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CENTRO UNIVERSITRIO DE JARAGU DO SUL UNERJ

CENTRO DE TECNOLOGIA E ARTES


CURSO DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS
DISCIPLINA: MICROBIOLOGIA GERAL

ATIVIDADES PRTICAS

PROF Silvia Helena Olitta Morato Figueiredo

Jaragu do Sul
Abril/2005

CUIDADOS A SEREM TOMADOS NO LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA

1- No deixe seus pertences sobre os balces onde os experimentos so


realizados;
2- Desinfetar a bancada com lcool comercial, no incio e trmino de cada
aula prtica;
3- No fume, no coma no laboratrio. Evite levar a boca qualquer objeto
como lpis, canetas, etc;
4- No use fracos do laboratrio para tomar gua;
5- Comunique imediatamente ao professor, qualquer acidente como
derramamento de culturas sobre a bancada, ferimentos, aspiraes de
culturas, etc;
6- Coloque sempre os materiais contaminados (pipetas, alas, etc) nos
recipientes indicados;
7- Siga as normas de uso de aparelhos. O microscpio deve ser
manuseado cuidadosamente e aps o seu uso deve ser desligado, o fio
enrolado e colocado a capa;
8- No esquea de lavar as mos com desinfetante no inicio e no trmino
da aula.

Orientaes para elaborao dos relatrios prticos


Seguir a metodologia cientfica para elaborao de relatrios, enfatizando:
1- Descrever o objetivo do exerccio (o que se prentende comprovar);
2- Descrever a metodologia utilizada;
3- Descrever e discutir os resultados obtidos.

MATERIAIS DE LABABORATRIO DE MICROBIOLOGIA

1- Autoclave (calor mido) - Seu funcionamento baseia-se no vapor


dgua sob presso, e utilizada para esterilizao de materiais usados
em microbiologia, principalmente meios de cultura;
2- Forno de Pasteur (calor seco) Usado para esterilizar materiais secos
tais como tubos, placas, etc;
3- Estufa de incubao Onde os microrganismos so mantidos durante
o seu desenvolvimento em uma temperatura constante;
4- Microscpio Para a observao dos microrganismos;
5- Placa de Petri Recipiente redondo de vidro com tampa rasa,
destinada ao cultivo de microrganismos em meio slido;
6- Tubo de cultura Destinado ao cultivo de microrganismos em pequeno
volume de meio (lquido ou slido);
7- Pipeta graduada Utilizada para diluio, inoculao, etc. Contm um
tampo de algodo em uma das extremidades;
8- Esptula de Drigalsky Bastonete de vidro com formato de tringulo
usado para distribuir homogeneamente uma cultura lquida sobre o meio
de cultura slido contido na placa de Petri;
9- Cabo de Kolle Cilindro em cuja extremidade h um fio de platina ou
outra liga metlica (nquel-cromo) que pode ser reto (agulha) ou
encurvado (ala). Serve para semear microrganismos em meio slido ou
lquido;
10-Lminas So retngulos de vidro claro e transparente, de espessura
mdia e bordos polidos, que servem para o exame de microrganismos
ao microscpio;
11- Lamnulas Pequenos quadrados de vidro, muito finos e transparentes,
destinados a cobrir a preparao contida na lmina, nos ensaios a
fresco, evitando aberraes da imagem e refrao dos raios luminosos;
12-Lminas escavadas Servem chamada ensaio em gota pendente,
em que o material observado numa gota de lquido, e possuem uma
ou duas depresses (10 a 12 mm de dimetro);
13-Lminas hematimtricas Tambm denominadas lminas de
contagem, so escavadas e milimetradas e permitem contar o nmero
de clulas em suspenso contidas num volume determinado de meio de
cultura lquido;
14-Tubos de Durham Tubos pequenos, cilndricos, medindo 5X20mm
mais ou menos, que so colocados invertidos no meio lquido contido
num tubo de cultura; durante a esterilizao, o tubo de Durham fica
cheio do lquido; aps a inoculao e fermentao o lquido deslocado,
total ou parcialmente, pelo gs formado em uma fermentao;
15-Frascos de Erlenmeyer Servem para guardar quantidades maiores
de meio de cultura e tambm para o desenvolvimento de
microrganismos em meio lquido, com ou sem agitao e aerao;
16-Frascos conta-gotas- Servem para corantes, so de vidro na cor neutra
ou escura;
17-Cubas para material usado Destinam-se a conter o material
contaminado;
18-Pina para lmina Serve para fixar uma lmina com material que vai
sofrer colorao, podendo ser de metal ou madeira;

