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anlise em laboratrios de
biotecnologia agroalimentar
e de sade humana
Raul Antonio Sperotto
(Organizador)
Protocolos e mtodos de
anlise em laboratrios de
biotecnologia agroalimentar e
de sade humana
1 edio
Lajeado, 2014
Biotecnologia
SUMRIO
Editora Univates
Coordenao e Reviso Final: Ivete Maria Hammes
Editorao: Glauber Rhrig e Marlon Alceu Cristfoli
Capa: Marlon Alceu Cristfoli
Conselho Editorial da Univates Editora
Titulares Suplentes
Adriane Pozzobon
Simone Morelo Dal Bosco
Augusto Alves
Ieda Maria Giongo
Beatris Francisca Chemin
Rogrio Schuck
Fernanda Cristina Wiebusch Sindelar Ari Knzel
Avelino Tallini, 171 - Bairro Universitrio - Lajeado - RS, Brasil
Fone: (51) 3714-7024 / Fone/Fax: (51) 3714-7000
editora@univates.br / http://www.univates.br/editora
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Luclia Hoehne
Qumica Industrial, doutora em Qumica (UFSM), professora do Centro de Cincias Exatas e
Tecnolgicas (CETEC) e do Programa de Ps-Graduao em Biotecnologia (PPGBiotec) do Centro
Universitrio UNIVATES (http://lattes.cnpq.br/1088266827926373).
Luclia Santi
Biloga, doutora em Biologia Celular e Molecular (UFRGS), ps-doutoranda no Proteomic Mass
Spectrometry Lab, Department of Chemical Physiology, The Scripps Research Institute, La Jolla CA, EUA (http://lattes.cnpq.br/7154170979832540).
Luciana Knabben Oliveira Becker Delving
Mdica, mestranda do Programa de Ps-Graduao em Biotecnologia (PPGBiotec) do Centro
Universitrio UNIVATES (http://lattes.cnpq.br/1880043506615687).
Marcia Ines Goettert
Farmacutica, doutora em Cincias Farmacuticas (Universidade de Tuebingen), professora do
Centro de Cincias Biolgicas e da Sade (CCBS) e do Programa de Ps-Graduao em Biotecnologia
(PPGBiotec) do Centro Universitrio UNIVATES (http://lattes.cnpq.br/5742493416858879).
Mardja Manssur Bueno e Silva
Acadmica do curso de Cincias Biolgicas da Universidade Federal do Rio Grande do Sul
(UFRGS) (http://lattes.cnpq.br/6836121028944714).
Marelise Teixeira
Acadmica do curso de Cincias Biolgicas do Centro Universitrio UNIVATES
(http://lattes.cnpq.br/4505465308986872).
Markus Berger Oliveira
Farmacutico, doutor em Biologia Celular e Molecular (UFRGS), ps-doutorando no Laboratrio
de Bioqumica Farmacolgica do Centro de Biotecnologia (UFRGS)
(http://lattes.cnpq.br/8841487917492985).
Mariano Rodrigues
Qumico, mestre em Biotecnologia (Centro Universitrio UNIVATES), professor dos cursos
Tcnicos em Qumica e Nutrio do Centro Universitrio UNIVATES
(http://lattes.cnpq.br/8641590738904901).
Matheus dos Santos Rocha
Bilogo, mestrando do Programa de Ps-Graduao em Diversidade Animal e Vegetal
(UNISINOS) (http://lattes.cnpq.br/2563225109320691).
Mnica Jachetti Maciel
Biloga, mestre em Cincia e Tecnologia de Alimentos (UFGRS), professora do Centro de Cincias
Biolgicas e da Sade (CCBS) do Centro Universitrio UNIVATES
(http://lattes.cnpq.br/2575088289818885).
Noeli Juarez Ferla
Bilogo, doutor em Cincias (USP), professor do Centro de Cincias Biolgicas e da Sade (CCBS)
e dos Programas de Ps-Graduao em Biotecnologia (PPGBiotec) e Ambiente e Desenvolvimento
(PPGAD) do Centro Universitrio UNIVATES (http://lattes.cnpq.br/6071378790176893).
Biotecnologia
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SUMRIO
PREFCIO
O nmero de artigos cientficos publicados vem aumentando significativamente nos ltimos
anos nas mais diversas reas e nos principais pases do mundo, entre eles o Brasil. No somente a
publicao de artigos originais cresce, mas tambm as revises completas e, com isso, aumenta o
nmero de peridicos, edies, novas subreas, meios alternativos de divulgao etc. Em funo
disso, tanto pesquisadores, profissionais das reas da Sade, da Biologia, da Qumica, das Cincias
Agrrias, de Alimentos e de Engenharias como estudantes de Ensino Mdio, de nvel tcnico, de
graduao e ps-graduao vm sendo diariamente imersos em um volume cada vez maior de
informao.
At recentemente, ns, pesquisadores, tnhamos o desafio de encontrar informao em uma
esfera muito mais limitada e algumas vezes de difcil acesso. Hoje, o nosso maior desafio filtrar
e, por muitas vezes, decifrar a informao resumida contida em artigos cientficos mediante busca
limitada por certo nmero de palavras-chave e outras normas que dificultam a reprodutibilidade
de experimentos e de protocolos. Alm disso, com o aumento do nmero de referncias e citaes,
muitas vezes no fidedignas, e pequenas modificaes e outras omisses no incorporadas em
protocolos insuficientemente descritos em artigos, frequentemente torna-se difcil ou mesmo
impossvel a reproduo de experimentos bsicos em muitos laboratrios e grupos de pesquisa.
A publicao on-line como livro eletrnico de Protocolos e mtodos de anlise em
laboratrios de biotecnologia agroalimentar e de sade humana tem como objetivo central
disponibilizar informaes sobre o uso de metodologia cientfica j testada em vrios laboratrios,
tornando mais acessvel e simplificada a aplicao de protocolos com enfoque multidisciplinar nas
reas biomdicas e de sade, biolgicas em geral, agrrias e de biotecnologia. Os autores deste
livro so profissionais com formao e background cientfico bastante diversificado e apresentam
os protocolos de modo no s a facilitar a busca das referncias e citaes, mas tambm para que
pesquisadores e estudantes possam aplic-los e reproduzi-los de maneira simples. A insero de
notas ou dicas durante a descrio completa dos protocolos gera alternativas de aplicao e
revela a informao que muitas vezes no est descrita nos artigos e que fundamental para a
reprodutibilidade dos experimentos e ensaios.
Simplificar o acesso a protocolos importantes com aplicabilidade em diversas e diferentes
reas cientficas o primeiro passo para o sucesso dos experimentos no desenvolvimento dos
projetos de pesquisa, base para o avano cientfico e tecnolgico e, principalmente, para a formao
qualificada de recursos humanos em nvel escolar, tcnico, de graduao e de ps-graduao.
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SUMRIO
SUMRIO
CAPTULO 1
PREPARO DE SOLUES, TCNICAS BSICAS E UTILIZAO DE EQUIPAMENTOS
DE ROTINA.................................................................................................................................................15
1.1 SEGURANA NO LABORATRIO..................................................................................................................................16
1.2 PRINCIPAIS VIDRARIAS....................................................................................................................................................18
1.3 PRINCIPAIS TIPOS DE GUA EMPREGADOS NO LABORATRIO.......................................................................22
1.4 LIMPEZA E DESCONTAMINAO DE VIDRARIAS..................................................................................................24
1.5 SOLUES DE LIMPEZA E SECAGEM DE MATERIAL..............................................................................................26
1.6 MEDIDAS DE VOLUMES DE LQUIDOS........................................................................................................................28
1.7 AQUECIMENTO EM BANHO MARIA............................................................................................................................31
1.8 AQUECIMENTO EM ALTAS TEMPERATURAS...........................................................................................................32
1.9 AQUECIMENTO EM BICO DE BUNSEN........................................................................................................................34
1.10 RESFRIAMENTO EMPREGANDO BANHO DE GELO...............................................................................................36
1.11 UTILIZAO DE EVAPORADOR ROTATRIO (ROTAEVAPORADOR).............................................................37
1.12 TRANSFERNCIA DE LQUIDOS..................................................................................................................................38
1.13 TRANSFERNCIA DE SLIDOS.....................................................................................................................................39
1.14 TCNICAS DE PESAGEM................................................................................................................................................40
1.15 MTODOS DE PESAGEM.................................................................................................................................................43
1.16 MEDIDAS DE VOLUME....................................................................................................................................................45
1.17 PROCESSO DE SEPARAO POR FILTRAO.........................................................................................................50
1.18 PROCESSO DE SEPARAO POR CENTRIFUGAO.............................................................................................52
1.19 PROCESSO DE SEPARAO POR PRECIPITAO..................................................................................................53
1.20 PROCESSO DE SEPARAO POR DECANTAO...................................................................................................54
1.21 TCNICAS DE PREPARO DE SOLUES....................................................................................................................55
CAPTULO 2
EXTRAO E QUANTIFICAO DE CIDOS NUCLEICOS E PROTENAS..............................58
2.1 EXTRAO DE DNA HUMANO A PARTIR DE SANGUE PERIFRICO MTODO DE SALTING-OUT........59
2.2 EXTRAO DE DNA DE AMOSTRAS VEGETAIS.......................................................................................................62
2.3 EXTRAO DE DNA DE BACTRIAS ENDOFTICAS DE RAIZ...............................................................................65
2.4 EXTRAO DE DNA BACTERIANO DE SOLO............................................................................................................67
2.5 EXTRAO DE DNA DE UM ISOLADO BACTERIANO.............................................................................................69
2.6 EXTRAO DE DNA BACTERIANO DIRETAMENTE DE AMOSTRAS DE LEITE...............................................71
2.7 EXTRAO DE PLASMDEO (MINIPREP).....................................................................................................................73
2.8 EXTRAO DE RNA UTILIZANDO TRIZOL..............................................................................................................75
2.9 EXTRAO DE RNA DE AMOSTRAS VEGETAIS UTILIZANDO CONCERT PLANT RNA REAGENT.......76
2.10 EXTRAO DE PROTENAS TOTAIS DE AMOSTRAS DE TECIDO DE MAMFEROS......................................77
2.11 EXTRAO DE PROTENAS TOTAIS DE AMOSTRAS VEGETAIS........................................................................78
2.12 QUANTIFICAO DE DNA UTILIZANDO O QUBIT.............................................................................................80
2.13 QUANTIFICAO DE RNA UTILIZANDO O QUBIT..............................................................................................81
2.14 QUANTIFICAO DE DNA E RNA UTILIZANDO ESPECTROFOTOMETRIA DE DENSIDADE
PTICA - L-QUANT.............................................................................................................................................................82
2.15 QUANTIFICAO DE PROTENAS UTILIZANDO O QUBIT................................................................................84
2.16 QUANTIFICAO DE PROTENAS PELO MTODO DE BRADFORD..................................................................85
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SUMRIO
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CAPTULO 3
GENOTIPAGEM DE POLIMORFISMOS EM AMOSTRAS HUMANAS..........................................90
3.1 REAO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)...........................................................................................................91
3.2 DIGESTO ENZIMTICA..................................................................................................................................................93
3.3 ELETROFORESE EM GEL...................................................................................................................................................94
3.4 METODOLOGIAS DE GENOTIPAGEM BASEADAS NA PCR....................................................................................96
CAPTULO 4
ANLISES FISIOLGICAS EM AMOSTRAS VEGETAIS E ANIMAIS....................................... 100
4.1 EXTRAO E QUANTIFICAO DE CLOROFILAS.................................................................................................101
4.2 QUANTIFICAO DE ACARES SOLVEIS TOTAIS...........................................................................................102
4.3 QUANTIFICAO DE CARBONILAO OU OXIDAO DE PROTENAS......................................................103
4.4 QUANTIFICAO DO NVEL DE PEROXIDAO LIPDICA UTILIZANDO TBARS.......................................105
4.5 QUANTIFICAO DE VAZAMENTO DE ELETRLITOS (ELECTROLYTE LEAKAGE ASSAY)......................106
4.6 LOCALIZAO HISTOQUMICA DA PEROXIDAO LIPDICA UTILIZANDO O REAGENTE DE
SCHIFF....................................................................................................................................................................................107
4.7 LOCALIZAO HISTOQUMICA DA PERDA DE ESTABILIDADE DE MEMBRANA UTILIZANDO O
REAGENTE EVANS BLUE..................................................................................................................................................108
4.8 LOCALIZAO HISTOQUMICA IN SITU DO ACMULO DE RADICAL SUPERXIDO (O2-).....................109
4.9 LOCALIZAO HISTOQUMICA IN SITU DO ACMULO DE PERXIDO DE HIDROGNIO (H2O2)........110
4.10 PREPARAO DO TAMPO FOSFATO DE POTSSIO
(K2HPO4) - 10 mM (0,01 M) - PH 7,8...................................................................................................................................111
4.11 DETERMINAO DO CONTEDO DE PERXIDO DE HIDROGNIO (H2O2).................................................112
4.12 ANLISE DAS ENZIMAS ANTIOXIDANTES SUPERXIDO DISMUTASE (SOD), CATALASE (CAT), E
ASCORBATO PEROXIDASE (APX)...................................................................................................................................113
4.13 TESTE DE COMETA E MICRONCLEO.....................................................................................................................116
4.14 ANLISE DE CITOTOXICIDADE POR ALAMAR BLUE.........................................................................................130
4.15 AVALIAO DA PROLIFERAO CELULAR PELO MTT....................................................................................132
4.16 OXIDAO DE H2DCF-DA PARA AVALIAO DE ESPCIES REATIVAS DE OXIGNIO
INTRACELULARES..............................................................................................................................................................133
4.17 MARCAO COM IODETO DE PROPDEO PARA DETERMINAO DA DISTRIBUIO DO CICLO
CELULAR...............................................................................................................................................................................135
4.18 COMARCAO COM ANEXINA V-FITC / IODETO DE PROPDEO PARA ANLISE DE MORTE
CELULAR...............................................................................................................................................................................137
4.19 MARCAO COM LARANJA DE ACRIDINA PARA AVALIAO DA ETAPA FINAL DO
MECANISMO DE AUTOFAGIA........................................................................................................................................139
4.20 ENSAIO DE AGREGAO DE GFP-LC3 PARA MENSURAO DA ETAPA INICIAL DA AUTOFAGIA..141
4.21 AVALIAO DO NDICE MITTICO PARA INFERNCIA DE PROLIFERAO CELULAR.......................142
4.22 ATIVIDADE DE BETA-GALACTOSIDASE CIDA ASSOCIADA SENESCNCIA (SA--GAL)..................143
4.23 ENSAIO CLONOGNICO PARA MENSURAO DA CAPACIDADE PROLIFERATIVA DE CLULAS
NICAS ...................................................................................................................................................145
4.24 MARCAO DE BROMODEOXIURIDINA (BrdU) PARA AVALIAO DA PROLIFERAO
CELULAR ..............................................................................................................................................................................146
4.25 ANLISE MORFOMTRICA NUCLEAR (NMA) PARA INFERNCIA DE APOPTOSE, SENESCNCIA
E IRREGULARIDADES NUCLEARES...............................................................................................................................148
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SUMRIO
11
CAPTULO 5
ANLISE DE EXPRESSO GNICA EM
NVEL DE RNA....................................................................................................................................... 150
5.1 TRATAMENTO DAS AMOSTRAS DE RNA COM DNASE I E DNASE TURBO................................................151
5.2 SNTESE DE PRIMEIRA FITA DE CDNA UTILIZANDO A TRANSCRIPTASE REVERSA M-MLV.................152
5.3 SNTESE DE PRIMEIRA FITA DE cDNA UTILIZANDO A TRANSCRIPTASE REVERSA SUPERSCRIPT II..... 153
5.4 ANLISE DA EXPRESSO GNICA POR RT-PCR SEMI-QUANTITATIVO.........................................................154
5.5 PREPARAO DE UMA PLACA DE RT-qPCR (PCR EM TEMPO REAL) DE 48 POOS...................................157
5.6 CONFIGURAO DO EQUIPAMENTO STEPONE (APPLIED BIOSYSTEMS) PARA ANLISES DE
EXPRESSO GNICA..........................................................................................................................................................160
CAPTULO 6
ANLISE DE EXPRESSO GNICA EM NVEL DE PROTENA................................................ 161
6.1 ELETROFORESE DE PROTENAS EM CONDIO DESNATURANTE EM GEL DE
POLIACRILAMIDA SDS PAGE.......................................................................................................................................162
6.2 MTODOS DE COLORAO DE GIS SDS-PAGE.....................................................................................................166
6.3 IMUNOIDENTIFICAO DE PROTENAS POR WESTERN BLOTTING...............................................................168
CAPTULO 7
PRODUO E ANLISE DE BIOPRODUTOS................................................................................. 171
7.1 MANUTENO DAS CULTURAS.................................................................................................................................172
7.2 PREPARAO DO INCULO........................................................................................................................................172
7.3 DETERMINAO DE BIOMASSA.................................................................................................................................172
7.4 DETERMINAO DA ACIDEZ TITULVEL...............................................................................................................173
7.5 DETERMINAO DO pH................................................................................................................................................175
7.6 DETERMINAO DA MATRIA MINERAL (CINZAS)............................................................................................176
7.7 DETERMINAO DA UMIDADE, VOLTEIS E SLIDOS TOTAIS.......................................................................178
7.8 DETERMINAO DE LIPDIOS.....................................................................................................................................180
7.9 DETERMINAO DO NITROGNIO TOTAL.............................................................................................................181
7.10 DETERMINAO DE PROTENA SOLVEL............................................................................................................184
7.11 ANLISE DAS PROPRIEDADES FUNCIONAIS E NUTRICIONAIS DE PROTENAS.......................................186
7.12 DETERMINAO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE............................................................................................191
7.13 DETERMINAO DA DEMANDA QUMICA DE OXIGNIO (DQO).................................................................194
7.14 DETERMINAO DE POLIFENIS TOTAIS.............................................................................................................197
7.15 AVALIAO QUALITATIVA DE METABLITOS SECUNDRIOS DE PLANTAS..........................................200
CAPTULO 8
CULTURA DE CLULAS ANIMAIS.................................................................................................... 205
8.1 CULTURA E MANIPULAO DE LINHAGENS CELULARES...............................................................................206
8.2 CULTURA PRIMRIA DE CLULAS FOLICULARES DE TIREOIDE HUMANA................................................210
CAPTULO 9
CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS................................................................................................. 213
9.1 PREPARAO DE SOLUES ESTOQUE PARA O MEIO MS................................................................................214
9.2 PREPARO DO MEIO DE CULTURA MS (MURASHIGE E SKOOG)........................................................................216
9.3 OBTENO E DESINFESTAO DOS EXPLANTES.................................................................................................219
9.4 ESTABELECIMENTO DOS EXPLANTES E CONDIES DE INCUBAO.........................................................222
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SUMRIO
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CAPTULO 10
ISOLAMENTO E CARACTERIZAO DE BACTRIAS PROMOTORAS DE
CRESCIMENTO VEGETAL.................................................................................................................. 227
10.1 ISOLAMENTO DE DIAZOTRFICOS ENDOFTICOS DE RAIZ............................................................................228
10.2 ISOLAMENTO DE DIAZOTRFICOS DE SOLO RIZOSFRICO............................................................................231
10.3 ISOLAMENTO DE DIAZOTRFICOS FORMADORES DE ENDSPOROS DE SOLO RIZOSFRICO...........232
10.4 ISOLAMENTO DE RIZBIOS........................................................................................................................................234
10.5 IDENTIFICAO DO GNERO E ESPCIE BACTERIANA....................................................................................235
10.6 PRODUO DE COMPOSTOS INDLICOS..............................................................................................................237
10.7 SOLUBILIZAO DE FOSFATO DE CLCIO...........................................................................................................238
10.8 PRODUO DE SIDERFOROS BACTERIANOS.....................................................................................................239
10.9 ATIVIDADE DA ENZIMA ACC DEAMINASE...........................................................................................................241
CAPTULO 11
ANLISES BSICAS DE BIOINFORMTICA.................................................................................. 242
11.1 DESENHO DE INICIADORES (PRIMERS) PARA PCR UTILIZANDO SOFTWARES ONLINE.......................243
11.2 VERIFICAO DA QUALIDADE DOS PRIMERS PROJETADOS.........................................................................244
11.3 PREPARAO DE ARQUIVO CONTENDO SEQUNCIA NO FORMATO FASTA..........................................246
11.4 OBTENO DE SEQUNCIAS REVERSO-COMPLEMENTAR..............................................................................247
11.5 BUSCA DE SIMILARIDADE DE SEQUNCIAS UTILIZANDO UM BANCO DE DADOS DE
SEQUNCIAS E AS FERRAMENTAS BLAST (BASIC LOCAL ALIGNMENT SEARCH TOOL) ...........................248
11.6 ALINHAMENTO DE SEQUNCIAS DE NUCLEOTDEOS E PROTENAS (ALINHAMENTO GLOBAL) ....254
11.7 LOCALIZAO DE DOMNIOS CONSERVADOS EM SEQUNCIAS DE PROTENAS..................................256
11.8 PREDIO DE DOMNIOS TRANSMEMBRANA A PARTIR DE SEQUNCIAS DE PROTENAS.................257
11.9 PREDIO DE LOCALIZAO SUBCELULAR, PRESENA DE PEPTDEO DE DIRECIONAMENTO
N-TERMINAL E DE SINAL DE LOCALIZAO NUCLEAR, A PARTIR DE SEQUNCIAS DE PROTENAS.... 258
11.10 IDENTIFICAO E ANLISE DA REGIO PROMOTORA DE GENES ORIUNDOS DE GENOMAS
DE PLANTAS.........................................................................................................................................................................261
11.11 PREDIO DE SECREO E LOCALIZAO DE PROTENAS........................................................................263
CAPTULO 12
CRIAO E APLICAO DE CAROS PARA CONTROLE BIOLGICO................................. 265
12.1 CRIAO E APLICAO DE CAROS PARA CONTROLE BIOLGICO..........................................................266
CAPTULO 13
CLULAS FNGICAS: PRODUO, CONTAGEM E VIABILIDADE APLICADAS AO
CONTROLE BIOLGICO..................................................................................................................... 268
13.1 PRODUO DE CONDIOS DE FUNGOS FILAMENTOSOS.................................................................................269
13.2 PREPARAO DA SUSPENSO DE CONDIOS (ESPOROS) DE FUNGOS FILAMENTOSOS.......................271
13.3 CONTAGEM DA SUSPENSO DE CONDIOS OU LEVEDURAS.........................................................................272
13.4 TESTE DE VIABILIDADE DA SUSPENSO DE CONDIOS....................................................................................273
13.5 EXTRAO DE PROTENAS DE SUPERFCIE DE CONDIOS FNGICOS........................................................274
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13
CAPTULO 14
MODELOS BIOLGICOS PR-CLNICOS PARA AVALIAO DA ATIVIDADE DE
SUBSTNCIAS FARMACOLOGICAMENTE ATIVAS..................................................................... 275
14.1 MODELO DE TROMBOSE VENOSA LOCAL.............................................................................................................276
14.2 MODELO DE TROMBOSE VENOSA PROFUNDA....................................................................................................279
14.3 MODELO DE HEMORRAGIA........................................................................................................................................282
14.4 MODELO DE ASMA ALRGICA..................................................................................................................................284
14.5 MODELO DE PERMEABILIDADE VASCULAR.........................................................................................................286
14.6 MODELO DE GASTRITE.................................................................................................................................................288
14.7 MODELO DE COLITE......................................................................................................................................................290
CAPTULO 15
QUANTIFICAO E ANLISE DE ATIVIDADE ENZIMTICA.................................................. 292
15.1 ATIVIDADE PROTEOLTICA: AZOCASENA...........................................................................................................293
15.2 ATIVIDADE PROTEOLTICA: TRIPSINA...................................................................................................................295
15.3 ATIVIDADE PROTEOLTICA: TROMBINA + SUBSTRATO SINTTICO.............................................................298
15.4 ATIVIDADE PROTEOLTICA: TROMBINA + FIBRINOGNIO..............................................................................300
15.5 ATIVIDADE LIPOLTICA, LIPASE: TITULAO DE CIDOS GRAXOS ...........................................................302
15.6 ATIVIDADE LIPOLTICA, LIPASE: P-NITROFENIL-PALMITATO ......................................................................304
15.7 ATIVIDADE AMILOLTICA .........................................................................................................................................307
15.8 ATIVIDADE CELULSICA ...........................................................................................................................................309
CAPTULO 16
DETECO DE ATIVIDADE ENZIMTICA ATRAVS DE GIS DE ATIVIDADE/
ZIMOGRAMAS......................................................................................................................................... 311
16.1 GEL DE ATIVIDADE (ZIMOGRAMA) PARA DETECO DE QUITINASES (ST LEGER ET AL. 1993).........312
16.2 GEL DE ATIVIDADE (ZIMOGRAMA) PARA DETECO DE PROTEASES (MODIFICADO DE ST
LEGER ET AL. 1993)..............................................................................................................................................................315
16.3 GEL DE ATIVIDADE (ZIMOGRAMA) PARA DETECO DE LIPASES E ESTERASES (TEO ET AL. 2003)..... 317
16.4 GEL DE ATIVIDADE (ZIMOGRAMA) PARA DETECO DE CATALASES (ZIMMERMANN ET AL.
2006).........................................................................................................................................................................................319
16.5 GEL DE ATIVIDADE (ZIMOGRAMA) PARA DETECO DE SUPERXIDO DISMUTASES.........................321
CAPTULO 17
GERENCIAMENTO DE RESDUOS EM LABORATRIOS DE BIOTECNOLOGIA................ 324
17.1 BROMETO DE ETDIO....................................................................................................................................................325
17.2 ACRILAMIDA...................................................................................................................................................................327
17.3 FENOL................................................................................................................................................................................328
Biotecnologia
SUMRIO
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CAPTULO 1
PREPARO DE SOLUES, TCNICAS BSICAS E
UTILIZAO DE EQUIPAMENTOS DE ROTINA
Claucia Fernanda Volken de Souza, Christina Venzke Simes de Lima,
Eduardo Miranda Ethur, Luclia Hoehne, Mariano Rodrigues
Laboratrio pode ser definido como o local construdo com a finalidade de se realizar
diferentes experimentos. A importncia do laboratrio na pesquisa, em escala industrial ou
acadmica, em qualquer de suas especialidades, seja qumica, dimensional, eltrica e biolgica,
baseia-se no exerccio de suas atividades sob condies ambientais controladas e normatizadas.
Esta a forma de assegurar que no ocorram influncias estranhas que alterem o resultado do
experimento ou medio e, ainda, de modo que garanta a repetio do estudo em outro laboratrio
e com a mesma exatido nos resultados (Oliveira et al., 2007). No entanto, o laboratrio um local
de trabalho com potenciais riscos de acidentes, tendo em vista que se manipulam substncias com
uma periculosidade considervel e, que se indevidamente utilizadas, podem causar danos graves
ao usurio do laboratrio (Chambel, 2014), seja ele aluno, laboratorista ou professor.
Neste captulo inicial, tem-se o objetivo de evidenciar as tcnicas e procedimentos bsicos
que so usados em laboratrios de qumica e reas afins para auxiliar profissionais desta rea a ter
uma uniformidade na execuo dos mtodos e diminuir ao mximo qualquer interferente, para que
sejam obtidos resultados confiveis.
Referncias:
CHAMBEL, Silvia. Segurana no laboratrio. 2005. Disponvel em: <http://www.ideiasambientais.com.pt/
seguranca_laboratorio.html>. Acesso em: 21 jan. 2014.
OLIVEIRA, C. M. A. et al. Guia de laboratrio para o ensino de qumica: instalao montagem e operao. CRQ-IV:
So Paulo, 2007. 53 p.
Biotecnologia
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Biotecnologia
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- Ao utilizar uma capela sempre verifique se a mesma est limpa e o sistema de exausto est operando
corretamente. Mantenha as janelas da capela com o mnimo de abertura possvel, evitando sempre
colocar o rosto para dentro da mesma.
- Se a toxidade do produto for elevada, utilize mscara contra gases. No caso de diluies, sempre
derramar o cido sobre a gua, nunca o contrrio.
- Antes de usar qualquer aparelho, certifique-se que sabe manuse-lo. Leia as instrues ou pea uma
demonstrao ao instrutor.
- Ao ligar qualquer aparelho corrente eltrica, certifique-se do estado da fiao, tomadas e plugues,
compatibilidade da voltagem do aparelho com a da rede eltrica, aterramento, condies
da superfcie de contato com o aparelho (no deve estar mida) e da existncia de produtos
inflamveis na proximidade.
- Colocar os lixos (seco, orgnico, contaminado, txico, vidros etc) em recipientes adequados. No
jogar na pia ou local indevido.
- Deve-se lavar as mo antes de sair do laboratrio.
- Ao sair do laboratrio, verificar se as torneiras de gua e gs (neste caso, inclusive o registro) esto
fechadas, aparelhos desligados e janelas trancadas.
Referncias:
CHRISPINO, lvaro. Manual De Qumica Experimental. So Paulo: Editora tica. 2 Edio, 1994. 230 p.
CIENFUEGOS, Freddy. Segurana No Laboratrio. Rio De Janeiro: Intercincia, 2001.269 p.
LENZI, Ervim et al. Qumica Geral Experimental. Rio De Janeiro: Freitas Bastos, 2009. 390 p.
PAVIA, Donald L. et al. Qumica Orgnica Experimental: Tcnicas De Escala Pequena. Porto Alegre: Bookman, 2009.
880 p.
POSTMA, James M.; ROBERTS, Julian L.; HOLLENBERG, Leland. Qumica No Laboratrio. Barueri, SP: Manole, 5
Edio, 2009.546 p.
ROSA, Gilberto; GAUTO, Marcelo; GONALVES, Fbio. Qumica Analtica: Prticas De Laboratrio. Porto Alegre:
Bookman, 2013. 128 p.
UNIFEB. Apostila de Qumica Geral e Experimental. 2009. Disponvel em: <http://xa.yimg.com/kq/
groups/24693296/1821154571/name/UNKNOWN_PARAMETER_VALUE>. Acesso em: 30 mar. 2014
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- Balana analtica usada para se obter massa com alta exatido. Balanas semi-analticas so
tambm usadas para medidas nas quais a necessidade de resultados confiveis no to necessria
(Figura 4.10)
Figura 4. Diversos materiais de uso comum em laboratrios qumicos e reas afins.
Referncias:
BLOG DE VIDRARIA DE LABORATRIO. Relao de produtos mais utilizados em laboratrios. Disponvel em:
<http://www.vidrariadelaboratorio.com.br>. Acesso em: 09 jun. 2014
UNIFEB. Apostila de Qumica Geral e Experimental. 2009. <http://xa.yimg.com/kq/groups/24693296/1821154571/
name/UNKNOWN_PARAMETER_VALUE>. Acesso em 30 mar 2014
SILVA, R. R. Da; Bocchi, N.; Filho, R. C. R. Introduo Qumica Experimental. So Paulo: McGraw-Hill, 1990.
