Evaluacin de la capacidad de distintas preparaciones de

inducir inflamacin y del Zymosn de activar el sistema

complemento.
Acua, Mayra; Amarelle, Juliana; Casas, Luca; Espino, Vernica.

Grupo gama, Ctedra de Inmunologa, Departamento de Biociencias, Facultad de Qumica, Universidad de

la Repblica, Montevideo, Uruguay.

Resumen
Se propone mediante este trabajo evaluar la capacidad de distintas preparaciones de inducir una
respuesta inflamatoria y estudiar en particular la capacidad del adyuvante Zymosn de activar el sistema
del complemento. En la determinacin de la inflamacin se utiliz como parmetro el nmero de clulas
presentes en la cavidad peritoneal de los ratones, luego que los mismos fueran inoculados con las
distintas preparaciones de potenciales adyuvantes. Se realiz un recuento celular en cmara de Neubauer
y por Citometra de flujo, obteniendo tambin por este ltimo mtodo el porcentaje de granulocitos.
Los resultados obtenidos muestran que, de las preparaciones ensayadas, el Adyuvante completo de
Freund, la Almina Hidratada y el Zymosn, son capaces de inducir una respuesta inflamatoria, dado que
se verific un aumento de las poblaciones de granulocitos.
Para la determinacin de la capacidad de activar el complemento del Zymosn se llevaron a cabo varios
ensayos teniendo en cuenta los requisitos de Mg2+ y Ca2+ de las distintas vas de activacin del
complemento y los componentes C4 y C3 del Complemento. Como fuente de complemento se utiliz
suero humano normal. De esta manera se pudo constatar que el Zymosn es capaz de activar el sistema
del complemento mediante la va alternativa y mediante la via clsica y/o de las lectinas.
PALABRAS CLAVES: Inflamacin; Adyuvante; Zymosn; Sistema complemento; Citometra de flujo;
Cmara de Neubauer

Introduccin

Las clulas del sistema inmunitario innato

desempean un papel esencial en la iniciacin y
posterior
direccin
de
las
respuestas
inmunitarias adaptativas, a la vez que eliminan
los agentes patgenos diana de la respuesta
inmunitaria adaptativa. Adems, dado que existe

un retraso de 4 a 7 das antes de que la

respuesta inmunitaria adaptativa sea ejecutada,
la respuesta inmunitaria innata desempea una
funcin crucial para controlar la infeccin
durante dicho perodo.[1]
Por todo esto en los ltimos aos se ha
presenciado un gran aumento en el inters
acerca del sistema inmune innato.

La manipulacin dirigida de la inmunidad innata

tiene un enorme potencial para el desarrollo de
nuevas vacunas y terapias innovadoras para el
tratamiento de enfermedades como infecciones,
cncer, alergias, autoinmunidad y enfermedades
autoinflamatorias.[2]
Las
nuevas
vacunas,
para
reducir
la
reactogenicidad, poseen una composicin ms
definida asociada a una menor inmunogenicidad
comparada con las vacunas anteriores basadas
en virus o clulas completas. Por lo tanto los
adyuvantes,
usualmente
definidos
como
compuestos que pueden aumentar y/o modular
la inmunogenicidad intrnseca de un antgeno,
ayudan a inducir una respuesta inmune potente
y persistente. [3]
Por otro lado, el sistema complemento consiste
de aproximadamente 30 protenas solubles y de
membrana, constitutivamente expresadas y
ampliamente distribuidas en los tejidos. Algunos
de los componentes de membrana celular son
receptores para productos del complemento. A
su vez muchos de sus componentes son
proenzimas que circulan en la sangre y estn
presentes en el lquido intersticial en forma
inactiva. Cuando estas proenzimas entran en
contacto con un agente patgeno se activan y
desencadenan una serie de reacciones en forma
de cascada que se conocen con el nombre de
vas de activacin del complemento.
La activacin del componente central del
complemento, el C3, puede ocurrir por tres vas
diferentes: la va clsica, la va de las lectinas y
la va alternativa. Todas ellas llevan a la muerte
directa del patgeno por formacin del MAC
(membrane attack complex), o al marcado del
patgeno con ligandos (C3b, iC3b, y C3d) para
receptores del sistema celular inmune innato
(CD35, CD21, CR3, etc.) o a una serie de
respuestas celulares y humorales de la
inmunidad adaptativa[4]
En particular las convertasas de C3 necesitan de
la disponibilidad de Mg2+ en el medio para su
formacin, y adicionalmente las vas clsica y de
las
lectinas
dependen
tambin
de
la
disponibilidad de Ca2+ para su activacin; en la
va de las lectinas es necesario para la asociacin
de MBL (Mannose Binding Lectin) con sus
blancos, mientras que en la va clsica es
necesario para el ensamblaje del componente
C1(para la interaccin entre C1q, C1r y C1s). Los

