Microbiologa clnica

Coprocultivo
1 OBJETIVO
Identificar las posibles especies patgenas de microorganismos presentes en las vas
gastrointestinales (Heces) a travs del coprocultivo y de sus reacciones bioqumicas.

2 - FUNDAMENTO
La porcin inferior del intestino tiene una flora bacteriana normal excesivamente amplia. Los
microorganismos con mayor prevalencia son los anaerobios ( Bacteroides, bcilos gram
positivos, Estreptococos), microorganismos entricos gran negativos y Enterococcus faecalis.
Cualquier intento por aislar bacterias patgenas de las heces implica la separacin de las especies
patgenas, usualmente a travs del empleo de medios selectivos diferenciales y de cultivos
enriquecidos. Las principales causas de trastornos gastrointestinales agudos incluyen a los virus,
las toxinas (de: Estafilococos, Vibriones,Escherichia coli ), bacilos entricos gran negativos
invasores, los fermentadores lentos de la lactosa, la Shigella, la Salmonella y la Campilobacterias.
La importancia relativa de estos grupos tiene grandes discrepancias en las distintas partes del
mundo.
Las heces y los raspados rectales son los especimenes de que se dispone con mayor facilidad.
Debe anotarse, en el examen macrocpico la presencia de sangre, moco o helmintos en la
inspeccin inicial. Se suspenden los especmenes en un caldo selectivo como el Caldo de
Tetrationato y se cultivan sobre medios ordinarios as como en medios selectivos diferenciales, por
ejemplo Agar EMB, Agar McConkey, Agar S-S, para permitir la separacin de los bacilos gran
negativos que no fermentan la lactosa de otras bacterias entricas comunes.
Los frotis teidos pueden revelar una prevalencia de leucocitos y de ciertos microorganismos
anormales como Cndida o estafilococos, pero no pueden utilizarse para diferenciar las bacterias
entricas patgenas de las de la flora normal, por lo que deben realizarse otro tipo de pruebas para
discriminar los tipos de bacterias presentes en la muestra como son las pruebas bioqumicas.

3. MATERIAL

Agua destilada

Gradilla

Tubos de ensayo

Asa de siembra desechable y normales

Hisopo

Papel de filtro

Pipetas de vidrio

Medios de cultivo

Pinzas metlicas

Alcohol

Algodn graso

Vaso de precipitado

Mechero Bunsen

Portaobjetos

Cubreobjetos

Microscopio

Cubeta de tincin

Pinzas de madera

Frasco lavador

3.2 Reactivos:

Medios de cultivo para aislamiento:

agar sangre
agar Mc Conkey
Agar entrico Hektoen (HK)

Medios para pruebas bioqumicas:

- Agar Christensen
- KIA

Colorantes para tincion de Gram: lugol, cristal violeta, fucsina bsica, alcohol

Lugol o Negro sudn

3.3 Muestras:
Muestra: heces de adulto.

4. PROCEDIMIENTO
El procedimiento fue el siguiente:

1.

Recogida de la muestra
Preparacin o indicaciones del paciente:
Se debe seguir con el rgimen habitual de comidas.
a. para nios/as
Para bebs y nios pequeos que usan paales:
Se puede cubrir el paal con un envoltorio plstico. Si se coloca correctamente el envoltorio
plstico, separando las heces de la orina, se puede evitar que stas se mezclen con el fin de
obtener una muestra mejor.
b. para adultos
Hay muchas maneras de recolectar las muestras. Se pueden recoger las heces con la ayuda de un
envoltorio plstico que se coloca suelto sobre el inodoro y se sostiene en su lugar con el asiento.
Luego se coloca la muestra en un recipiente limpio. El equipo para recoleccin de la muestra trae
una gasa especial que se usa para recogerla y luego se coloca la muestra en un recipiente limpio.
B. Condiciones para la toma de muestras
Heces que no tengan ms de media hora de obtenidas, o muestras tomadas directamente del recto
con un hisopo de algodn. Cuando las siembras no se pueden efectuar de inmediato o la muestra
demora en llegar al laboratorio, se aconseja emulsionar aproximadamente 1g de heces en 1 ml de
un lquido conservador, o bien, depositar en ste el hisopo rectal.
Muestra de heces de 12 o 24 hrs.
Se recogern las heces en un frasco limpio con cierre hermtico, no es necesaria la esterilidad. El
anlisis se har en las 12 horas siguientes a la deposicin, guardando la muestra en el frigorfico a
4-10 C. Si el anlisis se pospone ms de 24 horas se aadir un volumen igual al de las heces de
una solucin acuosa al 5% de formol comercial.
C. Procesamiento de la muestra una vez llega al laboratorio.
- Evitar contaminacin por material no estril.
- Uso de contenedores y medios de transporte apropiados.
- Etiquetar muestra adecuadamente.
- Temperatura de conservacin: 4C para evitar la proliferacin bacteriana.

