CAPTULO 2.10.12.

TOXOPLASMOSIS

RESUMEN
Definicin y descripcin de la enfermedad: La toxoplasmosis es una infeccin zoonsica de
animales causada por el protozoo parsito Toxoplasma gondii. En ovejas y cabras la toxoplasmosis
causa abortos o el nacimiento de corderos/cras dbiles, lo que puede ir acompaado de fetos
momificados. Las caractersticas de las membranas intercotiledonarias placentales son normales,
pero en los cotiledones pueden verse focos blancos de necrosis, de aproximadamente 2-3 mm de
dimetro. Microscpicamente, estos focos aparecen como reas de necrosis por coagulacin que
estn relativamente libres de inflamacin. La inflamacin, cuando existe, no es supurativa. Los
taquizotos de Toxoplasma se observan slo raramente asociados con estos focos, habitualmente
en la periferia de la lesin. El examen del cerebro puede revelar microgliosis focal. Las lesiones a
menudo tienen un pequeo foco central de necrosis que se podra mineralizar. Con frecuencia se
presenta leucomalacia focal en la sustancia blanca cerebral, debida a la anoxia producida a
consecuencia de la patologa placentaria. La microgliosis focal es ms especfica cuando la
leucomalacia refleja una patologa placentaria, pero puede ocurrir en otras condiciones tales como
la enfermedad de la frontera (border disease) o raramente en la clamidiosis ovina. La infeccin en
cerdos puede causar prdidas fetales severas en cerdas gestantes pero con ms frecuencia es
leve e inapreciable.
Identificacin del agente: Toxoplasma gondii es a menudo difcil de encontrar en secciones de
tejidos, y es ms probable su presencia en secciones de cerebro y placenta. Se puede confirmar su
identidad mediante inmunohistoqumica, mientras que se puede emplear la reaccin en cadena de
la polimerasa para identificar el ADN del parsito en los tejidos. El aislamiento de T. gondii a partir
de muestras es caro y lento, pero, si es preciso, es mejor llevarlo a cabo inoculando ratones con
homogeneizado derivado de cerebro fetal o placenta.
Pruebas serolgicas: La prueba de tincin es el mtodo serolgico establecido desde hace ms
tiempo, y en muchos sentidos representa el patrn de oro, al menos en humanos. La prueba de
tincin emplea taquizotos de Toxoplasma virulentos vivos, un factor accesorio tipo complemento
y suero problema. Cuando el anticuerpo especfico acta sobre los taquizotos, estos ltimos no se
tien uniformemente con azul de metileno alcalino. La prueba no se puede realizar en algunas
especies. Adems, como se emplea Toxoplasma vivo, la prueba conlleva un riesgo potencial de
infeccin en humanos y, por otra parte, resulta cara su realizacin. La prueba de
inmunofluorescencia indirecta (IFI) proporciona ttulos comparables a los de la prueba de tincin,
pero es ms segura porque utiliza taquizotos muertos. La prueba IFI puede utilizarse para
diferenciar anticuerpos IgM e IgG. La prueba de aglutinacin directa y la de aglutinacin con latex
son relativamente rpidas y ninguna de las dos requiere instrumental de laboratorio complicado. La
tcnica del enzimoinmunoensayo requiere un equipamiento de laboratorio algo ms sofisticado
pero permite manejar gran nmero de muestras y no est sujeta a la interpretacin humana de los
resultados.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: Se dispone comercialmente de
una vacuna compuesta por taquizotos vivos de T. gondii para ser empleada en ovejas en algunos
pases europeos y en Nueva Zelanda. La vacuna se administra como una suspensin concentrada
de taquizotos con un adecuado diluyente y sistema de presentacin. La vacuna se debe mantener
y manipular estrictamente de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes, puesto que tiene un
periodo de validez muy corto.