requerimientos de estos cationes son utilizados

para controlar experimentalmente la activacin
de las diferentes vas del complemento: en
presencia de un quelante muy eficiente de Ca 2+
y Mg2+ como el etiln-diamino-tetraacetato
(EDTA) se bloquea la activacin por cualquiera
de las vas, mientras que en presencia de un
quelante con muy alta afinidad por Ca 2+ pero no
por Mg2+ como el EGTA (etiln-glicoltetraacetato) se logra inhibir la activacin de las
vas clsica y de las lectinas pero no de la va
alternativa. [5]
El objetivo de este trabajo es medir la actividad
pro inflamatoria de diferentes preparaciones as
como proponer cul de ellas podra ser utilizada
como adyuvante. Definiremos inflamacin como
el reclutamiento de clulas no linfoides en la
cavidad peritoneal de ratones inmunizados 24
horas antes. Los resultados se analizaran de
forma cualitativa y semicuantitativa.
Por otro lado, se analiz la capacidad del
Zymosn de activar al sistema complemento y
las vas de activacin involucradas.
En ambas experiencias las preparaciones se
analizaron mediante citometria de flujo. Tambin
se llev a cabo un recuento celular en cmara de
Neubauer para las muestras obtenidas de la
cavidad peritoneal.[6]
La evaluacin estadstica de los datos se realiz
mediante el Test de U de Wilcoxon, Mann
Whitney, que es la contraparte no paramtrica
del test de t para la comparacin de las medias
de
dos
distribuciones
continuas
(test
paramtricos). Examina la hiptesis alternativa:
la probabilidad que una observacin obtenida al
azar de la primera poblacin supera a una
observacin aleatoria de la segunda poblacin,
es distinta de la media. El mismo, es sensible
frente a diferencias de medianas, algo menos
sensible frente a las diferencias de asimetra, e
insensible frente a las diferencias de varianzas.
Para calcular el estadstico de U se ordenan los
(m+n) valores de las muestras en una nica
serie, por orden creciente, y se les asigna
rangos; cada nmero de rango llevara asimismo
una indicacin que exprese de cul de las dos
muestras procede el valor correspondiente. Sea
R1 la suma de todos los rangos de valores de la
muestra 1, y sea R2 la suma de todos los rangos
de valores de la muestra 2, se calcula entonces
los valores de U1 y U2.

U1= m.n + [m(m+1)]/2-R1

U2=m.n + [n(n+1)]/2-R2
El estadstico buscado U es entonces el mnimo
entre U1 y U2. Se rechazara la hiptesis nula
cuando el valor de U as obtenido sea igual o
menor que el valor crtico de tabla.[7]
Al existir desviaciones
normalidad se prefiere el
realidad compara ms bien
de t. Exactamente lo que
funciones de distribucin.

apreciables de la
test de U (que en
las medianas) al test
se compara son las

Objetivos
Estudiar la capacidad de diferentes
preparaciones de inducir localmente una
respuesta inflamatoria con la finalidad de
proponer cules son potencialmente tiles como
adyuvantes.
Estudiar la capacidad del Zymosn de
activar al sistema complemento y analizar la(s)
va(s) de activacin involucrada(s).
Materiales y Mtodos
A) Evaluacin

de la capacidad de
varias preparaciones de promover
la inflamacin.