2. Examen macroscpico de la muestra

Se comprueba su olor, consistencia, presencia de mucus, sangre, restos de alimentos sin digerir.

3. Examen y en fresco.
Observacin en el microscopio: lugol- fresco:
En fresco: Colocamos una gota diluida en agua destila de la muestra en un portaobjetos y
colocamos un cubre encima.
Se realiza una dilucin en un tubo de ensayo con una pequea cantidad de heces recogida con la
ayuda de un asa de siembra desechable y se le aade un poco de agua destilada, se agita un poco
y se obtiene una gota de esta dilucin. Dicha gota la colocamos en un portaobjetos y aadimos una
gota de Lugol donde colocaremos un cubreobjetos encima para su posterior observacin al
microscopio.
Otro mtodo de observacin es realizando el mismo procedimiento pero sustituyendo el lugol por el
negro sudan. Esta tincin est indicada para la observacin de grasa.
Prueba de parasitologa:
Este tipo de pruebas se realiza cuando se sospecha de la presencia en heces de parsitos. En
nuestro caso, la prueba no es necesaria, ya que el paciente no presenta una sintomatologa como
diarrea aguda, gases intestinales excesivos, dolores clicos, elevacin de eosinfilos en sangre u
otros sntomas.
En el examen de parasitologa se coloca un poco de muestra en el portaobjetos y se agrega una
gota de lugol.
Con un bote de muestra colocar una gasa y aadir 50 ml de suero fisiolgico para poder filtrar
dicha muestra. Al liquido resultante del filtrado de le coloca en un tubo de centrifuga y se centrifuga
5 min. a 3000 r.p.m. se desecha el sobrenadante y obtenemos el sedimento que observaremos con
una gota de lugol aadida para poder observar mejor.

4. Realizacin de medios de cultivo y siembra

1. Medios de cultivo utilizados y su utilidad.
Medios

ml/gr

Autoclavar Recipiente Utilidad

en el que se
vierte

Aislamiento
Agar Mac
Conkey

25/1.25 Si

Agar entrico
Hektoen
25/75.1 No

Placa

Placa

Pruebas
bioqumicas
Agar
25/0.6 Si
Christensen

Tubo

aislamiento de bacilos Gram

negativos, aerobios y anaerobios
facultativos. diferencia bacterias
que utilizan o no, lactosa.
Medio diferencial para aislamiento y
diferenciacin de gram-negativos
entricos (Salmonella y
Shigella spp)
diferenciar microorganismos en
base a la actividad uresica.
Identificar bacterias que hidrolizan
urea, tales como Proteus spp., otras
enterobacterias y estafilococos.
determinar si un
Microorganismo es capaz de utilizar

KIA

25/1.45 Si

Tubo

la lactosa, produce gas o cido

sulfhdrico.

Para la realizacin del medio Christensen, le aadimos 50ml al medio con la tcnica de barry, para
realizar la prueba de la ureasa.

6. Siembra e inoculacin de placas

Se procede a realizar la siembra, en estra mltiple, con la ayuda de un asa de siembra, tomando
una pequea cantidad de incculo de las heces, previamente diluido en suero, teniendo en cuenta
de trabajar en condiciones lo ms aspticas posibles. Se tapa la placa y se mete en la estufa en un
periodo de 24-48 horas.

1.

Examen morfolgico del crecimiento de las colonias

cultivadas macroscpicamente y al microscopio.
Las caractersticas fsicas de las colonias son de gran ayuda en la identificacin. Cada
microorganismo crece de manera diferente formando colonias de distinto color, forma, tamao,
textura, olor, brillo, etc. Existen colonias ms o menos elevadas, con bordes enteros, estrellados,
deflecados, y un largo etc. El tiempo de incubacin necesario para que aparezcan las colonias
tambin puede tener valor en la identificacin. Las caractersticas de las colonias tampoco ofrecen
un diagnstico por si solas, pero dirigen los esfuerzos hacia un grupo ms o menos amplio de
microorganismos.
Hay colonias muy caractersticas, casi exclusivas de determinadas bacterias. Es el caso de las
especies de Proteus, que se extiende ampliamente por la placa formando un velo muy
caracterstico.

1.