19-Algodo Serve de tampo de frascos e tubos contendo meio de


cultura ou solues esterilizadas, pois funciona como um filtro para
microrganismos.
PREPARAO DOS MATERIAIS DE LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA
muito importante a assepsia dos materiais e do prprio laboratrio, quando
se trabalha com microrganismos, isto porque, qualquer matria estranha pode
ser uma fonte de contaminao.
O cho do laboratrio deve ser limpo todos os dias com pano molhado e
desinfetante. Os balces e todas as outras superfcies tambm devem ser
desinfetadas.
Placas de Petri se forem usadas devem ser autoclavadas (120C, 20min), o
meio de cultura escorrido ainda quente, lavadas com gua e sabo e deixadas
por algumas horas em soluo detergente. Depois disso so passadas em
gua corrente, secas e preparadas para a esterilizao. As tampas so
revestidas com discos de papel de filtro e as placas so ento embrulhadas ou
colocadas em estojos apropriados para serem esterilizadas em estufa a 180C
por 90 minutos.
Tubos de cultura se tiverem culturas desenvolvidas, devem ser inicialmente
autoclavados como descrito acima. Aps a lavagem,e antes da esterilizao
so tamponados com algodo. A esterilizao feita em estufa de Pasteur
(180C por 90minutos) ou em autoclave, quando j possuem meio de cultura
em seu interior.
Pipetas so lavadas com gua corrente, deixadas em soluo detergente e
novamente passadas em gua. Depois de secas, coloca-se uma mecha de
algodo na boquilha e em seguida, so esterilizadas em estojos especiais ou
embrulhadas em papel.
Lminas e Lamnulas - uma vez retiradas do microscpio, so colocadas numa
cuba contendo soluo detergente. Lavadas, deixadas uma noite em soluo
sulfocrmica e lavadas novamente.
Soluo sulfocrmica
Bicromato de potssio comercial 60g
cido sulfrico concentrado comercial - 460ml
gua destilada -200ml
Pesar o bicromato de potssio e colocar em um balo, dissolver em gua.
Aquecer lentamente para dissolver bem. Colocar o balo num balde cheio de
gua fria e juntar lentamente pela parede do balo o cido sulfrico,agitando
sempre para no precipitar ( deve-se ter cuidado para que no se rompa o
balo). No caso de precipitao, juntar aos poucos gua fria ou morna para
ficar transparente (mais ou menos 400ml de gua). Guardar em frasco
apropriado e devidamente etiquetado.

Ala de inoculao devem ser flambadas antes e depois de qualquer


operao de semeadura. importante que se faa o resfriamento da ala antes
de ser colhido o material.
Semeadura em tubo de cultura - devem ser flambados a boca do tubo de
cultura aps a retirada e antes da colocao do tampo de algodo. O tampo
de algodo deve ser mantido pelo dedo mnimo da mo direita e nunca deve
ser deixado sobre a mesa do laboratrio.
As placas de Petri- devem ser manuseadas com cuidado e no podero ficar
abertas no ambiente, alm do cuidado de manuse-las sempre prximo da
chama. Uma vez semeadas, devem ser incubadas em estufa, com a tampa
voltada para baixo.
Flambar Esterilizar a boca do tubo ou do material usado antes e depois de
seu uso.
Referncia
NEDER, R. N. Microbiologia Manual de laboratrio. So Paulo, Nobel.
1992. 138p.
SOUNIS, E. Curso Prtico de Microbiologia. Rio de Janeiro, Livraria Atheneu
Editora. 2ed. 1989. 267p.
NASCIMENTO, G. G. F. Apostila de aulas prticas de microbiologia.
UNIMEP. Piracicaba- SP. 1999