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A. INTRODUCCIN
Toxoplasma gondii es un protozoo parsito intracelular obligado que puede causar abortos en ovejas, cabras y
cerdos. El parsito tambin tiene un potencial zoonsico. En un caso tpico de aborto, una oveja o una gama
infectada en la etapa intermedia de gestacin produce un cordero/cra nacida muerta unos pocos das antes de la
fecha prevista para el nacimiento. El feto abortado se acompaa a menudo de un hermano dbil o de un feto
momificado (3). La oveja/gama permanece asintomtica. En tales casos, los cotiledones placentarios estn
tpicamente moteados con focos blancos de alrededor de 23 mm de dimetro mientras que las membranas
intercotiledonarias se encuentran normales. La infeccin en la etapa temprana de gestacin, cuando el feto tiene
slo un sistema inmune rudimentario, provoca la muerte fetal y la reabsorcin. En este caso la madre puede
presentarse como estril, lo que a la larga puede parecer un problema de infertilidad del rebao. Las madres que
resultan infectadas en la ltima etapa de gestacin previsiblemente produzcan descendencia infectada pero
clnicamente normal. Despus de la infeccin, ya sea durante o fuera de la gestacin, no es de esperar que el
parsito cause abortos en las siguientes gestaciones. La infeccin en los cerdos puede provocar severas
prdidas fetales en cerdas gestantes, pero en las condiciones en las que se encuentran las explotaciones
ganaderas intensivas modernas, la infeccin es con ms frecuencia leve e inapreciable (7).
El ciclo de vida de T. gondii tiene componentes sexuales y asexuales. La fase asexual tiene lugar en el
hospedador intermediario, el cual es en la mayora de los casos, si no en todos, un animal de sangre caliente. La
fase sexual ocurre en las clulas enteroepiteliales del hospedador definitivo felino y tiene como resultado la
produccin de ooquistes. Despus de la infeccin primaria de un gato, los ooquistes pueden eliminarse en las
heces durante varios das, Los ooquistes esporulan en el medio exterior a lo largo de 15 das (dependiendo de
la aireacin y de la temperatura) y a partir de ese momento los ooquistes se vuelven infectivos. Son muy
resistentes y pueden permanecer infectivos en el medio ambiente durante un ao o ms. Los ooquistes
esporulados tienen un dimetro de 11 13 m y cada uno de ellos contiene dos esporocistos con cuatro
esporozotos cada uno (5). Cuando un animal susceptible ingiere ooquistes esporulados, los esporozotos
penetran en la pared intestinal, transformndose en taquizotos y estableciendo una infeccin.
En el ciclo asexual hay dos estadios de desarrollo: el taquizoto de multiplicacin rpida y el bradizoto de
multiplicacin lenta. Los taquizotos penetran activamente en las clulas del hospedador donde se multiplican
causando la rotura celular y la liberacin de los organismos localmente y en el torrente sanguneo. Cuando el
hospedador desarrolla inmunidad, el parsito mantiene su tamao y forma originales pero se transforma en el
estadio de bradizoto y se multiplica ms lentamente en los quistes tisulares hasta establecer una infeccin
persistente. Estos quistes tisulares microscpicos estn presentes con mayor frecuencia en el cerebro y en el
msculo esqueltico y representan la etapa quiescente del parsito dentro del hospedador. En ovejas, cabras,
cerdos, caballos y hombre, los quistes pueden permanecer durante el resto de la vida del individuo (5).
Habitualmente las especies de Toxoplasma no producen enfermedad clnica en ganado vacuno, camlidos o
ciervos, pero pueden causar la muerte de monos del Nuevo Mundo, marsupiales australianos, liebres (marrones
y de montaa) y algunos pjaros.
El aborto de ovejas y cabras causado por T. gondii debe diferenciarse del provocado por otros agentes
infecciosos, incluyendo las infecciones por Chlamydophila abortus (ver Captulo 2.4.7. Aborto enzotico de
ovejas), Coxiella burnetii (ver Captulo 2.2.10. Fiebre Q), Brucella melitensis (ver Captulo 2.4.2. Brucelosis
caprina y ovina [excluyendo la infeccin por Brucella ovis]), Campylobacter fetus fetus (ver Captulo
2.3.2. Campilobacteriosis genital bovina), Salmonella spp. (ver Captulo 2.10.3), Enfermedad de la Frontera (ver
Captulo 2.10.5.), y los virus que causan la Lengua Azul, la enfermedad de Wesselsbron y la enfermedad de
Akabane. En cerdos, Brucella suis (ver Captulo 2.6.2.) puede causar tambin muerte fetal, momificacin y
aborto.