Examen microscpico
Una vez transcurrido el tiempo necesario se procede a sacar el medio de cultivo, la placa de Petri y
se obtiene una pequea muestra con la ayuda del asa de siembra y se coloca en un porta
previamente humedecido con una gota de agua destilada. Para poder fijar la muestra lo podremos
realizar con calor, por lo que se pasa a realizarlo con el mechero y cuidando de no quemarnos lo
haremos con la ayuda de una pinza de madera.
A continuacin se procede a teir la muestra.
Tincin azul de metileno:
El procedimiento es bastante sencillo. Primero se ha de fijar la muestra pasando el porta por el
mechero varias veces. Luego se tie con el azul de metileno cubrindola entera. Pasado 5 min. Se
lava con agua destilada se deja secar y se proceder a observar en el microscopio con aceite de
inmersin y en el objetivo de 100x.
Esto nos permite comprobar la presencia o ausencia de leucocitos. As:
Presencia de leucocitos: La infeccin ha cursado con inflamacin intestinal. Se trata por tanto
de microorganismos invasivos como Salmonella, Shigella.

ausencia de leucocitos: Significa que no ha habido inflamacin por lo que la infeccin puede
ser debida a virus (Rotavirus) o a bacterias productoras de toxinas (Vibrio cholerae).
Para realizar la tincin de Gram:
Primero se realiza un frotis con la muestra en un portaobjetos.( Realizamos 3 frotis con tres
colonias aisladas). Se fija la muestra en el mechero y se coloca despus en la cubeta para
proceder a teirla.
Se cubre la muestra con 1 minuto de cristal violeta, 1 min de lugol, 30 seg y 1 min de fucsina
bsica, y se lava con agua destilada entre colorante y colorante adems del alcohol y se deja
secar.
Esta tincin nos sirve para distinguir entre las bacterias Gram + y Gram segn sea la
composicin de su pared y apreciar visualmente su forma y organizacin.

1.

Realizacin de pruebas bioqumicas

Prueba KIA
Sembramos en picadura dos tubos con el medio KIA e incubamos a 37C durante 18-24 horas.
Observar. Con la prueba bioqumica del KIA hemos detectado la capacidad que tienen las
enterobactericeas para metabolizar o no la glucosa y/o lactosa, produccin de gas y de cido
sulfhdrico.
B-GALACTOSIDASA
Nos indica si la bacteria en su metabolismo fermenta la lactosa. Esta prueba la realizaremos
preparando una suspensin densa del microorganismo en un tubo
donde aadiremos una gota de tolueno y mezclaremos para despus aadir el disco de ONPG.
Incubaremos a 37C y leemos antes de 24h el resultado.
OXIDASA
Esta prueba nos indica si el microorganismo contiene la enzima citocromo oxidasa
descartando que fuera un microorganismo anaerobio estricto pudiendo ser aerobio o anaerobio
facultativo. Se procede a impregnar una tira reactiva con una muestra de la colonia crecida en la
placa de Agar Sangre y observar la reaccin que produce cambiando de color.
CATALASA
Para esta prueba se toma una colonia del microorganismo joven y se coloca sobre un
portaobjetos donde aadiremos una gota de perxido de hidrgeno observando si produce o no
burbujas.
UREASA
Esta prueba se realiza sembrando el microorganismo en medio Christensen en tubo inclinado
por la superficie en zigzag. El resultado se observa despus de una incubacin a 37C con un
cambio de color del indicador.

5.RESULTADOS
EXAMEN MACROSCOPICO DIRECTO DE LA MUESTRA

Cantidad: 13.20
Color: marrn oscuro
Olor: fecaloideo
Consistencia: dura y consistente
Forma: cilndrica
Presencia de:
- moco: no
- sangre: no
- pus: no
- fragmento de carne: no
- fragmento de fcula: si
- trozos de mucosa epitelial: no
- falsas membranas: no

OBSERVACIN MICROSCOPIO EN FRESCO Y CON LUGOL

- En fresco: Morfolgicamente se observan microorganismos Bacilos.
- Lugol: Se observa almidn tiido de un suave color lilceo. No se observan parsitos.
EXAMEN MORFOLGICO DEL CRECIMIENTO DE LAS COLONIAS
CULTIVADAS MACROSCPICAMENTE Y AL MICROSCOPIO
- Examen morfolgico del crecimiento de las colonias cultivadas macroscpicamente y al
microscopio:
1. Agar sangre: Colonias redondas, borde entero, circular, color blanquecino.
2. Christensen: Colonias redondas, circular, convexa.
3. Kia: Se observa produccin de cido en todo el tubo, burbujas, agrietamiento e incluso
desplazamiento del medio.
4. McConkey: Colonias rosas a rojas si el aislado es capaz de fermentar la Lactosa y en caso de
que fueran colonias sin color sera el caso contario.
5. Hecktoen: No creci nada en este medio en 24 horas puede ser debido a un periodo de
incubacin insuficiente o a la siembra con inoculo muy diluido.