Materiales

Reactivos

Se utilizaron las siguientes preparaciones:

Albmina de suero bovino (BSA, Sigma)
en buffer fosfato salino, pH 7.2 (PBS).
suspensin de un extracto de paredes de
levaduras (Zymosn A, Sigma) en PBS.
gel de hidrxido de aluminio (almina
hidratada, Sigma).
suspensin de un lisado bacteriano en
aceites minerales (adyuvante completo de
Freund, ACF, sigma).

Animales de experimentacin.

Ratones Balb/c (cepa endogmica), criados en el

Laboratorio Veterinario Miguel Rubino (Dilave) y
mantenidos en el bioterio de la Ctedra de
Inmunologa (Instituto de Higiene).
Mtodos

Administracin de las preparaciones a

los ratones.

Los animales son previamente individualizados,

por tincin de su cola con colorantes. Al iniciar el
experimento se inoculan en la cavidad peritoneal
100 l de cada preparacin segn:
Lote 1 (n=3): buffer fosfato salino (PBS) pH 7.2
Lote 2 (n=3): BSA 6 mg/ml en PBS
Lote 3 (n=3): Zymosn 6 mg/ml en PBS
Lote 4 (n=3): almina hidratada 13 mg/ml en
PBS
Lote 5 (n=3): emulsin de ACF en PBS (v/v)

Lavado Peritoneal.

Los ratones se sacrifican por sobredosis del

anestesia. Antes de realizar el lavado, se
descubre la cavidad peritoneal; para ello, se
efecta un corte a lo largo del abdomen del
ratn y se despega suavemente la piel. El lavado
se realiza inyectando en la cavidad peritoneal 5
ml de PBS (tambin se puede utilizar medio de
cultivo celular como DMEM o RPMI) conteniendo
suero bovino fetal al 2 %, fro. El volumen de
lquido inyectado produce una gran hinchazn en
la cavidad abdominal. Luego de masajear el
abdomen durante unos minutos, se retira con
cuidado el lquido (en general, se recuperan
entre 3 y 3.5 ml) y se lo vierte en un tubo en
fro. Homogeneizar la suspensin de clulas y
colocar una alcuota de 1 ml en un tubo para
citometra de flujo.

Caracterizacin por citometra de flujo

Los lavados peritoneales obtenidos se analizaron

por citometra de flujo, y en base a la
caracterizacin celular previamente realizada por
los docentes de la Ctedra se obtuvieron datos
de:
los nmeros de clulas totales (eventos
totales) registrados en un tiempo fijo (1 minuto)
y velocidad de flujo fija (media). El citmetro de
flujo no es un instrumento diseado para
cuantificar el nmero de clulas en una
preparacin, pero el registro del total de clulas

(eventos) que atraviesan el haz de luz en un

tiempo fijo puede tomarse como un indicador de
la cantidad de clulas en la suspensin. Un dato
aproximado de la concentracin puede obtenerse
conociendo que el volumen de muestra
analizado por el citmetro durante 1 min,
utilizando una velocidad de flujo media, es de 35
l 5 l (notar que el error en este volumen es
del 14%)
el nmero total de clulas en las
regiones R1, R2 y R3*
el porcentaje que representan las clulas
en R1 y R2 del total de clulas de la muestra
(R3).

Recuento
Neubauer

celular

en

cmara

de

Materiales

Reactivos.

VBS-Ca/Mg (suero fisiolgico tamponado

a pH 7.4 con veronal/veronal sdico,
conteniendo Ca2+ 0.15 mM y Mg2+ 0.5 mM)
Suspensiones de Zym A (Sigma) 1
mg/ml y 0,5 mg/ml en tampones VBS-Ca/Mg,
VBS-EDTA (VBS conteniendo EDTA 20 mM) y
VBS-EGTA/Mg (VBS conteniendo EGTA 8 mM,
Mg2+ 2 mM)
Suero humano normal (SHN, conservado
en alcuotas a -70C)
Suero humano normal previamente
adsorbido por Zym (conservado en alcuotas a 70C)

