BIOQUIMICA

Laboratorio Bioqumica

Determinacin de la concentracin de clorofila en una muestra de Beta vulgaris var.

Cicla (acelga) , y establecimiento de su espectro de absorcin
Yesica Natalia Lpez, Cesar David Chaparro
a

Campus del Puente del comn, km 7, Autopista Norte de Bogot, Cha, Cundinamarca, Colombia

I N F O R M A C I O N ARTI C U L O
Historia del artculo:
Recibido febrero 12 de 2015
Recibi en forma revisada -__
Aceptado-__
Palabras clave:
Pigmento
Transmitancia
Absorbancia
Espectro de absorcin
colorimetria

RESUMEN

Se realiz un barrido del espectro UV-VIS de un patrn de clorofila con el fin de identificar la
longitud de onda a la cual esta biomolecula absorbe mayor cantidad de luz, para posteriormente
realizar la cuantificacin de clorofila que se encuentra en la Beta vulgaris var. Cicla .Este anlisis
se efectu mediante el estudio de una muestra problema obtenida tras el tratamiento de la materia
prima, la cual fue sometida a un proceso de secado y extraccin soxhlet; con el extracto obtenido se
realizo una solucin de 1 mg/ ml aproximadamente, se midi la absorbancia y finalmente se obtuvo la
concentracin de clorofila en la muestra a travs de mtodos grficos. Adicionalmente cada miembro
en el equipo de trabajo realizo 5 mediciones de 700 l cada una con el fin de probar cul de ellos es
mas diestro en el uso de la micropipeta.

1. Introduccin
El estudio a nivel bioqumico de cualquier biomolcula requiere
la utilizacin de tcnicas analticas que permitan su
determinacin cualitativa y cuantitativa, as como su
caracterizacin fsico-qumica y biolgica; una de las tcnicas
ms utilizadas es la espectroscopia de luz UV- VIS debido a que
permite hallar la concentracin de un compuesto en solucion 1
(Nieves Abril Daz); adicionalmente trabajos tericos muestran
que el umbral de absorcin de la longitud de onda del espectro de
absorcin del UV-Vis proporciona una estimacin razonable del
tamao de partcula (S. Martnez).
La clorofila es una de las biomolculas de mayor inters, no solo
por ser un pigmento capaz de convertir la energa ptica de la luz
en energa elctrica, lo cual la hace responsable en gran medida
de la vida de las plantas 2 (CALVO) , sino adems por poseer
propiedades anti cancergenas, antibacterianas, antioxidantes, y
energizantes3 (Botanical online); por lo general los pigmentos
fotosintticos como la clorofila y la feofitina son habitualmente
determinados por mtodos espectrofotomtricos4 (S. DEL
VALLE TASCN)
La finalidad de este laboratorio es determinar cuantitativamente
la concentracin de clorofila en una muestra problema de Beta
vulgaris var. Cicla mediante el uso de la espectroscopia de luz
UV-VIS como tcnica de cuantificacin de esta biomolcula,
adems se busca establecer el espectro de absorcin de la
clorofila, la longitud de onda a la que posee mayor absorcin de

la luz, y la familiarizacin del equipo de trabajo con el uso del

espectrofotmetro
2. Mtodos y Materiales
2.1. Espectros de absorcin UV-VIS para clorofila
Se tomo una pastilla patrn de clorofila y se macer finamente
con ayuda de un mortero, con lo cual posteriormente se prepar
una solucin de clorofila de 5 mg/ml en una mezcla etanol- ter
etlico (9:1) para montar una alcuota en una celda de cuarzo y
llevar a cabo un barrido del espectro UV-VIS en el
espectrofotmetro
2.2. Curva de calibracin para la clorofila:
Se prepararon disoluciones de 25 ml de 2,4,8,12,16 y 20 mg/ml
con el patrn de clorofila preparado anteriormente, se determino
la absorbancia de las muestras con ayuda del espectrofotmetro
para realizar la curva de calibracin
2.3. Determinacin de la concentracin de clorofila en la
muestra problema

BIOQUIMICA

Se pesaron 4.52g de acelga fresca, se corto en trozos muy

pequeos y se llevo a la estufa por 3 h a 40C con el fin de
determinar el % de humedad que haba en la muestra; una vez se
obtuvo el material completamente seco, se realizo una extraccin
soxhlet con una mezcla de etanol- ter etlico (9:1) durante 3h;
tras dejar secar la muestra se realiza una solucin de 1mg/ml para
determinar la concentracin de clorofila en las mismas
condiciones en las que se realizo la curva de calibracin
2.4. Establecimiento de habilidad para utilizar la micropipeta

* si 2C => 2(2-log(82))=2-log(%T)
log(%T)=2+2log(82)-4=> log(%T)=1,8276
%T=67,24

e.

