Citometria de Flujo

La citometria de flujo (CMF) es una tcnica de anlisis celular multiparametrico

cuyo fundamento se basa en hacer pasar una suspensin de partculas
(generalmente clulas) alineadas y de una en una por delante de un haz de lser
focalizado. La citometra de flujo es una tecnologa (proceso) que permite la medida
simultnea de mltiples caractersticas fsicas de una sola clula. Estas medidas son
realizadas mientras las clulas (partculas) pasan en fila, a una velocidad de 500 a
4000 clulas por segundo, a travs del aparato de medida en una corriente de fluido
(1).

EL CITOMETRO
COMBINADO DE :

NECESITA

Fluidos,
restringir
anlisis

para
las

UN

SISTEMA

introducir
clulas

y
para

Optica , una fuente de excitacin

y un sistema coleccin para

generar y recoger las seales
luminosas.
El
sistema
de
excitacin consiste en un lser,
lentes y prismas para dirigir el
rayo. El sistema de coleccin
consiste en espejos pticos y filtros para encaminar determinadas
longitudes de onda hacia detectores pticos determinados.

Electrnica, para convertir las seales pticas en seales electrnicas

proporcionales y digitalizarlas para anlisis computacional.

SISTEMA HIDRAULICO: Controles neumtico y fluidos para establecer un flujo

laminar que permita a la suspensin celular atravesar la cmara de flujo.
SISTEMA OPTICO: Lser (Argn con luz monocromtica de 488nm , filtros , lentes y
detectores.
SISTEMA ELECTROINFORMATICO: Convierte la luz dispersa en seales elctricas y
las procesa para su anlisis.

Sistema

optico

El impacto de cada clula con el rayo de luz

produce
seales
que
corresponden
a
diferentes parmetros de la clula y que son
recogidos por distintos detectores.
PARAMETROS
Caractersticas

Morfolgicas

de

la

clula : tamao y complejidad del citoplasma

Caractersticas
antigenicas
de
la
clula : Inmunofenotipo.
PARAMETROS FISICOS

Su tamao relativo (forward scatter-FSC)

Su granularidad relativa o complejidad interna ( side scatter

SSC).

FLUORESCENCIA RELATIVA (FL1, FL2, FL3)

Determinacin

cuantitativa

de

caractersticas

antignicas,

bioqumicas y biofsicas de clulas individuales (1,2).

OBJETIVOS
PRINCIPALES
LA CITOMETRIA DE FLUJO

DE

Identificar y enumerar
subpoblaciones
celulares
nicas y definidas.

Seleccionar y separar
fsicamente subpoblaciones
de clulas deseadas (por
defleccin electrosttica ;
esta
tecnologa
de
separacin
se
llama
"electronic cell sorting")

Medir
capacidad
funcional de subpoblaciones
celulares definidas

COMO

SE

DETECTAN

ESTAS

CARACTERISTICAS

El citmetro de flujo detecta como las clulas interactan con un rayo lser en
trminos de cmo la clula :

desva la luz incidente (parmetros FSC y SSC)

emite fluorescencia (parmetros FL1. FL2. FL3)(1).

LAS PROPIEDADES DE DISPERSION DE LA LUZ UNA CELULA
INFORMACION ACERCA DEL TAMAO CELULAR Y GRANULARIDAD

NOS

DA

SEALES
DE
DISPERSION
Forward Scatter (FS) :luz dispersada frontalmente en ngulo cnico pequeo (0-10
grados ) coincidente con luz incidente y es proporcional a tamao de la partcula
que produce la dispersin.

La luz es desviada a bajos ngulos entre 1 y 10 grados

Generalmente proporcional al tamao celular
Detectada a lo largo del eje del rayo de luz incidente en direccin delantera

Side Scatter (SSC) : luz dispersada lateralmente es proporcional al la complejidad

de la estructura celular.

Luz es desviada a altos ngulos

Proporcional a la granularidad de la clula y su complejidad
Detectado a 90 grados del eje de luz incidente.

