selecionados e quais as
principais estratgias?
Quais as principais metodologias aplicveis ao
laboratrio clnico?

Problema
O uso de antimicrobianos que alteram a
microbiota entrica est relacionado ocorrncia
de diarria causada por Clostridium difficile.
Em vrios casos nos quais h evidncias clnicas e
epidemiolgicas sugerindo essa etiologia, a
pesquisa das toxinas A e B nas fezes negativa.
Algumas cepas so mais virulentas em funo de
maior produo e toxinas

Analisando
Qual o padro ouro?
Cultura em meio seletivo seguido de teste de
toxigenicidade
Prazo de 5 a 7 dias

Como possvel detectar

C. difficile

Fonte: Voth, 2005

Fonte: Sloan, 2008

Performance do teste
Clostridium difficile

Sloan et al., 2009

Outra estratgia

Fonte: Espy, 2006

Animao

Reanalisando

Preparo de reagentes de amplificao (rea 1)


Extrao manual (rea 2)
Montagem da reao (rea 2)
Amplificao e anlise (rea 3)
possvel simplificar?

Realmente simplificando: GeneXpert

Realmente simplificando

Pesquisa do DNA de C. difficile


PCR em tempo real GeneXpert

Neisseria gonorrhoeae
Paciente de 25 anos, sem parceiro sexual fixo,
apresenta cervicite e uretrite.
Foram coletadas amostras endocervical e uretral:
Bacterioscpico com raros diplococos Gram-negativos
intracelulares
Cultura em meio seletivo para Neisseria: NEGATIVA

O mdico contesta os resultados


O que pode ter ocorrido e o que pode ser feito?

Viabilidade bacteriana em meio de


transporte

Fonte: Rishmawi, 2007

Neisseria gonorrhoeae
Hjelmevoll, 2008
360 amostras (185 homens e 57 mulheres)
37 positivas por cultura e Rt-PCR para gene porA
15 positivas apenas por RT-PCR, confirmadas por
sequenciamento de rRNA 16S

Alerta: podem ocorrer resultados falsamente


positivos em funo da similaridade dom
espcies no patognicas.

Chlamydia trachomatis
Sem parede celular
Patgeno de multiplicao intracelular
obrigatria
Uretrite
Cervicite
Salpingite  infertilidade/esterilidade

Mtodos disponveis
Isolamento em cultura de clulas McCoy
padro ouro
Imunofluorescncia sensibilidade 88%
RT-PCR/Amplicor sensibilidade 97%

SeptiFast
Deteco de DNA bacteriano ou fngico
em sangue total

Escherichia coli
Klebsiella sp.
Enterobacter sp.
Proteus mirabilis
Pseudomonas aeruginosa
Acinetobacter baumannii
Stenotrophomonas
maltophilia

Staphylococcus aureus
SCN
Streptococcus
pneumoniae
Streptococcus spp.
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecium

SeptiFast
Deteco de DNA bacteriano ou
fngico em sangue total

Candida albicans
Candida tropicalis
Candida parapsilosis
Candida krusei *
Candida glabrata *
Aspergillus fumigatus

Tempo de Anlise
Hemocultura
Transporte/abertura de ficha
 1 hora
Incubao em equipamento
com leitura a cada 10 min
Deteco em 6 a 72 horas
Bacterioscpico e semeadura
ou inoculao e sistema de
automao
8 a 24 horas identificao
Total 15 a 96 horas para
possvel interveno

SeptiFast
3 ml de sangue total
Transporte/abertura de ficha
Extrao do DNA = 2 h
Amplificao do DNA, anlise
e identificao da espcie = 3
h
Total 6 horas para possvel
interveno

Bases Moleculares
Bactrias de crescimento rpido e fungos tm
mltiplos operons de rRNA
Alvo com mltiplas cpias no cromossomo 
maior sensibilidade

rRNA E. coli - GenBank

Como Funciona
Vrias reaes de PCR
Anlise de curva de melting

Estudos Recentes - ICAAC 2008


Tsalik et al. Duke University
Adultos febris atendidos no setor de emergncias
(TA > 38,3C)
Septifast e 1 par de hemoculturas
142 pacientes recrutados, 20% com hemocultura
positiva
Definio de casos:
Confirmado
Provvel
Possvel

ICAAC 2008
Schaub et al. , Sua

Testes positivos

Comparando os Mtodos
Padro Ouro a Clnica

Consideraes
H necessidade de estudos para a avaliao
do impacto na mortalidade e tempo de
internao
Sensibilidade semelhante hemocultura
Menor tempo de resposta
Redirecionamento do tratamento na sepse
por P. aeruginosa, A. baumannii, S.
maltophilia ou Candida krusei/C. glabrata ?