La concentracin de clulas en los lavados

peritoneales fue medido utilizando una cmara
calibrada conocida como cmara de Neubauer.
Se trata de un portaobjetos con una depresin
en el centro, en cuyo fondo se ha marcado con
la ayuda de un diamante una cuadrcula de
dimensiones conocidas. Cuando se coloca un
cubreobjetos sobre esta zona, se forma un
espacio de volumen conocido (0.1 mm3 = 0.1
l). Para determinar la concentracin de una
suspensin de clulas, se coloca la muestra en
este espacio (por ejemplo 10 l) y se cuentan
observando al microscopio ptico la cantidad de
clulas presentes en los cuatro campos ubicados
en las esquinas de la cuadrcula. La
concentracin de clulas en la muestra se
calcula como:

Anticuerpos anti-C3 humano, anti-C4

humano y anti-Ig humanas totales conjugados a
FITC.

cl/ml = promedio del nmero de clulas por

campo x factor de dilucin x 104

200 L de Zym en VBS-Ca/Mg + 200 L

de SHN 1:2 en VBS-Ca/Mg (Activacin de todas
las vas)

A partir de los valores de concentracin y

volumen obtenido de las muestras se calcul el
nmero total de clulas recuperadas de la
cavidad peritoneal de cada animal. Se
observaron los valores obtenidos entre los
animales de un mismo grupo; se calcul el valor
medio para cada lote de animales y el rango de
variacin.

B)

Estudio de la interaccin entre

el
Zymosn
y
el
sistema
complemento

R3 = R1+R2

Mtodos

Estudio de la activacin de las diferentes

vas del complemento por Zymosn.

Incubacin del Zymosn con suero.

Las suspensiones de Zym (1 y 0,5 mg/ml) se
incuban con SHN durante 40 min a 37C. La
incubacin se realiza a una dilucin final 1:4 del
SHN en el tampn adecuado segn la va del
complemento que se pretenda estudiar. Para
ello, se combinan volmenes iguales de la
suspensin de Zym con una dilucin 1:2 del SHN
segn se indica:

200 L de Zym en VBS-EDTA + 200 L

de SHN 1:2 en VBS-EDTA (Inhibicin de todas
las vas)
200 L de Zym en VBS-EGTA/Mg + 200
L de SHN 1:2 en VBS-EGTA/Mg (Activacin slo
de la VA)
Se homogeneiz la suspensin de Zymsan
antes de tomar el volumen necesario para la
incubacin.
Al cabo de 40 min, se centrifug la suspensin,
se descart cuidadosamente el sobrenadante y
se lavaron las partculas de Zym con PBS
conteniendo 0.05% de Tween 20 (PBS-T). Se

realizaron 3 lavados con 1 ml de PBS-T cada vez,

resuspendiendo las partculas en el lquido de
lavado,
centrifugando
y
retirando
cuidadosamente el PBS-T.

Incubacin del Zymosn con anticuerpos anti-C3

humano, anti-C4 humano.
La capacidad del Zym de activar al sistema
complemento se verifica analizando la presencia
de las molculas C3 y C4 sobre las partculas
previamente incubadas con SHN. Para ello, se
incubaron las partculas obtenidas en la
incubacin del Zym con suero durante una hora
a 37C con 100 L de una
solucin de
anticuerpos de cabra anti-C3 humano (dilucin
1:200 en PBS-T) o anti-C4 humano (dilucin
1:200 en PBS-T) conjugados a FITC. Luego de la
incubacin, se lavaron las partculas como se
explic
anteriormente.
Finalmente,
se
resuspendieron en 500 l de PBS, se colocaron
en un tubo para citometra y se mantuvieron a
4C y protegidas de la luz hasta su anlisis por
citometra de flujo.

Anlisis de la unin de C3 y C4 a Zymosn por

citometra de flujo.
Las suspensiones obtenidas en la incubacin del
Zymosn con anticuerpos anti-C3 humano y antiC4 humano se analizaron por citometra de flujo.

Anlisis de la presencia de anticuerpos

anti-Zymosn en el suero humano
normal utilizado.