AIRIMUV : AR E INFECCIOLOGIA
Durante muito tempo, a ideia que a vida possa emergir do mundo inerte manteve-se espalhada, dando
corpo teoria da gerao espontanea . Foi smente em 1862 que o cientista Louis Pasteur varreu
esta teoria demonstrando que o desenvolvimento de organismos num meio prviamente esterilizado
nicamente devido a uma contaminao por microorganismos contidos no ar ambiente. Existem portanto
microorganismos flutuando no ar que nos rodeia e que respiramos. Estes microorganismos sero
capazes de se replicarem e de proliferarem desde que encontrem um meio favorvel ao seu
desenvolvimento. Pasteur demonstrou que estes micrbios podem ser destruidos e que o aquecimento a
uma temperatura elevada permite igualmente interromper toda a proliferao destes microorganismos.
A flora encontrada no ambiente em geral no patognica. No entanto, certos microorganismos em
suspenso no ar ambiente so potncialmente agentes infecciosos e vo vecular as doenas por
transmisso do tipo aerotransportada . De acordo com o seu tamanho e modo de reproduo, so
classificados como vrus (organismos muito pequenos, necessitando de uma clula hospedeira para se
multiplicarem) como bactrias (visveis ao microscpio, multiplicando-se em meios inertes nutritivos) ou
ainda em leveduras (organismos de tamanho superior, com um nivel muito importante de resistncia no
meio
exterior).
Existe uma fonte muito importante destes microorganismos: as mucosas nasais e orais em caso de
infeco ( constipao , gripe, ) produzem em grande quantidade microorganismos. Os espirros e a
emisso de perdigotos projectam gotculas aerotransportadas de secrees naso-faringeas ( gotculas de
Flgge, com um tamanho roda de 5 m.) potncialmente infectantes. A mo levantada frente do nariz
e da boca do sujeito que tosse ou espirra no faz mais que desviar a trajectria destas gotculas que se
encontram em suspenso no ar ambiente e vo ser inaladas pelas pessoas na vizinhana imediata (os
sujeitos atingidos so infectados por inalao do aerossol produzido pelas pessoas contaminadas ou
infectadas a uma distncia que pode ir at aos 2 m.).

Este modo de transmisso pode ser responsvel por epidemias, mesmo pandemias (a uma mais larga
escala) como a gripe ou a SARS (sindroma agudo respiratrio severo) no sudeste da sia e trata-se
ento de um problema escala da sade publica. A crena actual que a transmisso do vrus H5N1
(vrus responsvel pela gripe aviria) que circula actualmente no mundo animal, no passa ao homem.
Aps certas transformaes, este vrus poderia tornar-se transmissivel por via area, de humano a
humano. Estas transformaes (por recombinao gentica entre vrus ou por mutao gentica )
so presentemente sempre hipotticas e tericas mas so um risco potncial a levar em considerao,
produzindo as medidas de preveno executadas pelos poderes pblicos.
Imagina-se sem dificuldade que o ar hospitalar no fuja a esta propagao de microorganismos. O ar
ambiente pode ser a origem para o homem de infeces especficas, infeces nosocomiais
contraidas especificamente no recinto hospitalar. Em certas zonas do hospital pode mesmo produzir-se
uma concentrao de germens potencialmente patognicos e que por vezes adquirem um poder de
resistncia aos tratamentos anti-infecciosos. Sabe-se de facto a gravidade de uma infeco tal como a
aspergilose devida a uma levedura (Aspergillus flavus ou niger a mais frequente) contraida atravs das
vias respiratrias (por inalao) por pessoas hospitalizadas e desde j enfraquecidas por uma outra
afeco que motivou a sua hospitalizao. Por vezes certas bactrias esto em contacto com tecidos
abertos (sem proteco da pele) durante intervenes cirrgicas encontram ai um meio propcio ao seu
desenvolvimento. Estes riscos impem ao meio hospitalar normas muito rgidas relativas qualidade do
ar, e tambm para a da gua.
O estudo do ar exterior mostra que contm partculas inertes, as mais frequentes de natureza mineral ou
orgnica. Calcula-se que a massa total destas partculas inertes no ultrapassar 1g/m 3 (ou seja roda
de 100 a 300.000 partculas/mm3). A presena destas partculas inertes variavel em funo da poluio
e dos fenmenos metereolgicos. O exterior contm igualmente como vimos, partculas vivas
podendo originar o nascimento de microorganismos tais como bactrias ou leveduras. Os
microorganismos s vivem raramente em estado livre no ar. O seu transporte areo necessita
frequentemente de um suporte, talvez uma poeira ou atravs da transmisso inter-humana das gotculas
de
saliva
(gotculas
de
Flgge).
A concentrao destas partculas vivas foi calculada em menos de 2000/mm 3 no ar ambiente. Esta
concentrao varia igualmente em funo da estao e das condies.
Em situao fechada (por exemplo num compartimento) o numero de partculas emitidas muito mais
importante na presena de vrios individuos. Com efeito, uma pessoa em repouso (sentada num
escritrio) emite volta de 100.000 partculas/mn, e uma pessoa em actividade emitir de 5 milhes
(deslocamento vivo) a 30 milhes de partculas (actividades desportivas em local fechado). Estas
partculas sero de natureza diferente: partculas inertes (produzidas pelo compartimento ele prprio,
detritos de txteis ou diferentes materiais), microorganismos principalmente produzidos pela ou pelas
pessoas presentes no local. Estes microorganismos tm um poder patognico varivel. Estes
microorganismos tm tambm uma durao de vida muito heterognea (de alguns minutos para um
vrus a vrias semanas para certos esporos). Para tomar o exemplo do hospital, a presena de partculas
provocando a nascena de microorganismos diferente em qualidade e em quantidade de um hospital
para outro e, no seio de um mesmo hospital, de um quarto de doente para outro.
A relao entre ar e infeco no sempre fcil de estabelecer porque a contaminao do ar no implica
forosamente uma infeco. Com efeito a infeco depender em parte da natureza do microorganismo
(concentrao do agente, virulencia e capacidade patognica), dos modos de contaminao, por
exemplo a porta de entrada cutnea durante uma interveno cirrgica e por outro lado a receptividade
do hospedeiro, estado imunitrio, leso das barreiras naturais (por exemplo perda de substncia no caso
de um grande queimado).
Os agentes responsveis pelas infeces transmissveis por via area so: as micobactrias, as
legionelas, certos vrus, vrus da varicela, da gripe, VRS (vrus respiratrio sincitial, responsvel pelas
epidemias invernais de bronquiolite na criana jovem), vrus do sarampo e vrus da rubeola, CMV
(cytomgalovrus) e certos cogumelos e parasitas (aspergillus e Pneumocystis carini). Ao por-se em
causa estes microorganismos especificos implica com frequencia o isolamento dos pacientes
contaminados para evitar a transmisso inter-humana. Algures, no meio hospitalar, em certas situaes
(bloco operatrio, quarto de paciente enxertado imuno-deprimido) a qualidade do ar deve ser prxima do
meio estril. Os controlos particulares e microbiolgicos do ar so praticados regularmente para dominar
e prevenir a contaminao aerotransportada.
O ar torna-se um vector de partculas e de microorganismos, particularmente nos locais fechados e de
ajuntamento humano. Estes elementos so potencialmente responsveis por situaes de risco
patognico e a vigilncia e o dominio da qualidade do ar tornam-se cada vez mais importantes na nossa
poca de epidemias potencialmente identificadas (SRAS, gripe aviria, legionelose), de grandes
ajuntamentos de populao (transmisso local em zonas de fortes concentraes humanas) e da
migrao rpida de pessoas atravs de meios de transporte modernos (difuso geogrfica).