FLUORESCENCIA
Un fluorocromo es una molcula qumica que absorbe la luz a una determinada
longitud de onda (ENERGIA ) energa de excitacin y emite a una longitud superior
(MENOR
ENERGIA)
Interacciona con la luz de excitacin procedente de el lser. Se utiliza unido a
anticuerpos especficos (monoclonales ) para antgenos de la clula. La cantidad de

fluorescencia con la cual una clula se tie es proporcional a la cantidad de sitios de

unin.
Cmo se obtiene la luz fluorescente.

Unin de sitios especficos con

anticuerpos marcados con fluorocromos

El fluorocromo absorbe energa del lser

Vibracin y disipacin del calor.

El fluorocromo libera energa absorbida

por :

de onda llamada fluorescencia (1,2,3).

Emisin de fotones a una mayor longitud

REACTIVOS FLUORESCENTES
Marcadores

fluorescentes

de

unin

covalente: Isoticianato

de

Fluoresceina,

Picoeritrina,
rodamina,
rojo
texas,
cianinas.
Marcadores fluorescentes de unin no covalente: Hoechst, DAPI, Naranja de
acrimina,
yoduro
de
propidio,
Los marcadores fluorescentes son sensibles al medio ambiente .

rh12.

Pequeas molculas orgnicas (FITC, biotina): unin covalente directa con

grupos amino libres en anticuerpos

Protenas fluorescentes (ficoeritrina, aloficocianina): se unen a anticuerpos a

travs de algunos reactivos.

REALIZACIN
DE FLUJO

DE

CITOMETRIA

Se hace en 3 etapas independientes :

Fase pre-citometra: preparacin de los

reactivos, preparacin de las clulas, diseo
del protocolo y coloracin de las clulas con
los reactivos fluorescentes.

Fase de citometra de flujo : involucra el

procesamiento de las clulas marcadas y la
recoleccin de los datos para cada una de las
medidas (parmetros) realizados en cada
clula individual.

Fase de anlisis: anlisis de los datos recolectados

La mezcla de clulas teidas con diferentes fluorocromos es forzada a pasar a

travs de una aguja creando una delgada fila de lquido que contiene las clulas. A
medida que cada clula pasa en frente del lser, desva el rayo incidente y las
molculas teidas unidas a la clula van a ser excitadas y emiten luz fluorescente.
Tubos fotomultiplicadores detectan tanto la luz desviada y las emisiones
fluorescentes, la informacin es digitalizada y procesada por el computador. Los
resultados son presentados a manera de histogramas o "dot-plots" (2).

APLICACIONES DE LA CITOMETRIA DE FLUJO

Hematologa : tipificacion y conteo de clulas , reticulocitos y anlisis

de medula sea .

Farmacologa :estudios de cintica celular

Inmunologa :subpoblaciones de linfocitos ,tipaje tisular

Oncologa :Diagnostico y pronostico ,monitores de tratamientos

Microbiologa :diagnostico bacteriano y virico ,estudios de sensibilidad

a los antibiticos

Gentica : Cariotipo y diagnostico de portador y diagnostico prenatal.

INMUNOTIPIFICACIN
Es el proceso para determinar marcadores expresados en la superficie celular.
Esta deteccin se hace empleando anticuerpos monoclonales antgeno-especficos
marcados con un fluorocromo dirigidos al marcardor que queremos evaluar.
Para esto, es necesario aislar previamente las clulas a analizar ( por ejemplo
linfocitos, a partir de sangre total, por gradiente de ficoll ). Las clulas son luego
estimuladas a producir los marcadores ponindolas en contacto con un antgeno
capaz

de

estimular

su

sntesis.

Posteriormente estas son incubadas con una sustancia denominada brefeldina A

(BFA) cuya funcin es impedir que las clulas expulsen las citoquinas que estn
sintetizando, haciendo entonces que se acumulen en su interior.Despus las clulas
son fijadas, permeabilizadas y finalmente marcadas con los anticuerpos especficos.
Una vez realizado este ltimo procedimiento, las clulas estn listas para ser ledas
en el citmetro (2, 5).