Incubacin del Zymosn con suero.

Para el anlisis de la presencia de anticuerpos
anti-Zym en el SHN, se realiz una incubacin de
Zym con suero en las mismas condiciones que
las utilizadas para la activacin de todas las vas
del complemento, utilizando el SHN y SHN
previamente adsorbido por Zym como control.
Las suspensiones de Zym (1 y 0,5 mg/ml) se
incuban con SHN y SHN previamente adsorbido
por Zym durante 40 min a 37C. La incubacin
se realiz a una dilucin final 1:4 del SHN y del
SHN previamente adsorbido con Zym en tampn
VBS-Ca/Mg. Para ello, se combinaron volmenes
iguales de la suspensin de Zym con una
dilucin 1:2 de cada suero:

VBS-Ca/Mg (Control)
Se homogeneiz la suspensin de Zymosn
antes de tomar el volumen para la incubacin.
Al cabo de 40 min, se lavan las partculas de
Zym de la forma indicada en incubacin de Zym
con suero.

Incubacin del Zymosn con anticuerpos anti-Ig

humanas.
Para evaluar la presencia de anticuerpos antiZym en el SHN, las partculas de Zym obtenidas
en la incubacin del Zymosn con suero, se
incubaron con 100 L de una solucin de anti-Ig
humanas (dilucin 1:100 en PBS-T) conjugados
a FITC. Luego de la incubacin, se lavaron las
partculas como se explic en incubacin del
Zymosn
con
suero.
Finalmente,
se
resuspendieron en 500 l de PBS, se colocaron
en un tubo para citometra y se mantuvieron a
4C y protegidas de la luz hasta su anlisis por
citometra de flujo.

Anlisis de la unin anticuerpos a Zymosn por

Citometra de flujo:
Las suspensiones obtenidas en la incubacin de
Zymosn con anticuerpos anti-Ig humanas se
analizaron por Citometra de flujo.
Resultados

A) Evaluacin de la capacidad de
varias preparaciones de promover
la inflamacin.
Se determina el porcentaje de granulocitos
existentes en la cavidad peritoneal mediante
citometria de flujo, los datos obtenidos de esta
se analizaron a travs del software "Flowing".
Con este software se realizaron graficos dot plot
SSC-FSC representados en la Figura 1. En el
mismo se seleccionaron dos gates, en los cuales
uno corresponde a la regin R2 zona delimitada
en amarillo (Linfocitos) y el otro a R1 que
contiene tanto a R2 como a la poblacin en rojo
(granulocitos).

200 L de Zym en VBS-Ca/Mg + 200 L

de SHN 1:2 en VBS-Ca/Mg
200 L de Zym en VBS-Ca/Mg + 200 L
de SHN previamente adsorbido por Zym 1:2 en

Figura 1. Dot Plots SSC vs FSC para el contenido de la cavidad peritoneal en las muestras inoculadas
con: a) PBS; b) BSA; c) Zym; d) ACF; e) Alum.
Ratn

PBS

BSA

ACF

ALUM

ZYM

22

24

78

62

45

23

19

82

63

42

21

19,9

84

72

53

20,5

22,5

82

73,9

54

18,7

20

83

75,2

60,1

Tabla 1. Porcentaje de granulocitos reclutados en la cavidad peritoneal por accin de cada una de las
preparaciones en cinco ratones. Estos datos fueron obtenidos de los grficos representados en la Figura
1.

Figura 2. - Grfico de % granulocitos reclutados por las distintas preparaciones, se utiliza la mediana y
los rangos para realizar ste grfico. * Indica que existen diferencias significativas con grado
incertidumbre 0,05 con el grupo control (PBS)

Se aplic el test estadstico de Wilcoxon-Mann Whitney para comparacin de muestras independientes

descripto en la introduccin para evaluar que preparaciones produjeron una diferencia significativa en el
% de granulocitos con respecto al grupo control (PBS).

Recuento de clulas en cmara de Neubauer por microscopa ptica

Ratn

PBS X 106

BSA X 106

ACF X 106

ALUM X 106

ZYM X 106

3,9

1,3

7,9

6,9

2,7

3,2

1,3

4,2

6,7

1,5

----

-----

7,1

5,3

3,5

Tabla 2. Recuento de clulas por microscopa ptica.