Cada uno de los integrantes del equipo de trabajo se encarga de

medir 700 l con la micropipeta, y repite el procedimiento 5
veces con el fin de establecer quien tiene mayor habilidad para
manejar este instrumento
3. Cuestionario
a.

Cuando se analiza una muestra que contiene hierro (II) por

el mtodo del - bipiridilo se obtiene una transmitancia de
57.5% contra un blanco de reactivos, en una cubeta de
1.00cm. Si la absortividad molar del - bipiridilo ferroso
es de 8.650. cul ser la concentracin del hierro en la
muestra, en moles/litro?

A=logT =log 0.575=0.24

La absortividad molar de cierto soluto es de 2.1x104.

Calcular la transmitancia para una solucin 2.00x10-6 M.
utilizando una cubeta de 5.00 cm.

C=
A= CL =( 2.110 4 ) ( 2106 M ) ( 5 cm )=0.21
T=
b.

= 0.62

f.

Se sabe que una sustancia tiene una absortividad molar de 14

000 a su longitud de onda de mxima absorcin. Calcular
que molaridad de esta sustancia podr medirse en un
espectrofotmetro, si se desea que la lectura de absorbancia
sea de 0.850, en una cubeta de1.00 cm.

C=
c.

1
10 A

A
0.850
=
=6.07105 M
l ( 14000 ) (1 cm)

A=log T =log 0.192=0.72

d.

Utilizando una cubeta de absorcin de 1.00 cm, se determin

la transmitancia de la luz de 436 nm (436 A) para una
solucin de bromo en tetracloruro de carbono,
encontrndose los siguientes resultados:

Calcular la absortividad molar, .

El porcentaje de transmitancia de una solucin acuosa de

fumarato de sodio a 250 nm y 25C, es de 19.2% para una
solucin 5x10-4 M. en una celda de 1.00 cm. Calcular la
absorbancia y la absortividad molar correspondiente.

A
0.24
=
=0.028 M
l (8.650)(1cm)

A
0.72
=
=1.440
4
Cl ( 510 M ) (1 cm)

Una solucin de concentracin C de una sustancia coloreada

tiene un %T de 82.0 si la concentracin se cuadriplica el %T
es de 45.2. Demostrar que la solucin obedece la ley de
Lambert-Beer y calcular el %T para una concentracin 2C.

A=2-log(%T)=e*b*c

1.

A
2
=
=366.3
3
Cl ( 5.4610 M ) (1cm )

2.

A
1.52
=
=434.3
Cl ( 3.5103 M ) ( 1cm)

3.

A
0.796
=
=179.04
Cl ( 2.1103 M ) (1 cm)

4.

A
0.465
=
=372
Cl ( 1.25103 M ) (1 cm)

5.

A
0.244
=
=381.25
Cl ( 0.64103 M ) (1 cm)

*C=2-log82) => 4(2-log(82))=2-log(%T)

=>log(%T)=-8+4log(82)+2=>log(%T)=1,65
%T=45,2

g.

Se sabe que las sales de VO+2 tienen una absortividad molar

de 12.000 a su longitud de onda de mxima absorcin. Si se
utiliza celda de 10.00 cm, calcular cuntos mg/ml de VO+2

BIOQUIMICA
debern estar presentes para producir una absorbancia de
0.573. (Pm VO+2 = 91.942).
4. Resultados y discusin de resultados

C=
h.

La absortividad molar () del cido benzoico en metanol es

aproximadamente 1950 a 275nm. cul ser la mxima
concentracin de cido benzoico, en g/ml que puede usarse
en una celda de 1.00 cm para que la absorbancia no exceda
de 0.013?

C=

i.

A
0.573
=
=4.775103
l ( 12 ) (10 cm)

mol
91.942 g
l
1000l
4.1. Espectros de absorcin UV-VIS
mol
=0.44 mg/ml
1000 g

A
0.013
=
=6.67106
l ( 1950 ) (1 cm)

mol
122.1 g
l
1000 l
mol
=0.814 g/ml
1 ml

Una solucin de permanganato de potasio de concentracin

C tiene una transmitancia de 60.0 % en una celda de 1.00
cm., a una determinada longitud de onda. Si se dobla la
concentracin, calcular. a. El % de T b. La absorbancia y
laconcentracin de KMnO4 para dar 60.0 % de T en una
celda de 10.00 cm de paso de luz.e*b*c=2-log(%T)
a)

c=2-log(60)
c=0,22=> 2(0,22)=2-log(%T)
log(%T)=2-0,44 => %T=36,307

b)

A=2-log(60)=0,2218
C=(2-log(60))/10=0,022M

j.