Riesgos para la salud humana

Toxoplasma gondii infecta fcilmente a los seres humanos y mientras la infeccin es relativamente comn
(aproximadamente el 30% de la poblacin dependiendo de la edad y del ambiente), la enfermedad clnica es
relativamente inusual. Quienes de forma especial corren el riesgo de desarrollar la enfermedad clnica son las
mujeres embarazadas, ya que el parsito puede plantear una seria amenaza para el feto si la madre resulta
infectada por primera vez durante la gestacin, y los individuos en estado de inmunosupresin, tales como
pacientes con transplantes de tejidos, pacientes de SIDA, pacientes con ciertos tipos de cncer y los que reciben
ciertas formas de terapia contra el cncer; estos individuos corren el riesgo de desarrollar una infeccin letal
aguda de no ser tratados. Tambin pueden ser ms susceptibles los nios y ancianos. En ocasiones, las
personas sin inmunodeficiencia aparente pueden desarrollar una enfermedad caracterizada por malestar general,
fiebre y linfoadenopata. Las dos principales fuentes de infeccin humana son la ingestin de carne poco
cocinada o cruda que contiene quistes tisulares de T. gondii vivos, o la exposicin a ooquistes procedentes de
heces de gato, que pueden encontrarse en jardines y en hoyos de arena de parques infantiles.

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B. TCNICAS DE DIAGNSTICO
1.

Identificacin del agente

a)

Aislamiento
La mejor forma de aislar T. gondii procedente de fetos abortados ovinos y caprinos y de membranas fetales
se realiza inoculando ratones de laboratorio. Los mejores tejidos para la inoculacin son cerebro fetal y
cotiledones placentarios, y los resultados ptimos se obtienen con muestras frescas libres de
contaminacin. Las muestras no deben congelarse en ningn momento puesto que el parsito morira.
i)

Con precauciones aspticas, se recogen 25 g de cotiledn placentario o tejido cerebral del feto
abortado.

ii)

Se homogeniza el tejido en un volumen igual de tampn fosfato salino 0,3 M estril (PBS), pH 7,4, con
adicin de antibiticos (100 Unidades Internacionales [UI])/ml de penicilina y 745 UI/ml estreptomicina)
en un homogeneizador stomacher (Seward Laboratory, London) u otro equipo de maceracin
adecuado. El tejido cerebral puede ser homogeneizado correctamente pasndolo diez veces a travs
de una aguja de calibre 16 mediante una jeringa.

iii)

Se inoculan por va intraperitoneal tres ratones libres de Toxoplasma con 0,5 ml del tejido
homogeneizado.

iv)

Se sacrifican los ratones 68 semanas despus de la inoculacin y se extraen sus cerebros. Tambin
debe conservarse la sangre en esta etapa y el suero se separa y congela a 20C. Asimismo, deben
recogerse los cerebros de los ratones que mueran antes de las 68 semanas.

v)

Se homogeniza cada cerebro de ratn con un volumen igual de PBS estril pasndolo diez veces a
travs de una aguja de calibre-16 mediante una jeringa.

vi)

Se extiende una gota (5 l) de una suspensin dada en cinco portas.

vii)

Se seca y se tie con Giemsa, se deshidrata y se monta bajo un cubreobjetos.

viii) Los portas se examinan al microscopio. Los quistes tisulares aparecen como estructuras circulares
que miden 550 m rellenos de bradizotos en forma de cuarto creciente y teidos de azul.
Un mtodo alternativo para examinar el cerebro de ratn consiste en tomar una pequea porcin de la parte
delantera del cerebro (aproximadamente del tamao de la cabeza de una cerilla) y aplastarla con un
cubreobjetos. Los quistes tisulares se detectarn fcilmente.
Si los tejidos inoculados estn fuertemente infectados con T. gondii, los ratones pueden morir al cabo de 1
2 semanas.
La ausencia de quistes tisulares no implica que se descarte un posible diagnstico positivo. Se debe
analizar el suero de los ratones para detectar la presencia de anticuerpos contra Toxoplasma (p. ej.
utilizando una prueba de inmunofluorescencia indirecta [IFI]); si este anlisis es tambin negativo, es
improbable la infeccin por Toxoplasma.

b)