B) Estudio de la interaccin entre el

Zymosn y el sistema complemento
El anlisis por citometra de flujo para la
determinacin de las interacciones del Zymosn
con los componentes del complemento C3 y C4
brind los resultados ilustrados en la Figura 3.
Por otro lado, los resultados obtenidos con

respecto a la interaccin del Zymosn con

inmunoglobulinas se observan en la Figura 4.
Donde se puede determinar si hay presencia de
anticuerpos anti-Zym en SHN.
En estas figuras se observan los histogramas de
nmero de eventos vs fluorescencia emitida.

Figura 3. Histogramas, nmeros de evento vs fluorescencia emitida. a) y b) suspensiones de Zymosn

0,5 mg/mL y 1 mg/mL respectivamente, en VBS-Ca/Mg, VBS-EDTA y VBS-EGTA/Mg con Ac anti-C4
humano conjugado a FITC; c) y d) suspensiones de Zymosn 0,5 mg/mL y 1 mg/mL respectivamente, en
VBS-Ca/Mg, VBS-EDTA y VBS-EGTA/Mg con Ac anti-C3 humano conjugado a FITC.

Figura 4. Histogramas: nmeros de eventos vs fluorescencia. a) y b) suspensiones de Zymosn 0,5

mg/mL 1 mg/mL respectivamente, en VBS-Ca/Mg con SHN y en VBS-Ca/Mg con SHN previamente
adsorbido por Zym (control).
Discusin

A) Evaluacin de la capacidad de
varias preparaciones de promover
la inflamacin.
Para la evaluacin de la capacidad de inducir
inflamacin de las distintas preparaciones, se
realiz la comparacin del nmero de clulas
totale y el porcentaje de granulocitos reclutados
en la cavidad peritoneal determinado a travs de
citometra de flujo.
De estos parmetros el que permite obtener
datos ms representativos es el porcentaje de
granulocitos reclutados, ya que el nmero de
clulas presenta como desventaja la variabilidad
existente entre ratones del mismo lote, aunque
se trate de una cepa endogmica, as como
tambin depende de la cantidad de suero
inyectado.
De los resultados obtenidos por citometra de
flujo del porcentaje de granulocitos presentes en
las
diferentes
preparaciones
evaluadas
comparadas con la preparacin control (PBS) (la
cual no presenta ni DAMPs ni PAMPs por eso la
utilizamos como control), observamos que en el
caso de la albmina de suero bovino (BSA) en
PBS aplicando el test U con un grado de
incertidumbre de 0,05, podemos decir que no se
obtuvieron diferencias significativas, por lo tanto

se descarta su posible uso como adyuvante. Esto

es coherente ya que la BSA es una protena que
no presenta PAMPs ni DAMPs, por lo tanto no se
desencadena una respuesta inmune contra ella.
Por otra parte en el caso de las preparaciones de
suspensin de un extracto de paredes de
levaduras (ZYM) en PBS, gel de hidrxido de
aluminio (ALUM) en PBS y de la suspensin de
un lisado bacteriano en aceites minerales (ACF)
y a travs de la aplicacin del mismo test que en
el caso de la BSA podemos ver que si se
observaron diferencias significativas con el grupo
control (PBS), por lo que seran potenciales
adyuvantes. Este resultado es el esperado ya
que en el caso del ZYM se trata de un extracto
de paredes bacterianas por lo que presenta
PAMPs capaces de activar al sistema inmune
innato. El ALUM por otra parte si bien no
presenta PAMPs puede generar DAMPs tales
como el cido rico, el ingreso de ambos a la
clula genera la activacin del inflamasoma
NLRP3 el cual convierte a la pro-IL-1 en IL-1
que es proinflamatoria. Para que ocurra este
proceso tambin es necesario recibir seales a
travs del TLR4, las cuales activan la
transcripcin de genes para sintetizar la pro-IL1. Por ltimo tenemos al ACF que consiste en
una suspensin de lisado bacteriano de
mycobacterias inactivadas por calor en aceites
minerales, por lo tanto en este caso hay
presencia de PAMPs que activan a la inmunidad

innata a travs de los receptores para estos.