ENSAYO
DE
SECRECION

CAPTURA

DE

Se ha utilizado para cuantificar la secrecin de

citoquinas a partir de linfocitos T
El procedimiento utilizado es :

Encapsulacin de la clula en una microgota de agarosa con biotina

Unin no especfica y retencin del anticuerpo en la matriz de agarosa

Incorporacin de un anticuerpo dirigido contra la citoquina que queremos

detectar
Incorporacin de un segundo anticuerpo que reconoce la unin antgenoanticuerpo ya formada. Este segundo anticuerpo est marcado con un fluorocromo

Las microgotas se analizan en el citmetro, midiendo la fluorescencia emitida

por el fluorocromo, que es proporcional a la unin antgeno-anticuerpo (6).

DETERMINACION

DEL

CONTENIDO

CELULAR

DE

DNA

Una suspensin de clulas es coloreada con un colorante fluorescente que se

une estequiomtricamente con el DNA. La cantidad de colorante unido es entonces
proporcional a la cantidad de DNA. Las clulas coloreadas se introducen entonces en
el citmetro y la luz fluorescente emitida es proporcionarle al contenido de DNA de
cada

clula.

Este anlisis nos da informacin adems sobre la distribucin de las clula en

las diferentes fases del ciclo celular (G1, S, G2 o M). Sin embargo no es posible
diferenciar G2 y M ya que en las dos se encuentra el mismo contenido de DNA. Se
han desarrollado modelos matemticos para establecer el porcentaje de clulas que
se encuentran en cada fase. Esta informacin puede complementarse utilizando
antgenos cuya expresin est restringida a un momento del ciclo celular en
particular. Por ejemplo en las fases G1 y S tempranas hay un incremento en la
excrecin del antgeno celular nuclear proliferante (PCNA) : por otra parte el
antgeno Ki-67 es una protena nuclear que se incrementa linealmente a travs de
todo el ciclo celular alcanzando la concentracin mxima en G2 y M. Al marcar
ests protenas con anticuerpos especficos unidos a un fluorocromo, podemos
entonces establecer con mayor precisin la fase del ciclo celular en que se
encuentra
la
clula.
La medida del contenido de DNA tambin ha sido utilizada para determinar el
grado de aploida de clulas malignas y el porcentaje de estas que se encuentran en
fase S. Algunos autores sugieren que esta informacin es til para conocer el
tamao del tumor, el estado nodal y el estado de expresin de marcadores para
ayudar a establecer el pronstico del tumor (5,7).

APOPTOSIS
La apoptosis es la muerte celular programada. Hay varias
enzimas implicadas en este proceso celular. Dichas enzimas
pueden ser determinadas por citometra de flujo al ser unidas a
anticuerpos marcados con fluorocromos (por ejemplo la
dipeptidilpeptidasa, calpaina, aminopeptidasa y catepsina D ,
las dos ltimas implicadas en el proceso de apoptosis inducido
por citoquinas y expresadas en la superficie celular)
(7).

FAGOCITOSIS
Marcando bacterias con un colorante fluorescente, se puede
analizar el proceso de facocitosis de estas por parte de macrfagos y
neutrfilos (7).

VENTAJAS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO

Anlisis de un nmero estadsticamente significativo de clulas ( 1000 a ms de

100.000 clulas).

Mltiples marcajes de una sola clula.

Mltiples parmetros : define subpoblaciones complejas.

Anlisis de alto numero de partculas en corto tiempo (5.000 eventos /seg. ).

Alta sensibilidad y objetividad.
Medidas separadas de cada clula (no slo el promedio).

Medidas cuantitativas : discriminacin de las clulas segn la cantidad de

marcador.
Miles de clulas por segundo (1).

DESVENTAJAS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO

Poca informacin morfolgica de la clula
No proporciona informacin de la localizacin celular en un tejido
Puede analizar solamente una cantidad limitada de material (10
clulas / hora)

Necesita suspensin de clulas individuales (1).