EXERCCIO N1
PREPARAO DO MATERIAL DE LABORATRIO
Material
- Placas de Petri
- Tubos de cultura
- Pipetas
- Papel de filtro, tesoura, pina, papel de embrulho, fita crepe, caneta
- Algodo
Mtodo
1- Cortar um disco de papel de filtro com o dimetro um pouco maior que o
da tampa da placa de Petri, colocar na parte interna da tampa. Fechar a
placa e embrulhar, fechar com fita crepe e levar para ser esterilizada em
forno de Pasteur por 180C 90minutos.
2- Fazer um tampo de algodo que se ajuste firmemente ao tubo de
cultura. Em seguida, enrolar o conjunto de tubos em papel de embrulho
de modo a proteger o algodo e esterilizar em forno de Pasteur por
180C 90minutos.
3- Introduzir com um pina, uma mecha de algodo na boquilha da pipeta.
Embrulhar individualmente, fechar com fita crepe, anotar o volume e
esterilizar em forno de Pasteur por 180C 90minutos.
RECORDANDO A TCNICA PARA PIPETAR SOLUO
Material
- Becker de 150ml
- Soluo de azul de metileno
- Pipetas de 10ml; 5ml; 2ml; 1ml; 0,5ml.
Mtodo

1- Pipetar o volume integral de cada pipeta e transferir para o beckerrepetir a operao 3 vezes.
2- Com a pipeta de 10 ml, pipetar 5ml; 2,5ml e 0,5ml, transferir para o
becker.
3- Com a pipeta de 5ml, pipetar 4ml; 2ml e 0,1ml, transferir para o becker.
4- Com a pipeta de 2ml, pipetar 1ml; 0,5ml e 0,1ml, transferir para o becker.
5- Com a pipeta de1ml, pipetar 0,5ml; 0,3ml e 0,1ml, transferir para o
becker.
6- Com a pipeta de 0,5ml, pipetar 0,4ml, 0,2ml e 0,1ml, trnasferir para o
becker.
Questes
1- Por que colocado papel de filtro na tampa da placa de Petri?
2- Por que se coloca algodo na boquilha da pipeta em microbiologia?
3- Por que se deve ter tantos cuidados com a assepsia, quando se trabalha
com microrganismos?