Tcnicas Laboratoriais Bsicas. Disponvel em: <file:///C:/Users/user/Documents/UNIVATES/Ebooks%20finais/
3c063ab671ad9b66895ffa8f310ab5c4.pdf>. Acesso em: 31 mar 2014.
TRINDADE, D. F et al. Qumica - bsica experimental. So Paulo: Cone, 1998.
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resinas, com o passar do tempo, tornam-se saturadas de ons das impurezas da gua. Este momento
detectado por um pequeno condutivmetro embutido no deionizador. Aps um processo de
renovao ou reciclagem, estas colunas podem ser reaproveitadas no deionizador.
1.3.4 gua ultrapura
gua ultrapura uma gua de extrema pureza, isenta de partculas, ons e substncias
orgnicas ou micro-organismos. obtida pela passagem da gua por sistemas de abrandamento
como resinas trocadoras, que substituem o clcio e o magnsio dissolvido na gua por ons de Sdio,
seguido de sistema de osmose reversa, que faz a remoo desses ons, seguido de um refinamento
por uma srie de filtros constitudos de resinas catinicas e aninicas, um leito de carvo ativo para
remoo de contaminantes orgnicos e, finalmente, um filtro fsico para remoo de particulados.
usado em laboratrios analticos onde se requer uma gua de altssima pureza como, por exemplo,
nas anlises por HPLC.
Referncias:
MABIC, S. Maintaining water quality in clinical chemistry. Advance for Medical Laboratory Professionals, v. 15, n. 8,
2007.
MABIC, S. Water for clinical chemistry. Application note, 2006.
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O material do item a no pode ser usado nunca. O material do item b, embora visualmente
possa parecer limpo, ainda pode estar realmente:
a) contaminado com vrias impurezas qumicas e biolgicas;
b) contaminado com reduzida quantidade de impurezas qumicas;
c) realmente limpo para determinaes muito sensveis.
O material do item c pode ser usado em alguns casos em que a contaminao no seja sria;
comumente anlises rpidas e grosseiras. O material do item b pode ser utilizado para uso geral
(muitas anlises biolgicas de rotina e anlises qumicas de baixa preciso). O material do item e
utilizado em anlises qumicas e biolgicas finas, que exigem alto grau de pureza ou preciso,
exigindo procedimentos especiais para limpeza.
As anlises so comprometidas com a presena de impurezas, seja por contaminao da
amostra a ser preparada, seja pela alterao no volume ou peso final das mesmas. Assim, a matria
gordurosa impede o perfeito escoamento nos aparelhos volumtricos, causando inexatido do
trabalho.
indicado encher o aparelho volumtrico com gua da torneira. Retira-se a mesma e observase se houve escoamento completo ou se permanecem gotculas que indicam a presena de pontos
gordurosos. Lava-se com detergente e escova, enxaguando bem com gua da torneira e, por ltimo,
procede-se o enxgue com gua destilada.
1.4.1 Uso de Detergente
Existem diversas marcas de detergentes prprios para limpeza de vidraria. O Extran um
dos mais conhecidos, produzido pela Merck. Existem tambm outros tipos como o DECON 90, que
produzido pela Decon Laboratories, ou o DETERTEC, produzido pela Vetec. Estes podem ser
diludos em vrias concentraes (definidas no rtulo), dependendo do grau de sujeira do aparelho
a ser limpo. Podem ter caractersticas bem definidas como ao bacteriolgica ou iseno de alguma
substncia qumica como, por exemplo, o fsforo.
Coloca-se o detergente no aparelho com gotculas, deixando-se em contato por trs a cinco
minutos. A seguir, recolhe-se a mistura para o frasco de origem. Esta mistura tem um efeito
corrosivo sobre a pele. Portanto, deve-se manuse-la com cuidado. Aps, o aparelho lavado vrias
vezes com gua da torneira, e em seguida, duas ou trs vezes com gua destilada, secando-se as
paredes externas.
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Referncias:
CHRISPINO, lvaro. Manual De Qumica Experimental. So Paulo: Editora tica. 2 Edio, 1994. 230 p.
CIENFUEGOS, Freddy. Segurana No Laboratrio. Rio De Janeiro: Intercincia, 2001. 269 p.
DECON 90. http://www.decon.co.uk/english/decon90.asp. Acesso em: 31 mar 2014
LENZI, Ervim et al. Qumica Geral Experimental. Rio De Janeiro: Freitas Bastos, 2009. 390 p.
MERCK. Reactivos, diagnstica, productos qumicos 1992/93. Darmstadt, 1993. 1584 p.
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Edio, 2009. 546 p.
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Caso desejar uma secagem mais rpida, pode-se enxaguar a aparelhagem com acetona e, a
seguir, deixando-a secar ao ar ou na estufa.
Referncias:
MOURA, J. A. S.; YOGUI, G. T. Limpeza e preparao de vidrarias para anlise de compostos orgnicos.
Procedimento Operacional Padro Organo MAR-2012-05, Reviso n 1. Laboratrio de Compostos Orgnicos em
Ecossistemas Costeiros e Marinhos, Departamento de Oceanografia, Universidade Federal de Pernambuco, 2012. 6p.
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Bookman, 2013.128 p.
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A) pipeta volumtrica
B) bureta
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A medida de lquidos com qualquer aparelho est sujeita a uma srie de erros devido s
seguintes causas:
Ao da tenso superficial sobre a superfcie lquida;
Dilatao e contrao provocadas pela variao de temperatura;
Imperfeita calibrao dos aparelhos volumtricos.
Estes erros afetam a exatido do aparelho. A bureta mais exata que as pipetas graduadas,
que por sua vez so mais exatas que as provetas. O bquer e o erlenmeyer no apresentam valor em
termos de exatido.
A leitura do volume contido no aparelho feita comparando-se o nvel do lquido com as
linhas calibradas existentes nas paredes do aparelho. O nvel do lquido usualmente considerado
como a parte inferior do menisco (superfcie curva do lquido), que mais facilmente localizada
quando se coloca um retngulo preto a 1 mm abaixo do menisco. Este ficar com uma colorao
escura, facilitando a leitura. A leitura deve ser feita quando a curvatura inferior do menisco coincidir
com a altura dos olhos. Evita-se, assim, o erro de paralaxe.
Forma correta de medir um volume: LEITURA PELA PARTE INFERIOR DO MENISCO
COM O OLHO AO NVEL APROPRIADO, conforme Figura 6:
Figura 6: Leitura de volume em proveta
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Referncias:
BUSATO, Germano Luis Ferrari. Disponvel em: <http://followscience.com/content/368927/medidas-e-volumes>.
Acesso em 30 mar 2014.
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Pr-anlise. Disponvel em: <http://www.pro-analise.com.br>. Acesso em: 30 mar 2014.
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Bookman, 2013. 128 p.
UNIFEB. Apostila de Qumica Geral e Experimental. 2009. Disponvel em: <http://xa.yimg.com/kq/
groups/24693296/1821154571/name/UNKNOWN_PARAMETER_VALUE>. Acesso em: 30-03-14
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Outra tima alternativa como fonte de calor so as mantas de aquecimento, cuja temperatura
regulada por um controlador de calor. A verdadeira temperatura da manta no pode ser controlada
com facilidade; porm, aps certa experincia torna-se relativamente fcil o controle. So ideais
para reaes e destilaes que exigem temperaturas relativamente elevadas. So muito fceis de
usar e de operao segura, devendo-se tomar o cuidado em evitar o derrame de lquidos no poo
da manta de aquecimento, j que a superfcie da base de cermica pode estar muito quente e fazer
o lquido pegar fogo. Na montagem da aparelhagem pode-se optar pela utilizao de macacos de
laboratrio ou blocos de madeira, para serem colocados sob a manta de aquecimento; neste caso a
manta abaixada e a aparelhagem fica presa na mesma posio. Outro cuidado que se deve ter
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em utilizar manta de tamanho compatvel com a vidraria que contm a soluo, a fim de se evitar
superaquecimentos (Figura 9).
Figura 9: Aquecimento em manta
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tubo.
Observando o bico de Bunsen, verifica-se que ele constitudo de trs partes: base, anel e
Entre a base e o tubo, h um anel de encaixe no qual existem orifcios ou janelas. A entrada
de ar ocorre atravs das janelas emparelhadas. Quando elas esto justapostas, pode-se dizer que
esto abertas; quando o anel cobre totalmente a janela do tubo, pode-se dizer que esto fechadas.
A chama luminosa (amarela) obtida quando o anel est fechado. Neste caso, a quantidade
de oxignio pequena, consequentemente menor ser a queima e menor ser a quantidade de calor
produzida pela chama. A chama no luminosa (azul) obtida quando o anel est aberto. Neste
caso, a quantidade de oxignio maior; maior ser a queima e maior ser a quantidade de calor
produzida pela chama.
Portanto, quando o anel est fechado, a combusto incompleta e h formao de fuligem
(carbono). Quando o anel est aberto, a combusto completa e no h formao de fuligem.
Para acender o bico de Bunsen, proceda da seguinte maneira:
- Primeiramente, verifique se as janelas do anel esto fechadas: o bico de Bunsen deve ser aceso com
as janelas fechadas para evitar que a chama se recolha para o interior do tubo.
- A seguir, abre-se a vlvula de gs da bancada. Feito isso, segure um fsforo aceso um pouco acima
e ao lado da extremidade do tubo. Abra o registro e acenda a chama. A chama que se obtm
grande, amarela e luminosa. Abre-se em seguida a entrada de ar, lentamente, at que a chama se
torne azul. Controle a quantidade de gs com o registro e gire o anel gradativamente at abrir por
completo as janelas do bico de Bunsen. Se, durante o funcionamento do bico, ouvir-se um rudo
tpico, deve-se regular a entrada de ar e de gs.
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Referncias:
CHRISPINO, lvaro. Manual de Qumica Experimental. So Paulo: Editora tica. 2 edio, 1994. 230 p.
CIENFUEGOS, Freddy. Segurana no laboratrio. Rio de Janeiro: Intercincia, 2001. 269 p.
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edio, 2009. 546 p.
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Referncias:
OLIVEIRA, C. M. A. et al. Guia de laboratrio para o ensino de qumica: instalao montagem e operao. CRQ-IV:
So Paulo, 2007. 53 p.
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Referncias:
ROSA, Gilberto; GAUTO, Marcelo; GONALVES, Fbio. Qumica Analtica: Prticas de Laboratrio. Porto Alegre:
Bookman, 2013. 128 p.
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b) Analticas: apresentam o prato para a colocao da amostra com proteo lateral, com o objetivo
de evitar que as correntes de ar provoquem instabilidade ou erros de leitura. Apresentam
sensibilidade de 0,0001 a 0,00001 g sendo, dessa forma, utilizadas quando se requer uma maior
preciso na pesagem. necessrio salientar que, para uma maior estabilidade da balana durante
a pesagem, preciso construir uma plataforma com isolamento pra colocar a balana (Figura 15).
Figura 15: balana analtica
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Existem vrios tipos de balana analtica: manuais, eltricas e digitais. O princpio, porm,
o mesmo. Consiste em se fazer uma comparao entre a massa que se quer medir e a massa de
pesos de referncia.
As balanas manuais, mais antigas, possuem dois braos iguais presos por estribos a uma
barra central. Estes braos abrigam os pratos da balana, onde se efetua a pesagem. Os pesos de
referncia (analticos) so manuseados sempre por intermdio de uma pina adequada. Nunca
so manuseados diretamente com a mo. Todo este sistema est armazenado dentro de uma caixa
fechada com paredes de vidro e janelas laterais.
As balanas eltricas, ainda utilizadas, possuem o mesmo princpio. Porm, um dos pratos
interno e o outro externo. No prato externo coloca-se o corpo cuja massa se quer medir. O prato
interno possui barras horizontais ao longo de sua altura, onde so depositados pesos analticos
(massas de referncia) por meio de botes situados na parte frontal e balana. Existe uma escala
fixa, que d valores de massa da centena at o dcimo de grama. Tambm existe uma escala mvel,
que registra valores de massa das trs ltimas casas depois da vrgula.
As balanas digitais, mais modernas, possuem somente um prato. Internamente, possuem
um sistema eletrnico, com placas de circuito impresso, que substitui os pesos de referncia. Estas
balanas so mais precisas e prticas de manusear, pois possuem um sistema de taragem. So
calibradas com um peso de referncia. Com a balana estabilizada e no nvel, calibra-se o zero com
o prato livre de qualquer corpo. Depois, procede-se a calibrao da massa deste peso de referncia.
Tem-se, da, um intervalo de calibrao. A partir dele, o sistema eletrnico da balana est apto
para medir qualquer outra massa, dentro de seu limite de medida.
A balana analtica um instrumento de preciso, de construo delicada que exige do
operador o mximo cuidado para obter resultados corretos. Por isso, recomenda-se observncia
rigorosa do que segue:
a) A balana analtica deve ser instalada em local adequado, de preferncia em sala especial, separada
do laboratrio, onde ela no fique sujeita ao de vapores corrosivos. Um lugar onde, tambm
no incida luz solar direta, nem se verifiquem mudanas bruscas de temperatura. A balana
colocada sobre uma plataforma fixa a uma parede to livre quanto possvel de vibraes e bem
nivelada;
b) Nenhum cristal, p ou gota de material deve permanecer sobre a mesa da balana, ou no interior
da mesma;
c) A caixa da balana deve ser mantida fechada enquanto no estiver em uso;
d) A balana deve ser conservada no nvel;
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e) Enquanto no estiverem em uso, a alavanca e o prato devero ser mantidos suspensos (travados) e
sem objetos ou pesos sobre seu prato;
f) A colocao de massas no prato deve ser feita cuidadosamente, evitando choque, com o auxlio de
pinas apropriadas e sempre com a balana travada;
g) Os reagentes nunca so colocados diretamente sobre o prato, mas em recipientes apropriados (vidro
de relgio, frascos de pesagem etc.) e no caso de pequenas quantidades de material inofensivo,
pode ser usado papel gessado ou papel de alumnio;
h) Sendo volteis, a pesagem de lquidos e slidos corrosivos, requer cuidados especiais; semelhantes
materiais tm de ser pesados em recipientes perfeitamente fechados;
i) A carga mxima da balana nunca deve ser ultrapassada;
j) O prato da balana sempre deve ser conservado rigorosamente limpo. Qualquer corroso, mesmo
pequena de sua cromagem requer a sua substituio ou conserto;
k) Evitar apoiar-se sobre a plataforma-suporte da balana, quando em operao ou no, para evitar
oscilaes, desnvel e, portanto, desequilbrio do aparelho;
l) sempre aconselhvel que as balanas sejam ligadas 30 minutos antes do uso, para ambientao e
autocalibrao;
m) Colocar o recipiente de pesagem no centro do prato da balana;
n) Cuidar para que o material de pesagem no encoste nas paredes da balana.
Referncias:
CHRISPINO, lvaro. Manual de Qumica Experimental. So Paulo: Editora tica. 2. edio, 1994. 230 p.
CIENFUEGOS, Freddy. Segurana no laboratrio. Rio de Janeiro: Intercincia, 2001. 269 p.
LENZI, Ervim et al. Qumica Geral Experimental. Rio de Janeiro: Freitas Bastos, 2009. 390 p.
PAVIA, Donald L et al. Qumica Orgnica experimental: Tcnicas de escala pequena. Porto Alegre: Bookman, 2009.
880 p.
POSTMA, James M.; ROBERTS, Julian L.; HOLLENBERG, Leland. Qumica no Laboratrio. Barueri, SP: Manole, 5
edio, 2009. 546 p.
ROSA, Gilberto; GAUTO, Marcelo; GONALVES, Fbio. Qumica Analtica: Prticas de Laboratrio. Porto Alegre:
Bookman, 2013. 128 p.
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Aps ter-se definido a massa de reagente a ser pesada, tira-se o frasco do interior da balana e
se retira pequenas pores de reagente. Este procedimento deve ser feito com cuidado, inclinandose o frasco e batendo-se levemente a tampa deste na sua borda, para que o reagente caia aos poucos
no recipiente que vai ser utilizado para solubilizar o slido.
A cada retirada de pequena poro de reagente do pesa-filtro, tampa-se o mesmo, colocando-o
na balana para, com a tampa lateral desta fechada, proceder-se nova leitura. Este procedimento
repetido vrias vezes, at que a balana indique que j a quantidade desejada de reagente foi
retirada.
Referncias:
CHRISPINO, lvaro. Manual de Qumica Experimental. So Paulo: Editora tica. 2 edio, 1994. 230 p.
CIENFUEGOS, Freddy. Segurana no laboratrio. Rio de Janeiro: Intercincia, 2001. 269 p.
LENZI, Ervim et al. Qumica Geral Experimental. Rio de Janeiro: Freitas Bastos, 2009. 390 p.
PAVIA, Donald L et al. Qumica Orgnica experimental: Tcnicas de escala pequena. Porto Alegre: Bookman, 2009.
880 p.
POSTMA, James M.; ROBERTS, Julian L.; HOLLENBERG, Leland. Qumica no Laboratrio. Barueri, SP: Manole, 5
edio, 2009. 546 p.
ROSA, Gilberto; GAUTO, Marcelo; GONALVES, Fbio. Qumica Analtica: Prticas de Laboratrio. Porto Alegre:
Bookman, 2013. 128 p.
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A
Fonte: Dos autores.
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a pequena poro de lquido que fica retido na extremidade da pipeta, salvo em pipetas especiais.
Estas possuem duas listras na ponta superior. Nestes casos, pode-se retirar o resduo de lquido
de seu interior, fechando-se a extremidade superior com o dedo indicador e, com a outra mo,
segurando o bulbo da pipeta. Com isto, provoca-se ligeiro aumento da temperatura do ar interno,
causando uma expanso suficiente para expulsar o resduo de lquido.
A Figura 17 mostra como se manuseia corretamente uma pipeta.
Figura 17: manuseio correto da pipeta
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As pipetas volumtricas e como todos os aparelhos volumtricos, devem ser aferidos quando
se necessita utiliz-los em anlises volumtricas. Esta tcnica baseia-se na determinao da massa
de gua destilada contida dentro da pipeta. De uma forma resumida, so feitas trs medidas de
gua destilada, em temperatura conhecida, para cada pipeta. Escoa-se esta quantidade para frascos
erlenmeyer de 125 mL (com tampa), pesados previamente em balana analtica. Estes frascos
so pesados novamente e, com o auxlio de tabelas apropriadas, faz-se a converso dos pesos
encontrados para os respectivos volumes corrigidos (nas temperaturas medidas).
Mais recentemente, surgiram as micropipetas. Estas servem para se obter medidas de
volumes extremamente pequenos. Estas pipetas so utilizadas, em sua grande parte, em anlises de
cromatografia, onde se necessitam volumes muito pequenos de amostra para a leitura do aparelho.
Em alguns laboratrios, em que se exige maior preciso nas anlises, so utilizadas pipetas
automticas. Deve-se evitar a sua utilizao com lquidos corrosivos como cido sulfrico ou cido
clordrico. Neste tipo de pipeta deve-se sempre utilizar ponteiras plsticas.
1.16.3 Uso de buretas
As buretas so constitudas de tubos de vidro calibrados que permitem o fcil controle de
escoamento de volumes variveis de lquidos.
Ao ser utilizada, deve ser fixada na posio vertical, fixa em um suporte. Inicialmente devese ambientar a mesma com o reagente a ser utilizado, lavando a mesma com cerca de 5 mL do
mesmo, o qual deve ser adicionado com o auxlio de um funil. Enche-se ento a bureta, at um
pouco acima do marco zero, e deixa-se escoar o reagente at que atinja o zero da escala, tomando o
cuidando na leitura do mesmo a fim de evitar erros. Durante esse processo deve-se eliminar todas
as bolhas de ar que possam existir. Coloca-se ento o frasco que vai receber o lquido abaixo da
bureta, deixando o lquido escoar lentamente. A torneira da bureta deve ser controlada com a mo
esquerda. Aps escoar a quantidade necessria do lquido deve-se aguardar alguns segundos para
fazer a leitura do volume retirado.
As buretas, assim como as pipetas volumtricas, tambm necessitam ser aferidas, caso sejam
utilizadas em determinaes quantitativas mais precisas. A tcnica de aferio de buretas segue a
mesma lgica da tcnica descrita para aferio e pipetas volumtricas. Porm, um pouco mais
complexa, pois se faz a aferio de cada segmento de 5 ou 10 mL. A Figura 18 evidencia uma bureta.
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Referncias:
Manuseio de pipetas. Disponvel em: <http://coracaodefarmaceutico.blogspot.com.br/2013/05/controle-dequalidade-nocoes-basicas.html>. Acesso em: 31/03/2014
ROSA, Gilberto; GAUTO, Marcelo; GONALVES, Fbio. Qumica Analtica: Prticas de Laboratrio. Porto Alegre:
Bookman, 2013.128 p.
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Umedece-se o papel com uma pequena quantidade do solvente com que se est trabalhando,
de modo a se obter uma boa aderncia. Para uma rpida filtrao, o papel deve ser ajustado no
funil de modo que o ar no penetre entre o papel e o funil. O dimetro do papel de filtro utilizado
deve ser tal que sua parte superior deve estar a 1 cm abaixo da borda do funil de vidro.
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Referncias:
Filtrao. Disponvel em: <http://www.soq.com.br/conteudos/ef/misturas/p2.php>. Acesso em 31/03/2014.
POSTMA, James M.; ROBERTS, Julian L.; HOLLENBERG, Leland. Qumica no Laboratrio. Barueri, SP: Manole, 5
edio, 2009. 546 p.
ROSA, Gilberto; GAUTO, Marcelo; GONALVES, Fbio. Qumica Analtica: Prticas de Laboratrio. Porto Alegre:
Bookman, 2013. 128 p.
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Referncias:
POSTMA, James M.; ROBERTS, Julian L.; HOLLENBERG, Leland. Qumica no Laboratrio. Barueri, SP: Manole, 5
edio, 2009. 546 p
ROSA, Gilberto; GAUTO, Marcelo; GONALVES, Fbio. Qumica Analtica: Prticas de Laboratrio. Porto Alegre:
Bookman, 2013. 128 p.
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2. Medir o volume de soluto necessrio com o auxlio de uma pipeta e transferir para um bquer.
3. Diluir o soluto utilizando apenas uma parte do solvente e agitando com um basto de vidro.
4. Verter a soluo para o balo volumtrico, com auxlio de um funil, lavando o bquer, o basto de
vidro e o funil com solvente para arrastar todo o soluto, cuidando-se para no exceder a marca do
gargalo.
5. Aps a soluo diluda, fazendo-se o solvente escoar pelas paredes do balo, at que o lquido
chegue extremidade inferior do gargalo. Se o gargalo do balo volumtrico estiver com a parte
superior da marca molhado este deve ser secado com a ponta de um basto de vidro envolvida
com papel filtro. Faz-se o ajuste final, com o auxlio de uma pipeta de Pasteur ou de um contagotas, lentamente, de tal maneira que o menisco fique tangente ao trao de referncia.
6. Fechar o balo e homogeneizar a soluo invertendo vrias vezes o balo volumtrico.
7. A seguir, transfira a soluo para um frasco apropriado e devidamente etiquetado com o nome do
composto, a concentrao da soluo, identificao de quem preparou a soluo e data.
IMPORTANTE: Toda a soluo cida ou bsica deve ser preparada adicionando-se cido ou
base gua (e nunca o contrrio) para evitar exploso, devido ao alto calor de dissoluo desses
reagentes.
1.21.2 Preparao de soluo padro
Uma soluo denominada PADRO quando sua concentrao exatamente conhecida.
A preparao de uma soluo padro requer, direta ou indiretamente, o uso de um reagente
quimicamente puro e com composio perfeitamente definida. Os reagentes com tais caractersticas
so chamados de PADRES PRIMRIOS. Portanto, se obtm uma soluo padro se esta for
preparada diretamente a partir de um padro primrio, ou se for padronizada ao reagir com um
padro primrio.
Para que uma substncia possa servir como padro primrio, so requeridas certas exigncias:
- Ela deve ser de fcil obteno, purificao, dissecao e conservao;
- As impurezas que por ventura existam no reagente devem ser facilmente identificveis;
- O reagente no deve ser higroscpico ou voltil;
- O reagente deve ser bastante solvel.
Quando em uso numa titulao, uma bureta deve ser manipulada corretamente, para evitar
maiores erros.
Coloca-se em um erlenmeyer a amostra a ser titulada, cuja massa ou volume deve ser
conhecido com exatido. Conforme o caso adiciona-se a seguir as substncias que forem necessrias
(ex.: solvente, indicador).
Separadamente, coloca-se a soluo, que ser usada como titulante, em uma bureta. Acertase o zero. Em seguida, coloca-se o erlenmeyer sob a bureta e deixa-se o titulante escoar, gota a gota.
Controla-se a torneira da bureta com a mo esquerda ou direita.
Uma pessoa destra usar sua mo esquerda na torneira fazendo uma leve presso nesta para a
esquerda, de modo a prevenir vazamentos, e com a mo direita agitar continuamente o erlenmeyer.
Um indivduo canhoto dever proceder de modo inverso. Quando possvel, aconselhvel o uso
de agitador com barra magntica, para uma melhor agitao do meio reagente.
Observa-se atentamente a soluo do erlenmeyer. Cada gota do titulante, caindo na soluo,
provoca uma alterao visual (geralmente mudana de cor) que desaparece com a agitao.
medida que se aproxima o ponto final da titulao, a alterao demora mais tempo para desaparecer.
Diminui-se a velocidade de adio do titulante, de modo que a gota se misture completamente com
a soluo, antes que caia a gota seguinte.
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Alm destes detalhes tcnicos, quando o ponto final de uma titulao est prximo,
frequentemente necessrio adicionar mistura reagente uma frao de gota do titulante. Para
fazer isto, deixa-se formar parcialmente uma gota e toca-se a extremidade da bureta com a parede
interna do erlenmeyer. Lavam-se as paredes do frasco com uma pequena poro de gua de um
frasco lavador e agita-se a mistura.
No se deve arrastar com gua a frao da gota retida na extremidade da bureta.
Quando ocorrer uma alterao permanente na soluo, interrompe-se a adio de titulante e
l-se o volume de lquido na bureta.
Referncias:
CHRISPINO, lvaro. Manual de Qumica Experimental. So Paulo: Editora tica.2 edio, 1994. 230 p.
CIENFUEGOS, Freddy. Segurana no laboratrio. Rio de Janeiro: Intercincia, 2001. 269 p.
LENZI, Ervim et al. Qumica Geral Experimental. Rio de Janeiro: Freitas Bastos, 2009. 390 p.
PAVIA, Donald L et al. Qumica Orgnica experimental: Tcnicas de escala pequena. Porto Alegre: Bookman, 2009.
880 p.
POSTMA, James M.; ROBERTS, Julian L.; HOLLENBERG, Leland. Qumica no Laboratrio. Barueri, SP: Manole, 5
edio, 2009. 546 p.
ROSA, Gilberto; GAUTO, Marcelo; GONALVES, Fbio. Qumica Analtica: Prticas de Laboratrio. Porto Alegre:
Bookman, 2013. 128 p.
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CAPTULO 2
EXTRAO E QUANTIFICAO DE CIDOS
NUCLEICOS E PROTENAS
Adriane Pozzobon, Andressa Dametto, ngela Maria Schorr-Lenz, Camille Eichelberger Granada,
Cludia Stein, Edina Aparecida dos Reis Blasi, Fernanda Oliveira Diefenthaler, Giseli Buffon,
Guilherme Pinto Bertuzzi, Ivan Cunha Bustamante Filho, Jorge Almeida Guimares,
Jlia Pasqualini Genro, Luana Maria Wollinger, Luclia Santi, Marcia Ines Goettert,
Markus Berger Oliveira, Pmela Maria Seibel, Raul Antonio Sperotto, Ronize Zeni da Silva,
Thais Fernanda Dornelles, Vernica Contini, Vinicius de Abreu Waldow,
Walter Orlando Beys da Silva
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Dica: dissolver o pellet o mximo possvel, quando ele j estiver no microtubo. Pode-se
utilizar o vrtex.
9. Adicionar 50 L de SDS 10% e agitar.
Dica: pode-se misturar a suspenso com o auxlio de uma pipeta ou agitar manualmente.
10. Incubar por 10 a 20 minutos, a 55C.
Dica: o objetivo da incubao homogeneizar o material, mas possvel que algumas
amostras no dissolvam totalmente ao fim dos 20 minutos.
11. Adicionar 300 L de NaCl 6 M no tubo e agitar.
12. Centrifugar a 12.000 rpm, durante 5 minutos.
Dica: durante esta centrifugao, pode-se preparar os microtubos contendo 1 mL de etanol
70% gelado Passo 15.
13. Coletar o sobrenadante em um novo tubo de 15 mL, previamente identificado, com o
auxlio de uma micropipeta.
Dica: o DNA est contido no sobrenadante, portanto NO coletar o pellet (composto por
resduos de protenas).
14. Adicionar ao sobrenadante dois volumes de etanol 100% gelado. Inverter o tubo
lentamente para a precipitao do DNA.
Dica: a inverso do tubo deve ser suave, e o DNA aparecer na forma de uma nuvem branca
suspensa no lquido.
15. Com o auxilio de uma micropipeta, ou de uma pipeta de vidro descartvel, coletar o
DNA e transferi-lo para um microtubo de 1,5 mL, contendo 1 mL de etanol 70%.
16. Centrifugar a 12.000 rpm por 5 minutos.
17. Com o auxilio de uma micropipeta, remover o sobrenadante. O DNA compe o pellet no
fundo do tubo.
Dica: o pellet poder ter diferentes tamanhos e colorao esbranquiada ou transparente.
18. Deixar os tubos abertos por cerca de 30 minutos para que evapore o restante do etanol.
19. Adicionar em torno de 350 L de TE, e inverter suavemente. Levar geladeira.
20. Armazenar o DNA em temperatura ambiente, ou em 4 C por um dia e, aps, armazenar
a -20 C.
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Materiais Utilizados:
- Tubos 15 mL. O dobro de tubos da quantidade de amostras.
- Microtubos 2,0 mL. O dobro de microtubos da quantidade de amostras.
- Etanol/lcool 100 % a temperatura ambiente ou gelado.
- Etanol/lcool 70 % gelado.
Reagentes:
Soluo TKM 1 (1000 mL)
- Tris 10 mM = 1,211 g
- KCl 10 mM = 0,745 g
- MgCl2 10 mM = 2,033 g
- EDTA 2 mM = 0,744 g
- Acertar pH em 7,6.
- Armazenar a 4 C.
Soluo TKM 2 (100 mL)
- 100 mL de TKM 1
- NaCl 0,4 mM = 2,337 g
- Armazenar a 4 C.
SDS 10 % (10 mL)
- 1,0 g de SDS
- 10 mL de gua Milli-Q
- Armazenar em temperatura ambiente.