Caso clnico
 Paciente de 34 anos, sexo masculino, HIV
soropositivo apresenta, h duas semanas, febre,
diarria e dor em membro inferior direito em
topografia de cicatriz cirrgica.
 H cerca de trs meses havia sido submetido a
cirurgia ortopdica com colocao de haste de
fixao em funo de fratura traumtica de fmur.
 A tomografia computadorizada de MI evidenciou
abscesso no stio cirrgico e sinais de osteomielite.

Caso clnico
 O paciente foi submetido drenagem cirrgica da
leso e o material enviado para cultura geral, fungos
e micobactrias
 Foram iniciados ceftazidima e vancomicina
 Aps duas semanas no houve crescimento
bacteriano ou fngico
 Em funo da persistncia da febre foi solicitada a
coleta de trs hemoculturas

Giemsa

Identificao

Identificao
 Realizada extrao do DNA do crescimento em
Karmali.
 Amplificao e sequenciamento parcial do gene que
codifica a subunidade 16S do RNA ribossmico (rRNA
16S).

Resultado do alinhamento da seqncia


parcial do rRNA 16S com os depsitos do
GenBank

100% de similaridade com Helicobacter fenneliae

Outras aplicaes
Identificao do Complexo M. tuberculosis e
diferenciao de M. bovis e M. bovis BCG.

Culturas para micobactrias


escarro ou lavado bronco-alveolar
Isolados Identificados na Rotina - Jan a Dez 2009 - Fleury

Complexo M. tuberculosis

55

55,0

Mycobacterium avium/intracellulare

22

22,0

Mycobacterium abscessus

8,0

Mycobacterium kansasii

7,0

Mycobacterium gordonae

2,0

Mycobacterium spp.

6,0

Barnes PF, Cave MD. Molecular epidemiology of tuberculosis. N Engl J


Med. 2003;349(12):1149-56.

Por que PCR Multiplex?


50% dos casos identificados em uma nica
reao
reduo de custo
reduo da carga de trabalho
agilidade

Diferenciao de M. bovis e M. bovis BCG


(pirazinamida R)

Sequncias alvo no multiplex


IS6110  complexo MTB
hsp65  todas as micobactrias
Espaadores 33 e 34 regio DR 
diferenciao de M. bovis e M. bovis BCG
Yeboah-Manu D, Yates MD, Wilson SM. Application of a simple multiplex
PCR to aid in routine work of the mycobacterium reference laboratory. J
Clin Microbiol. 2001;39(11):4166-8.

Regio DR
DR

DR

30

30

DR

DR

31

31

DR

DR

32

25

DR

DR

37

32

DR

DR

38

33

DR

39

DR

DR

40

DR

41

DR

42

M.tuberculosis

34

DR

35

DR

36

DR

37

M.bovis
selvagem

33

DR

34

DR

35

DR

36

M.bovis BCG

99 bp

DR

30

DR

31

DR

25

DR

32

DR

33

DR

172 bp

99 bp

PCR Multiplexo

O que fazer para identificar as demais


espcies

rRNA 16S (rrs)


hsp65
ITS 16S-23S
sodA
gyrB
rpoB

Alvos mais Utilizados


rRNA 16S (rrs)
Aproximadamente 1.500 bp
Regies hipervariveis A (129-267) e B (430500)
Na prtica 9  609
No permite diferenciao:

espcies do complexo MTB


M. abscessus e M. chelonae
M. zulgai e M. malmoense
M. kansasii e M. gastri
M. ulcerans e M. marinum
M. shimoidei e M. triviale

Alvos mais Utilizados


hsp65
1623 bp
Na prtica 146  585 = 441bp
Permite diferenciao
M. abscessus e M. chelonae
M. zulgai e M. malmoense
M. kansasii e M. gastri

No permite diferenciao
Espcies do Complexo MTB

Seqenciamento de DNA
Fundamentos

Estrutura dos cidos Nucleicos

Nucleotdeos Estrutura dos cidos Nucleicos

DNA
RNA

Ligao Fosfodister

Ligao Fosfodiester

Dideoxinucleotdio Frederick Sanger Prmio


Nobel Qumica - 1980

Sequenciamento de DNA
cycseqpc.exe

O laboratrio clnico hoje


Extrao automatizada

Estao para preparo automatizado de


reaes

Automao HIV-HCV-HBV

Automao

Automao

Automao