EXERCCIO N2
PREPARAO DE MEIOS DE CULTURA
MEIOS DE CULTURA E CULTIVO DE MICRORGANISMOS
Para o cultivo e identificao de microrganismos, usam-se solues e
substncias nutritivas denominadas meios de cultura, que devem atender s
exigncias nutricionais das espcies de microrganismos a ser cultivada.
Esses meios quanto s substncias nutritivas podem ser:
1- Meios sintticos - quando os componentes so quimicamente
definidos;
2- Meios complexos - quando se adiciona ao meio substncias complexas
por exemplo: extrato de carne, peptona, sangue, etc.
Em relao ao estado fsico, os meios de cultura podem ser:
1- Meios lquidos tambm denominados de caldos;
2- Meios slidos quando se adiciona ao caldo 1,5 a 2% de gar.
Quanto fora seletiva e diferencial, podem ser:
1- Meios enriquecidos quando se acrescentam substncias como
sangue, soro, etc; para microrganismos com exigncias nutritivas mais
complexas;
2- Meios seletivos quando so adicionados ao meio de cultura
substncias que impedem o crescimento de certos microrganismos e
possibilita o crescimento de outros. Ex: meio de SS, meio de Mac
Conkey, etc

3- Meios Diferenciais quando contm substncias que indicam certas


caractersticas bioqumicas dos microrganismos. Ex: o sangue
adicionado ao meio indica se uma bactria hemoltica ou no.
4- Meios de enriquecimento quando favorece o crescimento de
determinados microrganismos. Ex. adio de selenito favorece o
crescimento de Salmonella..
Referncia.
NEDER, R. N. Microbiologia Manual de laboratrio. So Paulo, Nobel.
1992. 138p.
NASCIMENTO, G. G. F. Apostila de aulas prticas de microbiologia.
UNIMEP. Piracicaba- SP. 1999
Material
-Meio de Nutrient Broth (NB), Sabouraud Agar (AS), Nutriente Agar (NA)
- Tubos de cultura;
- Frascos de Erlenmeyer de 250ml;
- Provetas de 100ml, 200ml, 500ml;
- Balana, algodo, papel alumnio, esptula de para pesagem, gua destilada,
basto de vidro.
Mtodo
Grupos de 1, 3, 7 e 10 (preparar 200ml cada)
- Pesar 4,6g de Nutrient Agar(NA), adicionar 200ml de gua destilada, agitar e
aquecer no microondas at dissolver. Tampar e esterilizar em autoclave a
121C a 1atm de presso por 20 minutos.
Grupos 2, 4, 8 e 11 (preparar 100ml cada)
- Pesar 6,5g de Sabouraud Agar (AS), adicionar 100ml de gua destilada,
agitar e aquecer no microondas at dissolver. Tamponar e esterilizar em
autoclave a 121C a 1atm de presso por 20 minutos.
Grupos 5, 6, 9 e 12 (preparar 100ml cada)
- Pesar 0,8g de Nutrient Broth, adicionar 100ml de gua destilada, dissolver a
frio com basto de vidro e com auxilio de uma pipeta distribuir 5ml em tubos de
cultura. Tamponar e esterilizar em autoclave a 121C a 1atm de presso por
20minutos.

Questes
1- Para que serve o meio de cultura?
2- Qual a temperatura e tempos ideais para esterilizao de meios de
cultura na autoclave?

3- Por que os meios de cultura no podem ser esterilizados dentro das


placas de Petri?
4- Por que os meios de cultura no so esterilizados em forno de Pasteur?
5- Para que serve o gar na composio do meio de cultura?

EXERCCIO N3
MICRORGANISMOS DO AR E AMBIENTE
Microrganismos encontram-se em praticamente todos os ambientes; ar, gua e
principalmente no solo, deste passam ao ar pelo vento sendo arrastados por
partculas de poeira. Do ar passam para nossa superfcie contaminando gua e
alimentos.
As condies que favorecem a sobrevivncia e o crescimento de muitos
microrganismos (nutriente, umidade e temperatura adequada) so as mesmas
sob as quais vivem as populaes humanas, assim inevitvel que vivamos
entre grande quantidade de germes.
Material
- Placas de Petri contendo Nutriente Agar (NA) e Agar Sabouraud (AS)
- Cotonete
Mtodo
a) Presena de microrganismos no ar
Retirar a tampa de uma placa de Petri com NA e outra com AS e deixar abertas
no ambiente determinado por 15 minutos. Fechar e incubar a placa de NA a
37C por 24h e a AS na temperatura ambiente por 5 dias.
b) Presena de microrganismo no laboratrio
Utilizando placas de NA inocular da seguinte forma:

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Placa 1- passar o cotonete na superfcie de qualquer objeto do laboratrio e


depois na superfcie do meio de cultura. Tomar cuidado para no ferir o meio;
Placa 2- tocar a superfcie do meio de cultura com a ponta dos dedos
Fechar e incubar as placas a 37C por 48horas.
Resultado
Descrever em termos gerais a aparncia dessas colnias
Fazer a distino entre uma colnia de fungo e bactria
Questes
1- Qual a importncia em se cultivar microrganismos em laboratrio?
2- Qual a finalidade prtica de se conhecer os microrganismos do
ambiente?
3- Quais as precaues que devem ser tomadas para controlar os
contaminantes do laboratrio?
4- O que uma colnia de bactria? E de fungo?
5- Neste experimento houve influncia do meio de cultura no aparecimento
de fungos e bactrias?
Referncia
NASCIMENTO, G. G. F. Apostila de aulas prticas de microbiologia.
UNIMEP. Piracicaba- SP. 1999
EXERCCIO N4
TCNICAS MICROBIOLGICAS
Para se observar o desenvolvimento de um microrganismo indispensvel que
sejam tomadas precaues de assepsia e empregar tcnicas adequadas de
repicagem de modo a preservar as caractersticas de cada linhagem.
Material:
- culturas
- tubos com nutriente lquido (NB)
- placas de Petri com NA e AS
- ala de inoculao e pipetas.
Mtodo:
A) Semeadura do inoculo de bactrias desenvolvida em meio lquido.
a.1) transferir 0,1ml da cultura desenvolvida em meio lquido para tubo de
cultura contendo este mesmo meio. Agitar aps a inoculao e incubar a 37C
por 24 horas.
a.2) inocular 0,1ml de cultura desenvolvida em meio lquido para placa de Petri
contendo NA e espalhar com a ala de Drigalsky. Incubar a 37C por 24 horas
B) Repique do inoculo de bactria desenvolvida em meio slido

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Utilizando a ala de inoculao ou ala de platina, transferir a cultura de


bactria desenvolvida em meio slido para tubos com meio slido inclinado
(NA) e nutriente lquido (NB).
Incubar a 37C por 24horas
C) Repique em estrias
Utilizando a ala de inoculao repicar a cultura bacteriana desenvolvida no
meio slido para a placa de Petri pelo mtodo da estria.
Resultado
- Observar o crescimento da bactria em meio lquido ( turvao, formao de
pelcula ou sedimento);
- Observar o crescimento da bactria nos tubos com meio inclinado e nas
placas de Petri.

EXERCCIO N5
COLORAO DE GRAM
O exame microscpico de bactrias pode ser feito a partir de uma suspenso
de clulas em meio lquido ou desenvolvidas em meio slido, atravs de
coloraes. Essa tcnica possibilita observar as caractersticas morfolgicas de
bactrias e sua melhor visualizao, alm de poder evidenciar tambm
diferenas entre clulas de diferentes espcies ou dentro da mesma espcie
pelo uso de corantes apropriados.
A colorao de Gram bastante utilizada pois a maioria das bactrias se cora
por este mtodo, permitindo que sejam obtidas informaes relacionadas a sua
morfologia, principalmente no que diz respeito a parede celular, por esta
vantagem esta colorao um dos procedimentos utilizados na taxonomia das
bactrias.
Material:
- Culturas:
- Corantes especficos para o mtodo de colorao
Mtodo:
a) Preparo do esfregao.

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Colocar uma gota da suspenso bacteriana em uma lmina e espalhar


ligeiramente com a ala de platina para que as clulas sejam homogeneamente
distribudas. Secar a preparao no ar.
Fixar o esfregao, passando a lmina diretamente na chama, evitando o
superaquecimento. Esperar que esfrie completamente ante de corar.
b) Colorao:
- cobrir o esfregao com cristal violeta por 1 minuto;
- escorrer o corante e cobrir com lugol por 1 minuto;
- escorrer o corante e lavar em gua corrente;
- lavar com lcool-acetona por 30 segundos e depois lavar em gua corrente;
- colorir com safranina por 30 segundos;
- lavar em gua corrente e secar com papel de filtro;
- observar no microscpio com a objetiva de imerso.
Resultado.
- anotar a forma da bactria e seus arranjos de crescimento;
- anotar a resposta da reao de Gram.
Questes
1- Qual a importncia da colorao de Gram?
2- Qual a finalidade de se usar lugol e lcool nesse tipo de colorao?
3- Qual finalidade de se usar a safranina nesse tipo de colorao?
EXERCCIO N6
CARACTERSTICAS MORFOLGICAS DE FUNGOS
a) Fungos Filamentosos
Os fungos filamentosos, tambm conhecidos por bolores, so constitudos por
hifas que se ramificam e se entrelaam formando miclio. A parte do miclio
que penetra no substrato digerindo-o e absorvendo-o o miclio vegetativo.
O miclio reprodutivo o responsvel pela produo de esporos e varia
grandemente nas diferentes espcies de fungos, servindo para classific-los e
identific-los.
Material
Cultura de:
Lminas e lamnulas
Mtodo
Examinar macroscopicamente e microscopicamente as culturas fornecidas em
placas de Petri. Para o exame fresco, colocar uma gota do corante azul de
metileno em uma lmina e com a ala, emulsionar uma pequena quantidade da
cultura do fungo a ser observado. Cobrir com a lamnula e observar no
microscpio no aumento de 400X.
Resultado