NaCl 6M (100 mL)
- 32,66 g de NaCl
- 100 mL de gua Milli-Q
- Aquecer para dissolver. Armazenar em temperatura ambiente.
Soluo TE (50 mL)
- Tris 10 mM = 0,6 g
- EDTA 1 mM = 0,0186 g
- Acertar pH em 8,0. Armazenar a 4 C.
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0,2 g
1,4 M NaCl
1 % polivinilpirrolidona
0,1 g do produto
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2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
Descartar sobrenadante.
11.
12.
13.
14.
15.
Descartar sobrenadante.
16.
17.
18.
19.
20.
1,0 mL
100 mM
1,0 mL
50 mM
2,5 mL
NaCl 2 M
500 mM
7,2 L
-mercaptoetanol
10 mM
5,5 mL
H2O
q.s.p.
BTE
0,50 mL
50 mM
0,02 mL
1 mM
9,50 mL
H2O
q.s.p.
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Referncias:
DELLAPORTA, S. L.; WOOD, J.; HICKS, J.B. A plant DNA minipreparation: version II. Plant Molecular Biology
Reporter 1: 19-21, 1983.
DOYLE, J.J.; DOYLE, J.L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical
Bulletin 19: 11-15, 1987
DOYLE, J.J.; DOYLE, J.L. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus 12: 13-15, 1990.
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Componentes
Quantidade
Objetivo
TE 1
Tris 1 M (pH 8)
1 mL (CFinal 10 mM)
5 mL (CFinal 25 mM)
Soluo tampo
Inibir a atividade
das nucleases
Componentes
Quantidade
20 mL (CFinal 100mM)
SDS
25 gramas
Tris-HCl 1M pH8
5 mL (CFinal 50mM)
Objetivo
Auxlio na lise da
parede celular
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Componentes
Quantidade
Objetivo
TE 2
Tris 1 M (pH 8)
1 mL (CFinal 10 mM)
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Composio
Quantidade
Objetivo
Crombach
2 mL (CFinal = 1 mM)
Tris-HCl
4g (CFinal = 25 mM)
Estabilizar a
soluo
gua destilada
Composio
Quantidade
Concentrao
final
PEG 6000
250 g (CFinal = 50 %)
50 %
NaCl
29,22 g (CFinal = 1 M)
1M
gua destilada
---
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Composio
Quantidade
Objetivo
TES
Tris 1 M (pH 8)
1 mL (CFinal 10 mM)
Soluo de limpeza
5 mL (CFinal 25 mM)
NaCl 5 M
3 mL (CFinal 150mM)
Armazenamento: geladeira.
4. Descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 500 L de TE1 (a composio da
soluo TE1 est descrita no protocolo de extrao de DNA de bactrias endofticas).
5. Adicionar 25 L de Lisozima (20 mg/mL) e incubar a 37C por 30 minutos.
Dica: o uso de uma Lisozima de boa qualidade de fundamental importncia.
6. Adicionar 108 L de SDS 20 % e 6 L de Proteinase K (20 mg/mL) e incubar a 58 C por 15
minutos. Esfriar a temperatura ambiente.
Soluo
Proteinase K
Composio
Quantidade
Objetivo
Proteinase K
Glicerol
2,5 mL
Degradao
proteica
CaCl2 0,5 M
200 L
Tris 50 mM (pH 8)
1 mL
1,3 mL
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11. Centrifugar por 5 minutos a 5.000 rpm, coletar a fase aquosa (parte superior) e transferi-la
para um novo microtubo.
Dica: se esta soluo no tiver volume de no mnimo 500 L, completar com TE2.
12. Repetir os passos 10 e 11 usando somente clorofrmio.
13. Repetir os passos 10 e 11 usando somente clorofrmio:lcool isoamlico (24:1).
14. Adicionar 8 L de uma soluo de NaCl 5 M e 0,6 volumes de isopropanol gelado.
Misturar com cuidado e manter por 20 minutos no gelo.
Dica: nesta fase a soluo deve ter 500 L. Se no tiver, completar o volume com TE2.
Dica: esta soluo deve ficar no gelo por no mnimo 20 minutos, mas pode ficar por tempo
indeterminado sem prejudicar a amostra.
15. Centrifugar por 20 minutos a 12.000 rpm.
16. Descartar o sobrenadante, lavar o pellet com 500 L de etanol 70 % e centrifugar por 5
minutos a 12.000 rpm.
17. Retirar o etanol 70 % e deixar o pellet secar a 35 C por 1 hora.
18. Ressuspender o pellet em 30 L de TE2 (a composio da soluo TE2 est descrita no
protocolo de extrao de DNA de bactrias endofticas).
19. Checar 2 L da soluo em gel de agarose 0,8 %.
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Referncias:
DE GRACIA, A. S. Deteco de DNA de Brucella abortus em amostras de leite bovino experimentalmente
contaminado atravs da reao em cadeia pela polimerase (PCR). 1997. 37 f. Dissertao (Mestrado em
Epidemiologia Experimental Aplicadaa Zoonoses) Faculdade de Medicina veterinria e zootecnia da Universidade
de So Paulo, So Paulo, 1997.
AGOSTINI, C. KRELING C.S, BUSTAMANTE-FILHO, I.C, SOUZA C.F. V, BIOLCHI, V, POZZOBON A. (2012).
Deteco de Listeria monocytogenes pela tcnica da reao em cadeia da polimerase (PCR) em amostras de leite
bovino in natura. Rev. Inst. Latic. Cndido Tostes, Nov/Dez, n 389, 67: 15-20.
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Componentes
Quantidade
Objetivo
Tris 1 M (pH 8)
2 mL
2 mL
Homogeneizao das
clulas
Glicose 1 M
2,5 mL
Componentes
Quantidade
Objetivo
Soluo II
NaOH 1 M
20 mL
SDS 20%
5 mL
Lise celular e
abertura de poros na
membrana
6. Adicionar 200 L da soluo III, agitar com a mo e centrifugar por 10 minutos a 12.000
Soluo
Componentes
Quantidade
Soluo III
Acetato de Amnio 5 M
(pH 5,2)
60 mL
11,5 mL
Objetivo
Precipitao de
protenas e restos
celulares
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13. Ressuspender o pellet em 50 L de soluo TE2 (a composio da soluo TE2 est descrita
no protocolo de extrao de DNA de bactrias endofticas de raiz).
14. Para verificar a eficincia da extrao, checar 2 L em gel de agarose 0,8 %.
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16. Ressuspender o pellet com gua Milli-Q com DEPC autoclavada conforme o tamanho do
Dica: para pellets menores usar entre 10 e 20 L. Para pellets maiores, entre 30 e 50 L.
17. Incubar em banho-maria por 10 minutos a 60 C
18. Manter 1 minuto no gelo e dar uma breve centrifugada (4.000 rpm).
19. Estocar a -20 ou -80 C ou proceder quantificao.
Referncia:
CHOMCZYNSKI, P; SACCHI, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenolchloroform extraction. Analytical Biochemistry 162(1): 156-9. 1987.
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Ligar a centrfuga a 4 C.
2.
3.
4.
Adicionar 500 L do reagente Concert frio (4C) e agitar bem no vrtex at ressuspender toda a amostra.
5.
Deixar os tubos deitados por 5 minutos a temperatura ambiente. importante deixar os tubos deitados,
pois aumenta a superfcie de contato da amostra com o reagente.
Dica: realizar esse procedimento na capela de exausto.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
Adicionar um volume igual de Isopropanol Absoluto e misturar invertendo o tubo vrias vezes.
13.
14.
15.
16.
Adicionar 1 mL de etanol 75 %.
17.
18.
19.
Centrifugar brevemente e remover o lquido residual com a pipeta sem perturbar o pellet.
20.
21.
Se a soluo estiver turva, centrifugar a 12.000 rpm por 1 minuto e transferir sobrenadante para novo
tubo.
22.
Guardar no Ultra-freezer.
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0,3025 g do produto
150 mM
0,4383 g do produto
1 mM EDTA
0,01861 g do produto
0,1% SDS
0,050 g do produto
1% Triton X-100
500 L do produto
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Albumina 1mg/mL
10 L
20L
30 L
40 L
NaOH 1N
50 L
40 L
30 L
20 L
10 L
Comassie Blue
2,5 mL
2,5 mL
2,5 mL
2,5 mL
2,5 mL
Dica: dependo das necessidades do experimento, mais pontos de curva podem ser
adicionados, ou a curva pode ter maior amplitude. Isto deve ser determinado para cada tipo de
amostra.
4. Pipetar 10 L das amostras em duplicata ou triplicata nos tubos identificados.
5. Nos tubos da curva de albumina, pipetar os volumes indicados de NaOH 1 N na terceira
coluna da tabela 1, e homogeneizar no vrtex.
6. Nos tubos de amostras, pipetar 40 L de NaOH 1 N e homogeneizar no vrtex.
7. Em todos os tubos, adicionar 2,5 mL de soluo de Coomassie Blue, e homogeneizar no
vrtex.
8. Reservar soluo por 5 minutos e, posteriormente, fazer a leitura em 595 nm, zerando com
o Branco e comeando pela Curva.
Clculo
Calcular o FCP (fator de calibrao parcial) de cada ponto da curva:
FCP1 = Q1/A1
Onde: Q = quantidade de protena adicionada e A = absorbncia
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Volume B
0,4 mL = 200 L B1 + 200 L B2
0,6 mL = 300 L B1 + 300 L B2
0,8 mL = 400 L B1 + 400 L B2
1,0 mL = 500 L B1 + 500 L B2
2,0 mL = 1.000 L B1 + 1.000 L B2
Procedimentos
1. Identificar os tubos da curva e das amostras.
2. Descongelar a albumina;
3. Preparar o Reativo C (quantidade necessria de acordo com o nmero de amostras e suas
duplicatas);
4. Pipetar a Curva padro de Albumina.
Tubos
Branco
1, 1
2, 2
3, 3
4, 4
5, 5
6, 6
Padro de
albumina 1mg/
mL
0
10 L
20 L
40 L
60 L
80 L
100 L
gua Milli-Q
Q (Clculo)
100 L
90 L
80 L
60 L
40 L
20 L
0
0,00 mg
0,01 mg
0,02 mg
0,04 mg
0,06 mg
0,08 mg
0,10 mg
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2. Curva padro com albumina bovina (BSA), utilizando a soluo de BSA padro includa
gua (L)
0
125
375
175
325
325
325
400
[BSA] (g/mL)
2000
1500
1000
750
500
250
125
0= branco
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CAPTULO 3
GENOTIPAGEM DE POLIMORFISMOS EM
AMOSTRAS HUMANAS
Camile Wnsch, Guilherme Pinto Bertuzzi, Jlia Pasqualini Genro, Luana Maria Wollinger,
Pricila Girardi, Raquel Piccinini Castoldi, Vernica Contini
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50 mM MgCl2 1,5 nM
Primer mix (10 mM cada)
0,5 M cada
1,0 a 2,5U
Nota: deve-se acrescentar gua Milli-Q, ou de injeo, para completar o volume final da
reao. A concentrao de DNA total acrescentado reao pode variar conforme as especificaes
da PCR.
Cuidados durante a realizao da tcnica:
- Usar os EPIs (Equipamentos de Proteo Individual) necessrios e falar o mnimo durante
a realizao do procedimento.
- Manter todos os reagentes protegidos da luz e no gelo at o momento em que for us-los.
Dica: fazer alquotas dos reagentes para que no haja contaminao desses.
- Identificar os microtubos conforme as amostras a serem amplificadas.
Preparar uma reao geral de PCR (contendo os reagentes bsicos: buffer ou tampo,
dNTPs, MgCl2, primers, Taq polimerase, gua) em um nico microtubo, considerando o nmero
de amostras a serem amplificadas. Em seguida, distribuir nos microtubos individuais, previamente
identificados, e adicionar o DNA de cada amostra. No caso da realizao da reao em uma placa,
recomenda-se montar um esquema/ desenho da placa, com a localizao de cada amostra a ser
genotipada.
Dica: multiplicar a quantidade de cada reagente pelo nmero de amostras a serem
amplificadas + Controle Negativo.
Importante: a presena de um tubo de Controle Negativo, sem adio de DNA, essencial
para garantir a qualidade do procedimento.
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c) Genotipagem de SNP: PCR em Tempo Real (Sistema de discriminao allica TaqMan Applied Biosystems)
A metodologia para a genotipagem de SNPs pelo sistema de discriminao allica TaqMan
segue o princpio geral da PCR convencional. No entanto, a PCR em tempo real permite a
quantificao dos cidos nucleicos durante o processo, por meio da utilizao de compostos
fluorescentes (fluorforos), os quais emitem sinais de fluorescncia na medida em que aumenta a
quantidade de produto da PCR. A PCR em tempo real requer uma plataforma de instrumentao
especfica, com sistemas para a excitao e coleta da fluorescncia e um software acoplado para a
anlise dos dados.
O sistema TaqMan utiliza sondas (fragmentos de DNA marcados com fluorforos) que
hibridizam com regies especficas do genoma, localizadas entre os stios de ligao dos primers.
A sonda marcada com um fluorforo reprter na extremidade 5 e com uma molcula quencher
na extremidade 3- assim, quando a sonda est intacta, a proximidade entre o fluorforo reprter e
o quencher impede a emisso de fluorescncia. Durante a reao da PCR ocorre a hibridizao dos
primers e da sonda e, durante a extenso dos primers pela enzima Taq Polimerase, por sua atividade
5-3 exonuclease, ocorre a clivagem da sonda. Desta forma, a fluorescncia emitida pelo fluorforo
reprter pode ser detectada pelo sistema. Assim, o sistema capaz de produzir, ao fim da PCR,
uma descrio da intensidade de fluorescncia detectada a cada ciclo.
Para a genotipagem de SNPs pelo sistema de discriminao allica TaqMan so necessrias,
portanto, alm dos reagentes de uma PCR convencional, duas sondas (marcadas com fluorforos
distintos), as quais so especficas para cada alelo do polimorfismo a ser genotipado. Diversos
ensaios j padronizados, com conjuntos de primers e sondas especficas, esto disponveis para a
genotipagem de milhares de SNPs em humanos. Os demais reagentes necessrios PCR (enzima
Taq Polimerase, dNTPs, tampo da reao) tambm podem ser adquiridos balanceados, e em
conjunto, em um master mix especfico para o sistema de discriminao allica TaqMan.
Existem diferentes modelos de equipamentos de PCR em tempo real, os quais podem variar
nos sistemas pticos, na capacidade de amostras e nos softwares de anlise dos dados. No entanto,
para a genotipagem de polimorfismos atravs do sistema de discriminao allica TaqMan
algumas condies bsicas podem ser observadas:
- O ensaio padronizado de cada SNP (contendo os primers e as sondas) adquirido,
geralmente, em uma concentrao de 40X.
Dica: para cada ensaio disponibilizado sempre a informao correspondente aos fluorforos
reprteres. De formal geral, os dois alelos possveis do polimorfismo so marcadores com as
fluorescncias VIC e FAM, respectivamente.
- O master mix de genotipagem, geralmente, est em uma concentrao de 2X.
Dica: recomenda-se uma padronizao na concentrao de DNA de todas as amostras a
serem genotipadas.
Dica 1: recomenda-se sempre observar as condies descritas e sugeridas pelo fabricante,
tanto na preparao da reao, quanto no funcionamento do software.
Cuidados durante a realizao da tcnica:
- Usar luvas sem talco (azul) para manusear o equipamento.
- Manter todos os reagentes TaqMan protegidos da luz e no gelo at o momento em que for
us-los. A exposio excessiva luz pode afetar as sondas fluorescentes.
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Dicas: fazer alquotas dos reagentes TaqMan para que no haja contaminao desses;
enrolar os tubos e alquotas dos ensaios em um pedao de papel alumnio para evitar a exposio
excessiva de luz.
- Assim como em uma reao de PCR convencional, recomenda-se preparar uma reao
geral de PCR (contendo o master mix e o ensaio) em um nico microtubo, considerando o nmero
de amostras a serem amplificadas, e distribuir posteriormente. Da mesma forma, indispensvel a
presena de um ou mais controles negativos da reao.
Leitura dos resultados:
A leitura dos resultados da genotipagem de SNPs por PCR em tempo real dita
endpoint, pois avalia a emisso de fluorescncia das sondas no final da termociclagem. Assim,
para um determinado SNP, trs grupos diferentes podem ser observados, de acordo com o tipo
de fluorescncia emitida. Por exemplo, para um SNP com os alelos T (sonda marcada com o
fluorforo VIC) e G (sonda marcada com o fluorforo FAM), so possveis trs gentipos, cada
qual correspondendo a uma leitura de fluorescncia: (i) amostras homozigotas TT exibiro a
fluorescncia VIC; (ii) amostras homozigotas GG emitiro a fluorescncia FAM e (iii) amostras de
heterozigotos exibiro as duas fluorescncias (VIC e FAM).
Embora o funcionamento do software de anlise dos resultados varie conforme o modelo do
equipamento de PCR em tempo real utilizado, basicamente os resultados podem ser visualizados
de duas maneiras:
1. Allelic Discrimination Plot
- Grfico com o resultado final da reao. Exibe a classificao das amostras nos trs gentipos
possveis do SNP analisado.
- Clicando sobre os poos individuais da placa possvel identificar a amostra no grfico e
vice-versa.
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2. Amplification Plot
- Permite a visualizao individual de cada amostra durante o ciclo da PCR.
- O exemplo abaixo corresponde a uma amostra heterozigota (deteco das duas fluorescncias
durante a amplificao).
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CAPTULO 4
ANLISES FISIOLGICAS EM AMOSTRAS
VEGETAIS E ANIMAIS
Adriane Pozzobon, Andressa Dametto, Bruna Caye, Cludia Stein, Dalana Faleiro, Dbora Mara Kich,
dina Aparecida dos Reis Blasi, Eduardo Cremonese Filippi-Chiela, Giseli Buffon,
Isabel Cristina Gouva de Borba, Luciana Knabben Oliveira Becker Delving, Marcia Ines Goettert,
Mardja Manssur Bueno e Silva, Raul Antonio Sperotto, Ronize Zeni da Silva,
Vinicius de Abreu Waldow
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0,5 mL
(50 mM)
EDTA 50 mM
0,4 mL
(2 mM)
PMSF 100 mM
100 L
(1 mM)
Benzamidina 100 mM
100 L
(1 mM)
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Referncia:
LEVINE, R. L; WILLIAMS, J. A.; STADTMAN, E. R.; SHACTER, E. Carbonyl assays for determination of oxidatively
modified proteins. Methods Enzymol, v. 57, p. 233-346, 1994.
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7. No dia seguinte, adicionar o carvo ativado e filtrar imediatamente. Repetir este passo at
que o filtrado torne-se incolor.
Deteco histoqumica da peroxidao lipdica descrita conforme Pompella et al. (1987)
As amostras devem ser coradas com reagente de Schiff durante 60 minutos para detectar
aldedos provenientes da peroxidao lipdica. Depois da reao com o reagente de Schiff, a amostra
deve ser lavada com uma soluo de sulfito (0,5% K2S2O5 em HCl 0,05 M) e mantida nessa soluo
para manter a colorao.
Referncia:
POMPELLA, A.; MAELLARO, E.; CASINI, A. F.; COMPORTI, M. Histochemical detection of lipid peroxidation in the
liver of bromobenzenepoisoned mice. American Journal of Pathology 129: 295-301, 1987.
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7. Visualizar os pontos escuros (azuis) demarcados pelo NBT que mostram a reao com o
Dica: cuidar ao manusear (fotografar na lupa, por exemplo), pois as folhas rasgam com
facilidade e tambm logo enrolam fora do etanol 70%.
Referncia:
SHI, J.; Fu, X.Z.; Peng, T.; Huang, X.S.; Fan, Q.J., Liu, J.H. 2010. Spermine pretreatment confers dehydration tolerance of
citrus in vitro plants via modulation of antioxidative capacity and stomatal response. Tree Physiology 30: 914-922.
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3. Imergir segmentos do tecido (no caso de folhas, em torno de 5 cm) na soluo Tampo +
Dica: podem ser utilizadas placas de petri para a imerso.
4. Manter 8 horas sob iluminao forte e constante;
Dica: pode ser usada a luz de uma capela de exausto, mas importante aproximar ao
mximo as amostras da luz, para que esta seja eficiente.
5. Retirar as folhas da soluo e ferver em etanol absoluto at descolorirem por completo,
ficando esbranquiadas;
Dica: bastante cuidado ao ferver o etanol absoluto. Pode ser utilizada uma chapa com
aquecimento.
6. Retirar as folhas da fervura e conserv-las em etanol 70%.
7. Visualizar os pontos escuros (marrons) demarcados pelo DAB que mostram a reao com
o H2O2 .
Dica: cuidar ao manusear (fotografar na lupa, por exemplo), pois as folhas rasgam com
facilidade e tambm logo enrolam fora do etanol 70%.
Referncia:
SHI, J.; Fu, X.Z.; Peng, T.; Huang, X.S.; Fan, Q.J., Liu, J.H. 2010. Spermine pretreatment confers dehydration tolerance
of citrus in vitro plants via modulation of antioxidative capacity and stomatal response. Tree Physiology 30: 914-922.
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3 Branco: Preparar um branco para o escuro (ser utilizado para zerar o espectrofotmetro e
o tubo deve ser envolto em papel alumnio) e dois brancos para a luz (que devem ser submetidos
luz, e quantificados).
Pipetar 1880 do Mix, 100 L de gua e 10 L de riboflavina.
Observao: a preparao do branco no escuro tem por objetivo subtrair da amostra que ser
iluminada o processo de reduo do NBT. O branco mantido na luz juntamente com as amostras
quantificado com o objetivo de definir uma unidade de SOD relativa quantidade de enzima
necessria para inibir 50% a mxima fotorreduo do NBT.
4 Amostras: Pipetar nos tubos de ensaio 1880 L do MIX (em duplicata por amostra), 100 L
da amostra e 20 L de riboflavina.
Agitar no vrtex e em seguida submeter os tubos iluminao intensa durante 10 minutos
junto com os dois tubos do Branco para luz (no contendo a amostra).
Aps 10 minutos na luz, transferir a soluo para as cubetas uma a uma e realizar a leitura
em espectrofotmetro a 560 nm.
Observao: programe o espectrofotmetro para uma leitura pontual.
Ateno: os tubos do Branco submetidos luz devero apresentar uma cor violeta escuro e
devem ficar mais escuros que as reaes com as amostras. A reao de cor violcea se d pois aps
10 minutos de iluminao ocorre a fotorreduo do NBT pela formazana azul.
2. CATALASE (240 nm /10 em 10 segundos / por 90 segundos) (Havir & Michale, 1987;
Anderson et al., 1995)
1 Colocar no banho-maria a 27C o tampo de incubao (contendo 500 L de tampo fosfato
de potssio 200 mM pH 7.0, 400 L de gua Milli-Q) e deixar em banho-maria durante 10 minutos.
2 Preparar 10 mL de perxido de hidrognio (H2O2), diluindo 260 L de H2O2 em 10 mL de
gua Milli-Q.
3 BRANCO: preparar uma reao para zerar o equipamento, contendo 500 L de fosfato de
potssio + 50 L de H2O2 + 450 L de H2O.
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10. Colocar a grade com lminas na Soluo de Lise Final e deixar na geladeira por, no
mnimo, 24 horas (mximo 48 horas).
CORRIDA (somente depois de 24 horas)
1. Preparar o tampo de eletroforese por, no mnimo, 24 horas antes de iniciar a corrida e
deixar na geladeira, at a temperatura do tampo alcanar 4 C;
2. Quando a temperatura estiver em 4 C, retirar as lminas da soluo de Lise Final com o
auxlio de uma pina;
3. Secar a parte de baixo e a lateral da lmina com papel absorvente;
4. Colocar as lminas na horizontal na cuba de eletroforese, sem espao entre elas e entre as
duas colunas lminas, de maneira que fiquem com as tarjas para a direita (lado positivo);
5. Colocar gelo e gua envolta da cuba, controlando a temperatura que deve ser de 4 C;
6. Colocar o tampo de eletroforese (4 C) at cobrir as lminas e deixar por 25 minutos;
7. Aps os 25 minutos, colocar o eletrodo vermelho no lado da parte fosca da lmina, e o
eletrodo preto no lado oposto;
8. Programar a fonte de eletroforese para 25 V constantes e 300 mA (a corrente controlada
com o volume do tampo);
9. Correr durante 25 minutos;
10. Aps, retirar as lminas com o auxlio de uma pina, secando-as na lateral e na regio
posterior da parte fosca;
11. Colocar as lminas na grade e cobri-las com tampo de neutralizao durante 5 minutos
(repetir 3X).
COLORAO
1. Depois, lavar 2X com gua destilada;
2. Deixar secar por, no mnimo, 2 horas a 37 C na estufa (por mais tempo se for em
temperatura ambiente);
3. Fixar por 10 minutos na soluo fixadora (depois de usar, recolocar no frasco mbar);
4. Lavar 3X com gua destilada;
5. Deixar secar por, pelo menos 5 horas a temperatura ambiente, ou por 1,5 horas a 37 C na
estufa;
6. Reidratar os gis por 5 minutos em gua destilada;
7. Corar as lminas (colocadas na grade de vidro, costa-a-costa) por 30 minutos utilizando a
soluo corante que deve ser preparada na hora, com agitao no escuro;
8. Lavar as lminas 3X com gua destilada;
9. Colocar as lminas na soluo de parada por 5 minutos;
10. Lavar as lminas 3X com gua destilada;
11. Deixar secar em temperatura ambiente.
ANLISE
Em microscpio ptico, analisar 100 ncleos em aumento de 100X. Classific-los de 0 a 4.
Obter escore de 0 a 400 para cada amostra.
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Dica: recomenda-se que o pH fique em torno de 7.25, pois aps a filtrao o pH pode elevar.
Meio de Cultura RPMI 1640 Meio Completo
78% Meio RPMI 1640 Incompleto
20% Soro Bovino Fetal (SFB)
2% Fitohemaglutinina A
a) Em um frasco estril adicionar o meio, soro bovino fetal e fitohemaglutinina A e aps
homogeneizar;
Dica: Preparar o meio completo somente no momento do uso.
PREPARO DAS LMINAS
1. Utilizar sempre lminas novas, de preferncia com tarja fosca;
2. Lavar cada uma com detergente (para retirar a gordura);
3. Estocar em lcool 70% dentro da geladeira at o uso.
* Sempre iniciar o cultivo em segunda-feira ou tera-feira (DIA 0)
PROCESSAMENTO
DIA 0 Cultura das clulas
a) Coletar a amostra de sangue (5 mL) em tubo heparinizado;
b) Retirar da geladeira 20 minutos antes do incio da cultura, o SBF, a Fitohemaglutinina e o
meio RPMI 1640;
c) Limpar a capela de fluxo laminar com lcool 70%;
d) Colocar na capela todos os materiais que sero utilizados na cultura das clulas em
suspenso;
e) Ligar a lmpada UV por 20 minutos;
f) Desligar a UV, e ligar o exaustor e lmpada fria;
g) Colocar na capela, limpando frasco com lcool 70% antes, o SBF, a Fitohemaglutinina, o
meio RPMI 1640 e as amostras de sangue coletado;
h) Adicionar 500 uL de sangue total em frascos ou placas de 12 poos contendo 5 mL de meio
completo;
i) Incubar na estufa a 37C.
DIA 1: 24 horas aps o preparo da amostra
a) Tratamento das amostras (sangue total) com o extrato e com o controle positivo (Etilmetanosulfonato EMS), em concentraes pr-determinadas;
Concentrao do EMS: 200 g/mL
Concentrao dos extratos Soluo estoque: 20.000 g/mL
Concentrao dos extratos: 200, 100, 50, e 25 g/mL
(Usar a seguinte frmula para os clculos das diluies: C1xV1 = C2xV2)
b) Recolocar as amostras na estufa a 37 C.
Obs.: o tratamento com agentes mutagnicos dever ser inserido na cultura de acordo com o
protocolo adotado. Para maiores detalhes, ver protocolo da OECD.
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24 h
44 h
48 h
Incubar a
37C
Homogeneizar
Adicionar CtB
72 h
Coletar ou
prosseguir a
incubao
96 h
Coletar
Obs.: os agentes testes devero ser adicionados na cultura conforme protocolo abaixo.
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ANLISE
Critrios para seleo das clulas
Analisar 1000 clulas binucleadas/lmina em aumento de 1000 vezes com as seguintes
caractersticas: ncleos intactos e tamanhos aproximadamente iguais, ncleos com o mesmo
padro de colorao e dentro do limite citoplasmtico, membrana celular intacta, clula claramente
distinguvel das clulas adjacentes.
Caractersticas do microncleo
Morfologia idntica dos ncleos principais; dimetro entre 1/16 at, no mximo de 1/3 dos
ncleos principais; mesma colorao dos ncleos; no estar ligado ou conectado a um dos ncleos
principais e nem sobreposto.
Parmetros considerados na anlise
- Nmero de clulas binucleadas;
- Distribuio de clulas binucleadas com 0, 1, 2, 3 ou mais MNs em 1000 clulas binucleadas;
- Nmero total de microncleos nas clulas binucleadas;
- Frequncia de MNs/1000 clulas binucleadas;
- Frequncia de clulas binucleadas/500 clulas viveis;
- ndice de Diviso nuclear (IDN)
IDN = [M1+ 2 (M2) + 3 (M3) + 4 (M4)] /N
M1- M4 = n de clulas com 1, 2, 3 e 4 ncleos.
N = n total de clulas viveis.
Teste de Microncleo clulas em adeso:
PRODUTOS UTILIZADOS
- Tripsina-EDTA;
- Soro Bovino Fetal;
- Formalina 1%;
- Citrato de Sdio 1%;
- Fixador Carnoy 3 metanol/1 cido actico;
- Citocalasina B (4 g/mL);
- Soluo de Giemsa (20% em PBS).
PREPARO DAS SOLUES
Meio DMEM + HAM F10: para linhagem CHO-K1
1000 mL gua Mili-Q autoclavada;
8,656 g DMEM + 4,9 g HAM F10
1,2 g NaHCO3 (bicarbonato de sdio)
0,1 g Penicilina
0,06 g Estreptomicina
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Dica: o volume de CMF no qual o pellet dever ser ressuspenso varia de acordo com o tipo
de citmetro a ser utilizado. Em citmetro com leitor de placa de 96 poos deve-se ressuspender em
150 - 200 L, enquanto para leitura em tubo deve-se ressuspender em volume de 200 - 400 L.
Referncias:
KESTON AS, Brandt R. (1965) The fluorometric analysis of ultramicro quantities of hydrogen peroxide. Anal.
Biochem. 11: 1-5.
MYHRE O, Andersen J, Aarnes H, Fonnum F (2003) Evaluation of the probes 2,7-dichlorofluorescin diacetate,
luminol, and lucigenin as indicators of reactive species formation. Biochem. Pharmacol. 65: 1575-1582.