Una muestra de 1.000 g que contiene manganeso se

determin por espectrofotometra, se prepar un extracto de
250 ml de la solucin de concentracin desconocida, se
tom una alcuota de 5 ml y se diluy en un baln aforado
de 50 ml. Luego, para poder interpolar la curva estndar de
manganeso a 535 nm de la ltima solucin, se tom una
alcuota y se diluy en una solucin 1:2. La transmitancia de
la solucin medida en un espesor de 1 cm es de 40 %. Si la
absortividad molar es 2300 L/mol.cm, determine: a) % de
Mn en la muestra b) mg/Kg de Mn en la muestra.
C=(2-log(40))/2300=1,73E-4M*2=3,46E-4M*0,05L=
1,73E-5moles/0,005L=3,46E-3M*0,25L=8,65E4moles*55gmol=0,0475gramos de Manganeso al inicio
a)

%manganeso= 4,75%

b)

0,0475g*1000=47,5mg/1E-3Kg=47500mg/kg

Imagen 1: barrido del espectro UV-VIS para la clorofila

El barrido se realizo en un rango desde los 400 hasta los 700 nm
con el fin de identificar la longitud de onda mxima a la que la
molcula de clorofila presenta mayor absorbancia, este rango de
longitudes de onda se utilizo debido a que en l se encuentra la
luz visible, sin embargo solo en determinados rangos (400-500
) ( 600-680) tiene la capacidad de alterar los electrones que se
encuentran en las molculas de clorofila (Valencia & Gonzales,
2013). Como se evidencia en la imagen 1, se obtuvieron 2
grandes picos; el primero de ellos correspondiente a los 400 nm
aproximadamente , alrededor del azul, y otro a los 609 nm
alrededor del rojo; segn (Valencia & Gonzales, 2013) en los
distintos estados energticos en los que puede estar una molcula
de clorofila, solo se van a observar aquellos en los que las
frecuencias asociadas de la luz estn a 4.6x105 Y 6.6x10 2 htz.
De tal manera que la mayora de los electrones de la molcula
tendrn sus estados de energa acotados en bandas que estn
alrededor de las frecuencias del rojo y el azul; sin embargo dado
que existe gran variedad de compuestos que al igual que este
absorben en frecuencias de azul, el pico presente cercano a
400nm fue descartado a pesar de ser el ms alto, y se escogi el
de 609 nm como la longitud de onda a la cual se realizara la
medicin de absorbancia de la muestra problema
4.2. Curva de calibracin para la clorofila
En la realizacin de la curva de calibracin que se utilizara para
hallar la concentracin de clorofila, uno de los valores de
absorbencia tomados se aleja un poco de lo esperado tal como se
puede observar en la grafica 1, dicha diferencia puede deberse a
errores de procedimiento, como una mal aproximacin de la
concentracin de clorofila presente en la muestra 4 , dados por
errores de medicin a la hora de realizar la solucin con etanolter etlico (9:1) .
A pesar de la diferencia si se sigue el criterio de Chauvenet
para el descarte de datos, este valor no se puede rechazar debido

BIOQUIMICA

a que un dato se excluye si se desva de la media un valor mayor

a la desviacin tpica, para esta toma de datos la media
corresponde a 0.395 y la desviacin estndar a 0.219 , por tanto
ningn valor de la toma de datos se descarta

Y = 3.0607X +0.0321
Realizando un simple despeje se pudo obtener que el coeficiente
de extincin = 3.0607 y por tanto la concentracin de clorofila
en la muestra est dado por
X= ((y-b)/m)=(0.20-0.0321)/3.0607
X= 0.055
Al comparar la concentracin de clorofila de la muestra con la
grafica de calibracin se puede notar que este resultado
concuerda con la lnea de tendencia, comprobando que existe una
amplia relacin de independencia entre la absorbancia y la
concentracin.

Grafica 1: curva de calibracin de la concentracin de la clorofila

vs la absorbancia
4.3. Determinacin del porcentaje de humedad de la muestra

tipo de crisol
vacio
con
muestra
hmeda
con muestra seca

peso ( g)
52.1625

Para poder cuantificar una sustancia por interpolacin a partir de

su espectro, en este caso hallar la concentracin de la clorofila en
la muestra problema, es necesario que su concentracin se
encuentre en el intervalo de linealidad de la curva de calibracin,
ya que valores por encima (muy concentrada) o por debajo (muy
diluida) no sern cuantificados de manera confiable (Gmez &
Florian); tambin es muy importante asegurarse de escoger
adecuadamente la longitud de onda a la cual se realizara la
medicin de absorbancia debido a que a determinada longitud de
onda se marca ms la relacin de dependencia existente entre la
absorbancia y la concentracin, haciendo de el resultado obtenido
un dato ms exacto
4.5. Establecimiento de habilidad para utilizar la micropipeta