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Identificar as estruturas observadas ao microscpio: hifas, estrutura de


reproduo, esquematizando-as.
b) Fungos unicelulares - Leveduras
As leveduras so fungos unicelulares que se reproduzem ma comumente por
brotamento. Muitas vezes os brotos se separam imediatamente da clula me
formando o pseudo-miclio ( as clulas ficam ligadas em cadeias). A forma das
clulas tambm de grande importncia na taxonomia das leveduras.
Material
Cultura de:
Lminas e lamnulas
Mtodo
Examinar macroscopicamente as culturas fornecidas em placas de Petri
observando cor, brilho.
Para o exame micorscpico colocar uma gota do corante azul de metileno em
uma lmina e emulsionar pequena quantidade do material. Cobrir com a
lamnula e observar no microscpio no aumento de 400X.
Resultado
Desenhar as estruturas observadas no microscpio como forma, tamanho,
modo de reproduo.
EXERCCIO N7
CONTROLE DO CRESCIMENTO MICROBIANO
Os microrganismos podem sobreviver em ambientes com diferentes condies
fsicas e qumicas, havendo no entanto, limitaes toleradas por eles. Sabe-se
que em condies naturais podem ocorrer efeitos inibitrios seletivos ou
mesmo letais sobre a flora microbiana. A inibio ou destruio dos
microrganismos depende, em parte, da intensidade das condies fsicas que
lhes so impostas.
Cultura:
a) Ao de agentes fsicos
Efeito da temperatura
1- Alta temperatura
Dividir o fundo de uma placa contendo NA em quatro setores, riscando com um
lpis pelo lado de fora. Fazer uma estria com a ala no quadrante 1 (t= 0) e
colocar o tubo no banho maria por 5, 10 e 20 minutos. Aps cada intervalo de
tempo, realizar uma semeadura nos outros quadrantes da placa. Incubar por
48h a 37C
2- Baixa temperatura

14

Semear a cultura microbiana em placa contendo NA e incubar em temperatura


de 3 a 5C por 48horas.
b) Ao de agentes qumicos
Material
Cultura:
lcool 50% e 70%
gua oxigenada 3,5 e 10%
Placas com NA
Polvedine
Cotonetes esterilizados
Mtodo
- Colocar 5ml de cada uma das solues fornecidas em tubos esterilizados. Em
cada uma desses tubos acrescentar 0,5 ml da cultura bacteriana. Aps 5, 10 e
30 minutos, transferir com uma ala de cada mistura para um dos quadrantes
da placa de Petri contendo NA. Incubar por 48horas a 37C.
- ao de antissptico sobre a pele: umedecer um cotonete em uma soluo
salina e esfregar vigorosamente a pele das costas de uma das mos, numa
rea de aproximadamente 4 cm de dimetro, inoculando a seguir uma
superfcie de uma das metades da placa de NA. Umedecer um segundo
cotonete com o PVPI e esfregar na pele da outra mo, numa rea do mesmo
dimetro que a primeira. Esperar 5 minutos para que haja ao do antissptico
e a rea seque. Passar nesta rea um terceiro cotonete umedecido em salina,
tomando cuidado para no atingir a rea circundante assepsia. Inocular a
outra metade da placa com esse cotonete. Incubar a placa por 48horas a 37C
Resultado: comparar o crescimento, comparando com o controle sem
tratamento.
Questes
1- Por que nas concentraes mais altas de NaCl o crescimento foi inibido?
2- Que concluso chegou em relao aos experimentos?