Esta preparacin tambin tiene la capacidad de
generar DAMPs ya que se trata de una emulsin
la cual presenta gotculas que son fagocitadas no
pudiendo ser metabolizadas generando la
necrosis celular
Es esencial para que se desencadene una
respuesta inflamatoria por activacin del sistema
inmune innato la presencia de PAMPs y/o
DAMPs.
Al realizar el recuento de clulas por microscopa
ptica se esperaba obtener un aumento en la
concentracin de clulas de las muestras con
posible actividad adyuvante con respecto al
control (PBS). Sin embargo, los resultados
obtenidos no fueron coherentes (tabla 2) ya que
con respecto al control en algunos casos se
observ el aumento de la concentracin y en
otros no se observ dicho aumento, quedando
demostrado que este no es un parmetro
adecuado para la determinacin.
Asimismo este mtodo tiene como desventaja el
tiempo necesario para llevarlo a cabo, ya que es
neceario la preparacin de la muestra en frotis.

B) Estudio de la interaccin entre el

Zymosn y el sistema complemento
En la figura 3 aparecen los histogramas
obtenidos de las suspensiones de suero humano
normal con zymosn 0,5 mg/ml y 1 mg/ml
incubado con Ca y Mg, EGTA y EDTA en cada
caso y tambin el solapamiento de los tres
histogramas. En los histograma realizados con
EDTA, que forma complejos con el Ca2+ y Mg2+,
necesarios para las 3 vas de activacin del
complemento
se
observan
seales
de
flourescencia cercanas a cero, lo que puede
deberse a la fluorescencia intrnseca de las
clulas o a uniones inespecficas de los
anticuerpos anti-C3-FITC y anti-C4-FITC con el
zymosn, pero no es indicativo de la activacin
del complemento. En los histogramas realizados
con EGTA que forma complejos con el Ca2+,
necesario para la va clsica y la va de las
lectinas, pero no con el Mg2+, se observan picos
con una mayor fluorescencia para el ensayo
realizado con anticuerpos anti-C3-FITC, por lo
que se puede conclur que hubo una activacin
de la va alternativa.

En los histogramas realizados con Ca2+ y Mg2+ se

observan picos con una mayor fluorescencia,
tanto para el marcado con anti-C3 como para el
anti-C4, por lo que se puede conclur que hubo
una activacin de alguna de las 3 vas del
complemento, no pudiendo especificar cual de
ellas por medio de este ensayo. Al tener picos
con alta fluorecencia para el anti-C4 podemos
intuir que se activ la va de las lectinas y/o
clsica por deposicin de C4, molcula
caracterstica de estas vas.
En otro ensayo se evalu la activacin de la va
clsica, utilizndose como control negativo SHN
depletado de anticuerpos anti-Zym, el cual no
contiene estos anticuerpos porque fue sometido
previamente a incubacin con Zymosn en
exceso. Para ello, se utiliz SHN conteniendo
Zymosn marcado con anti-IgG. Al comparar los
histogramas se observan fluorescencias cercanas
a cero para el SHN depletado, y fluorescencias
mayores para el SHN, lo que indica la existencia
de anticuerpos unidos a la pared del Zymosn y
una posible activacin de la va clsica.
Conclusiones
Al evaluar la capacidad de diferentes
preparaciones de inducir localmente una
respuesta inflamatoria se encontr que el ACF,
Almina y Zymosn son potencialmente tiles
como adyuvantes.
Al estudiar la capacidad del Zymosn de activar
al sistema complemento, se infiri que en
presencia de EGTA se activa la va alternativa,
mientras que en presencia de Ca2+ y Mg2+ se
activara la va clsica y/o de las lectinas, no
pudiendose demostrar con los ensayos
realizados. La presencia de Anticuerpos antiZymosn sugiere que es posible que el sistema
complemento se active por la va clsica.
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