700L DE
YESICA
0.7407 g
0.7216 g
0.7322 g
0.7257g
0.6817 g

56.762
52.6066

Tabla 1: tipo de crisol vs el peso por crisol

El valor del porcentaje de humedad presente en la materia
prima utilizada fue calculada a partir de la siguientes relaciones:
(g) agua= crisol muestra humeda crisol muestra seca
(g) muestra inicial= crisol muestra humeda- crisol vacio
%Humedad= ((g) agua*100)/ (g) muestra inicial
Obteniendo que % Humedad= (4.1554*100)/ 4.5995 = 90.3 %
El porcentaje de humedad presente en esta planta corresponde a
ms del 90 %, evidencia de que todos los seres vivos estamos
constituidos bsicamente por agua
4.4. Determinacin de la concentracin de clorofila en la
muestra problema
La absorbancia de la muestra problema de Beta vulgaris var.
Cicla obtenida con ayuda de espectrofotmetro es 0.20; a partir
de este resultado se logro obtener la concentracin de clorofila
presente en la muestra problema por medio de mtodos grficos,
teniendo en cuenta que la ecuacin de la grafica de la curva de
calibracin sigue la tendencia Y=mx+ b donde:

AGUA
CESAR
0.9280 g
1.2055 g
1.0328 g
0.9632g
1.0092 g

Tabla 2: g de agua obtenidos tras medir con la micropipeta

700L

La densidad de agua a 20C es 9,9829E4 g/l as que el peso de

700 l es de 0,6988 g.
A simple vista se puede notar que quien ms se aproxim a ste
dato fue Yesica, debido a que estos datos obtuvieron no solo la
menor desviacin estndar sino tambin la menor desviacin
tpica, por lo tanto fueron ms homogneos lo que nos dice que
entre una medicin y otra no hubo diferencia significativa y un
correcto uso de la micropipeta.

Varianza muestral
Desviacin tpica

Yesica
Cesar
0,00051 0,01152
964
036
0,02279 0,10733
555
293

Y corresponde a la absorbancia de la clorofila

Tabla 2: anlisis estadstico para la toma de datos

m corresponde a l coeficiente de extincin molar * l con l =

longitud de la celda= 1

5. Conclusiones

X= corresponde a la concentracin de la clorofila en la muestra

La clorofila es una biomolecula que presenta mayor absorbancia

en dos rangos especficos de longitud de onda, entre 400 -500nm

Obteniendo:

BIOQUIMICA
y 600 y 650nm de forma que absorben para los colores azul y
rojo

6. Bibliografa
1.

Botanical online. (s.f.). Botanical online. Recuperado el

7 de febrero de 2015, de http://www.botanicalonline.com/clorofila.htm

2.

La concentracin de clorofila presente en la muestra problema de

Beta vulgaris var. Cicla sigue la linealidad de la curva de
calibracin

CALVO, M. (s.f.). Bioquimica de los alimentos.

Recuperado el 7 de febrero de 2015, de
http://milksci.unizar.es/bioquimica/temas/pigmentos/clo
rofila.html

3.

Para obtener valores ms exactos a la hora de calcular la

concentracin y el coeficiente de extincin molar de forma
grafica es necesario realizar las soluciones a distintas
concentraciones de forma precisa y escoger la longitud de onda
apropiada para medir la absorbancia de dichas soluciones

CARLOS RIVERA R., . Z. (2005). COMPARACIN

DE LA ESTIMACIN DE LA CLOROFILA-a
MEDIANTE LOS MTODOS
ESPECTROFOTOMTRICO Y FLUOROMTRICO.
Bogota .

4.

F, M.-R. V., & R.*, C.-Z. (2011). Caracterizacin de las

propiedades pticas de Betacianinas y Betaxantinas por
espectroscopa Uv-Vis y barrido en Z . Guadalajara.

5.

Gmez, D., & Florian, E. L. CONCENTRACIN Y

CALIBRACIN: LEY DE BEER. Medellin.

6.

Loaiza, L. (2012). ANALISIS ESTADISTICO

APARTIR DEL CRITERIO DE CHAUVENET. Bogota
.

7.

Nieves Abril Daz, J. A.-V. Espectrofometra: Espectros

de absorcin y biomoleculas . Cordoba.

8.

S. DEL VALLE TASCN, M. J. COEFICIENTES DE

EXTINCIN DE CLOROFILASY FEOFITINAS (a y
b) EN DMSO Y ECUACIONES PARA EL CLCULO
DE SUS CONCENTRACIONES. Valencia: 1994.

9.

S. Martnez, T. S. Sntesis y caracterizacin de

nanoparticulas de CdS obtenidas por microondas.
Mexico.

Para descartar un dato de un espacio muestral es necesario un

tratamiento estadstico conocido como criterio de Chauvenet,
para el caso correspondiente a este articulo en particular no se
debe descartar ningn dato que tenga una desviacin estndar
menor a 0.2 por encima de la media

10. Valencia, R. R., & Gonzales, R. A. (2013). Espectro de

absorcion de la clorofila.