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2. Retirar o meio de cultura para um ependorfe de 2 mL e lavar as clulas com 600 mL de PBS
Dica: PBS 10x - Nacl 80 g; KCl 2 g; NaHPO4 14,4 g; KH2PO4 2,4 g; H20 destilada autoclavada 1000 mL q.s.p. Ajustar o pH para 7,4 e autoclavar. Diluir antes do uso.
3. Remover gentilmente o PBS para dentro do mesmo eppendorf de 2 mL onde o meio de
cultura foi acondicionado e adicionar 250 L de tripsina aos poos, colocando a placa na estufa a 37
C por 2-5 minutos.
Dica: o tempo de tripsinizao varia de acordo com o tipo celular; clulas muito aderentes
requerem tempo maior de incubao (5 minutos). No aconselhvel exceder 5 minutos de
tripsinizao, sob pena de reduo de viabilidade celular.
4. Neutralizar a tripsina com 500 L de meio de cultura contendo Soro Fetal Bovino
e homogeneizar (up and down) aproximadamente 10 vezes, e passar o volume para o mesmo
ependorfe de 2 mL onde o meio de cultura e o PBS foram guardados.
Dica: Up and down fundamental para uma dissociao eficiente das clulas; citmetros
de fluxo que utilizam capilar como clula de leitura sofrem entupimento quando h a presena de
agregados celulares.
5. Centrifugar 5 minutos 1.500 rpm, seguido da remoo do sobrenadante.
Dica: pode-se descartar o sobrenadante tanto por meio do uso de pipeta quanto vertendo
diretamente o lquido, sem agitao.
6. Ressuspender o pellet celular com 1 mL de PBS 1x e centrifugar a 1.500 rpm por 5 minutos
7. Centrifugar 5 minutos a 1.500 rpm.
8. Fixar as clulas com 1 mL de etanol 70% (em PBS 1x) gelado, gotejando-o enquanto as
clulas so agitadas no vrtex.
Dica: deve-se deixar fixando por pelo menos 30 minutos a 4 C (ideal: aproximadamente
2 horas); pode-se parar aqui e guardar as clulas por at 3 meses a -20 C at que o ensaio seja
realizado.
9. Centrifugar por 6 minutos a 1.500 rpm.
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Referncias:
ZHANG G, Gurtu V, Kain SR, and Yan G (1997) Early detection of apoptosis using a fluorescent conjugate of Annexin
V. BioTechniques 23: 525-531.
VAN ENGELAND M, Nieland L, Ramaekers F, Schutte B, Reutelingsperger C (1998) Annexin V-affinity assay: a
review on an apoptosis detection system based on phosphatidylserine exposure. Cytometry 31: 1-9.
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Referncias:
TRAGANOS F,DARZYNKIEWICZ Z (1994) Lysosomal proton pump activity: supravital cell staining with acridine
orange differentiates leukocyte subpopulations. Meth. Cell Biol.41: 185-194.
STANKIEWICZ M,Jonas W,Hadas E,Cabaj W,Douch PG (1996) Supravital staining of eosinophils. Int. J.
Parasitol.26: 445-446.
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1 mL
50 L
500 L
300 L
4 L
100 L
50 L
2 mL
100 L
1 mL
600 L
8 L
200 L
100 L
3 mL
150 L
1,5 mL
900 L
12 L
300 L
150 L
4 mL
200 L
2 mL
1,2 mL
16 L
400 L
200 L
5 mL
250 L
2,5 mL
1,5 mL
20 L
500 L
250 L
6 mL
300 L
3 mL
1,8 mL
24 L
600 L
300 L
12 mL
600 L
6 mL
3,6 mL
48 L
1,2 mL
600 L
Dica 2: o tempo de incubao com o substrato bastante varivel dependendo do tipo celular.
Deve-se padronizar esse perodo em experimento piloto com diferentes tempos de marcao, a fim
de evitar marcao falso-positiva ou falso-negativa.
6. Retirar a soluo de marcao e contracorar os ncleos celulares, por meio da incubao
com 300 L de PBS 1x + 300 nM de DAPI por 30 minutos no escuro.
Dica: DAPI um corante fluorescente que se liga ao DNA.
Dica 1: esta marcao nuclear tem como objetivo dirigir a contagem posterior do nmero de
clulas positivamente marcadas para X-gal.
7. Retirar a soluo de marcao contendo DAPI e adicionar 500 L de PBS 1x / poo.
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12. Centrifugar a 1.500 rpm por 6 minutos; ressuspender o pellet celular em 1 mL de PBS 1x e
centrifugar novamente a 1.500 rpm por 6 minutos.
13. Ressuspender o pellet celular em 380 L de PBS-T e adicionar 20 L de anticorpo antiBrdU conjugado a FITC por 1 hora no escuro sob agitao.
Dica: PBS-T = preparar 50 mL (50 mL PBS 1x + 500 L BSA 1 mg/mL + 250 L Tween 20).
14. Centrifugar a 1.500 rpm por 6 minutos e, aps, adicionar 1 mL de PBS 1x ao pellet celular,
seguido de centrifugao a 1.500 rpm por 6 minutos
15. Ressuspender o pellet celular em 200 L de PSSI incubar, no mnimo, 15 minutos a 37 C
ou 30 minutos a temperatura ambiente
Dica 1: PSSI - 1,4 L de Triton X-100 1%; 20 L de RNAse (20 mg); 60 L de Iodeto de Propdeo
2 mg/mL; 10 mL q.s.p. de PBS 1x.
16. Proceder a leitura em citmetro de fluxo.
Referncia:
DOLBEARE F, Gratznert H, Pallavicini M, Gray JW (1983) Flow cytometric measurement of total DNA content and
incorporated bromodeoxyuridine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 5573-5577.
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4. Quando todos os ncleos a serem considerados estiverem marcados, selecionar: Count >
Measure Objects > Measure > Select measures > Aspect, Area/Box, Radius Ratio e Roundness.
5. Na sequncia, selecionar Edit > Convert AOI(s) to Objects e, finalmente, File > Data to
Clipboard.
6. Colar os dados diretamente no Excel.
ETAPA 3: Anlise dos dados no Excel
1. Abrir a planilha do Excel para o NMA (http://www.ufrgs.br/labsinal/NMA).
2. Selecionar ncleos regulares / normais e copiar os dados destes ncleos. Colar na tabela
Normal Nuclei and Settings (tabela laranja esquerda) para fazer a setagem dos ncleos.
Dica: a anlise de NMA semelhante citometria de fluxo - inicialmente feita uma setagem
(aba Normal Nuclei and Settings) para, na sequncia, ser feita a anlise das diferentes.
3. Ajustar o tamanho da elipse normal para que fique representativa da populao controle
/ normal.
Dica: exemplos de elipses normais corretas ou incorretas podem ser encontradas na referncia
abaixo.
4. Copiar e colar TODOS os dados obtidos na rea Treated Nuclei da aba Normal Nuclei and
Settings (tabela laranja direita).
5. Ajustar os limiares que dividem as populaes, alterando o nmero de desvios padro nas
clulas S4, S6, S8 e S10.
6. Para a anlise propriamente dita, duplicar a planilha Condition 1 at o nmero necessrio
correspondente ao nmero de tratamentos de interesse.
7. Colar os dados das variveis obtidas no IPP dos ncleos de cada tratamento no espao
amarelo de cada planilha referente aos tratamentos.
8. Apagar os X da coluna I onde no houver dados.
Dica: diferentes experimentos devem ser colocados na ordem indicada na coluna A.
9. A porcentagem de clulas em cada condio dada na coluna AH. Os grficos representam
rea nuclear versus ndice de Irregularidade Nuclear (NII), esquerda, e a porcentagem de cada
mecanismo celular ( direita).
Referncia:
FILIPPI-CHIELA EC, Oliveira MM, Jurkovski B, Callegari-Jacques SM, da Silva VD,LenzG (2012)
Nuclearmorphometricanalysis(NMA): screening of senescence, apoptosis andnuclear irregularities. PLoS One 7:
e42522.
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CAPTULO 5
ANLISE DE EXPRESSO GNICA EM
NVEL DE RNA
Adriane Pozzobon, Andressa Dametto, dina Aparecida dos Reis Blasi, Giseli Buffon,
Raul Antonio Sperotto, Ronize Zeni da Silva, Vinicius de Abreu Waldow
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2.
3.
4.
5.
DNAse Turbo
1.
2.
3.
4.
5.
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H2O Milli-Q
10x DNAse Reaction Buffer
DNAse Turbo
1 g de RNA Total
TOTAL
No termociclador, manter a 37 C por 30 minutos.
Pipetar em cada tubo 1 L de EDTA 25 mM.
Manter a 75 C por 10 minutos.
Guardar no ultrafreezer.
q.s.p
1 L
1 L
10 L
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2.
3.
4.
1 L
1 L
q.s.p.
13 L
4 L
2 L
5.
6.
7.
8.
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1L de M-MLV (200 U/ l)
Manter a 37 C por 50 minutos.
Manter a 70 C por 15 minutos para inativao da enzima.
Guardar na geladeira.
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mg/L de RNA
p/ 1g de RNA/l
cada reao
2 L
4 L
2 L
1 L
Dica: sempre centrifugar brevemente (spin) os reagentes antes de usar. Descongelar e manter
todos os reagentes (e principalmente o RNA) no gelo.
3. Pipetar o volume respectivo de H2O com DEPC (do Kit) em cada tubo;
4. Pipetar o volume correspondente de RNA e manter a amostra sempre no gelo.
5. Adicionar 1 L de dNTP mix em cada tubo.
6. Adicionar 1 L de primer OligodT (10 mM) a cada tubo.
7. Incubar 65oC por 5 minutos.
8. Adicionar 9 L da Mix a cada tubo.
9. Incubar 42 oC por 2 minutos.
10. Adicionar 1 L da enzima transcriptase reversa, Superscript II (Invitrogen) por tubo.
Dica: tirar a enzima do freezer somente na hora de pipetar e misturar com a ponteira aps
adicionar no tubo.
11. Incubar 42oC por 50 minutos.
12. Terminar a reao 70oC por 15 minutos.
13. Colocar no gelo.
14. Coletar a reao por breve centrifugao.
15. Adicionar 1 L de RNAse H em cada tubo.
Dica: retirar a enzima do freezer somente na hora de pipetar.
16. Incubar por 20 minutos 37oC antes de proceder a amplificao por PCR.
Referncia:
WANG, T. and M. J. Brown (1999). mRNA quantification by real time TaqMan polymerase chain reaction: validation
and comparison with RNase protection Anal Biochem 269(1): 198-201.
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SUMRIO
153
Ps Hot-Start
gua DEPC
32,8 x 15 = 492 L
6,4 x 15 = 103,5 L
4,0 x 15 = 60 L
1,0 x 15 = 15 L
MgCl2 50 mM
1,2 x 15 = 18 L
0,3 x 15 = 4,5 L
DNTP Mix 10 mM
1,0 x 15 = 15 L
Primer Sense
0,5 x 15 = 4,5 L
Primer Antisense
0,5 x 15 = 4,5 L
cDNA 2,0
Taq DNA Polimerase
0,3 x 15 = 3,0 L
TOTAL 40 L 10 L
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SUMRIO
154
80 mL TBE 1X
1,2 g Agarose
1L Brometo de Etdeo
1. Pesar agarose de acordo com o volume de TBE 1X a ser utilizado.
2. Mistur-la ao TBE 1X em um becker.
3. Fazer uma marca no menisco da soluo para completar o volume aps a fervura.
4. Tapar o recipiente com plstico-filme de polietileno.
Dica: fazer alguns pequenos furos com a ponta da tesoura.
5. Preparar o suporte do gel e acoplar o pente.
6. Ferver a mistura em micro-ondas at dissolver completamente a agarose.
7. Completar o volume evaporado com o TBE 1X.
8. Aguardar o resfriamento parcial e acrescentar o Brometo de Etdeo.
Dica: toda a manipulao com o Brometo de Etdeo deve ser feita com luvas apropriadas.
9. Homogeneizar e verter a mistura no suporte com cuidado para no formar bolhas.
Dica: agitar delicadamente o erlenmeyer para misturar bem o brometo de etdeo e evitar a
formao de bolhas. Se formar bolhas prximas ao pente, estas podem ser removidas com o auxlio
de uma ponteira.
10. Aguardar a polimerizao (em torno de 30 minutos) para desenformar o gel.
11. Posteriormente ao preparo do gel, proceder a pipetagem das amostras no gel.
12. Cortar um pedao de parafilm e pipetar 5 L de tampo de corrida conforme o nmero
de amostras.
13. Pipetar 7 L de amostra em cada bolinha de tampo de corrida.
14. Aspirar a mistura e pipetar a amostra no poo do gel.
Dica: sempre reservar o primeiro poo para o marcador de peso molecular. Pipetar entre
1 e 2 L. Pipetar lentamente, cuidando para no furar o gel e verificando se o tampo da cuba de
eletroforese cobre todo o gel, principalmente os poos.
15. Fechar a cuba, conectar os eletrodos e ligar a fonte a 100 mV, 300 mA por aproximadamente
1 hora (o tempo depende do fragmento a ser analisado e da concentrao do gel de agarose).
16. Visualizar a amplificao no transluminador (luz UV).
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SUMRIO
155
Observaes:
Preparo do tampo TBE 10X
Para 1 litro:
Pesar: 55 g de cido brico, 108 g de TRIS e 9,25 g de EDTA. Dissolver os sais em parte da
gua Milli-Q (aproximadamente 600 mL). Aps dissolver, acrescentar o restante da gua (400 mL).
Verificar o pH (deve estar entre 8 e 9). Distribuir em duas garrafas de meio litro e autoclavar.
Dica: se o pH no estiver entre 8 e 9, desprezar o tampo e refazer, pois o pH no deve ser
ajustado.
Para preparar a soluo TBE 1X, diluir 100 mL de TBE 10X em 900 mL de gua Milli-Q
autoclavada.
Preparo do tampo de corrida: Tampo Type III
Para 5 mL: Pesar 0,0125 g de xylene cyanol e 0,0125 g de azul de bromofenol. Misturar em
um becker 1,5 mL de glicerol, 3,5 mL de gua Milli-Q e os corantes. Agitar at dissolver. Distribuir
em cinco tubos eppendorfs e armazenar na geladeira.
Referncia
WATSON, James D. et al.2006. Biologia Molecular do Gene. 5 ed. Porto Alegre: Artmed.
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156
15,9 L
2,7 L
5,3 L
5,3 L
26,5 L
0,7 L
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SUMRIO
157
15. Com o auxlio da pipeta multicanal, transferir 10 L do mix do gene 4 em cada pocinho
da coluna 5, 6, 7 e 8 das linhas D, E e F.
16. Adicionar 10 L de cDNA (diludo 100X) em cada pocinho correspondente a cada amostra.
17. Os pocinhos C4, C8, F4 e F8 sero os controles negativos dos respectivos genes 1, 2, 3 e 4.
Nestes poos adicionar 10 L de H2O, ao invs do cDNA.
Dica: Caso se formem algumas bolhas na parede dos pocinhos, as mesmas devero ser
empurradas para baixo com o auxlio de uma ponteira, ou com uma centrfuga de placas. Cuidar
para no contaminar os poos vizinhos.
18. Colocar o adesivo na placa.
Dica: O adesivo deve estar bem fixado para evitar a evaporao dos reagentes.
19. Colocar a placa dentro do equipamento de RT-qPCR para anlise da expresso gnica.
20. Criar ou editar um template e salv-lo com um nome apropriado.
21. Iniciar a reao.
22. Salvar o arquivo e calcular os valores de expresso.
Protocolo para anlise de expresso gnica de 2 genes (1 gene teste + 1 gene controle):
1. Identificar 2 eppendorfs de 1,5 mL com os nomes dos respectivos genes.
2. Pipetar os seguintes itens em cada eppendorf identificado (mix para meia placa - 24 poos):
H2O 99,4 L
Tampo 10X 53 L
MgCl2 (50 mM)
31,8 L
5,3 L
10,6 L
10,6 L
53 L
1,4 L
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SUMRIO
158
Dica: Caso se formem algumas bolhas na parede dos pocinhos, as mesmas devero ser
empurradas para baixo com o auxlio de uma ponteira, ou com uma centrfuga de placas. Cuidar
para no contaminar os poos vizinhos.
12. Colocar o adesivo na placa.
Dica: O adesivo deve estar bem fixado para evitar a evaporao dos reagentes.
13. Colocar a placa dentro do equipamento de RT-qPCR para anlise da expresso gnica.
14. Criar ou editar um template e salv-lo com um nome apropriado.
15. Iniciar a reao.
16. Salvar o arquivo e calcular os valores de expresso.
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SUMRIO
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60 C por 1 minuto
Dica: na curva de dissociao ocorre um aumento gradual da temperatura (de 0,3 em 0,3 C
por segundo) at chegar aos 95 C. Quando atinge esta temperatura, permanece por 15 min. Aps
permanece 1 min a 60 C.
3. Clicar na janela Setup, aps Plate Setup e, por ltimo, Define Targets and Samples.
Definir os nomes dos genes e das amostras a serem avaliados nos respectivos campos.
4. Clicar na janela Assign Targets and Samples e organizar o layout da placa (distribuio dos
genes e amostras de cada poo, lembrando-se de identificar os controles negativos).
5. Colocar a placa preparada no aparelho.
6. Clicar em Start Run para iniciar o procedimento.
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160
CAPTULO 6
ANLISE DE EXPRESSO GNICA EM NVEL DE
PROTENA
ngela Maria Schorr-Lenz, Ivan Cunha Bustamante Filho, Jorge Almeida Guimares, Luclia Santi,
Markus Berger Oliveira, Pmela Maria Seibel, Walter Orlando Beys da Silva
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SUMRIO
161
144 g do produto
SDS 10 g do produto
Tris 30,3 g do produto
Dica: dissolver em 1 L de gua destilada. gua ultrapura pode ser utilizada para evitar o
crescimento de fungos na soluo estoque. No ajustar o pH com cidos ou bases, pois altera as
caractersticas inicas do tampo. Armazenar a 4C. Se ocorrer precipitao, aquea a temperatura
ambiente antes do uso.
2. Tampo de corrida 1X (Running Buffer) Soluo de uso:
Diluir o Running Buffer 10X 1:10 em gua destilada. Por exemplo, 50 mL de soluo
concentrada em 450 mL de gua destilada. Guardar na geladeira e utilizar gelado.
Dica: pode ser utilizado pelo menos 3 x.
3. Soluo de Acrilamida 40% (39:1):
100 ml
Acrilamida (39%)
39 g do produto
Bisacrilamida (1%)
1 g do produto
80 mL
Ajustar o pH a 8,8 com HCl 6N. Adicionar gua ultrapura para obter o volume final de 150
mL. Armazenar a 4C.
5. Tampo Tris 0,5 M pH 6,8:
100 ml
Tris 6 g do produto
gua ultrapura
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60 mL
SUMRIO
162
Ajustar o pH a 6,8 com HCl 6N. Adicionar gua ultrapura para obter o volume final de 100
mL. Armazenar a 4C.
6. Soluo de SDS 1%:
Para 100 mL, pesar 1 g de SDS. Homogeneizar gentilmente em 90 mL de gua ultrapura com
barra magntica para evitar bolhas em excesso. Ajustar para 100 mL e armazenar a temperatura
ambiente.
7. Soluo de Persulfato de Amnio (APS) 10%:
Para 100 mL de soluo, pesar 10 mg de APS. Em um bquer, dissolver o APS em 80 mL de
gua ultrapura. Aps completa dissoluo, ajustar em balo volumtrico para 100 mL. Aliquotar
em microtubos de 0,5 a 1 mL e armazenar a -20C.
Dica: o reagente APS higroscpico. Mant-lo em um frasco fechado com slica para evitar a
degradao do mesmo.
SDS-PAGE preparo do gel de poliacrilamida:
1. Preparar os suportes e placas de vidro para polimerizar o gel;
Dica: os suportes que prendem as placas de vidro devem ser montados primeiro e aps,
fixados no suporte maior. Encaixar e nivelar as placas de vidro em superfcie plana, para evitar o
vazamento do gel.
2. Preparar o gel de separao de poliacrilamida em um bquer;
Para cada gel de 0,75 mm, preparar as solues abaixo:
Soluo de gel de separao (Resolving gel) 10%
Acrilamida (40%)
1270 L do produto
Tris 1,5 M
850 L do produto
SDS 1%
350 L do produto
Glicerol
280 L do produto
gua ultrapura
2190 L do produto
Dica: colocar as solues na ordem descrita e homogeneizar aps cada uma. Para acrescentar
o Glicerol, deve-se cortar a ponteira, para facilitar a pipetagem.
3. Acrescentar 35 L de Persulfato de Amnio 10% e 3 L de Temed no bquer e homogeneizar;
4. Transferir imediatamente a soluo do gel de separao de poliacrilamida entre as duas
placas de vidro, at quase 1,5 cm do final da placa menor, aguardar para ver se no h vazamentos
e pipetar lcool etlico absoluto at o topo da placa;
Dica: marcar a placa de vidro com uma caneta at o ponto onde a soluo do gel de acrilamida
foi pipetada. O lcool etlico isola o gel de separao do ar, permitindo uma borda de gel lisa. SDS
0,1% tambm pode ser usado.
5. Aguardar a polimerizao 30 minutos;
Dica: nos minutos finais, prepara-se a soluo do gel de entrada de poliacrilamida (prximo
passo).
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SUMRIO
163
300 L do produto
Tris 0,5 M
690 L do produto
SDS 1%
270 L do produto
gua ultrapura
1400 L do produto
7. Descartar, por inverso e com o auxlio de um papel absorvente, o lcool etlico das placas
contendo o gel de separao polimerizado;
Dica: no desmontar os suportes, apenas descartar o lcool por inverso dos mesmos. Retirar
o excesso com papel filtro.
8. Acrescentar 2,5 L de Persulfato de Amnia 10% e 27 L de Temed no bquer;
9. Transferir a soluo do gel de entrada de poliacrilamida em cima do gel de separao
polimerizado, at o final da placa;
10. Inserir o pente de plstico, que dar o formato dos poos do gel de entrada;
Dica: proteja seus olhos durante esse procedimento, pois h possibilidade de respingos no
momento da insero do pente.
11. Aguardar a polimerizao 30 minutos;
12. Retirar o pente de plstico e utilizar o gel;
Dica: caso no utilize o gel imediatamente, guarde o mesmo na geladeira, envolto por papel
umedecido com gua destilada e plstico filme, dentro de um recipiente com tampa. O gel pode ser
utilizado em at trs dias.
SDS-PAGE preparo das amostras:
1. Descongelar e manter as amostras no gelo;
2. Para cada amostra a ser pipeta no gel, preparar um microtubo e identific-lo com o nome
ou nmero da amostra;
3. Preparar o Tampo de amostra (Stock Sample Buffer) conforme abaixo:
Tris 0,5 M (pH 6,8)
1,25 mL do produto
2 mL do produto
Glicerol
2,5 mL do produto
gua ultrapura
3,55 mL do produto
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Comassie Blue #2
2g
100 mL
475 mL
425 mL
Soluo descorante #1
100 mL
450 mL
450 mL
cido actico
Metanol
H2O destilada
Soluo descorante #2
80 mL
210 mL
510 mL
cido actico
Etanol
H2O destilada
2. Comassie coloidal
2.1 mais sensvel que o Comassie Blue.
2.2 Da mesma forma que o anterior, aps a eletroforese, remover cuidadosamente o gel das
placas e acondicionar em um recipiente especfico.
2.3 Adicionar o corante Comassie Blue at cobrir inteiramente o gel.
leve.
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SUMRIO
166
Comassie coloidal
0,05%
10%
20%
2%
Comassie Blue G*
Sulfato de amnio
Metanol
cido fosfrico
*deve ser adicionado por ltimo e no ser agitado pode-se mexer levemente com um basto de vidro. Manter protegido da luz a
temperatura ambiente.
Nitrato de prata
Formaldedo 37%
H2O destilada
Soluo de revelao
3g
25 L
1 mL
49 mL
Carbonato de sdio
Formaldedo 37%
Tiossulfato de sdio 0,02%
H2O destilada
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3,0285 g do produto
Glicina 0,192 M
14,4134 g do produto
20% de Metanol
200 mL do produto
14,4 g do produto
KH2PO4
2,4 g do produto
gua ultrapura
800 mL do produto
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168
Western Blotting:
1. Preparar um recipiente e adicionar o Towbin a uma quantidade suficiente para cobrir toda
a membrana.
Dica: o recipiente deve ter tampa e dimenses ideais para abrigar a membrana.
2. Apos o trmino da eletroforese SDS-PAGE, retirar o gel reserva-lo no recipiente com
Towbin por 10 minutos.
Dica: o gel pode ser cortado na regio de interesse, isto resulta em menos rea de membrana a
ser utilizada e, consequentemente, economia de membrana e anticorpos. O gel deve ser cortado em
cima da placa de vidro que o abriga, e observando-se a marcao do marcador de peso molecular.
O enxgue pode durar at dez minutos, tempo suficiente para preparar o cassete do equipamento
de Western Blotting.
3. Colocar o papel filtro no cassete do equipamento de Western Blotting, e umedecer
generosamente com Towbin;
4. Cortar a membrana de nitrocelulose no tamanho exato do gel e coloc-la no centro do
cassete, com o lado mais brilhante para cima;
5. Colocar o gel exatamente em cima da membrana de nitrocelulose;
Dica: cuidar para no ficar nenhuma bolha entre a membrana de nitrocelulose e o gel, pois
pode atrapalhar na transferncia das protenas.
6. Colocar gentilmente outro papel filtro umedecido generosamente com Towbin por cima do
gel no cassete do equipamento.
7. Remover o excesso de bolhas passando o rolo plstico por cima do papel filtro;
8. Fechar o cassete e encaix-lo no equipamento TransBlot Turbo;
9. Iniciar a transferncia de protenas, selecionando a amperagem/voltagem e o tempo.
O equipamento possui diversos programas que podem ser padronizados para cada tipo de
amostra ou massa molecular da protena de interesse. Para o protocolo padro de um minigel no
cassete A, acesse os seguintes comandos:
List > Bio-Rad > 1 mini gel > StandardSD > Run > A:Run
10. Encerrada a transferncia, retirar o cassete do equipamento e abri-lo com cuidado.
Descartar tudo, menos a membrana de nitrocelulose;
Dica: use marcador pr-corado para confirmar se a transferncia ocorreu corretamente.
Alternativamente, pode-se corar a membrana de nitrocelulose com uma soluo de Ponceau S 0,1%.
100 mL de Ponceau 0,1%
Ponceau S
0,1 g do produto
cido Actico
5 mL do produto
Na2HPO4
14,4 g do produto
KH2PO4
2,4 g do produto
gua ultrapura
80 mL do produto
Ajustar para 100 mL com gua ultrapura. Armazenar 4C, no congelar. A soluo pode ser
reutilizada para corar membranas at 10 vezes.
11. Proceder com o bloqueio da membrana: colocar a membrana de nitrocelulose em um
recipiente com MTPBS, tendo o cuidado de cobrir ela totalmente. Incubar em agitador orbital por
1h a 4C.
Dica: cortar um das pontas da membrana para identificar a posio do marcador e o sentido
da pipetagem.
Biotecnologia
SUMRIO
169
15. Cobrir a membrana com TPBS. Agitar por 5 minutos e descartar. Repetir essa lavagem 5
16. Descartar o TPBS da ltima lavagem e incubar a membrana com o anticorpo secundrio.
Agitar sob refrigerao por 2 horas;
17. Ao final da incubao, retirar o anticorpo secundrio e guard-lo no respectivo tubo e
congel-lo. Anotar o nmero de utilizaes.
18. Cobrir a membrana com TPBS. Homogeneizar por 5 minutos e descartar. Repetir essa
lavagem 5 vezes;
19. Preparar o e-cran, colocando a membrana entre o plstico dobrado;
Dica: fazer uma marcao no plstico das dimenses da membrana para facilitar a visualizao
na sala de escura. Esta marcao importante tambm para a identificao dos marcadores de
massa molecular.
20. Preparar o reativo ECL: para uma membrana inteira, recomenda-se o uso de 200 uL de
reagente ECL. Para prepar-lo, homogeneizar em vortex propores iguais dos dois reagentes em
um microtubo, ou seja, 100 uL de cada.
Dica: a preparao do reativo deve ser feita ao abrigo de luz e o mesmo deve ser pipetado
imediatamente sobre a membrana. Este procedimento est adaptado para o Western Lightnin PlusECL da PerkinElmer. Caso outros reagentes forem utilizados, o protocolo deve ser adaptado de
acordo com as recomendaes do fabricante.
21. Pipetar o reativo ECL em cima da membrana de nitrocelulose, distribuindo uniformemente;
22. Fechar o e-cran, aguardar 5 minutos e iniciar a revelao na sala escura;
23. Cortar um pedao do filme radiogrfico e posicion-lo em cima da membrana. Fechar o
e-cran e aguardar alguns minutos.
Dica: o tempo de exposio da revelao depender da intensidade da luminosidade
produzida na membrana. Deve ser padronizado para cada filme.
24. Retirar o pedao de filme e mergulhar na soluo de revelao, at aparecerem as bandas.
Aps, mergulhar na soluo de cido actico 10% e, por fim, na soluo fixadora.
Dica: os tempos de exposio do filme membrana e de imerso na soluo reveladora
devem ser ajustados conforme o resultado das primeiras revelaes.
25. Aps imerso na soluo fixadora por, no mnimo, 3 minutos, lavar com gua corrente e
aguardar a secagem;
26. Finalizada a exposio, os filmes so escaneados a 300 pdi em formato TIFF para
quantificao das bandas;
Referncias:
AUSUBEL FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K (eds.) Current Protocols in
Molecular Biology. John Wiley & Sons, 2003.
BIO-RAD. Trans-Blot Turbo Blotting System Instruction manual. Bio-Rad Laboratories, 2010.
Biotecnologia
SUMRIO
170
CAPTULO 7
PRODUO E ANLISE DE BIOPRODUTOS
ngela Gerhardt, Anglica Vincenzi, Brbara Parraga da Silva, Claucia Fernanda Volken de Souza,
Christina Venzke Simes de Lima, Eduardo Miranda Ethur, Greici Raquel Wildner, Luclia Hoehne,
Mariano Rodrigues, Mnica Jachetti Maciel
Biotecnologia
SUMRIO
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Biotecnologia
SUMRIO
172
Biotecnologia
SUMRIO
173
f = fator de correo da soluo de hidrxido de sdio 0,1 N (normalidade real dividida por
0,9 = fator de converso do cido ltico;
m = massa da amostra na alquota, em gramas ou em mL.
Clculo para manteiga:
Soluo alcalina normal (SAN) % = V x f x 100 / m
Onde:
V = volume da soluo de hidrxido de sdio 0,1 N gasto na titulao, em mL;
f = fator de correo da soluo de hidrxido de sdio 0,1 N;
m = massa da gordura, em gramas.