Secciones de tejidos
En cotiledones placentarios afectados de ovejas y cabras se aprecian tpicamente grandes focos de
necrosis por coagulacin, que pueden mineralizarse con el tiempo. La inflamacin asociada es
caractersticamente suave y no supurativa. Las muestras bien preservadas de cotiledones placentarios
pueden mostrar un edema moderado del mesnquima de las vellosidades fetales con una hipercelularidad
difusa debida a la presencia de grandes clulas mononucleares. A veces son visibles pequeas cantidades
de toxoplasmas intra- y extracelulares, normalmente en la periferia del rea necrtica o en una vellosidad
que est en las etapas tempranas de la infeccin. Los taquizotos de Toxoplasma son ovoides, de 26 m
de largo, con ncleos moderadamente basfilos y localizados en el centro o hacia el extremo posterior.
En el cerebro fetal se pueden desarrollar lesiones primarias y secundarias. Los focos microgliales,
tpicamente con un centro necrtico y a veces mineralizado y frecuentemente asociado con una meningitis
linfoidea focal suave, representan una respuesta inmune fetal despus de un dao directo por la
multiplicacin local del parsito. Los toxoplasmas se encuentran slo raramente, casi siempre en la periferia
de estas lesiones. La leucomalacia focal es tambin comn y se considera que es debida a la anoxia fetal
en la etapa ltima de la gestacin causada por las lesiones avanzadas en el placentoma que impiden la
transferencia de suficiente oxgeno entre la madre y el feto. Estos focos se producen ms comnmente en
los centros de sustancia blanca cerebral, pero a veces tambin en la sustancia blanca cerebelal. Estos

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cambios neuropatolgicos, cuando se ven juntos, son tpicos de la infeccin por Toxoplasma. Sin embargo,
la confirmacin de la identidad de estructuras tipo T. gondii en secciones de tejido de, por ejemplo, cerebro
o placenta puede llevarse a cabo por inmunohistoqumica que marca T. gondii intactos o restos antignicos.
El mtodo es fcil y sensible y se emplea con tejidos fijados (incluyendo tejidos de archivo) que pueden
tambin exhibir cierto grado de descomposicin, de modo que en este caso el aislamiento no sera
apropiado o posible. Son igualmente adecuados el mtodo ABC indirecto de la inmunoperoxidasa y la
tcnica peroxidasaantiperoxidasa (PAP) (10).

c)

Mtodos de reconocimiento del cido nucleico

Se han desarrollado varias tcnicas basadas en la reaccin en cadena de la polimerasa para detectar el
ADN de T. gondii. Las regiones diana principales son la secuencia repetitiva B1, el gen P30 (SAG1) o el
ARN ribosmico (ARNr). La PCR B1 y P30 son tcnicas ampliamente usadas y representan buenas ayudas
diagnsticas, pero son mejores si se utilizan en conjuncin con otra prueba, porque son insuficientemente
fiables cuando se emplean solas. Se ha ensayado una tcnica de PCR basada en la deteccin del ARNr
18S y parece ser ms sensible, sin embargo se necesitan ms estudios (6). La sensibilidad de la PCR
depende del nmero de copias de la secuencia diana (B1: 35 copias; P30: 1 copia; ARNr: 110 unidades
repetidas). Se dispone comercialmente de oligonucletidos sintticos de ADN personalizados (ej.
www.sigma-genosys.co.uk).
El mtodo descrito es una forma combinada de PCR, que amplifica la secuencia de ADN repetitiva B1 (12).
El ADN del parsito puede extraerse y purificarse a partir de varios tejidos, incluyendo placenta, el sistema
nervioso central, el corazn y el msculo esqueltico.
Se retiran los glbulos rojos contaminantes de los tejidos lavando en tampn de lisis Tris/NH4 Cl 10 mM, pH
7,6, y a continuacin se centrifugan a 2.000 g durante 15 minutos. Entonces se extrae el ADN a partir del
sedimento resultante y se resuspende en Tris 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM conteniendo 100
g/ml de proteinasa K y Tween 20 al 0,5%.
Las muestras se incuban a 55C durante al menos 1 hora; entonces se inactiva la proteinasa K mediante
ebullicin. El procedimiento de la PCR se realiza en volmenes de 50 l. La amplificacin del gen B1 se
lleva a cabo segn una modificacin del procedimiento descrito en la ref. 1. La mezcla de reaccin contiene
Tris 10 mM, pH 8,3, MgCl2 2,5 mM, KCl 40 mM, gelatina al 0.01%, dNTPs 0.1 mM, 0.2 M de cada cebador
(los oligonucletidos cebadores se describen en la ref. 1), dos cebadores sentido P1 y P2 y dos antisentido
P3 y P4) y 2,5 unidades de polimerasa Taq.
La amplificacin primaria se realiza con los cebadores 1 y 4 dando un producto de 193 bp despus de
25 ciclos a 93C durante 1 minuto, 50C durante 1,5 minutos y 72C durante 3 minutos. El producto
amplificado se diluye entonces al 1/20 en agua destilada para reducir la amplificacin de los productos no
especficos.
La amplificacin secundaria utilizando los cebadores internos 2 y 3 y las mismas condiciones de reaccin,
se lleva a cabo en 15 ciclos dando un producto de 94 bp. Entonces se visualiza el producto final en geles de
agarosa a 1%. Se puede emplear un ensayo tipo Southern utilizando una sonda marcada para confirmar la
identidad de los productos B1 de la PCR y distinguirlos de los productos no especficos.