15

EXERCCIO N8
ANTIBIOGRAMA
A prova da sensibilidade a drogas antimicrobianas utilizada para orientar o
tratamento clnico (principalmente no caso daqueles que adquiriram
resistncia), para investigao epidemiolgica, testes de novos antibiticos e
identificao preliminar de algumas bactrias. Basicamente dois mtodos so
utilizados para avaliar a sensibilidade dos microrganismos s drogas: mtodo
da diluio e difuso
a) Mtodo da diluio: pela tcnica da diluio em tubos, pode-se determinar
a menor quantidade de antimicrobiano para inibir o crescimento de um
organismo (CIM= concentrao mnima inibitria)
b) Mtodo da difuso: se fundamenta na capacidade de difuso do antibitico
atravs de um meio slido, inibindo ou no o crescimento do microrganismo.
Este mtodo mais comumente empregado e consiste na utilizao de discos
de papel impregnados com quantidades conhecidas de drogas, as quais so
colocadas na superfcie de uma placa inoculada. O halo de inibio pode ser
influenciado pela composio do meio de cultura, densidade do inoculo,
concentrao do antibitico no disco, difusibilidade do antibitico no meio e
perodo de incubao.

16

Material
Cultura de:
Agar Mueller-Hinton (MH)
Discos de antibiticos:
Mtodo
Em uma placa de Petri contendo meio de MH, inocular 0,1 ml da cultura
bacteriana fornecida e espalhar o inculo com a ala de Drigasky.
Colocar os biodiscos de antibiticos na superfcie do meio com uma pina
estril, pressionando levemente e mantendo um espaamento de modo que
fiquem suficientemente separados uns dos outros para evitar a superposio
dos halos de inibio.
Anotar o nome do antibitico, sua sigla e sua concentrao no biodisco.
Incubar a 37C por 48horas.
Resultado
A leitura da placa dever ser feita medindo-se o dimetro dos halos de inibio
(incluindo o dimetro do biodisco) e comparando com os dados da tabela e
anexo. Classificar como resistente, sensvel e intermedirio).

Critrios de interpretao baseados no mtodo de Bauer & Kirby, 1966


Dimetro em milmetro
Antimicrobiano Conc. disco Resistente
Ac. Pipemidico 20mcg
13 ou Ac. Nalidxico
30mcg
13 ou Amoxilina
10mcg
BGN entricos
11 ou Staphylococcus
20 ou Aztreonam
30 mcg
15 ou Amicacina
30 mcg
14 ou Ampicilina
10 mcg
BGN entricos
13 ou Staphylococcus
28 ou Canamicina
30 mcg
13 ou Carbenicilina
100 mcg
18 ou Cefalotina
30 mcg
14 ou Cefoxitina
30 mcg
14 ou Cefotaxima
30 mcg
14 ou Ceftriaxona
30mcg
13 ou Cefalexina
30mcg
14 ou Cefadroxil
30mcg
14 ou Ceftazidima
30mcg
14 ou -

Intermedirio Sensvel
14 a 18
19 ou +
14 a 18
19 ou +
12 a 13
21 a 28
16 a 21
15 a 16

14 ou +
29 ou +
22 ou +
17 ou +

14 a 16
--14 a 17
20 a 22
15 a 17
15 a 17
15 a 22
14 a 20
15 a 17
15 a 17
15 a 17

17 ou +
29 ou +
18 ou +
23 ou +
18 ou +
18 ou +
23 ou +
21 ou +
18 ou +
18 ou +
18 ou +

17

Ciprofloxacina
Clindamicina
Cloranfenicol
Eritromicina
Estreptomicina
Gentamicina
Imipenem
Lincomicina
Neomicina
Netilmicina
Nitrofurantoina
Norfloxacina
Oxacilina
Penicilina G
Enterococos
Staphycoccus
Polimixina B
Rifampicina
Sulfazotrin
Sulfonamida
Tetraciclina
Tobramicina
Vancomicina

5mcg
2mcg
30mcg
15mcg
10mcg
10mcg
10mcg
2mcg
30mcg
30mcg
300mcg
10mcg
1mcg
10 unid.
300 UI
30mcg
25mcg
300mcg
30mcg
10mcg
30mcg

15 ou 14 ou 12 ou 13 ou 11 ou 12 ou 13 ou 14 ou 12 ou 12 ou 14 ou 12 ou 9 ou -

16 a 20
15 a 20
13 a 17
14 a 22
12 a 14
13 a 14
14 a 15
15 a 16
13 a 16
13 a14
15 a 16
13 a 16
10 a 13

21 ou +
21 ou +
18 ou +
23 ou +
15 ou +
15 ou +
16 ou +
17 ou +
17 ou +
15 ou +
17 ou +
17 ou +
14 ou +

14 ou 28 ou 8 ou 11 ou 10 ou 12 ou 14 ou 12 ou 9 ou -

--9 a 11
12 a 18
11 a 15
13 a 16
15 a 18
13 a 14
10 a 11

15 ou +
29 ou +
12 ou +
19 ou +
16 ou +
17 ou +
19 ou +
15 ou +
12 ou +

18