Costos de la tecnologa
Mtodo destructivo.
Incapacidad de visualizar las clulas que se analizan.

millones de

PROCESAMIENTO DE LOS DATOS. EL ANLISIS DE DATOS EN CITOMETRA

DE FLUJO:

Los citmetros producen una gran cantidad de informacin que puede ser
guardada en forma de histogramas (histogramas monoparamtricos de 256
1024 canales, histogramas biparamtricos de 64 x 64 = 4096 puntos) o en modo
LISTA (list mode) que consiste en guardar toda la informacin obtenida para cada
evento de modo que se pueden modificar las regiones de anlisis y reconstruir los
histogramas en funcin de nuevos parmetros de seleccin. Para evitar
interpretaciones subjetivas y aprovechar al mximo la informacin obtenida es
necesario la ayuda de la informtica y pruebas matemticas estadsticas.
La citometra de flujo permite el estudio de mltiples caractersticas celulares
combinando las lecturas sobre seales de dispersin de luz y seales
fluorescentes. El empleo de fluorocromos con longitudes de onda de excitacin
compatibles con la fuente de luz del citmetro (generalmente 488 nm, pero pueden
ser otras) y con distintos espectros de emisin posibilita el estudio simultneo de
varias propiedades o caractersticas sobre celulas incluso en muestras
heterogneas.

1.- Datos univariantes (histogramas monoparamtricos): Suelen ser representados

como un histograma. Un mtodo rpido y sencillo de interpretacin es la
observacin del histograma y la ayuda del soporte informtico del citmetro para
calcular el porcentaje de eventos en regiones seleccionadas. Hay que tener en
cuenta la resolucin del histograma para la discriminacin de la seal y el CV (en
un histograma de 100 canales con un CV del 2 % no se podran discriminar 32
picos de cromosomas). Cuando deseamos una informacin precisa interesa un
histograma con el mayor nmero de canales posibles. Para el estudio del

inmunofenotipo en que interesa positividad o negatividad, escalas pequeas con

pocos canales pueden ser suficientes. 1.1.-Mtodos no paramtricos: se basan en
la observacin del histograma y posicin de los cursores (clulas positivas, etc..).
Un problema especial son las muestras con baja fluorescencia que se diferencian
poco del negativo (generalmente una subpoblacin puede ser claramente
identificada si tiene un elevado nmero de clulas o alta seal fluorescente), se
emplean mtodos de normalizacin y sustraccin de la seal con comparaciones
de curvas (Kolmogorov-Smirnov). En ocasiones puede ser til la suavizacin
(smooth) del contorno del histograma (tambin en anlisis del ADN con pocos
eventos). La transformacin o uso de escalas logartmicas es til en caso de que
la seal sea muy amplia o se halle muy dispersa puesto que agrupa los canales de
seal alta y permite diferenciar igualmente el control negativo.
1.2.- Mtodos paramtricos: en algunos casos por la dificultad de interpretacin de
los datos y la elevada informacin que contiene es necesario aplicar modelos
matemticos. En ellos se emplean conversiones matemticas de los histogramas y
sus datos a curvas o ecuaciones. Se usan en el anlisis de las distribuciones de
ADN y modelos de cintica celular.
2.- Datos bivariantes (histogramas biparamtricos): En los mtodos no
paramtricos se emplean porcentajes, canales y CV de ventanas o regiones
amorfas de anlisis. Se presentan como histogramas biparamtricos con dos ejes
y el nmero de eventos se representa como densidad de puntos, colores, o lneas
isomtricas. En el anlisis paramtrico se emplean mtodos matemticos, y en el
caso del ADN se asemejan los picos a gaussianas volumtricas. Dada la gran
informacin que manejan se necesitan ordenadores muy potentes.
En el anlisis multiparamtrico la principal dificultad es la limitacin humana de
poder manejar cmodamente y de forma comprensible informacin relativa a ms
de tres variables simultneamente. Se necesitan modelos matemticos de
componentes principales, agrupacin y clasificacin para analizar la compleja
informacin. La informacin se representa en forma de mltiples histogramas
mono/biparamtricos, cubos tridimensionales, y matrices de datos.