Dica: algumas das amostras no apresentam colorao rsea ntida no fim da titulao,
devido as suas caractersticas prprias de cor opaca ou escura, por isso aconselhvel trabalhar
em ambiente claro e colocar um papel branco embaixo da bureta durante a titulao, dessa forma
facilitando a visualizao da viragem.
Referncias:
BRASIL. Ministrio da Agricultura. Secretaria Nacional de Defesa Agropecuria. Laboratrio Nacional de Referncia
Animal. Mtodos analticos oficiais para controle de produtos de origem animal e seus ingredientes: mtodos
fsicos e qumicos. Braslia, DF, 1981. v. II, cap. 18, p. 2. cap.15, p. 4-5. cap. 21, p., p. 4-5. cap. 17, p. 5.
MERCK. Reactivos, diagnstica, productos qumicos 1992/93. Darmstadt, 1993. 1584 p.
RICHARDSON,G.H. Dairy products. In: HELRICH, K. (Ed.) Official methods of analysis of the Association of
Official Analytical Chemists: food composition: additives: natural contaminants. 15th ed. Arlington: Association of
Official Analytical Chemists, 1990. v. 2, cap. 33, p. 805.
WOOLLEN, H.(Ed). Food Industries Manual, 20 th ed.New Iork1: Chemical Publishing, 1970.
Biotecnologia
SUMRIO
174
7.5 DETERMINAO DO pH
Esse mtodo empregado na determinao do pH de amostras de alimentos obtidos por
meio de processos de cultivo de microrganismos, ou seja, de alimentos fermentados. Fundamentase na medida da concentrao de ons hidrognio na amostra.
Mtodo de BRASIL (1981):
1. Preparao conforme tipo de amostra:
1.1. Produtos lquidos: medir o pH colocando cerca de 50 mL de amostra em um bquer;
1.2. Queijos: adicionar cerca de 20 mL de gua em um bquer de 50 mL. Acrescentar
quantidade suficiente de amostra previamente preparada, misturando com basto de vidro de
modo a obter uma pasta homognea;
1.3. Produtos em p: reconstituir a amostra pesando uma quantidade conhecida de
aproximadamente 10 g e diluir com 100 mL de gua.
2. Realizar a leitura do pH em aparelho pHmetro calibrado.
Referncia:
BRASIL. Ministrio da Agricultura. Secretaria Nacional de Defesa Agropecuria. Laboratrio Nacional de Referncia
Animal. Mtodos analticos oficiais para controle de produtos de origem animal e seus ingredientes: mtodos fsicos e
qumicos. Braslia, DF, 1981. v. II, cap. 17, p. 5 -6.
Biotecnologia
SUMRIO
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Biotecnologia
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Onde:
Peso inicial: Peso do cadinho vazio (g)
Peso final: Peso do cadinho com amostra aps ser retirado da mufla (g)
Referncias:
BRASIL. Ministrio da Agricultura. Secretaria Nacional de Defesa Agropecuria. Laboratrio Nacional de Referncia
Animal. Mtodos analticos oficiais para controle de produtos de origem animal e seus ingredientes: mtodos
fsicos e qumicos. Braslia, DF, 1981. v. II, cap. 2, p. 3.
MERCK. Reactivos, diagnstica, productos qumicos 1992/93. Darmstadt, 1993. 1584 p.
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Dica: ao pingar as gotas de indicador misto, observar. Se essas ficarem verdes, porque o
erlenmeyer est contaminado.
Parte 4: Titulao
9. Titular com soluo de cido sulfrico 0,1 N ou soluo de cido clordrico 0,1 M at a
viragem do indicador.
Clculo:
Protena Bruta % = (Va-Vb) x M x 6,38 x 0,014 x 100/ m
Onde:
Va= Volume de HCl 0,1 M ou H2SO4 0,1 N gasto na titulao
Vb= Volume de HCl 0,1 M ou H2SO4 0,1 N gasto na prova em branco
N= Normalidade real do cido utilizado para a titulao
6,38= Fator de transformao do nitrognio em protena, especfico para derivados lcteos
0,014= Miliequivalente grama do nitrognio
m= massa da amostra em gramas
Referncia:
BRASIL. Ministrio da Agricultura. Secretaria Nacional de Defesa Agropecuria. Laboratrio Nacional de Referncia
Animal. Mtodos analticos oficiais para controle de produtos de origem animal e seus ingredientes: mtodos
fsicos e qumicos. Braslia, DF, 1981. v. II, cap. 2, p. 3-6.
Biotecnologia
SUMRIO
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Biotecnologia
SUMRIO
184
Fazer uma soluo de 5 mg/mL, pesando 0,5 g de albumina bovina em 100 mL de gua
destilada.
c) Primeiramente, faz-se a curva para a albumina. O preparo pode ser em tubos de ensaio ou
em frascos plsticos.
Concentrao
Volume da soluo
Volume de gua
Ponto da curva
Protena
de BSA
destilada
Tubo A
Tubo B
Tubo C
Tubo D
Tubo E
Tubo F
(mg/mL)
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
(0,5 mg/mL) em L
0
40
80
120
160
200
L
2000
1960
1920
1880
1840
1800
d) Retirar 500 L de cada tubo da curva anterior e transferir para novos tubos de ensaio (ou
outros frascos de plstico). Fazer em triplicatas, ou seja:
Para a construo da curva para a leitura no espectrofotmetro:
Tubo 1: 500 L do tubo A da tabela anterior + 2,5 mL de reagente C
Tubo 2: 500 L do tubo B da tabela anterior + 2,5 mL de reagente C
Tubo 3: 500 L do tubo C da tabela anterior + 2,5 mL de reagente C
Tubo 4: 500 L do tubo D da tabela anterior + 2,5 mL de reagente C
Tubo 5: 500 L do tubo E da tabela anterior + 2,5 mL de reagente C
Tubos 6 , 7 e 8: 500 L da amostra + 2,5 mL de reagente C
Deixar todos os tubos a temperatura ambiente por 10 min.
e) Adicionar em todos os tubos 250 L do reagente D (Reagente de folin-Ciocaltens e gua
1:1) e aguardar por 30 min.
f) Ler no espectrofotmetro a 750 nm.
g) Construir a curva e fazer o grfico concentrao (mg/mL) x absorbncia. Verificar a
equao da reta.
Observao: a amostra deve ser diluda de forma que sua concentrao fique dentro da
amplitude da curva de calibrao.
Referncias:
LOWRY, O. H et al. Protein measurement with the folin phenol reagent. Journal Biol. Chem., p. 265-275, 1951.
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NaCl 3%
leo vegetal
Procedimento:
Prepara-se uma suspenso contendo 1 g de protena com 34 mL de soluo de NaCl 3%,
em liquidificador domstico por 30 segundos em velocidade baixa. Com auxlio de uma bureta
adiciona-se 30 mL de leo vegetal de soja a uma vazo de 10 mL/min sob agitao. A emulso
formada deve ser transferida para tubos de centrfuga e levados a um banho de gua a 85 C por 15
minutos. A seguir, as amostras devem ser centrifugadas a 3000xg por 40 minutos.
Aps a centrifugao, o volume de leo separado em cada amostra deve ser transferido para
uma proveta graduada e efetuada a leitura. A diferena entre a quantidade de leo medido e a
quantidade de leo adicionado expressa como a quantidade de leo emulsificado por grama de
protena contida na amostra e deve ser calculada da seguinte forma:
CE = quantidade de leo emulsificado (mL)
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natural (com bastantes cuidados) e que sofreram desnaturao, podem apresentar maior grau
de digestibilidade. No entanto, desnaturaes com a ao do calor tendem a diminuir o grau de
digestibilidade.
A digestibilidade de uma protena representa a parte da protena que pode ser hidrolisada
pelas enzimas digestivas; estas protenas seriam ento quebradas em aminocidos, estando
disponveis ao organismo humano. Nestes ensaios, procura-se imitar as condies de acidez do
estmago, sendo por isso chamada in vitro. Consiste numa propriedade importante pois representa
o valor nutritivo de uma protena.
Equipamentos:
Balana analtica
Aparelho de banho Maria digital
pHmetro
Centrfuga
Vidrarias, utenslios e outros:
Esptula
Proveta graduada
Pipeta graduada
Bquer
Tubos de ensaio
Esptula
Bquer 50 mL
Tubos de centrfuga
Pipeta de pasteur
Reagentes:
Pepsina
HCl 0,1 N
Merthiolate incolor
NaOH 0,2 N
Pancretana
Tampo de fosfato
cido tricloro actico 5%
Procedimento:
Inicialmente, pesa-se uma quantidade de amostra que corresponda ao equivalente a 0,5 g
de protena. Prepara-se uma soluo de 1,5 mg de pepsina por mL de HCl 0,1 N, e adiciona-se
15 mL desta soluo amostra. A seguir, adiciona-se 0,5 mL de soluo de merthiolate incolor.
Homogeneiza-se bem e leva-se a banho-maria a 37 C por 3 horas, com agitao peridica. Decorrido
este tempo, os tubos contendo as amostras devem ser resfriados e a soluo ajustada a pH 8,0 com
uma soluo de NaOH 0,2 N, utilizando um pHmetro .
Prepara-se, tambm, uma soluo de 0,5 mg de pancreatina por mL de tampo fosfato pH
8,0. Adiciona-se 10 mL da soluo de pancreatina ao produto hidrolisado pela pepsina e leva-se
novamente ao banho-maria a 37 C, porm por 24 horas com agitao peridica. Aps o tempo de
hidrlise, adiciona-se 5 mL de uma soluo de tricloro actico 5% amostra e centrifuga-se por 15
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minutos a 5000 xg para separao do material insolvel, sendo o filtrado recolhido para posterior
determinao do nitrognio digerido, pelo mtodo de Kjeldhal.
A digestibilidade in vitro expressa como a porcentagem de nitrognio digerido em relao
ao nitrognio total na amostra inicial, sendo calculada da seguinte forma:
Digestibilidade (%) = Nitrognio digerido x 100
Nitrognio total
Referncias:
A.O.A.C. Official Methods of Analysis. Association of Official Analytical Chemists., 18a edition, v. 1-2, USA. 2005.
ARAJO, J. M. Qumica de alimentos: teoria e prtica. 4 ed. Viosa: UFV, 2008. 596 p.
BALTI, R. et al. Comparative study on biochemical properties and antioxidative activity of cuttlefish (Sepia officinalis)
protein hydrolysates produced by alcalase and bacillus licheniformis NH1 proteases. Journal of amino acides. V. 2,
2011. 11 p.
BELITZ, H. D.; Grosch, W. Qumica de los alimentos. 2a edio. Editora: Acribia, S.A. Zarogoza. Espanha. 1997.
DAMODARAN, S.; Parkin, K.L; Fennema, O.R. Qumica de alimentos de fennema. Traduo Adriano Brabdelli et al.
4 ed. Porto Alegre: Artmed, 2010. 900 p.
KRISTINSSON, H. G.; Rasco, B. A. Fish protein hydrolysates: production, biochemical, and functional properties.
Critical reviews in food science and nutrition. v. 40, p. 43. 2000.
LOWRY, O. H et al. Protein measurement with the folin phenol reagent. Journal Biol.Chem., p. 265-275, 1951.
SCHMIDT, C. G. Hidrlise enzimtica das protenas de carne de frango. Dissertao de Mestrado. Fundao
Universidade Federal do Rio Grande (FURG), Rio Grande: FURG, 2008, 130 p.
SGARBIERI, V.C. Protenas em alimentos proticos: propriedades, degradaes, modificaes. 1. Ed. So Paulo:
Varela, 1996. 517 p.
ZAIA et al. Determinao de protenas totais vias epectrofotometria: Vantagens e desvantagens dos mtodos
existentes. So Paulo: Qumica Nova, n.1, v.6. 1998. p 787-793.
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DAMODARAN, S.; Parkin, K.L; Fennema, O.R. Qumica de alimentos de fennema. Traduo Adriano Brabdelli et al.
4 ed. Porto Alegre: Artmed, 2010. 900 p.
KRISTINSSON, H. G.; RASCO, B. A. Fish protein hydrolysates: production, biochemical, and functional properties.
Critical reviews in food science and nutrition. v. 40, p. 43. 2000.
MENSOR, L.L et al. Screnning of brazilian plant extracts for antioxidant activity by the use of the DPPH free radical
method.Phytotheraphy Research., v.15,n.2, 2001, pag 127-130.
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A= volume da soluo sulfato ferroso amoniacal gasto para titulao do amostra (mL)
N= Normalidade da soluo de sulfato ferroso amoniacal
8000= equivalente-grama de oxignio para 1 L de gua.
Se for utilizada diluio, multiplicar pelo fator de diluio utilizado.
Referncia:
Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 22 st edition. Mtodo 5220 B, pg 5-17, 2012.
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4. Procedimento:
- A determinao de fenis totais quantificada por meio de espectrofotometria UV/Vis.
a. Inicialmente, realiza-se a curva padro, utilizando para isso uma Soluo de cido Glico.
b. Para realizar a curva de cido glico, dilui-se em um balo volumtrico de 10 mL, 50 mg
de cido Glico em Metanol.
c. Partindo desta soluo, realizam-se sucessivas diluies em metanol, conforme figura
abaixo, obtendo-se as seguintes concentraes: 500mg/L, 250mg/L, 150mg/L, 100mg/L e
50mg/L.
d. Para o branco foi utilizado apenas o metanol. A Figura 1 mostra o procedimento da
diluio dos padres.
Figura 1: procedimento para a diluio de padres para a determinao de fenis totais
e. Em cada tubo de ensaio, acrescenta-se: 40L da soluo; 3,16mL de gua destilada; 200L
de reagente Folin-Ciocalteu 1N e 600L de soluo de Na2CO3saturada previamente preparada.
f. Realiza-se leitura aps 30 minutos em espectrofotmetro em um comprimento de onda de
765 nm.
g. Os dados obtidos so calculados segundo equao da reta, formando uma curva onde R2
deve ser o mais prximo possvel de 1.
h. Ao trmino da construo da curva, procede-se com a pesagem das amostras do Material
Vegetal seco.
i. A concentrao da soluo deve ser de 1mg/mL.
j. Em tubo de ensaio, acrescenta-se: 40L da soluo do extrato; 3,16mL de gua destilada;
200L de reagente Folin-Ciocalteu 1N e 600L de soluo de Na2CO3 saturada previamente
preparada.
40C,
m. Para a realizao do branco da amostra, procede-se da mesma forma que na amostra, mas
adicionou-se metanol ao invs da soluo de extrato.
n. Os valores obtidos so comparados com a curva de cido Glico, obtendo assim o valor
em equivalentes de cido Glico (mg de EAG/g de extrato EtOH DP).
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Referncias:
SINGLETON, V. L.; Rossi, J. A. Colorimetry of Total Phenolics with Phosphomolybdic Phosphotungstic Acid
Reagents. American Journal of Enology and Viticulture. 16:144-158, 1965.
SOUSA, C. M de M. et al. Fenis totais e atividade antioxidante de cinco plantas medicinais. Qumica Nova. 30: 351355, 2007.
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- Este teste no especfico, j que alguns fenis apresentam reao positiva, quando esto
em altas concentraes.
- Para a tcnica de caracterizao, uma reao geral para substncias fenlicas onde a
complexao de hidroxilas com o on Fe2+ leva ao desenvolvimento de substncias de colorao
azulada ou esverdeada, conforme estrutura da molcula.
- Adicionam-se trs gotas da soluo aquosa de cloreto frrico 1%, preparadas anteriormente,
ao tubos B, contendo os extratos.
- Na presena de taninos hidrolisveis ocorre o desenvolvimento de colorao azulada e na
presena de taninos condensados a colorao verde.
- O tubo C ser utilizado como controle para verificao da colorao inicial do extrato.
Flavonoides
- Pesam-se cerca de 0,2 g de extrato,
- Adicionam-se aproximadamente 50 mL de gua em banho-maria fervente por 30 minutos.
- Esfria-se, filtra-se, e extrai-se duas vezes em funil de separao utilizando 10 mL de
n-butanol.
- Evapora-se a frao butanlica secura em cpsula de porcelana, e retoma-se o extrato em
metanol (cerca de 10 mL).
- Transfere-se para 2 tubos de ensaio (A e B).
- No tubo A adicionam-se 0,5 mL de cido clordrico concentrado e aps 0,1 g de magnsio
metlico.
- O desenvolvimento da colorao laranja indica a presena de flavonas, a colorao violcea
indica flavanonas e a cor vermelha a presena de flavonis.
- O tubo B ser utilizado como controle para a verificao da colorao inicial do extrato.
Cumarinas
- Aquece-se em tubo de ensaio, cerca de 0,1 g dos extratos em banho-maria fervente.
- Deve-se tampar o tubo de ensaio com papel filtro previamente impregnado e seco com uma
soluo metanlica de hidrxido de potssio 5%.
- Aps 10 minutos, o papel ser exposto luz ultra violeta (UV) de 365 nm.
- O desenvolvimento da fluorescncia azul e amarela indica a presena de cumarinas volteis.
Sugere-se utilizar como padro sementes de flavatonca, ricas em cumarinas volteis.
Quinonas
- Pesam-se 0,2 g dos extratos vegetais e extrair em banho-maria fervente durante 10 minutos,
com 5 mL de hidrxido de potssio 5%.
- Resfria-se, filtra-se o extrato e acidifica-o com cido actico.
- Em seguida, extrai-se com 5 mL de tolueno em funil de separao.
- Separa-se em um bquer a fase orgnica e adicionam-se 2 mL de soluo de hidrxido de
potssio 3%.
- O desenvolvimento de colorao vermelha indica a presena de antraquinonas, a colorao
violcea indica a presena de naftoquinoides e o surgimento de colorao azul indica a presena de
benzoquinoides.
- Para verificar a presena de quinonas glicosdicas, ferve-se em banho-maria cerca de 0,1 g
dos extratos vegetais com 10 mL de cido clordrico 10% durante 15 minutos.
- Resfria-se, filtra-se e adicionam-se 5 mL de tolueno ao extrato.
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Positivo
Negativo
Flavonides
Cumarinas
Saponinas
Alcaloides
Aparecimento de um precipitado
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CAPTULO 8
CULTURA DE CLULAS ANIMAIS
Adriane Pozzobon, Bruna Caye, Dalana Faleiro, Dbora Mara Kich, Marcia Ines Goettert
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15. Aproveitar o tempo de centrifugao para limpar a cmera de Neubauer com lcool 70%;
16. Terminado o processo de centrifugao, descartar a tripsina;
17. Ressuspender as clulas com 1 mL de meio completo;
18. Homogeneizar a clula com uma pipeta lentamente;
19. Colocar a lamnula de vidro sobre a cmara de Neubauer;
20. Pipetar 90 l da soluo azul de tripan no tubo eppendorf para diluio das clulas (1:10);
21. Adicionar 10 l da suspenso de clulas ao tubo eppendorf;
22. Pipetar 10 l soluo corada na lamnula da cmara de Neubauer;
23. Realizar a contagem de clulas por microscopia;
24. Aps a contagem, lavar a lamnula e cmara com gua corrente e secar;
25. Colocar 7 mL de meio nutritivo completo no frasco de cultura e transferir as clulas
ressupendidas (ou a quantidade desejada) para uma nova garrafa;
26. Identificar o frasco de cultura:
- Usurio
- Nmero de passagem
- Linhagem celular
- Data
27. Visualizar as clulas novamente ao microscpio;
28. Armazen-la na estufa.
Congelamento de clulas
Materiais: Meio de cultura nutritivo, soro bovino fetal (SBF), lcool 70%, azul de tripan,
frascos de cultura, cmera de Neubauer, criotubos, DMSO e tubos falcon.
Simulao:
1 quadrante: 33
2 quadrante: 43
3 quadrante: 28
4 quadrante: 30
1. Realizar a contagem celular;
2. Ajustar o clculo para a quantidade de clulas desejadas conforme exemplo acima;
3. Retirar a quantidade necessria de clulas da suspenso e o restante transferir para o frasco
de cultura, adicionar a quantidade necessria de meio de cultura nutritivo completo e armazenar
na estufa;
4. Centrifugar a suspenso celular;
5. Desprezar o sobrenadante;
6. Acrescentar soluo de congelamento (5-10% DMSO ou Glicerol + SBF) conforme o clculo;
7. Identificar os criotubos (linhagem, quantidade de clulas, passagem, data, nome);
8. Pipetar 1 mL da soluo em cada criotubo (processo realizado sobre gelo);
9. Armazenar os criotubos em refrigerador 4 C por aproximadamente 1h;
10. Transferir os criotubos para o freezer (-20 C) por 1-2h;
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uma colherinha. Desprezar o meio de transporte que contm os fragmentos lavados. Com o frasco
na horizontal, colocar os fragmentos na placa de Petry. Com a pina e tesoura triturar o tecido e
com o auxlio da colherinha, colocar o material triturado no Erlenmeyer, bem como a colagenase
(acondicionada no Banho Maria a 37 C) e a barrinha magntica; Fechar o Erlenmeyer com o papel
alumnio que estava na boca do mesmo; (pode-se colocar uma fita ao redor do papel alumnio para
melhor fix-lo) e colocar sob agitao por 2 horas a 37 oC.
Dica: ao abrir o Erlenmeyer na capela, deve-se ter o cuidado para no tocar na poro interna
do papel alumnio, pois este est esterilizado e ser utilizado para tapar o Erlenmeyer durante
a agitao. Durante todo o processo de lavagem e triturao do tecido, deve-se ter o cuidado de
no tocar com as mos no mesmo, sujeito a contaminaes. Outro cuidado importante com o
tempo desperdiado na triturao, passo no qual as clulas ficam expostas ao ambiente sem a
devida manuteno de suas condies basais, proporcionada pela soluo de Hanks. Durante a
dissociao enzimtica, a temperatura dever permanecer em torno dos 37o C proporcionando,
assim, condies timas ao enzimtica.
Antes do final da dissociao (45 minutos), colocar na capela: filtros com malha de 250 e
150 m encaixados em Erlenmeyers; tubos Corn esterilizados (tampa laranja. Ligar a UV por 30
minutos;
Ao Erlenmeyer de tripsinizao acrescentar igual volume de Hanks utilizado para a
dissociao enzimtica, a fim de inibir a ao da colagenase (poder ser medido em um tubo cnico,
pois no requer preciso de volume). Colocar o meio de cultura de interesse no Banho Maria a 37o C.
Despejar a soluo contendo o tecido dissociado no filtro de 250 m com cuidado e vagarosamente,
para no transbordar a malha. Verter o filtrado na membrana de 150 m. Distribuir o filtrado nos
tubos Corns, no encher muito (40 mL / tubo mx.).
Centrifugar por 10 minutos a 1.500 rpm. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o
sedimento em soluo de Hanks (15 - 20 mL), homogeneizar e juntar todo o volume de suspenso
em um nico tubo (em um terceiro tubo). Centrifugar por 10 minutos a 1.500 rpm. Preparar o filtro
de 60 m, verificando se a rosca est bem apertada, e colocando-o em um tubo Corn, com um copo
de seringa acoplada ao filtro.
Dica: deve-se ter o cuidado ao desenrolar o filtro de 60 m, pois o papel que o envolve ser
utilizado para forrar a base da capela ao abri-lo.
Colocar na capela dois Beckers pequenos com Hanks para lavar a membrana. Retirar os
tubos da centrfuga e desprezar o sobrenadante. Ressuspender o pellet em soluo de Hanks,
homogeneizar e filtrar com o filtro de 60.
Dica: o volume de Hanks utilizado dever ser de quatro vezes o tamanho do pellet, 25 mL.
Abrir o filtro sobre o papel alumnio e retirar a membrana com o auxlio de pipetas Pasteur,
fazendo uma trouxinha. Lavar a membrana nos Beckers com soluo de Hanks. Colocar a suspenso
celular da lavagem da membrana em tubo Corn e centrifugar todos os tubos por 10 minutos a 1.500
rpm.
Colocar na capela as placas de Petry e em um Becker mdio colocar o meio de cultura de
interesse. Separar bandejas para colocar placas e garrafas.
Retirar os tubos da centrfuga, desprezando o sobrenadante e ressuspender as clulas
epiteliais no meio de cultura (meio 199).
Dica: preparo do Meio 199:
1 pacote de p MEIO199
1 litro de gua Milli-Q
10 mL de Kanamicina
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4+6+2+5
3+7+3+2: soma total = 32. Divide-se por 8 =
4, este nmero ser multiplicado por 2 que representa o fator de diluio do corante resultando em
8. Teremos desta forma, 8 x104 clulas/mL; no entanto, o volume a ser plaqueado 1x105 cl/mL
logo: 8 x104 cl./mL = 0,8x105 cl/mL. Desta forma, calcula-se o volume a ser plaqueado por meio
de uma regra de trs. Por exemplo:
0,8x105 cl.------------ 1 mL
1,0x105 cl.------------ X
X = 1,25 mL. Este ser o volume a ser plaqueado para que tenhamos a densidade celular de
1x105 cl/mL em cada placa.
Distribuir em placas de plstico estreis de cultura de 35 mm na concentrao de 1x105
clulas/mL e incubar em estufa a 37C com atmosfera mida e adio automtica de 3% CO2.
Referncias:
SPRITZER, P. M., I. S. SILVA, et al. 1995. Culture of adult human prostatic epithelial cells: A simplified method for
obtaining primary cultures. Med Sci Res 23: 379-381.
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CAPTULO 9
CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS
Claudimar Sidnei Fior, Elisete Maria de Freitas, Aline Marjana Pavan e Marelise Teixeira
A tecnologia de cultura de clulas, protoplastos e tecidos de plantas constitui uma das reas
de maior xito da biotecnologia. Aps meio sculo de progresso, conquistou destacada posio na
propagao comercial e industrial de plantas.
A tcnica permite a preservao de material gentico in vitro, vindo a somar com as demais
ferramentas utilizadas atualmente na conservao de espcies, ou mesmo gentipos especficos.
Possibilita a conservao de plantas ou tecidos de diferentes procedncias, em condies de
crescimento mnimo ou associado criopreservao, para uso no melhoramento gentico, para
evitar a extino de espcies ou mesmo, para intercmbio entre instituies sem os riscos de
disseminao de pragas ou doenas.
A aplicao da tcnica de cultura de tecidos vegetais exige uma sequncia de procedimentos
conforme descrito a seguir:
1. Preparao de soluo estoque
2. Preparao do meio de cultura
3. Obteno e desinfestao dos explantes
4. Estabelecimento dos explantes e condies de incubao
5. Manuteno das plantas matrizes
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Componentes
NH4NO3
165000
16500
KNO3
190000
19000
H3BO3
620
62
KH2P04
17000
1700
KI
83
8,3
Na2MoO4 2H2O
25
2,5
CoCl2 . 6H2O
2,5
1,25
CaCl22H2O
44000
4400
MgSO4 . 7H2O
37000
3700
MnSO4 . 4H2O
2230
223
ZnSO4 . 7H2O
860
86
CuSO4 . 5H2O
2,5
1,25
Na2 EDTA.2H2O
3720
372
FeSO4 . 7H2O
2780
278
litro:
Passos a serem seguidos para o preparo das solues estoque do Meio MS volume de um
1. Para a diluio dos componentes, deve ser utilizada gua destilada.
2. Os reagentes devem apresentar a mxima pureza possvel.
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Biotecnologia
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440
KH2PO4
Fosfato de potssio
170
KNO3
Nitrato de potssio
1900
MgSO4. 7H2O
Sulfato de magnsio
heptahidratado
370
NH4NO3
Nitrato de amnia
1650
CoCl2.6H2O
Cloreto de cobalto
hexahidratado
0,025
CuSO4.5H2O
Sulfato de cobre
pentahidratado
0,025
H3BO3
cido brico
6,2
KI
Iodeto de potssio
0,83
MnSO4 4H2O
Sulfato de mangans
tetrahidratado
22,3
Na2MoO4.2H2O
Molibdato de sdio
dihidratado
0,25
ZnSO4.4H2O
8,6
27,8
Micronutrientes
FeEDTA:
Fe(SO4).7H2O
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MS
Componentes
(mg L-1)
Na2EDTA.2H2O
cido
etilendiaminotetraactico, sal
dissdico dihidratado
37,3
Componentes Orgnicos:
cido nicotnico
0,5
Glicina
2,0
Mio-inositol
100
Piridoxina.HCl
0,5
Tiamina.HCl
0,1
Sacarose (g/l)
30
Cada laboratrio deve optar em preparar o meio de cultura com o uso de solues estoque
ou no. Quando no so preparadas solues estoque para o preparo do meio, ou seja, quando
parte-se diretamente dos sais, devem ser seguidos os passos descritos a seguir:
1. Pesam-se todos os componentes, de acordo com a receita (Tabela 2) e a quantidade de
meio a ser preparada.
2. Logo em seguida, todos os componentes devem ser dissolvidos em gua deionizada.
Importante que seja utilizado algum recipiente com volume preciso (como provetas ou bales
volumtricos).
3. Concluda a dissoluo de todos os produtos qumicos e a sacarose, acrescenta-se o gar e
corrige-se o pH.
Dica: O ajuste do pH pode ser realizado com soluo 0,5 mol de cido clordrico (HCl) quando
este estiver muito alto e precisa ser reduzido. Quando ocorrer o inverso, ou seja, o pH estiver muito
baixo, o ajuste deve ser realizado com hidrxido de sdio (NaOH), na mesma concentrao.
A forma mais rpida e prtica para o preparo do meio de cultura atravs da utilizao das
solues estoques (conforme detalhado no item acima). Neste caso procede-se da seguinte forma:
1. Pipetar as alquotas de cada uma das solues, de acordo com a concentrao e a quantidade
de meio a ser preparada. Por exemplo, se a definio o preparo de um litro de meio, devem ser
pipetados 100 mL da soluo estoque A na concentrao 10 X ou de 10 mL quando a concentrao
da soluo for 100 X.
2. Ento deve ser acrescentado o mio-inositol, o carvo e a casena (opcionais) e a sacarose,
mantendo em agitao no agitador magntico.
3. Depois de misturadas todas as solues estoque, o mio-inositol, o carvo, a casena e a
sacarose, acrescenta-se gua deionizada para completar o volume final previamente definido e
corrige-se o pH (recomenda-se que seja 5,8).
4. Para finalizar, independente do mtodo seguido (com uso de soluo estoque ou no),
deve ser acrescentado o gar.
5. A soluo deve ser aquecida at a total dissoluo (recomenda-se utilizar chapa aquecedora
ou forno de micro-ondas) onde o meio atinja 90 a 95 C.
6. To logo alcance esta temperatura, distribui-se todo o volume nos frascos de cultivo (tubos
de ensaio, por exemplo), fechando-os com tampa autoclavvel ou papel alumnio. recomendado
que seja distribuda a mesma quantidade de meio em cada frasco.
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217
C.