2.

Pruebas serolgicas

Se dispone de diversas pruebas serolgicas para la deteccin de anticuerpos frente a T. gondii. En un tipo de
prueba el observador juzga el color de los taquizotos al microscopio, tal como sucede con la prueba de tincin
(DT) y la prueba IFI. Otra prueba depende del principio de aglutinacin de taquizotos de Toxoplasma, glbulos
rojos o partculas de latex, como sucede con la prueba de aglutinacin directa (DAT), la prueba de aglutinacin
indirecta (IHA) y la prueba de aglutinacin con latex (LA), respectivamente. Con la tcnica de
enzimoinmunoensayo (ELISA), el cambio en la intensidad de color define la cantidad de anticuerpo especfico en
una solucin dada. Las pruebas DT, IFI, DAT y ELISA se especifican ms adelante, indicndose la prueba IFI
con ms detalle.
La prueba serolgica DT (9) se considera el patrn de oro para anticuerpos anti-Toxoplasma en humanos. Los
taquizotos vivos de Toxoplasma se incuban con un factor accesorio tipo complemento y el suero problema a
37C durante 1 hora antes de aadir azul de metileno. Los anticuerpos especficos inducen la permeabilizacin
de la membrana del parsito de modo que el citoplasma se derrama y los taquizotos no incorporan el colorante
de modo que aparecen incoloros. Los taquizotos no expuestos al anticuerpo especfico (p. ej. una muestra de
suero negativo) incorporan el colorante y aparecern azules. La prueba DT es al mismo tiempo sensible y
especfica en humanos, pero podra ser impracticable en otras especies. Adems es potencialmente peligrosa
puesto que se emplea el parsito vivo. Es costosa y requiere un alto grado de experiencia tcnica.

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La prueba IFI (8) es un mtodo simple y se utiliza ampliamente. Los taquizotos intactos y muertos de
Toxoplasma se incuban con el suero problema diluido, se aade el antisuero especfico anti especie fluorescente
apropiado, y el resultado se visualiza entonces con un microscopio de fluorescencia. Se dispone comercialmente
de anticuerpos marcados con fluorescencia para una variedad de especies animales; el mtodo es relativamente
econmico y se encuentran disponibles comercialmente los kits adecuados. Sin embargo, el mtodo requiere un
microscopio de fluorescencia y como los datos son interpretados visualmente, se pueden producir variaciones
subjetivas. Puede resultar difcil encontrar algunos conjugados especficos de las especies y existe riesgo de una
posible reaccin cruzada con anticuerpos frente al factor reumatoide y con anticuerpos antinucleares.
La prueba DAT (4) es sensible y especfica. Se aaden taquizotos formalinizados de Toxoplasma a pocillos con
forma de U de placas de microtitulacin y se aplican las diluciones de los sueros problema. Las muestras
positivas producirn aglutinacin que puede ser variable, mientras que las muestras negativas producirn un
botn de taquizotos sedimentados en el fondo del pocillo. La prueba es simple y fcil de realizar aunque se
requieren cantidades relativamente grandes de antgenos. Se dispone de kits comerciales. Ms adelante se
indica el mtodo de crecimiento y recogida de parsitos.
La tcnica original ELISA (11) utiliza una preparacin de antgeno soluble realizada con taquizotos de la cepa de
Toxoplasma RH (como se describe ms adelante) y se coloca en pocillos de una placa de microtitulacin. Se
aaden los sueros problema (p. ej. ovino en origen), seguido de un conjugado anti-especie marcado con un
enzima como puede ser IgG anti-ovina marcada con peroxidasa de rbano. Cualquier conjugado adherido causa
un cambio de color en el sustrato que es directamente proporcional a la cantidad de anticuerpo unido y puede ser
ledo con un espectrofotmetro a la absorbancia especfica del sustrato empleado. La tcnica es simple, permite
ensayar un gran nmero de muestras y es fcil de realizar con el conjugado anti-especie elegido. Se dispone
comercialmente de conjugados anti-especies, sustratos y kits completos. Sin embargo la tcnica requiere un
espectrofotmetro. La tcnica ELISA es idnea para laboratorios que analizan gran nmero de muestras.