TINCIONES

Con la tincin de Gram detectamos el tipo de bacteria que es, gracias a la diferenciacin
de su morfologa.

Observacin morfolgica
AZUL DE METILENO
AGAR SANGRE
- Se observan diferentes agrupaciones de cocos: cocos, diplococos, ttrada, estreptococos,
estafilococos.
McCONKEY
- Se observa agrupaciones de bacilos teidos de azul por el azul de metileno.
CHRISTENSEIN

- Se observan agrupaciones de cocobacilos teidos de azul por el azul de metileno.

TINCION DE GRAM
CHRISTENSEIN
- Se observan agrupaciones de cocobacilos Gram +.
McCONKEY
- Se observan agrupaciones de bacilos Gram , algunos presentan puntos de color azul en la zona
terminal del bacilo. Esto puede ser debido a que se estuvieran dividiendo
por lo que al romperse la capa externa de peptidoglicano se pudo teir con el colorante de violeta
de genciana. Tambin pueden ser restos de este mismo colorante al realizar la tincin.
AGAR SANGRE
- Se observan cocos gram negativos ( rosados) en su mayora, pero tambin se pueden observan
algunos color azul del colorante violeta de genciana.
BACTERIAS ENCONTRADAS EN EL INTESTINO GRUESO DE HUMANOS.
BACTERIAS

Incidencia (%)

BACTERIAS

Incidencia (%)

Bacteroides fragilis

100

Escherichia coli

100

Bacteroides melaninogenicus

100

Salmonella enteritidis

3-7

Bacteroides oralis

100

Salmonella typhi

0.00001

Lactobacilos

20-60

Klebsiella species

40-80

Clostridium perfringens

25-35

Enterobacter species

40-80

Clostridium septicum

5-25

Proteus mirabilis

5-55

Clostridium tetan

1-35

Pseudomonas aeruginosa

3-11

Bifidobacterium bifidum

30-70

Peptostreptococcus

Comn

Staphylococcus aureus

30-50

Peptococcus

Oderado

Streptococcus faecalis

100

Methanogens

Comn

CUADROS DE RESULTADOS
MICROORGA-NISMO

MEDIO DE

TINCION DE GRAM

TINCION DE AZUL DE

CULTIVO

METILENO

Escherichia coli

Mac conkey

Bacilos Gram -

Peptostreptococcus

Agar sangre

Cocos, diplococos y estreptococos Cocos, diplococos y

gram +
estreptococos

Peptococcus

Agar sangre

Cocos y racimos Gram +

Cocos y racimos

Streptococcus
faecalis

Agar sangre

Coco Gram +

cocos

MICROORGANISMO

Bacilos

PRUEBAS BIOQUIMICAS
B-GALACTOSIDASA

OXIDASA

KIA

CATALASA

Peptostreptococcus

Peptococcus

Streptococcus faecalis

Escherichia coli

A/ A, G

UREASA

6.CONCLUSIN
Hemos llegado a la conclusin que en la muestra de heces no se ha encontrado ningn
microorganismo patgeno ya que por las pruebas realizadas hemos deducido que los
microorganismos existentes en la muestra son los habituales que presenta la flora intestinal, como
es Escherichia coli , ya que creci en el medio McConkey con la morfologa caracterstica de la E.
coli,( color rosado) basndonos tambin en la tincin de Gram donde aparecen en forma de Bacilos
Gram y que da positivo en la prueba de la B-galactosidasa, adems de dar negativo en la prueba
de la oxidasa, lo que nos hace sospechar que es una enterobacteria dado que estas siempre son
oxidasa negativa.
Las especies de Peptostreptococcus son organismos comensales en humanos, que viven predominantemente
en la boca, la piel, el aparato digestivo y el excretor, y componen una parte de la flora intestinal bacteriana.
Sospechamos que est presente en la muestra ya que creci como es normal en el Agar Sangre con colonias
blanquecinas y siendo una de las colonias que observamos con la tincin de Gram tenan forma cocoide en
cadenas cortas, en parejas o individualmente siendo Gram +.
El Peptococcus, al igual que el peptostreptococcus crece de la misma manera en agar sangre y al tomar una
colonia diferente observamos que la distribucin morfolgica era diferente ya que aparecan formando
racimos o solos.
Y por ltimo creemos que tambin se encuentra entre los microorganismos el Enterococcus faecalis, ya que

tambin creci en el Agar Sangre y en la tincin de gram fueron cocos gram positivos distribuidos en cadenas
o pares.