7. Embora tenha sido aquecido, o meio ainda necessita ser autoclavado por 15 minutos a 121
Este procedimento deve ser realizado to logo o meio seja distribudo nos frascos. Em casos
excepcionais, pode-se autoclavar no dia seguinte ao prepare; no entanto, isso deve ser evitado, pois
colnias de contaminao em desenvolvimento podem liberar toxinas, alm de consumir parte dos
compostos.
8. Depois de esterilizados, os meios esto prontos para a incubao dos explantes (segmentos
nodais, sementes, embries zigticos, meristemas e outros). Contudo, se necessrio, os meios
podem ficar armazenados por uma a duas semanas em local com temperatura amena, limpo e sem
luz.
Referncia:
MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures.
Physiologia Plantarum, Kopenhagen, v. 15, p. 473-497, 1962.
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219
3. Os ramos devem ser submetidos lavagem em gua corrente por cerca de 20 minutos para
promover a limpeza superficial.
Dica: o tempo de lavagem pode ser diferenciado dependendo de cada espcie, ou mesmo do
tipo de material a ser incubado (segmentos nodais, sementes, embries ou meristemas).
4. Aps, procede-se a retirada de parte das folhas e do caule, que no sero utilizados como
explantes, reduzindo assim a quantidade de inculos.
Recomendaes:
1. Antes de iniciar os procedimentos de incubao, a capela de fluxo laminar deve ser
previamente limpa com lcool etlico 70%.
2. Todo o material (pinas, bisturis, placas de petri) a ser utilizado no procedimento de
incubao deve ser previamente autoclavado.
3. Quando os materiais forem distribudos na cmara de fluxo de ar, estes devem receber
jatos de lcool etlico (70%). Ento, a luz ultravioleta mantida ligada por 20 minutos, perodo em
que ningum deve permanecer na sala de assepsia.
4. A seguir, em capela de fluxo laminar, os ramos restantes so imersos em diferentes
concentraes de substncias (Tabela 3) que podem contribuir para a desinfestao.
A seguir, na cmara de fluxo laminar, os ramos so imersos nas solues de desinfestao,
(Tabela 3), conforme o protocolo a ser seguido. De maneira geral, como procedimento padro,
recomenda-se iniciar pela imerso em lcool etlico que, alm da ao germicida, surfactante e,
quando aplicado inicialmente, facilita ao dos outros produtos. Graduaes de etanol superiores
a 80% podem desidratar os tecidos com facilidade, portanto, a concentrao recomendada 70%.
5. Assim, a primeira imerso deve ser em soluo contendo lcool etlico, sendo a concentrao
e o tempo definidos conforme a sensibilidade dos tecidos da planta. Em mdia, para a maioria dos
tecidos, este tempo pode variar de um a dois minutos.
Dica: tecidos tenros, que oxidam facilmente, so mergulhados em etanol 50 a 70% por alguns
segundos. Excepcionalmente, em se tratando de sementes, cujo tegumento ser removido aps a
desinfestao, pode-se manter em etanol 80% por mais tempo (5 a 10 minutos).
Tabela 3: Substncias desinfestantes comumente usadas em cultivo de tecidos de plantas
com a respectiva concentrao a ser utilizada e tempo mnimo e mximo de exposio.
Desinfestante
Concentrao (%)
Tempo de exposio
(minutos)
Hipoclorito de clcio
9-10
5-30
Hipoclorito de sdio
0,5-5
5-30
gua oxigenada
3-12
5-15
lcool etlico
70-95
1-15
Nitrato de prata
5-30
Cloreto de mercrio
0,1-1
2-10
6. Como procedimento padro na maioria dos laboratrios, aps o tratamento com etanol, os
tecidos vegetais so mergulhados em soluo de hipoclorito de sdio ou clcio com 1,0 a 2,5% de
cloro ativo.
Dicas:
- O hipoclorito de sdio facilmente encontrado em formulaes comerciais de gua sanitria.
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- As concentraes mais comuns variam de 0,5 a 2,0% de cloro ativo e o tratamento dura
at 50 minutos, no caso de tecido lignificado, embora o tempo mais utilizado para imerso em
hipoclorito seja de 10 a 15 minutos
sdio.
- O hipoclorito de clcio apresenta a vantagem de ser menos txico para os tecidos que o
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Figura 2: A. Explante com brotao na sala de crescimento. Este foi incubado em meio MS
com adio de carvo ativado (Imagem: Mara Filter). B. Plantas em cultivo in vitro em sala de
crescimento (Imagem: CSFior).
8.1. A temperatura mdia das salas de crescimento de 25oC. As plantas tropicais e subtropicais
tendem a ser cultivadas em temperaturas levemente mais altas do que espcies temperadas (mdia
de 27oC). Quando uma variao diurna-noturna desejada, normalmente, adota-se 25 C durante o
dia e 20 C noite, ou 28 C/24 C.
8.2. Em geral, para induo de parte area a regio do azul do espectro crtica e a luz
vermelha no apresenta efeitos. As lmpadas recomendadas para iluminao das culturas in vitro
so do tipo fluorescentes brancas fria, Plantilux ou com emisses balanceadas nas regies do azul
(430 nm) e vermelho (660 nm). Assim, em cultivo de tecidos, quando se objetiva a multiplicao de
plantas, as lmpadas devem conter emisses nesses espectros.
8.3. As condies de incubao podem variar muito. Escuro total ou intensidades de luz
reduzidas so teis nos primeiros dias aps o isolamento para reduzir a oxidao fenlica. O incio
da cultura no escuro tambm indicado para evitar estresse em alguns explantes, como meristemas
de rizomas, bulbos e razes.
8.4. A luz de baixa irradiao na cultura de tecidos vegetais utilizada pelas seguintes razes:
a) o fornecimento de altos nveis de luz artificial caro e gera calor no desejado;
b) as culturas em ambientes lacrados tornam-se superaquecidas em altas irradiaes devido
ao efeito estufa;
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Figura 2: Brotao juvenil emitida aps poda drstica em Rubus idaeus L. cultivado em casa
de vegetao (Imagem: CSFior).
6. Reguladores de crescimento, como giberelinas e citocininas, podem ser aplicados nas
plantas matrizes intactas antes da retirada dos explantes. Estes, com frequncia induzem algum
grau de rejuvenescimento em plantas lenhosas, facilitando a cultura in vitro e induzindo, com
frequncia, a quebra de dormncia de gemas axilares e aumentando o nmero de brotos dos quais
os explantes podem ser tirados. O uso das citocininas em plantas matrizes pode aumentar o nmero
de gemas, propiciando mais brotos para retirada de explantes. A dosagem tima de reguladores de
crescimento para induzir morfognese frequentemente varia de acordo com o tamanho e o tipo de
explante de uma nica planta.
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CAPTULO 10
ISOLAMENTO E CARACTERIZAO DE BACTRIAS
PROMOTORAS DE CRESCIMENTO VEGETAL
Adriana Ambrosini da Silveira, Camille Eichelberger Granada
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Meio de cultura
LGI semi-slido sem
Nitrognio
Reagentes
KH2PO4
Sacarose
K2HPO4
MgSO4.2H2O
CaCl2.2H2O
Na2Mo4.2H2O
Soluo de vitaminas *
FeEDTA **
Azul de bromotimol (0,5%) ***
gua destilada
gar puro
Quantidade
0,6 g
5g
0,2 g
0,2 g
0,02 g
0,002 g
1 mL
4 mL
5 mL
Completar volume para
1L
1,8 g
Reagentes
KH2PO4
Sacarose
K2HPO4
MgSO4.2H2O
FeCl3.6H2O
CaCl2.2H2O
NaMo4.2H2O
Azul de bromotimol (0,5%) *
gua destilada
gar puro
Para 1L
0,6 g
100 g
0,2 g
0,2 g
0,01 g
0,02 g
0,002 g
2,5 mL
Completar volume para 1 L
1,8 g
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Reagentes
cido mlico
K2HPO4
MgSO4.7H2O
NaCl
CaCl2.2H2O
Azul de bromotimol (0,5%) *
FeEDTA *
Soluo de vitaminas *
KOH
Soluo de micronutrientes **
gua destilada
gar puro
Para 1L
5g
0,5 g
0,2 g
0,1g
0,02 g
2 mL
4 mL
1 mL
4,5 g
2 mL
Completar volume para 1 L
1,8 g
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Para 100 mL
0,004 g
0,12 g
0,14 g
0,1 g
0,117 g
10. Aps 1 semana, reinocular todas as amostras para novos frascos de vidro contendo os
meios de cultura correspondentes e manter na estufa 28 C por mais 7 dias.
11. Para o isolamento de colnias, realizar um estriamento em placas de Petry contendo meio
de cultura com N (LGI, LGI-P e/ou Nfb, conforme descrito acima), correspondente ao do frasco de
vidro, e incubar em estufa 28 C por 1 ou 2 dias, ou at obter colnias isoladas.
12. Inocular diferentes colnias em tubos de ensaio contendo 3 ml de meio King-B lquido.
Manter os tubos sob agitao constante 28 C por 24 a 48 h, ou at turvar.
Dica: a escolha de uma ou mais colnias por placa opcional, mas se d preferncia ao
isolamento de colnias morfologicamente diferentes, ou com distintas coloraes.
Meio de Cultura
King-B
Reagentes
Glicerol
Peptona
K2HPO4
MgSO4.7H2O
Triptofano
gua destilada
Para 1 L
15 g
20 g
1,15 g
1,50 g
0,50 g
Completar volume para 1 L
13. Realizar a colorao de Gram com cada uma das amostras cultivadas em tubos de ensaio,
para avaliao da pureza do inculo.
14. Aliquotar 1,2 mL do caldo bacteriano e 300 l de glicerol puro estril em tubos criognicos
de 2 mL, a fim de se obter o estoque do isolado em glicerol 20%.
Dica: importante que o tubo criognico seja levemente agitado para uma mistura
homognea. Mantenha os tubos por pelo menos 6 horas a temperatura ambiente antes de estoc-lo
-20 C. Se possvel, armazene os tubos criognicos a -80 C.
Referncia:
DBEREINER, J., BALDANI V.L.D., BALDANI J.I. 1995. Como isolar e identificar bactrias diazotrficas de plantas
no-leguminosas. Braslia Embrapa-SPI, 60 p.
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Reagentes
Glicose
MgSO4.7H2O
FeCl3.6H2O
NaMoO4.2H2O
CaCl2.2H2O
K2HPO4
Soluo de tiamina (0,5 mg/ml)
Soluo de biotina (0,5 mg/ml)
Tioglicolato de sdio
Soluo de micronutriente de Jurgensen
*
gua destilada
gar puro
Para 1L
5g
0,2 g
0,04 g
0,005 g
0,15 g
0,8 g
2 ml
2 ml
0,5 g
1 ml
completar volume
para 1 L
15 g
Para 100 mL
0,286 g
0,181 g
0,022 g
0,008 g
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5. Inocular diferentes colnias em tubos de ensaio contendo 3 ml de meio King-B lquido (ver
Protocolo de isolamento de diazotrficos endofticos de raiz, descrito nesse captulo). Manter os
tubos sob agitao constante 28 C por 24 a 48 h, ou at turvar.
6. Realizar a colorao de Gram com cada uma das amostras cultivadas em tubos de ensaio,
para avaliao da pureza do inculo.
7. Aliquotar 1,2 mL do caldo bacteriano e 300 l de glicerol puro estril em tubos criognicos
de 2 mL, a fim de se obter o estoque do isolado em glicerol 20%.
Dica: importante que o tubo criognico seja levemente agitado para uma mistura
homognea. Mantenha os tubos por, pelo menos, 6 horas a temperatura ambiente antes de estoc-lo
-20 C. Se possvel, armazene os tubos criognicos -80 C.
Referncias:
SELDIN L., van Elsas J.D., PENIDO E.G.C. 1983. Bacillus nitrogens fixers from Brazilian soils. Plant Soil 70:243-255.
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Componentes
Manitol
K2HPO4
MgSO4 . 7H2O
NaCl
Extrato de levedura
Corante vermelho congo
gar
gua destilada
Quantidade
10 g
0,5 g
0,2 g
0,1 g
0,4 g
25 mg*
12 g
Completar o volume para 1L
* Usar 10mL de uma soluo de vermelho congo 2,5g . L-1. Ajustar o pH do meio de cultura
para 6,8 antes de esterilizar.
5. Incubar a placa em estufa 28C por um perodo de 2 a 10 dias.
Dica: as bactrias do gnero Rhizobium demoram de dois a trs dias para o aparecimento
de colnias em meio Levedura Manitol. Os isolados de Bradyrhizobium demoram de 6-10 dias. Os
gneros Mesorhizobium e Sinorhizobium possuem tempo de crescimento intermedirio.
6. As colnias caractersticas devem ser inoculadas em meio Levedura Manitol lquido 28C
at que a soluo fique turva (usar o mesmo meio descrito anteriormente sem adio de gar e o
corante Vermelho Congo).
Dica: sero consideradas caractersticas as colnias com bordas lisas, que no absorverem
corante, possurem colorao leitosa e aspecto gomoso.
7. Em um tubo estril adicionar 1mL da cultura bacteriana crescida em meio lquido
juntamente com 800-1000 L de glicerol estril. Agitar suavemente a soluo resultante at que esta
fique homognea.
8. Deixar a soluo a temperatura ambiente por 2-5 horas agitando suavemente a cada 30
minutos.
9. Estocar a soluo -20C.
Dica: quando for necessrio trabalhar com o isolado bacteriano que est preservado em
glicerol, inocular 20 L do estoque em meio de cultura apropriado.
Referncias
SOMASEGARAM P, HOBEN MJ. Methods in legume-rhizobium technology. NIFTAL, Hawaii, p 367. 1985.
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Sequncia
5 AAC GCG AAG AAC CTT AC 3
5 CGG TGT GTA CAA GAC CC 3
Posio
968-985
1401-1418
Condies da PCR
94 C 5 min; 30 ciclos de 94 C 45 seg, 52 C 45 seg, 72 C 45 seg; e 72 C 10 min
Dica: pelo alto nvel de conservao do gene 16S rDNA em bactrias, estes oligonucleotdeos
iniciadores amplificam o gene em qualquer espcie bacteriana.
Dica: como esta reao amplifica somente um poro do gene 16S rDNA, por esta metodologia
podemos identificar somente o gnero bacteriano.
Para amplificar o gene 16S rDNA completo, usar os oligonucleotdeos iniciadores:
Nome
pA
1542R
Sequncia
5 AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3
5 AGA AAG GAG GTG ATC CAG CC 3
Posio
8-28
1525-1542
Condies da PCR
94 C 5 min; 30 ciclos de 94 C 45 seg, 55 C 45 seg, 72 C 1 min; e 72 C 5 min
Dica: pelo alto nvel de conservao do gene 16S rDNA em bactrias, estes oligonucleotdeos
iniciadores amplificam o gene em qualquer espcie bacteriana.
Dica: como esta reao amplifica o gene 16S rDNA completo, por esta metodologia podemos
identificar o gnero e a espcie bacteriana.
3. O fragmento do DNA obtido pelos PCRs descritos acima deve ser sequenciado.
4. A sequncia obtida deve ser comparada com as sequncias do banco de dados GenBank
pelo software BlastN (disponvel em http://blast.ncbi.nlm.nih.gov) ou ez-taxon (disponvel em
http://www.ezbiocloud.net/eztaxon).
Referncias:
FELSKE A, RHEIMS H, WOKERINK A, STACKEBRANDT E, AKKERMANS DL.
Ribosome analysis reveals prominent activity of an uncultured member of the class Actinobacteria in grasslands
soils. Microbiol 143:29832989. 1997.
BROSIUS J, PALMER ML, KENNEDY PJ and NOLLER HF (1978). Complete nucleotide sequence of a 16s ribosomal
RNA gene from Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA 75:4801-4805.
STACKEBRANDT, E., LIESACK, W. Nucleic acids and classification, p.151194. In M. Goodfellow and A. ODonnell
(ed.), Handbook of new bacterial systematics. Academic Press, London. 1993.
Biotecnologia
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235
EDWARDS U, ROGALL T, BLOCKERL H, EMDE M, BOTTGER EC,. Isolation and direct complete nucleotide
determination of entire genes. Characterization of a gene coding for 16S ribosomal RNA. Nucleic Acids Research
17(19):7843-7853. 1989.
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Composio
Glicerol
Peptona
K2HPO4
MgSO4.7H2O
Triptofano
gua destilada
Quantidade
15 g
20 g
1,15 g
1,50 g
0,5 g
Completar o volume para 1L
Composio
FeCl3
H2SO4
gua destilada
Quantidade
2,4 g
84,2 mL
Completar o volume para 200 mL
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Componente
K2HPO4
gua destilada
CaCl2
gua destilada
Glicose
Extrato de levedura
gar
gua destilada
Quantidade
5g
50 mL de gua destilada
10 g
100 mL de gua destilada
10 g
2g
15 g
Completar para 1L
O pH do meio GL deve ser ajustado para 6,8. As solues 1 e 2 e o meio GL devem ser
autoclavadas separadamente.
3. Antes de verter o meio de cultura GL em placas de Petri, misturar a este as soluo 1 e 2 e
homogeneizar a soluo resultante.
Dica: a soluo resultante deve apresentar um fino precipitado esbranquiado (Ca3(PO4)2).
Este precipitado deve ser homogeneizado, juntamente com o meio antes de ser vertido.
4. Inocular 20 L da cultura bacteriana previamente crescida em meio lquido ao meio slido
obtido.
5. Esperar a gota secar e incubar 28C por 3-5 dias.
6. A formao de um halo de solubilizao claro entorno da colnia bacteriana indicativo
que este isolado solubilizou o fosfato precipitado.
Referncia:
SYLVESTER-BRADLEY R., ASAKAWA N., LA TORRACA S., MAGALHES FMM., OLIVEIRA L., PEREIRA
RM.: Levantamento quantitativo de microrganismos solubilizadores de fosfatos na rizosfera de gramneas e
leguminosas forrageiras na Amaznia. Acta Amazon 12:1522.1982.
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Componente
Glicerol
Peptona
K2HPO4
MgSO4.7H2O
gar
gua destilada
Quantidade
3g
4g
0,23 g
0,3 g
15 g
Completar o volume para 1L
Composio
Soluo 1
Soluo 2
Soluo 3
Soluo 4
Quantidade
7,5 mL
37,5 mL
30 mL
Completar o volume
Quantidade
13,5 mg
41 mL
Concentrao final
1 mM
10 mM
SOLUO 2
Composio
CAS
gua ultrapura estril
Quantidade
121 mg
Completar o volume para 100
mL
Concentrao final
2 mM
Proteger da luz
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SOLUO 3
Composio
CTAB (HDTMA)
gua ultrapura estril
Proteger da luz
Quantidade
364,45 mg
Completar o volume para 100 mL
Concentrao final
10 mM
SOLUO 4
Composio
Piperazina anidra
HCl 12M (puro = 37%)
Volume da Soluo Final
Diluir em 20mL
4,307 g
6,25 mL
100 mL
Diluir em 100mL
21,535 g
~ 31,25 mL
500 mL
Adicionar HCl aos poucos at pH 5,6. Esta soluo deve ser preparada na hora.
4. Aps esterilizar o meio gar King B, esperar a temperatura baixar um pouco e adicionar
aproximadamente 20% do volume do meio de corante CAS ao meio.
5. Verter a mistura resultante em placas de Petri estreis.
Dica: o meio de cultura dever ter a colorao azul escuro. Caso o meio fique com outra
colorao voc deve ter errado o pH do meio ou vertido o corante, quando o meio ainda estava
muito quente.
6. Inocular uma gota de aproximadamente 20 L da cultura bacteriana crescida no meio
lquido na placa de Petri preparada anteriormente.
7. Incubar a 28C por 2-3 dias.
8. O aparecimento de um halo cor laranja em torno da colnia bacteriana indicativo de
produo de siderforos.
Referncia:
SCHWYN B & NEILANDS JB.: Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Anal
Biochem 160: 47-56. 1987.
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240
Reagentes
KH2PO4
Na2HPO4
MgSO4.7H2O
Glicose
cido glucnico
cido ctrico
FeSO4.7H2O *
Soluo de elementos-trao **
gua destilada
Para 1 L
4g
6g
0,2 g
2g
2g
2g
100 L
100 L
Completar volume para 1L
Volume - 100 mL
0,01 g
0,01119 g
0,1246 g
0,07822 g
2. Regular o pH para 7,2 com KOH 5M, completar o volume para 1 L com gua destilada e
adicionar 10 g de gar puro.
3. Aps solidificado em placa de Petri, espalhar 50 L de ACC 0,5 M sobre o meio.
Dica: s descongelar a ACC no momento de uso e no mant-la fora do gelo por tempo
maior que o necessrio.
4. Inocular pela tcnica da gota 2 L de um caldo bacteriano recentemente cultivado e incubar
as placas 28 C por cerca de 5 dias, acompanhando o desenvolvimento da colnia diariamente.
5. Como controle negativo de crescimento so utilizadas placas de Petri sem adio de ACC,
contendo apenas o meio de cultura DF salts sem N.
Dica: importante destacar que mesmo no meio sem N e ACC (controle negativo) poder
haver crescimento bacteriano, mas em menor grau e tamanho de colnia quando comparado
ao meio contendo ACC. A diferena de crescimento o indicativo da atividade da enzima. A
quantificao de a-cetobutirato fornece maior preciso da atividade enzimtica e pode ser avaliada
por ensaios espectrofotomtricos (PENROSE & GLICK, 2003).
Referncias:
DRORKIN, M. & FOSTER, J.: Experiments with some microorganisms which utilize ethane and hydrogen. J
Bacteriol 75:592-601. 1958.
PENROSE, D.M. & GLICK, B.R. Methods for isolating and characterizing ACC deaminase-containing plant growthpromoting rhizobacteria. Physiol Planta 118:10-15. 2003.
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CAPTULO 11
ANLISES BSICAS DE BIOINFORMTICA
Felipe Klein Ricachenevsky, Walter Orlando Beys da Silva
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Biotecnologia
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Biotecnologia
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248
encontrar aquele alinhamento de maneira aleatria ou seja, quanto menor o valor, maior a
confiana, sendo o E value = 0 o mais confivel); e Identity (indica quantos nucleotdeos idnticos
so encontrados apenas na regio que foi alinhada).
Dica: dependendo do tipo de alinhamento feito, um E value aceitvel pode variar. Por
exemplo, se estamos alinhando sequncias de um organismo que apresenta grande nmero
de sequncias depositadas no banco, como humanos, camundongo, mosca-da-fruta ou arroz,
esperamos encontrar E value baixos, prximo a zero. J no caso de buscarmos sequncias obtidas
a partir de um organismo que no possui muitas sequncias no banco, em geral iremos encontrar
sequncias de outros organismos que apresentam similaridade, mas no so idnticas. Portanto,
nesse caso, esperamos E value mais alto (1e-10, por exemplo).
9. Na seo Alignments, possvel ver os alinhamentos propriamente ditos.
Dica: para acessar as sequncias encontradas (para copi-las e arquiv-las em formato
FASTA, por exemplo), basta clicar no nmero de acesso das mesmas nesta seo. Uma nova janela/
aba ser aberta, mostrando a sequncia e todas as informaes associadas a ela.
Busca por similaridade em banco de dados de protenas utilizando sequncia proteica como
query BLASTp (protena X protenas):
O BLASTp utilizando quando se quer encontrar sequncias de protenas em um banco de
dados que apresentem similaridade com uma sequncia de interesse tambm de protena.
1. Acessar o site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. No canto direito da pgina, encontrar e
clicar na opo BLAST.
2. Na pgina seguinte, clique na opo protein blast, na seo Basic BLAST.
3. Na caixa Enter query sequence, cole a sequncia da protena que deseja alinhar com o
banco de dados.
4. No menu Database, selecione o conjunto de dados contra o qual a sequncia de interesse
ser alinhada. Caso queira buscar em todo o banco de dados do GenBank, selecione Non-redundant
protein sequences.
5. Na caixa Organism, possvel restringir as buscas para apenas aquelas que so derivadas
de um organismos especfico. Tambm possvel excluir apenas essa espcie, clicando no boto
Exclude, assim como adicionar mais organismos para restringir ou excluir os mesmos das buscas
(boto +).
6. Clique em BLAST. O resultado pode demorar alguns minutos.
7. Analisar os resultados. Na seo Graphic Summary, possvel ver uma representao
grfica dos resultados. O tamanho das barras coloridas indica a extenso do alinhamento da
sequncia de interesse (query) com diferentes sequncias do banco de dados. J as cores indicam o
quo similares elas so. Arrastando o mouse por cima das barras, a caixa acima da representao
grfica mostrar o nome da sequncia com a qual a sequncia query apresenta similaridade.
8. Na seo Descriptions, so mostradas as sequncias que apresentam similaridade, e os
dados que quantificam essa similaridade. Dentre eles, importante observar os seguintes: Query
coverage (indica qual porcentagem da sequncia de interesse coberta pelo alinhamento com
cada sequncia do banco lembre-se que, por se tratar de um alinhamento local, muitas vezes
apenas uma regio de ambas as sequncias sero alinhadas); E value (indica a probabilidade
de encontrar aquele alinhamento de maneira aleatria ou seja, quanto menor o valor, maior
a confiana, sendo o E value = 0 o mais confivel); e Identity (indica quantos amino cidos
idnticos so encontrados apenas na regio que foi alinhada).
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249
Dica: dependendo do tipo de alinhamento feito, um E value aceitvel pode variar. Por
exemplo, se estamos alinhando sequncias de um organismo que apresenta grande nmero
de sequncias depositadas no banco, como humanos, camundongo, mosca-da-fruta ou arroz,
esperamos encontrar E value baixos, prximo a zero. J no caso de buscarmos sequncias obtidas
a partir de um organismo que no possui muitas sequncias no banco, em geral iremos encontrar
sequncias de outros organismos que apresentam similaridade, mas no so idnticas. Portanto,
nesse caso, esperamos E value mais alto (1e-10, por exemplo).
9. Na seo Alignments, possvel ver os alinhamentos propriamente ditos.
Dica: para acessar as sequncias encontradas (para copi-las e arquiv-las em formato
FASTA, por exemplo), basta clicar no nmero de acesso das mesmas nesta seo. Uma nova janela/
aba ser aberta, mostrando a sequncia e todas as informaes associadas a ela.
Busca por similaridade em banco de dados de protenas utilizando sequncia de nucleotdeos
como query BLASTx (nucleotdeos traduzidos X protenas):
O BLASTx utilizando quando se quer encontrar sequncias de protenas em um banco de
dados que apresentem similaridade com uma sequncia de interesse de nucleotdeos. Para isso, o
BLAST traduz a sequncia de interesse nas seis fases de leitura possveis (trs da fita senso, e trs
da fita antissenso), gerando seis sequncias de protenas que so ento comparadas com o banco de
dados de protena.
1. Acessar o site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. No canto direito da pgina, encontrar e
clicar na opo BLAST.
2. Na pgina seguinte, clique na opo blastx, na seo Basic BLAST.
3. Na caixa Enter query sequence, cole a sequncia de nucleotdeos que deseja alinhar com o
banco de dados.
4. No menu Database, selecione o conjunto de dados contra o qual a sequncia de interesse
ser alinhada. Caso queira buscar em todo o banco de dados do GenBank, selecione Non-redundant
protein sequences.
5. Na caixa Organism, possvel restringir as buscas para apenas aquelas que so derivadas
de um organismos especfico. Tambm possvel excluir apenas essa espcie, clicando no boto
Exclude, assim como adicionar mais organismos para restringir ou excluir os mesmos das buscas
(boto +).
6. Clique em BLAST. O resultado pode demorar alguns minutos.
7. Analisar os resultados. Na seo Graphic Summary, possvel ver uma representao
grfica dos resultados. O tamanho das barras coloridas indica a extenso do alinhamento da
sequncia de interesse (query) com diferentes sequncias do banco de dados. J as cores indicam o
quo similares elas so. Arrastando o mouse por cima das barras, a caixa acima da representao
grfica mostrar o nome da sequncia com a qual a sequncia query apresenta similaridade.
8. Na seo Descriptions, so mostradas as sequncias que apresentam similaridade, e os
dados que quantificam essa similaridade. Dentre eles, importante observar os seguintes: Query
coverage (indica qual porcentagem da sequncia de interesse coberta pelo alinhamento com
cada sequncia do banco lembre-se que, por se tratar de um alinhamento local, muitas vezes
apenas uma regio de ambas as sequncias sero alinhadas); E value (indica a probabilidade
de encontrar aquele alinhamento de maneira aleatria ou seja, quanto menor o valor, maior
a confiana, sendo o E value = 0 o mais confivel); e Identity (indica quantos amino cidos
idnticos so encontrados apenas na regio que foi alinhada).
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Dica: dependendo do tipo de alinhamento feito, um E value aceitvel pode variar. Por
exemplo, se estamos alinhando sequncias de um organismo que apresenta grande nmero
de sequncias depositadas no banco, como humanos, camundongo, mosca-da-fruta ou arroz,
esperamos encontrar E value baixos, prximo a zero. J no caso de buscarmos sequncias, obtidas
a partir de um organismo que no possui muitas sequncias no banco, em geral iremos encontrar
sequncias de outros organismos que apresentam similaridade, mas no so idnticas. Portanto,
nesse caso, esperamos E value mais alto (1e-10, por exemplo).
9. Na seo Alignments, possvel ver os alinhamentos propriamente ditos.
Dica: para acessar as sequncias encontradas (para copi-las e arquiv-las em formato
FASTA, por exemplo), basta clicar no nmero de acesso das mesmas nesta seo. Uma nova janela/
aba ser aberta, mostrando a sequncia e todas as informaes associadas a ela.
Dica 2: observar no cabealho de cada alinhamento qual a fase de leitura da sequncia de
interesse, a qual foi alinhada com a sequncia de protena do banco, em Frame. Valores +1, +2 e
+3 indicam fases de leitura da fita senso; -1, -2 e -3 indicam fases de leitura da fita antissenso.
Busca por similaridade em banco de dados de nucleotdeos traduzidos para protena utilizando
sequncia de protena como query tBLASTn (protena X nucleotdeos traduzidos):
O tBLASTn utilizando quando se quer encontrar sequncias de nucleotdeo em um banco
de dados que apresentem similaridade com uma sequncia de interesse de protena. Para isso, o
BLAST traduz todas as sequncias de nucleotdeos do banco nas seis fases de leitura possveis (trs
da fita senso, e trs da fita antissenso), gerando seis sequncias de protenas para cada uma, que so
ento comparadas com a sequncia de interesse de protena.
1. Acessar o site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. No canto direito da pgina, encontrar e
clicar na opo BLAST.
2. Na pgina seguinte, clique na opo tblastn, na seo Basic BLAST.
3. Na caixa Enter query sequence, cole a sequncia de protena que deseja alinhar com o
banco de dados.
4. No menu Database, selecione o conjunto de dados contra o qual a sequncia de interesse
ser alinhada. Caso queira buscar em todo o banco de dados do GenBank, selecione Nucleotide
collection.
5. Na caixa Organism, possvel restringir as buscas para apenas aquelas que so derivadas
de um organismos especfico. Tambm possvel excluir apenas essa espcie, clicando no boto
Exclude, assim como adicionar mais organismos para restringir ou excluir os mesmos das buscas
(boto +).
6. Clique em BLAST. O resultado pode demorar alguns minutos.
7. Analisar os resultados. Na seo Graphic Summary, possvel ver uma representao
grfica dos resultados. O tamanho das barras coloridas indica a extenso do alinhamento da
sequncia de interesse (query) com diferentes sequncias do banco de dados. J as cores indicam o
quo similares elas so. Arrastando o mouse por cima das barras, a caixa acima da representao
grfica mostrar o nome da sequncia com a qual a sequncia query apresenta similaridade.
8. Na seo Descriptions, so mostradas as sequncias que apresentam similaridade, e os
dados que quantificam essa similaridade. Dentre eles, importante observar os seguintes: Query
coverage (indica qual porcentagem da sequncia de interesse coberta pelo alinhamento com
cada sequncia do banco lembre-se que, por se tratar de um alinhamento local, muitas vezes
apenas uma regio de ambas as sequncias sero alinhadas); E value (indica a probabilidade
de encontrar aquele alinhamento de maneira aleatria ou seja, quanto menor o valor, maior
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a confiana, sendo o E value = 0 o mais confivel); e Identity (indica quantos amino cidos
idnticos so encontrados apenas na regio que foi alinhada).
Dica: dependendo do tipo de alinhamento feito, um E value aceitvel pode variar. Por
exemplo, se estamos alinhando sequncias de um organismo que apresenta grande nmero
de sequncias depositadas no banco, como humanos, camundongo, mosca-da-fruta ou arroz,
esperamos encontrar E value baixos, prximo a zero. J no caso de buscarmos sequncias obtidas
a partir de um organismo que no possui muitas sequncias no banco, em geral iremos encontrar
sequncias de outros organismos que apresentam similaridade, mas no so idnticas. Portanto,
nesse caso, esperamos E value mais alto (1e-10, por exemplo).
9. Na seo Alignments, possvel ver os alinhamentos propriamente ditos.
Dica: para acessar as sequncias encontradas (para copi-las e arquiv-las em formato
FASTA, por exemplo), basta clicar no nmero de acesso das mesmas nesta seo. Uma nova janela/
aba ser aberta, mostrando a sequncia e todas as informaes associadas a ela.
Dica 2: observar no cabealho de cada alinhamento qual a fase de leitura da sequncia do
banco, a qual foi alinhada com a sequncia de interesse, em Frame. Valores +1, +2 e +3 indicam
fases de leitura da fita senso; -1, -2 e -3 indicam fases de leitura da fita anti-senso.
Busca por similaridade em banco de dados de nucleotdeos traduzidos para protena utilizando
sequncia de nucleotdeos traduzidos para protena como query tBLASTx (nucleotdeos
traduzidos X nucleotdeos traduzidos):
O tBLASTx utilizando quando se quer comparar sequncias de nucleotdeos com o banco
de nucleotdeos, porm, tanto o banco de dados quanto a sequncia de interesse so traduzidos
em todas as seis fases de leitura possveis. Trata-se do modo mais abrangente de procurar por
sequncias similares, porm, o que mais consome tempo de computao. Para isso, o BLAST traduz
todas as sequncias de nucleotdeos do banco nas seis fases de leitura possveis (trs da fita senso, e
trs da fita antissenso), gerando seis sequncias de protenas para cada, que so ento comparadas
com as seis sequncias geradas da mesma forma para a sequncia de interesse de protena.
1. Acessar o site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. No canto direito da pgina, encontrar e
clicar na opo BLAST.
2. Na pgina seguinte, clique na opo tblastx, na seo Basic BLAST.
3. Na caixa Enter query sequence, cole a sequncia de protena que deseja alinhar com o
banco de dados.
4. No menu Database, selecione o conjunto de dados contra o qual a sequncia de interesse
ser alinhada. Caso queira buscar em todo o banco de dados do GenBank, selecione Nucleotide
collection.
5. Na caixa Organism, possvel restringir as buscas para apenas aquelas que so derivadas
de um organismos especfico. Tambm possvel excluir apenas essa espcie, clicando no boto
Exclude, assim como adicionar mais organismos para restringir ou excluir os mesmos das buscas
(boto +).
6. Clique em BLAST. O resultado pode demorar alguns minutos.
7. Analisar os resultados. Na seo Graphic Summary, possvel ver uma representao
grfica dos resultados. O tamanho das barras coloridas indica a extenso do alinhamento da
sequncia de interesse (query) com diferentes sequncias do banco de dados. J as cores indicam o
quo similares elas so. Arrastando o mouse por cima das barras, a caixa acima da representao
grfica mostrar o nome da sequncia com a qual a sequncia query apresenta similaridade.
8. Na seo Descriptions, so mostradas as sequncias que apresentam similaridade, e os
dados que quantificam essa similaridade. Dentre eles, importante observar os seguintes: Query
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coverage (indica qual porcentagem da sequncia de interesse coberta pelo alinhamento com
cada sequncia do banco lembre-se que, por se tratar de um alinhamento local, muitas vezes
apenas uma regio de ambas as sequncias sero alinhadas); E value (indica a probabilidade
de encontrar aquele alinhamento de maneira aleatria ou seja, quanto menor o valor, maior
a confiana, sendo o E value = 0 o mais confivel); e Identity (indica quantos amino cidos
idnticos so encontrados apenas na regio que foi alinhada).
Dica: dependendo do tipo de alinhamento feito, um E value aceitvel pode variar. Por
exemplo, se estamos alinhando sequncias de um organismo que apresenta grande nmero
de sequncias depositadas no banco, como humanos, camundongo, mosca-da-fruta ou arroz,
esperamos encontrar E value baixos, prximo a zero. J no caso de buscarmos sequncias obtidas
a partir de um organismo que no possui muitas sequncias no banco, em geral iremos encontrar
sequncias de outros organismos que apresentam similaridade, mas no so idnticas. Portanto,
nesse caso, esperamos E value mais alto (1e-10, por exemplo).
9. Na seo Alignments, possvel ver os alinhamentos propriamente ditos.
Dica: para acessar as sequncias encontradas (para copi-las e arquiv-las em formato
FASTA, por exemplo), basta clicar no nmero de acesso das mesmas nesta seo. Uma nova janela/
aba ser aberta, mostrando a sequncia e todas as informaes associadas a ela.
Dica 2: observar no cabealho de cada alinhamento qual a fase de leitura da sequncia do
banco a qual foi alinhada com a sequncia de interesse, em Frame. Valores +1, +2 e +3 indicam
fases de leitura da fita senso; -1, -2 e -3 indicam fases de leitura da fita anti-senso. Um segundo valor
indica tambm a fase de leitura da sequncia de interesse que foi usada no alinhamento.
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Dica: um dos parmetros do resultado que interessante ser alterado a caixa Do not show
non-aligned blocks. Ao clic-la, o alinhamento mostrar tambm as regies que no foram alinhadas
entre as sequncias utilizadas.
Dica 2: para decidir qual a melhor maneira de visualizar um resultado em particular,
importante testar e conhecer as opes de output. Teste diferentes combinaes.
6. Analisar o resultado. Verificar a seo Aligned sequences, que mostra quais sequncias
foram alinhadas, cada uma identificada de maneira independente e mostrando o tamanho da
mesmas (em pares de bases ou nmero de amino cidos). As identificaes so derivadas do
identificador do formato FASTA.
7. Observar o alinhamento propriamente dito, na seo Alignment. Na seo seguinte,
Pairwise similarities, as sequncias so comparadas uma a uma, mostrando valores de similaridade
e identidade.
Dica: similaridade e identidade so dois termos utilizados para expressar o quanto duas
sequncias so parecidas. Em se tratando de sequncias de DNA, os termos so usados de maneira
equivalente. J para alinhamentos entre sequncias de amino cidos, o termo identidade se refere
ao nmero de resduos iguais entre as duas sequncias; j o termo similaridade se refere tambm
aos resduos idnticos, mas inclui ainda as posies do alinhamento as quais, embora contenham
amino cidos diferentes, estes apresentam a mesma caracterstica de polaridade da cadeia lateral.
Portanto, a similaridade entre duas sequncias sempre maior ou igual identidade.
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# by prior
FGF1_HUMAN
FGF4_HUMAN
ATRX_HUMAN
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CAPTULO 12
CRIAO E APLICAO DE CAROS PARA
CONTROLE BIOLGICO
Guilherme Liberato da Silva, Matheus dos Santos Rocha, Noeli Juarez Ferla
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CAPTULO 13
CLULAS FNGICAS: PRODUO, CONTAGEM
E VIABILIDADE APLICADAS AO CONTROLE
BIOLGICO
Luclia Santi, Markus Berger Oliveira, Walter Orlando Beys da Silva
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2. Fazer o inculo estriado do fungo utilizando uma ala de platina, preenchendo toda a
3. Manter as placas em estufa 28oC ou a temperatura desejada at a total esporulao.
4. As placas podem ser utilizadas para a suspenso de esporos, conforme ser visto a seguir.
Meio BDA
300 g
10 g
18 g
1L
*ferver a batata com um pouco de gua destilada em micro-ondas (10 minutos). Filtrar a gua do cozimento,
para ser usada no meio, e adicionar os outros ingredientes. Ajustar o volume para 1 L. Esterilizar por
autoclavagem (15 minutos 121oC).
Referncias
FRAZZON, A. P.; SILVA, Vaz Junior da; MASUDA,A.;SCHRANK, A; VAIINSTEIN, MH.: In vitro assessment
ofMetarhiziumanisopliae isolates to control the cattle tick Boophilus microplus. Veterinary Parasitology. 94(1-2): 117-125.
2000.
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3. Manter os sacos de arroz em estufa por 28oC por 14 dias. Dependendo do fungo, este
tempo pode ser menor ou maior e render mais ou menos condios.
Dica: semanalmente, observar os sacos inoculados e agitar manualmente o arroz para
disperso dos esporos e melhora no rendimento.
4. Aps esporulao do fungo de forma satisfatria, misturar manualmente o arroz para
melhorar a liberao dos condios. Pode-se utilizar uma esptula estril para misturar o arroz.
5. Colocar o arroz em uma peneira e esfregar com uma esptula estril para liberao dos
esporos.
Dica: preparar um becker grande estril e colocar sob a peneira para coleta dos esporos. Por
ser muito leve, a formao de poeira de esporos fcil; portanto, o ato de peneirar deve ser feito
cuidadosamente para evitar a perda de material.
6. Estes esporos podem ser utilizados de duas formas:
6.1. secos: devem ser armazenados em falcons de 50 mL na geladeira, mantendo uma
viabilidade alta por normalmente at 1 ms (dependendo do fungo ou isolado).
6.2. em suspenso: utilizando uma soluo de Tween 80 0,01%, somente gua ou outra
formulao especfica. Podem ser armazenados na geladeira e mantm, normalmente, alta
viabilidade por at 1 semana, dependendo do fungo ou isolado.
Dica: o preparo da suspenso pode ser feita diretamente a partir do esporo produzido em
placa ou nos sacos de arroz adicionando a gua ou soluo sem a peneiragem dos esporos.
Dica: sempre antes de utilizar os esporos, independente se forem secos ou em suspenso,
deve-se testar sua esterilidade por meio de cultura por 16 horas em meio Luria-Bertani (LB).
Meio LB (Luria-Bertani)
10 g
5g
10 g
1L
Peptona
Extrato de levedura
NaCl
H2O destilada
Referncias:
BEYS DA SILVA, W.O., SANTI, L., BERGER M., PINTO, A.F.M., GUIMARES, J.A., SCHRANK, A., VAINSTEIN,
M.H.: Characterization of a spore surface lipase from the biocontrol agent Metarhizium anisopliae. Process
Biochemistry, 44: 829834. 2009.
SANTI, L.; SILVA, L.A.D.; BEYS DA SILVA, W.O.; CORREA, A.P.F.; RANGEL, D.E.N.; CARLINI, C.R.; SCHRANK,
A.; VAINSTEIN, M.H.: Virulence of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae using soybean oil
formulation for control of the cotton stainer bug, Dysdercus peruvianus. World Journal of Microbiology and
Biotechnology 27:22972303. 2011.
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Tween 80
H2O destilada
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CAPTULO 14
MODELOS BIOLGICOS PR-CLNICOS PARA
AVALIAO DA ATIVIDADE DE SUBSTNCIAS
FARMACOLOGICAMENTE ATIVAS
Jorge Almeida Guimares, Luclia Santi, Markus Berger Oliveira, Walter Orlando Beys da Silva
Os modelos biolgicos tm papel fundamental, tanto na etapa de pesquisa bsica quanto nas
etapas de desenvolvimento pr-clinico, para novos medicamentos e substncias farmacologicamente
ativas. Nesses casos, modelos que utilizam organismos vivos para mimetizar uma determinada
fisiopatologia so imprescindveis para o seguimento de uma srie de etapas, entre elas: A seleo
do alvo molecular; o desenvolvimento de ensaios farmacolgicos especficos que permitam aferir
a atividade sobre o alvo selecionado; o desenho molecular racional de ligantes para o alvo eleito;
testes de segurana e eficcia; e ensaios de toxicologia. Neste captulo, apresentaremos alguns
protocolos de modelos biolgicos in vivo clssicos teis tanto para o estudo do mecanismo de ao
de novas substncias e/ ou extratos quanto para a investigao da fisiopatologia de doenas. nfase
ser dada aos modelos de doenas tromboemblicas e inflamatrias.
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Procedimentos
1. Pesar o animal;
2. Preparar na mesma seringa e administrar por via intraperitoneal (i.p.) a mistura de
Xilazina (10 mg/kg) + Ketamina (75 mg/kg). Esta dose mantm um bom plano anestsico por 3045 minutos. Aps este tempo, suplementar com 1/3 da dose de Ketamina;
3. Dispor o animal na mesa cirrgica em decbito dorsal, prendendo patas e cabea;
4. Realizar a tricotomia de toda a regio abdominal e antissepsia com algodo embebido em
lcool iodado 1%;
5. Proceder a inciso do abdome, afastar a parede antero-lateral com as pinas hemostticas e
rebater o intestino grosso para o lado direto do animal, a fim de expor a veia cava inferior. Manter
a regio do intestino permanentemente hidratada com gaze embebida em PBS (37 C) durante todo
o procedimento;
6. Localizar a veia cava inferior prximo s veias renais e, com o auxlio das pinas retas
e dente-de-rato, dissec-la cuidadosamente at a regio de confluncia das veias ilacas comuns,
isolando-a do tecido conjuntivo adjacente e da aorta abdominal;
7. Com o auxlio da pina simples curva, passar os fios de nylon 4-0 pelas tributrias de
maior calibre e pela veia renal esquerda deixando ns frouxos, sem que haja obstruo do fluxo
sanguneo, para posterior ligadura;
8. Com o auxlio da pina simples curva passar um fio de nylon 4-0 na extremidade cranial
(ou superior da veia cava), imediatamente abaixo da veia renal direita, e outro fio na extremidade
caudal (ou inferior da veia cava) prximo regio de confluncia das veias ilacas comuns. Manter
os ns frouxos, sem que haja obstruo do fluxo sanguneo, para posterior ligadura;
9. Administrar a substncia a ser testada ou PBS (no caso dos animais do grupo controle)
por via intravenosa, diretamente na veia cava inferior prximo s ilacas. O volume mximo a ser
injetado deve ser de 0,5 mL diludos em PBS (37 C);
10. Cronometrar 5 minutos;
11. Administrar a soluo de tromboplastina (3 mg/kg em volume mximo de 0,5 mL)
diretamente na veia cava inferior prximo s ilacas e ligar a extremidade cranial (logo abaixo da
veia renal direita);
12. Cronometrar 20 minutos;
13. Ligar os demais pontos, incluindo a veia renal esquerda, as tributrias de maior calibre e
a extremidade caudal da veia cava inferior;
14. Dissecar cuidadosamente o segmento da veia cava ligado contendo o trombo. Comear
a disseco pela extremidade superior e, aps retir-lo completamente, lavar o segmento com PBS
(37 C);
15. Cortar um dos ns do segmento extrado e retirar o trombo formado;
16. Lavar o trombo com PBS 37 C, secar em papel filtro e pesar o trombo mido em balana
analtica;
17. Manter o trombo em estufa 60 C por 1 hora;
18. Pesar o trombo seco em balana analtica.
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Procedimentos
1. Pesar o animal;
2. Preparar na mesma seringa e administrar por via intraperitoneal (i.p.) a mistura de
Xilazina (10 mg/kg) + Ketamina (75 mg/kg). Esta dose mantm um bom plano anestsico por 3045 minutos. Aps este tempo, suplementar com 1/3 da dose de Ketamina;
3. Dispor o animal na mesa cirrgica aquecida 37 C em decbito dorsal, prendendo patas e
cabea (importante manter a temperatura de 37-38 C durante todo o procedimento);
4. Realizar a tricotomia de toda a regio abdominal e antissepsia com algodo embebido em
lcool iodado 1%;
5. Proceder a inciso do abdome (inciso de aproximadamente 2 cm), afastar a parede anterolateral com as pinas hemostticas e rebater o intestino grosso para o lado direto do animal, a fim
de expor a veia cava inferior. Manter a regio do intestino permanentemente hidratada com gaze
embebida em PBS (37 C) durante todo o procedimento;
6. Localizar a veia cava inferior prximo s veias renais e com o auxlio das pinas retas e
dente-de-rato dissec-la cuidadosamente somente na regio entre as veias renais esquerda e direita,
isolando-a do tecido conjuntivo adjacente e da aorta abdominal.
Dica: esta etapa deve ser realizada com cuidado especial no caso de camundongos devido
fragilidade dos tecidos. Recomenda-se o uso de uma lupa cirrgica para facilitar a visualizao das
estruturas e evitar leso na cava e aorta;
7. Com o auxlio da pina simples curva passar os fios de nylon 4-0 e imediatamente ligar
as tributrias de maior calibre e outros pequenos vasos que so ramificaes da cava inferior
principalmente no segmento entre as veias renais e a bifurcao da veia ilaca;
8. Com o auxlio da pina simples curva passar um fio de nylon 4-0 e imediatamente ligar a
veia cava inferior logo abaixo das veias renais;
9. Cuidadosamente acondicionar novamente o intestino na cavidade abdominal e suturar em
dois planos (parede abdominal e pele);
10. Administrar lidocana 4 mg/kg (0,4 mL/kg de uma soluo 1 %) diretamente no local
da sutura;
11. Manter os animais na manta de aquecimento 37 C at a completa recuperao da
anestesia;
12. Aps diferentes tempos da induo da estase (aps a ligao da veia cava) os animais so
novamente anestesiados seguindo o esquema acima e uma nova inciso na parede abdominal
realizada;
14. Dissecar cuidadosamente o segmento da veia cava ligado contendo o trombo (abaixo
das veias renais). Comear a disseco pela extremidade superior e, aps retir-lo completamente,
lavar o segmento com PBS (37 C);
15. Cortar o n do segmento extrado e retirar o trombo formado;
16. Lavar o trombo com PBS 37 C, secar em papel filtro e pesar o trombo mido em balana
analtica;
17. Manter o trombo em estufa 60 C por 1 hora;
18. Pesar o trombo seco em balana analtica.
Dicas: 1. Usando este modelo, a substncia a ser testada pode ser administrada como prtratamento (antes da induo da estase) ou ps-tratamento (aps a induo da estase) por via oral,
intraperitoneal, subcutnea ou intravenosa. Se a via de escolha for a intravenosa, recomenda-se
administrar pela veia caudal;
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2. O trombo pode ser retirado em diferentes tempos aps a induo da estase variando de 24
horas at 21 dias dependendo do tipo de substncia a ser testada. Normalmente a massa do trombo
aumenta com o tempo entre o primeiro e o quarto dia devido ao intenso processo inflamatrio e
ativao da coagulao e, posteriormente, diminui a partir do quarto dia dependendo da resoluo
do processo inflamatrio e ativao da fibrinlise.
Anlise dos Resultados
Os resultados so expressos pela razo entre a massa do trombo seco e a massa do animal
(geralmente mg de trombo/g de rato) e representados em um grfico versus a dose da substncia
testada. No caso de uma substncia antitrombtica, antiplaquetria ou de um inibidor da coagulao
espera-se que essa razo diminua conforme h um aumento de dose. Um nmero de 8-10 animais
por grupo a ser testado recomendado para garantir a reprodutibilidade dos resultados.
Alm da massa do trombo outros parmetros podem ser analisados como contagem de clulas
inflamatrias na parede do vaso, histologia, quantificao da deposio de protenas e fibrose na
parede do vaso, morfologia e morfometria do cogulo, anlise da expresso de genes de interesse
nas clulas vasculares, e ensaios de atividade enzimtica no plasma.
Referncias
Diaz JA, Ballard-Lipka NE, Farris DM, Hawley AE, Wrobleski SK, Myers DD, Henke PK, Lawrence DA, Wakefield
TW. Impaired fibrinolytic system in ApoE gene-deleted mice with hyperlipidemia augments deep vein thrombosis. J
Vasc Surg. 2012;55(3):815-22.
Shuster KA, Wrobleski SK, Hawley AE, Lucchesi BR, Sorenson DR, Bergin IL, Sigler RE, Guire KE, Nowland MH,
Wakefield TW, Myers DD Jr. Prothrombotic effects of thrombolytic therapy in a rat (Rattus norvegicus) model of
venous thrombolysis. Comp Med. 2013; 63(3):244-51.
Wrobleski SK, Farris DM, Diaz JA, Myers DD Jr, Wakefield TW. Mouse complete stasis model of inferior vena cava
thrombosis. J Vis Exp. 2011; 15;(52).
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- Material cirrgico (pina simples reta, pina dente-de-rato, pinas hemostticas e tesoura
- Lmina de ao para realizar tricotomia ou raspador eltrico;
- Cateter intravascular perifrico (20 G) ou cnula PE-50 conectada a uma seringa de 1 mL;
- Pina histolgica (ponta fina);
- Pipeta automtica;
- PBS;
- Heparina (20 UI/mL);
- Hidrxido de Alumnio;
- Isoflurano;
Pentobarbital sdico;
Ovalbumina.
Procedimentos
1. Anestesiar os animais levemente com isoflurano e realizar a 1 imunizao (dia zero) pela
injeo subcutnea (s.c.) de uma suspenso contendo 4 g de ovalbumina e 1,6 mg de hidrxido de
alumnio em PBS (volume mximo de 0,2 mL). Os animais controle devem ser injetados com PBS
(0,2 mL) por via s.c.;
2. No 7 dia aps a 1 imunizao (dia zero), realizar a 2 imunizao seguindo o mesmo
esquema anterior;
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5. Aps 24 h do 2 desafio sacrificar os animais pela injeo i.p de pentobarbital sdico (50
mg/kg);
6. Dispor o animal na mesa cirrgica em decbito dorsal, prendendo patas e cabea;
7. Proceder a tricotomia da regio do pescoo e trax, realizar uma inciso na regio do
pescoo (1 cm abaixo do focinho) e expor a traqueia. Dissecar cuidadosamente a regio da traqueia
separando-a do tecido conjuntivo subjacente, glndulas e msculo;
8. Aps a completa disseco e exposio da traqueia, inserir a pina histolgica na regio
abaixo da traqueia no sentido do lado esquerdo para o direito do animal, a fim de dar suporte para
a insero do cateter;
9. Introduzir o cateter intravascular 20 G ou a cnula PE-50 na poro superior da traqueia.
Se for utilizado o cateter, retirar a agulha e, em seguida, retirar tambm a pina histolgica abaixo
da traqueia;
10. Realizar a lavagem bronco-alveolar. Para isso, conectar uma seringa de insulina (1 mL)
no cateter ou cnula e injetar de 0,3 - 0,4 mL de heparina (20 UI/mL) diluda em PBS. O lquido
injetado deve ser coletado novamente e o procedimento deve ser repetido por mais duas vezes
totalizando um volume coletado de lavado bronco-alveolar de 1 mL.
Dica: trocar a seringa a cada grupo experimental e manter o lavado coletado no gelo;
11. Aps a coleta do lavado bronco-alveolar, dissecar a regio dos pulmes, remov-los e
lav-los com PBS. Parte do tecido pulmonar deve ser congelado imediatamente em nitrognio
lquido e reservado para posterior anlise de mediadores inflamatrios. Outra parte do tecido deve
ser armazenada em formaldedo tamponado 10 % para anlise histolgica.
Anlise dos Resultados
Neste protocolo, os resultados podem ser expressos de uma srie de maneiras diferentes
dependendo do direcionamento das anlises. Normalmente, o grau de inflamao pulmonar
determinado pela contagem total e diferencial de clulas inflamatrias presentes no lavado
bronco-alveolar. A anlise dessas clulas tambm pode ser feita diretamente no tecido pulmonar
por histologia. Alm disso, citocinas, quimiocinas, xido ntrico e a atividade de algumas enzimas
podem ser dosadas tanto no lavado bronco-alveolar quanto no tecido pulmonar.
Referncias:
RUSSO M, NAHORI MA, LEFORT J, GOMES E, DE CASTRO KELLER A, RODRIGUEZ D, RIBEIRO OG,
ADRIOUCH S, GALLOIS V, DE FARIA AM, VARGAFTIG BB. Suppression of asthma-like responses in different
mouse strains by oral tolerance. Am J Respir Cell Mol Biol. 2001;24(5):518-26.
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- Material cirrgico (pina simples reta, pina dente-de-rato, pinas hemostticas e tesoura
- Lmina de ao para realizar tricotomia ou raspador eltrico;
- PBS;
- Azul de Evans (C34H24N6Na4O14S4);
- Bradicinina;
- Histamina;
- Formamida;
- Estufa 40 C;
- Xilazina e Ketamina;
Procedimentos
1. Preparar na mesma seringa e administrar por via intraperitoneal (i.p.) a mistura de
Xilazina (10 mg/kg) + Ketamina (75 mg/kg). Esta dose mantm um bom plano anestsico por 3045 minutos. Aps este tempo, suplementar com 1/3 da dose de Ketamina;
2. Dispor o animal na mesa cirrgica em decbito ventral, prendendo patas e cabea;
3. Injetar por via intravenosa na veia caudal 50 mg/kg de Azul de Evans diludo em PBS
(volume mximo de 0,5 mL);
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- Material cirrgico (pina simples reta, pina dente-de-rato, pinas hemostticas e tesoura
- Cnula de gavagem para ratos;
- Fita para medio de pH;
- Lmina de ao para realizar tricotomia ou raspador eltrico;
- PBS;
- Etanol 80 %;
- HCl 5 %;
- Pantoprazol;
- Pentobarbital sdico;
Procedimentos
caixa;
2. Vinte e quatro horas antes da realizao do experimento, retirar a rao dos animais,
mantendo-os em jejum de alimentos slidos com acesso somente gua;
3. Com o auxlio da cnula de gavagem, injetar nos animais por via oral a substncia a ser
testada ou o controle positivo - pantoprazol 40 mg/kg;
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- Material cirrgico (pina simples reta, pina dente-de-rato, pinas hemostticas e tesoura
- Lmina de ao para realizar tricotomia ou raspador eltrico;
- Balana analtica;
- PBS;
- Dextran sulfato de sdio (DSS);
- Pentobarbital sdico;
Procedimentos
caixa;
zero).
4. No dia 6 de induo da colite, administrar o tratamento com a substncia a ser testada pela
via de escolha.
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Dica: o esquema de tratamento com a substncia-teste pode variar de acordo com o caso. Aqui
sugerimos um ps-tratamento de dose nica. No entanto, podem ser administradas doses seguidas
a partir do 6 dia at o fim do experimento. Alternativamente, pode-se optar por um esquema de
pr-tratamento administrando a substncia-teste dias antes da induo da colite com DSS;
5. No dia 8, interromper o tratamento com DSS, substituindo-o por gua;
6. No dia 10 sacrificar os animais pela injeo i.p de pentobarbital sdico (50 mg/kg);
7. Dispor o animal na mesa cirrgica em decbito dorsal, prendendo patas e cabea;
8. Realizar a tricotomia da regio abdominal;
9. Realizar uma inciso na regio mediana do abdome (5-6 cm), dissecar e remover o clon
desde o cecum at o reto (para retirar o reto sem romp-lo, necessrio cortar o osso que o protege
na poro final do clon).
Dica: adicionalmente, o bao, linfonodos, mesentrio e sangue podem ser coletados para
anlises posteriores;
10. As fezes presentes nos clons removidos devem ser retiradas, as estruturas lavadas com
PBS e o excesso de tecido conjuntivo adjacente tambm deve ser removido;
11. Pesar os clons limpos, medir o comprimento de cada estrutura e avaliar os danos
macroscpicos, dando ateno particular presena de hiperemia, leses hemorrgicas, lceras e
espessamento ou estreitamento da parede do clon.
Dica: a severidade do dano ao clon pode ser avaliada pela atribuio de um score de dano
que varia de acordo com o grau da leso (exemplos de grade de avaliao de danos podem ser
encontradas em Morris et al., 1989 ou McCafferty et al., 1999).
12. Congelar imediatamente parte do tecido de cada clon em nitrognio lquido para anlise
posterior de citocinas, quimiocinas e outros marcadores moleculares de leso. Outra parte dos
tecidos deve ser reservada em formaldedo tamponado 10 % para anlise histolgica.
Anlise dos Resultados
Neste protocolo, os resultados podem ser expressos de uma srie de maneiras diferentes,
dependendo do direcionamento das anlises. Normalmente, o grau de inflamao colnica e
gravidade da doena desenvolvida determinado pela avaliao do estado geral dos animais, perda
de peso, ndice de mortalidade, scores macroscpicos de leso no clon e alteraes histolgicas
associadas inflamao. Alm disso, citocinas, quimiocinas, xido ntrico e a atividade de algumas
enzimas podem ser dosadas no tecido colnico.
Referncias:
BENTO AF, LEITE DF, MARCON R, CLAUDINO RF, DUTRA RC, COLA M, MARTINI AC, CALIXTO JB. Evaluation
of chemical mediators and cellular response during acute and chronic gut inflammatory response induced by dextran
sodium sulfate in mice. Biochem Pharmacol. 2012 Dec 1;84(11):1459-69.
MCCAFFERTY DM, MIAMPAMBA M, SIHOTA E, SHARKEY KA, KUBES P. Role of inducible nitric oxide synthase
in trinitrobenzene sulphonic acid induced colitis in mice. Gut 1999;45(6):864-73.
MORRIS GP, BECK PL, HERRIDGE MS, DEPEW WT, SZEWCZUK MR, WALLACE JL. Hapten-induced model of
chronic inflammation and ulceration in the rat colon. Gastroenterology 1989;96(3):795-803.
YOSHIDA H, RUSSELL J, GRANGER DN. Thrombin mediates the extraintestinal thrombosis associated with
experimental colitis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2008; 295(5):G904-8.
YOSHIDA H, RUSSELL J, SENCHENKOVA EY, ALMEIDA PAULA LD, GRANGER DN. Interleukin-1beta mediates
the extra-intestinal thrombosis associated with experimental colitis. Am J Pathol. 2010;177(6):2774-81.
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CAPTULO 15
QUANTIFICAO E ANLISE DE ATIVIDADE
ENZIMTICA
Jorge Almeida Guimares, Luclia Santi, Markus Berger Oliveira, Walter Orlando Beys da Silva
Enzimas so protenas com atividade cataltica, ou seja, capazes de catalisar uma reao
qumica. As enzimas possuem a capacidade de converter uma substncia (substrato) em outra
(produto). Muitas enzimas so consideradas extremamente especficas, sendo capazes de agir sobre
um nico tipo de substrato. Para se quantificar uma determinada enzima. necessrio utilizar o
substrato especfico para esta. Para dosagem da atividade enzimtica, os mtodos mais amplamente
aplicados baseiam-se, principalmente, na liberao de cor (colorimtrico), de fluorescncia
(fluorescente) ou de luz (quimioluminescente) aps a converso do substrato em produto. A seguir,
veremos alguns protocolos para a quantificao de atividades enzimticas comuns presentes em
amostras biolgicas diversas.
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grupamento azo um dos ensaios para dosagem de atividade proteoltica mais aplicados e pode
ser realizado com outras protenas ao invs de casena, como colgeno e queratina, por exemplo.
Referncias:
Sangorrn, M.P.; Folco, E.J.; Martone, C.M.; Snchez, J.J 2001. Purification and characterization of a proteinase inhibitor
from white croaker skeletal muscle (Micropogon opercularis). International Journal of Biochemistry and Cell Biology
33:691-699.
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p-nitroanilina
p-nitroanilina
[p-nitroanilina] final
(L)
100
97
95
90
80
70
60
50
--
(L)
-3
5
10
20
30
40
50
100
(nmol/ poo)
0
0,36
0,72
1,44
2,88
4,32
5,76
7,2
14,4
(M)
0
4,2
7,2
14,0
28,0
42,0
56,0
70,0
140,0
Poo
1A
1B
1C
1D
1E
1F
1G
1H
2A
Dica: cada ponto da curva deve ser pipetado em triplicata na placa. O volume final de cada
poo deve ser de 100 L.
1.3. Medir a absorbncia em espectrofotmetro de microplacas 405 nm;
1.4. Construir um grfico de regresso linear simples colocando os valores das mdias
aritmticas das leituras de cada ponto nas ordenadas (eixo y) e os valores de quantidade de
p-nitroanilina (nmol/poo) ou a concentrao de p-nitroanilina (M) nas abscissas (eixo x);
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295
1.5. Obter a equao da reta na forma de: y = ax + b. Reservar a equao para calcular os
valores de atividade enzimtica posteriormente.
Dica: para a curva ser considerada satistafria, o valor de R deve ser maior ou igual a 0,95.
Ensaio de Atividade Enzimtica da Tripsina
1.6. Preparar uma soluo estoque de 5 mg/mL de tripsina.
Dica: dissolver a tripsina em tampo Tris-HCl 20 mM, pH 7,4, aliquotar em tubos de 1 ou 0,5
mL e manter congelado -20 C;
1.7. Preparar uma soluo de trabalho de tripsina na concentrao de 0,1 mg/mL.
Dica: diluir a partir da soluo estoque usando o tampo Tris-HCl 20 mM, pH 7,4 e aliquotar
em tubos de 1 ou 0,5 mL. At o momento do ensaio manter no gelo (4 C). Aps o ensaio manter
congelado -20 C;
1.8. Preparar 10 mL de uma soluo do substrato BAPNA (Hidrocloreto de N-Benzoil-DLarginina-4-nitroanilida) 10 mM.
Dica: Dissolver o BAPNA em uma soluo contento 9 partes de DMSO para 1 parte de gua
miliQ. Aliquotar o substrato em tubos de 0,5 mL e manter congelado -20 C;
1.9. Pipetar os reagentes na microplaca de 96 poos de fundo chato, conforme o esquema
sugerido na tabela 2:
Tabela 2: Protocolo do ensaio de tripsina
Poo
Identificao da
amostra
L
--Xa
1A
1B
1C
g/poo
--Xa
Tripsina
Substrato
Tampo (L)
90
80
Xa
As quantidades e o nmero de amostras a serem testadas devem ser definidas previamente e dependem de
cada experimento.
*
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0,028
Ou seja, considerando esse exemplo hipottico, a quantidade de p-nitroanilina liberada pela
tripsina por poo (volume de 100 L) foi de 1,036 nmols. Agora esse valor pode ser convertido e
expresso em unidades de atividade enzimtica (nmol de produto formado/minuto/ mL):
1,036 nmol = 0,52 nmols/min/mL
0,1*20
Este valor significa que a tripsina presente no poo foi capaz de gerar 0,52 nmols de
p-nitroanilina por minuto e por mL de reao.
2. Anlise dos Resultados
2.1. Aps realizados todos os clculos conforme indicado acima, os resultados so expressos
pelos valores de atividade enzimtica residual. Ou seja, pela quantidade de p-nitroanilina gerada
por unidade de tempo e por volume de reao. Na presena de um inibidor de serino-proteinases,
a quantidade de p-nitroanilina diminui e, consequentemente, diminui a atividade enzimtica
residual.
Referncias
BATISTA IF, OLIVA ML, ARAUJO MS, SAMPAIO MU, RICHARDSON M, FRITZ H, SAMPAIO CA. Primary
structure of a Kunitz-type trypsin inhibitor from Enterolobium contortisiliquum seeds. Phytochemistry 1996;41(4):101722.
OLIVA ML, MENDES CR, JULIANO MA, CHAGAS JR, ROSA JC, GREENE LJ, SAMPAIO MU, SAMPAIO CA.
Characterization of a tissue kallikrein inhibitor isolated from Bauhinia bauhinioides seeds: inhibition of the hydrolysis of
kininogen related substrates. Immunopharmacology 1999;45(1-3):163-9.
SANTI L, BEYS DA SILVA WO, BERGER M, GUIMARES JA, SCHRANK A, VAINSTEIN MH. Conidial surface
proteins of Metarhizium anisopliae: Source of activities related with toxic effects, host penetration and pathogenesis.
Toxicon 2010, 1;55(4):874-80.
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Poo
1A
1B
L
---
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g/poo
---
Trombina
Substrato
Tampo (L)
90
80
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1C
Xa
Xa
Xa
10
0,2
10
As quantidades e o nmero de amostras a serem testadas devem ser definidas previamente e dependem de
cada experimento.
*
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4:
1A
1B
1C
Identificao da amostra
L
--Xa
g/poo
--Xa
Trombina
Substrato
(0,02 mg/mL)
L
g/poo
--10
0,2
10
0,2
(Fibrinognio 5 mg/mL, L)
Tampo (L)
60
50
Xa
40
40
40
As quantidades e o nmero de amostras a serem testadas devem ser definidas previamente, e dependem de
cada experimento.
*
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1. Procedimento
Preparo das solues
1.1. Preparar uma soluo tampo de Tris-HCl 0,05 M, pH 8,0. Para tanto, dissolver 0,605 g
de Tris em 80 mL de gua destilada, ajustar o pH com HCl 5 M e completar o volume para 100 mL
com gua destilada;
1.2. Preparar uma soluo de HCl 5M pela adio lenta de 41,8 mL de HCl P.A. (cido
clordrico fumegante) em 58,2 mL de gua destilada;
1.3. Preparar uma soluo de fenolftalena 1 %, dissolvendo 1 g de fenolftalena em 60 mL de
etanol e completando o volume com gua destilada at 100 mL;
1.4. Preparar uma soluo de hidrxido de sdio 0,05 M (NaOH). Para tanto, dissolver 0,2 g
de NaOH em gua destilada e completar o volume para 100mL;
1.5. Preparar uma soluo de lcool polivinlico 2%, pela dissoluo de 2 g de lcool
polivinlico em 100 mL de gua destilada;
1.6. Preparar uma mistura de 50 mL de etanol + 50 mL de acetona, homogeinizar e manter a
temperatura ambiente (soluo de parada da titulao).
Mtodo do ensaio
1.7. Em um erlenmeyer de 250 mL, adicionar 2,5 mL de tampo TRIS-HCl 0,05M pH 8,0, 1
mL de triolena (pode ser usado leo de oliva) e 2 mL de lcool polivinlico 2 %;
1.8. Incubar em agitador orbital (shaker) 37 oC, 150 rpm por 1 min para atingir o equilbrio
trmico.
Dica: a amostra tambm deve estar no equilbrio trmico antes de ser adicionada ao sistema
de reao;
1.9. Adicionar 1 mL da amostra a ser testada.
Dica: para o frasco a ser lido como branco, adiciona-se 1 mL de gua ou tampo TRIS-HCl
0,05 M, pH 8,0 ao invs da amostra;
1.10. Incubar por 30 minutos, 150 rpm 37oC;
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cido graxo
pNPP p-Nitrofenol
1. Procedimento
Preparo das solues
1.1. Preparar uma soluo tampo de TRIS-HCl 0,05 M, pH 8,0, pela dissoluo de 0,605 g de
TRIS em 80 mL de gua destilada. Ajustar o pH com HCl 5 M e completar o volume para 100 mL
com gua destilada;
1.2. Soluo 1: Preparar uma soluo a 3 mg/mL do substrato NPP. Dissolver o pNPP em
isopropanol, incubar 37oC at a completa dissoluo, antes do uso, e estocar -20oC. Estabilidade
no freezer: de 1 ms ou at 2 incubaes 37oC
1.3. Soluo 2: Em 450 mL de Tris-HCl 0,05 M, pH 8,0 adicionar 0,5 g de goma arbica e 2 g de
Triton X-100. Dissolver e estocar na geladeira. Estabilidade: de 3 semanas.
1.4. Emulso: Equilibrar as solues 1 e 2 em banho-maria 37oC por cerca de 10 minutos,
gotejar vagarosamente a soluo 1 na Soluo 2 sob forte agitao, na proporo de 1:9 (a cada 9 mL
da Soluo 2 adicionar 1 mL da Soluo 1).
Dicas: utilizar um agitador magntico para preparar a emulso. Esta emulso deve ser
preparada sempre no momento do ensaio, no podendo ser armazenada para uso posterior.
Curva Padro de p-Nitrofenol
mM.
Dica: Preparar a soluo de p-nitrofenol no tampo Tris-HCl 0,05 M, pH 8,0 porque a cor
somente gerada em pH alcalino. Para facilitar a dissoluo pode-se adicionar um pouco de etanol
absoluto, mas sem exceder o volume final. As diluies devem ser feitas diretamente no tampo
Tris-HCl 0,05 M, pH 8,0;
1.6. Pipetar a soluo de p-nitrofenol e tampo em uma microplaca de 96 poos de fundo
chato, conforme as quantidades indicadas na tabela 5.
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304
(L)
(L)
(nmol/ poo)
100
97
95
90
80
70
60
50
--
-3
5
10
20
30
40
50
100
0
0,36
0,72
1,44
2,88
4,32
5,76
7,2
14,4
[p-nitrofenol]
final
(M)
0
4,2
7,2
14,0
28,0
42,0
56,0
70,0
140,0
Dica: Cada ponto da curva deve ser pipetado em triplicata na placa. O volume final
cada poo deve ser de 100 L.
de
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SUMRIO
305
Dica: existem outros substratos do tipo p-nitrofenil-steres que podem ser utilizados
praticamente da mesma maneira. O substrato sinttico para lipase mais utilizado o p-nitrofenilpalmitato.
Referncias:
SILVA WOB, MITIDIERI S, SCHRANK A, VAINSTEIN MH. (2005). Production and extraction of an extracellular
lipase from the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae. Process Biochemistry 40: 321326.
BEYS DA SILVA, W. O., SANTI, L., BERGER, M., PINTO, A.F.M., GUIMARES, J.A., SCHRANK, A., VAINSTEIN,
M.H. (2009) Characterization of a spore surface lipase from the biocontrol agent Metarhizium anisopliae. Process
Biochemistry 44: 829834.
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306
Soluo de glicose
1%
(L)
0
20
40
60
80
100
120
140
Volume de
gua
(L)
300
280
260
240
220
200
180
160
Conc. final de
glicose
(mol)
0
1,112
2,224
3,336
4,448
5,560
6,672
7,784
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307
AR * 10 * fd
30
Onde AR = concentrao de acares redutores na amostra (mmol), determinada por meio
da curva de calibrao de glicose.
fd = fator de diluio da amostra, quando houver.
Uma unidade de Atividade Amiloltica definida como a quantidade de enzima que libera 1
mmol de acares redutores por mL de amostra por minuto, sob condies padres aqui descritas.
Referncias:
MILLER, G.L. Use of dinitosalicylic acid reagent for the determination of reducing sugar. Analytical Chemistry. v.31,
p. 426-428, 1959.
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Tampo citrato
(mL)
0.5
0.45
0.4
0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
Glicose
(mg/mL)
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
Glicose
(mol)
0
1.38
2.77
4.16
5.49
6.86
8.23
9.6
10.97
12.34
13.71
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309
1.10. Colocar os dados em uma curva de quantidade de glicose (mmol) X absorbncia. Utilizar
o primeiro ponto como zero.
Dicas: a concentrao de acares redutores ser expressa em mmol de glicose. A faixa de
concentrao da curva de calibrao poder variar para se ajustar as concentraes encontradas nas
amostras analisadas.
Ensaio de Atividade Celulsica
1.11. Utilizando tubos de ensaio de 25 mL, adicionar 1 mL de tampo citrato, 0,5 mL da
amostra a ser testada e uma tira de papel Whatman n.1 (1 x 6 cm).
Dicas: preparar tambm dois tubos adicionais: Tubo B1 (branco da amostra) - adicionar 1 mL
de tampo citrato + 0,5 mL de amostra. Tubo B2 (branco total) - adicionar 1,5 mL de tampo citrato
+ uma tira de papel Whatman n.1 (1 x 6 cm)
1.12. Incubar os tubos 50 C por 1 hora;
1.13. Adicionar 3 mL da soluo de DNS, ferver por 5 minutos, adicionar 20 mL de gua
destilada e homogeneizar;
1.14. Resfriar em temperatura ambiente e determinar a absorbncia em espectrofotmetro a
540 nm;
1.15. Determinar a concentrao de glicose liberada utilizando a curva de calibrao de
glicose.
Dica: Se necessrio, realizar diluio da amostra em tampo citrato.
2. Anlise dos Resultados
2.1. Com o auxlio da curva padro (equao da reta do tipo y = Ax + b), determinar a
quantidade (mmol) de glicose liberada na presena das amostras;
2.2. Converter a quantidade de glicose calculada anteriormente em atividade celulsica,
usando a frmula abaixo. Clculo do resultado:
Atividade celulsica (U= mol.mL-1.min-1)
AR*2*fd
60
Onde: AR = concentrao de acares redutores (glicose) na amostra (mmol), determinada
atravs da curva de calibrao de glicose.
fd = fator de diluio, quando houver
Uma unidade (U) de atividade celulsica foi definida como 1 mol de glicose liberada por
mL por min, sendo expressa em FPU (filter paper unit ou unidade de papel filtro).
Referncias:
GHOSE, 1987. Measurement of cellulase activities. IUPAC - Pure and Applied Chemistry, 59: 257-268
Biotecnologia
SUMRIO
310
CAPTULO 16
DETECO DE ATIVIDADE ENZIMTICA ATRAVS
DE GIS DE ATIVIDADE/ZIMOGRAMAS
Jorge Almeida Guimares, Luclia Santi, Markus Berger Oliveira, Walter Orlando Beys da Silva
Biotecnologia
SUMRIO
311
3,05 mL
2,5 mL
100 L
100 L
4,2 mL
5 L
50 L
Stacking 4%
H2O destilada
0,5M tris HCl pH 6,8
SDS 10%
Acrilamida/bis-acrilamida (30/0,8%)
TEMED
Persulfato de amnio (APS) 10%
3,05 mL
1,25 mL
50 L
660 L
5 L
25 L
2. Preparao da amostra:
2.1 O volume de amostra a ser carregado no gel de aproximadamente 20L, sendo 10 L de
amostra e 10 L de tampo de amostra.
2.2 Manter os eppendorfs 100oC por 3 minutos (ou 95oC por 10 minutos)
2.3 Deixar esfriar a temperatura ambiente
2.4 Centrifugar as amostras por 3 minutos a 12.000 rpm
2.5 Aplicar no gel
3. Separao da amostra (eletroforese)
3.1 Idem ao gel SDS-PAGE
3.2 O gel dever ser migrado a uma voltagem de 150 volts (por aproximadamente 1 hora e 30
minutos 2 horas).
Biotecnologia
SUMRIO
312
Tampo de amostra
H2O destilada
0,5M tris HCl pH 6,8
SDS 10%
Glicerol
Azul de bromofenol
1%
3,8 mL
1 mL
1,6 mL
0,8 mL
0,4 mL
4. Deteco de quitinases
4.1 Aps a eletroforese, remover o gel da cuba e acondicionar em um recipiente
4.2 Incubar o gel com 100 mL tampo acetato 100mM pH 5,3 com Triton X-100 1% (1 mL/99
mL tampo acetato) por 20 horas 30oC, com agitao.
4.3 Corar o gel com soluo de calcofluor White M2R 0,01% em 0,5M tris-HCl pH 8,9 por 10
minutos.
4.4 Descorar com gua destilada (3 x 10 minutos) e avaliar se necessita mais
4.5 Visualizar em aparelho com luz ultravioleta (UV)
Tampo acetato 100 mM pH 5.3
0,2 M cido actico
0,2 M acetato de sdio
H2O destilada q.s.p.
8,8 mL
41,2 mL
50 mL
1,15 mL
10 mL
Biotecnologia
SUMRIO
313
5.8 Ressuspender o sedimento em 1 volume de gua destilada e estocar -20oC. Esta uma
soluo estoque de 1%.
Referncias:
ST LEGER, R.J.; STAPLES, R.C.; ROBERTS, D.W. 1993. Entomopathogenic Isolates of Metarhizium anisopliae, Beauveria
bassiana, and Aspergillus flavus Produce Multiple Extracellular Chitinase Isozymes. Journal of Invertebrate Pathology
61:81-84.
TRUDEL, J.; ASSELIN, A. 1989. Detection of chitinase activity after polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical
Biochemistry 178:362-366. Trudel, J.; Asselin, A. 1989. Detection of chitinase activity after polyacrylamide gel
electrophoresis. Analytical Biochemistry 178:362-366.
Biotecnologia
SUMRIO
314
2,35 mL
2,5 mL
100 L
1 mL
4 mL
5 L
50 L
Stacking 4%
H2O destilada
0,5M tris HCl pH 6,8
SDS 10%
Acrilamida / bis-acrilamida (30/0,8%)
TEMED
Persulfato de amnio (APS) 10%
3,05 mL
1,25 mL
50 L
660 L
5 L
25 L
2. Preparao da amostra:
2.1 O volume de amostra a ser carregado no gel de aproximadamente 20 L, sendo 10 L
de amostra e 10 L de tampo de amostra.
2.2 Manter os eppendorfs 100oC por 3 minutos (ou 95oC por 10 minutos)
2.3 Deixar esfriar a temperatura ambiente
2.4 Centrifugar as amostras por 3 minutos a 12.000 rpm
2.5 Aplicar no gel
2.6 Separao da amostra (eletroforese)
2.7 Idem ao gel SDS-PAGE
2.8 O gel dever ser corrido a uma voltagem de 150 volts por aproximadamente 2 horas.
Biotecnologia
SUMRIO
315
Tampo de amostra
H2O destilada
0,5M tris HCl pH 6,8
SDS 10%
Glicerol
Azul de bromofenol
1%
3,8 mL
1 mL
1,6 mL
0,8 mL
0,4 mL
15 g
72 g
5g
1L
*diluir para 1X na hora do uso com gua destilada. Manter na geladeira. Pode ser utilizado at 4 vezes.
3. Deteco de proteases
3.1 Aps a eletroforese, remover o gel da cuba e acondicionar em um recipiente.
3.2 Incubar o gel com 100 mL tampo tris 50 mM pH 8,0 com Triton X-100 2,5% (2,5 mL/97,5
mL tampo tris) por 16 horas a 37oC, com agitao.
3.3 Corar o gel com soluo de comassie R250 0.1% em 50% metanol.
Dica: abrir o metanol em capela de exausto.
Referncias:
ST LEGER, R.J.; STAPLES, R.C.; ROBERTS, D.W. 1993. Entomopathogenic Isolates of Metarhizium anisopliae, Beauveria
bassiana, and Aspergillus flavus Produce Multiple Extracellular Chitinase Isozymes. Journal of Invertebrate Pathology
61:81-84.
Biotecnologia
SUMRIO
316
4 mL
2,5 mL
3,35 mL
5 L
50 L
Stacking 4%
H2O destilada
0,5 M tris HCl pH 6,8
Acrilamida / bis-acrilamida (30/0,8%)
TEMED
Persulfato de amnio (APS) 10%
3,1 mL
1,25 mL
660 L
5 L
25 L
2. Preparao da amostra:
2.1 O volume de amostra a ser carregado no gel de aproximadamente 20 L, sendo 10 L
de amostra e 10 L de tampo de amostra.
2.2 No ferver as amostras. Preparar em eppendorfs e aplicar diretamente no gel.
2.3 Separao da amostra (eletroforese):
2.4 Idem ao gel SDS-PAGE.
2.5 O gel dever ser corrido a uma voltagem de 150 volts at chegar ao final.
3. Deteco de lipases/esterases:
3.1 Aps a eletroforese, remover o gel da cuba e acondicionar em um recipiente.
3.2 Incubar o gel com 100 mL tampo tris 50 mM pH 8,0 com Triton X-100 2% (2 mL/98 mL
tampo tris) e 10 M metilumbeliferil (MUF)-butirato por 15 minutos 37oC.
3.3 Visualizar as bandas de atividade em luz ultravioleta (UV)
Dica 1: a fluorescncia emitida no definitiva e vai perdendo a intensidade com o passar do
tempo, portanto o registro das bandas de atividade deve ser realizado rapidamente.
Dica 2: o substrato empregado, MUF-butirato, contem uma cadeia de cido graxo de 4
carbonos, por isso, este substrato pode ser alvo tanto de esterases (que atuam sobre substratos com
cadeia de at 10 carbonos) quanto de lipases (que atuam sobre substratos com cadeia de cido
graxo maior ou menor de 10 carbonos).
Biotecnologia
SUMRIO
317
Tampo de amostra
H2O destilada
0,5 M tris HCl pH 6,8
Glicerol
Azul de bromofenol 1%
3,8 mL
1 mL
0,8 mL
0,4 mL
Tampo de corrida 1X
Tris
Glicina
H2O destilada q.s.p.
1,8 g
8,64 g
1L
Referncia:
TEO, J.W.P.; ZHANG, L-H.; POH, C.L. 2003. Cloning and characterization of a novel lipase fromVibrio harveyistrain
AP6. Gene 312:181-188.
Biotecnologia
SUMRIO
318
Stacking 4%
3,1 mL
0,5M tris HCl pH 6,8
1,25 mL
Acrilamida / bis-acrilamida (30/0,8%) 660 L
TEMED
5 L
Persulfato de amnio (APS) 10%
25 L
H2O destilada
2. Preparao da amostra:
2.1 O volume de amostra a ser carregado no gel de aproximadamente 20 L, sendo 10 L
de amostra e 10 L de tampo de amostra.
2.2 No ferver as amostras. Preparar em eppendorfs e aplicar diretamente no gel.
2.3 Separao das amostras:
2.4 O gel dever ser corrido a uma voltagem de 70 a 80 volts por 16 horas na geladeira.
2.5 Deteco de catalases:
2.6 Aps eletroforese, remover o gel da cuba e colocar em um recipiente limpo.
2.7 Incubar o gel com 100 mL de 0.01% perxido de hidrognio (H2O2) por 5 minutos (33 L
soluo a 30% em 100 mL de gua destilada).
2.8 Revelar com 1% cloreto de ferro (FeCl2) + 1% ferricianida de potssio (K3Fe(CN)6) por 5
minutos.
2.9 Lavar com gua e observar as bandas.
Tampo de amostra
H2O destilada
3,8 mL
1 mL
0,8 mL
0,4 mL
Tampo de corrida 1X
Tris
Glicina
H2O destilada q.s.p.
Biotecnologia
1,8 g
8,64 g
1L
SUMRIO
319
Referncia:
ZIMMERMANN, P.; HEINLEIN, C.; ORENDI, G.; ZENTGRAF, U. 2006. Senescence-specic regulation of catalases in
Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. Plant Cell and Environment, 29:1049-1060.
Biotecnologia
SUMRIO
320
5,6 mL
3 mL
3,4 mL
5 L
50 L
Stacking 4%
H2O destilada
0,5 M Tris HCl pH 6,8
Acrilamida / bis-acrilamida (30/0,8%)
TEMED
Persulfato de amnio (APS) 10%
1,5 mL
750 L
750 L
5 L
25 L
2. Preparao da amostra:
2.1 O volume de amostra a ser carregado no gel de aproximadamente 20 L, sendo 10 L
de amostra e 10 L de tampo de amostra.
2.2 No ferver as amostras. Preparar em eppendorfs e aplicar diretamente no gel.
Dica: para cada amostra, deve-se preparar trs eppendorfs. Cada uma ser tratada de forma
diferente, para avaliar o tipo de SOD presente na amostra.
Tampo de amostra
H2O destilada
0,5 M Tris HCl pH 6,8
Glicerol
Azul de bromofenol 1%
3,8 mL
1 mL
0,8 mL
0,4 mL
Tampo de corrida 1X
Tris
Glicina
H2O destilada q.s.p.
1,8 g
8,64 g
1L
Biotecnologia
SUMRIO
321
3.2 Cortar o gel, separando cada amostra, e colocar cada uma das tiras em placas de petri
para colorao ou revelao.
3.3 Uma das fatias do gel dever ser tratada anteriormente colorao:
Para Fe-SOD antes de corar o gel, tratar por 1h com a seguinte soluo:
gua oxigenada 33% (H2O2)
230 L
20 mM
200 L
1 mM
20 L
50 mM
100 mL
3.4 Todas as fatias de gel devero passar pelo processo de colorao e revelao com as
seguintes solues:
4. Soluo de colorao SODs
Nitroblue tetrazolium (NBT) 2,45 mM
5 mg
50 mL
4.1 Para CuZn-SOD adicionar 10mM cianeto de potssio (KCN) na soluo reveladora:
Dica: preparar a soluo de revelao e dividir em dois frascos. Em 50 mL adicionar KCN
(0,037 g) para a identificao de CuZn-SOD.
5. Soluo de revelao*
Fosfato de potssio monobsico (K2HPO4)
0,627 g
3 L
0,325 mL
100 mL
5.1 Aps o tratamento com soluo de colorao e revelao, expor o gel luz branca forte
at surgirem as bandas.
- Para Mn-SOD esta enzima no inibida.
Biotecnologia
SUMRIO
322
Apndice:
Exemplos de colorao e deteco de gis de protena
1 2 3 4 5
Referncias:
SANTI L, BEYS DA SILVA WO, BERGER M, GUIMARES JA, SCHRANK A, VAINSTEIN MH. Conidial surface
proteins of Metarhizium anisopliae: Source of activities related with toxic effects, host penetration and pathogenesis.
Toxicon 2010, 1;55(4):874-80.
Biotecnologia
SUMRIO
323
CAPTULO 17
GERENCIAMENTO DE RESDUOS EM
LABORATRIOS DE BIOTECNOLOGIA
Ctia Viviane Gonalves
Biotecnologia
SUMRIO
324
Biotecnologia
SUMRIO
325
Referncias:
KAUFMAN, J. A. Waste Disposal in Academic Institutions. Chelsea: Lewis Publishers, 1990.
LUNN, G.; SANSONE, E. B. Ethidium Bromide: destruction and decontamination of solutions. Analytical
Biochemistry, London, 162: 453-458, 1987.
Biotecnologia
SUMRIO
326
17.2 ACRILAMIDA
Eliminao de Resduos
Para grandes volumes, encaminhar para ser queimado em um incinerador qumico com ps
queimador e lavador de gases. Quando em pequenas quantidades e em soluo, a acrilamida pode
ser hidrolisada, neutralizada e descartada.
Tcnica para Descontaminao de Acrilamida em soluo
Precaues:
1. Usar culos, luvas nitrlicas e vesturio de proteo.
2. Trabalhar em capela de exausto (h liberao de amnia).
Procedimento:
1. Em um bquer de 1000 L, acrescentar 500 mL da soluo contendo acrilamida e hidrolizar
com NaOH.
2. Neutralizar a soluo (obter pH entre 5-7).
3. Deixar a soluo em repouso por 1 hora e, aps ser diluda no mesmo volume de gua,
pode ser descartada sem causar danos ao ambiente.
Referncias:
ARMOUR, M.A. Hazardous Laboratory Chemicals Disposal Guide. Lewis Publishers. 3a ed., 2003.
Biotecnologia
SUMRIO
327
17.3 FENOL
Eliminao de Resduos
Quando em embalagem fechada, colocar todo o material em um recipiente rotulado e
separado para eliminao por incinerao. Quando em pequenas quantidades, o fenol pode ser
degradado atravs da reao de Fenton.
Tcnica para Descontaminao de Fenol
Precaues:
1. Usar culos, luvas butlicas e vesturio de proteo.
2. Trabalhar em capela de exausto.
Procedimento:
1. Em um balo de fundo redondo de 300 mL de trs bocas - equipado com um agitador,
um funil de adio, e termmetro preparar uma soluo de 4,7 g (0,05 mol) de fenol em 75 mL de
gua destilada.
2. Dissolver 2,35 g de sulfato ferroso heptahidratado (0,0085 mol) na mistura.
3. Ajustar o pH para 5-6 com cido sulfrico diludo.
4. Adicionar, lentamente, perxido de hidrognio (41 mL, 0,4 mol) gota a gota. A agitao
deve ocorrer durante a adio e mantida por 1 hora.
CUIDADO: A ordem importante se o H2O2 e o FESO4 forem pr-misturados ocorre uma
exploso violenta.
4. Manter a temperatura entre 50-60oC, ajustando a velocidade de adio ou utilizando banho
de gelo. Manter a agitao por mais 2 horas at a temperatura cair para 25oC.
5. Deixar a soluo em repouso por 12 horas e ento, pode ser descartado sem causar danos
ao ambiente.
Referncias:
ARMOUR, M.A. Hazardous Laboratory Chemicals Disposal Guide. Lewis Publishers. 3a ed., 2003.
Biotecnologia
SUMRIO
328