Preparacin de antisueros y antgenos

Se pueden obtener comercialmente antisueros contra T. gondii y antisueros conjugados para las pruebas IFI y
ELISA, lo que permite muestrear una variedad de especies animales. No se dispone de patrones internacionales
para sueros animales.
Ms adelante se indican los protocolos a seguir en la preparacin del antgeno del taquizoto para su utilizacin
en las pruebas IFI y ELISA. Los taquizotos se pueden cultivar en ratones o en cultivo de tejidos y se mantienen
intactos para la prueba IFI, o se preparan como antgeno soluble para la tcnica ELISA.

Produccin de taquizotos de Toxoplasma en ratones

i)

Se inyectan seis ratones libres de Toxoplasma por va intraperitoneal utilizando una jeringa de 1ml y
una aguja de calibre 23, con 0,2 ml de 1 107/ml de taquizotos de T. gondii de la cepa RH, se
recogen frescos a partir de un pase previo por ratn o a partir de cultivo de tejidos. (Para la
recuperacin ptima de los taquizotos tomando las mnimas clulas mononucleares del hospedador,
los ratones deben tener ms de 6-8 semanas de vida y pesar aproximadamente 22-25 g.)

ii)

Se sacrifican los ratones 3 das ms tarde mediante inhalacin de CO2 (evitar la dislocacin cervical
porque puede causar contaminacin del fluido peritoneal con glbulos rojos).

iii)

Se pincha el ratn de espaldas sobre una superficie de corcho limpia. Se separa la piel abdominal con
precauciones aspticas, se extrae cualquier fluido peritoneal con una aguja de calibre 21 unida a una
jeringa de 1 ml y se expulsa suavemente el exudado recogido en un volumen igual de PBS.
El momento ptimo de recoger los taquizotos es de 72 horas despus de la inoculacin inicial,
momento en el que habr organismos suficientes pero antes de que exista contaminacin significativa
de las clulas hospedadoras. Tambin es importante no posponer la recogida del fluido peritoneal ms
all de 3 das desde la muerte de los ratones. (Si los taquizotos para la inoculacin del ratn se toman
a partir de muestras estabilizadas congeladas, podra ser necesario recoger los ratones 4 o 5 das
despus de la inoculacin inicial y realizar un pase del parsito una vez ms a travs de ratones antes
de ser utilizados como antgeno en las pruebas indicadas anteriormente.)

iv)

Se centrifuga el fluido a 500 g durante 5 minutos, se aspira el sobrenadante y se resuspende en una

solucin salina equilibrada de Hanks (HBSS). Se alternan lavados en PBS y HBSS por centrifugacin.

v)

Se calcula la concentracin de taquizotos y clulas hospedadoras contaminantes con una cmara de

recuento Neubauer mejorada (El recuento de taquizotos se realiza a dilucin 1/1.000 y la
contaminacin celular a dilucin 1/10).

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vi)

Se llevan a cabo posteriores lavados (etapa iv anterior) cuando sea necesario para reducir la
contaminacin celular a <0,5% de clulas mononucleares y <0,25% de glbulos rojos.

vii)

Se resuspenden los taquizotos en PBS hasta alcanzar una concentracin final de 1 107/ml.

viii) Los taquizotos se pueden mantener de esta manera por pases continuos sin necesidad de adicionar
penicilina/estreptomicina, siguiendo procedimientos aspticos estrictos.

Preparacin de alcuotas de de taquizotos de T. gondii estabilizadas y congeladas

i)

Se consiguen los taquizotos a partir de ratones o cultivos de tejidos como ya se ha descrito.

ii)

Se centrifugan a 500 g durante 5 minutos y se resuspenden en medio de Dulbecco modificado por

Iscove (IMDM) (Gibco BRL, Paisley, Gran Bretaa) aproximadamente tres veces.

iii)

Se aaden las siguientes soluciones hasta conseguir estas concentraciones: dimetil sulfxido al 10%;
suero de caballo normal al 20% (libre de anticuerpos frente a T. gondii); taquizotos resuspendidos al
70% hasta una concentracin final de 1 108 taquizotos/ml.

iv)

La preparacin debe permanecer esttica durante 1 hora.

v)

Se distribuyen alcuotas de 1ml en tubos de tapn de rosca apropiados para el almacenamiento en

nitrgeno lquido.

vi)

Se introducen los tubos en un pequeo contenedor. Se envuelven en un material aislante grueso y se

colocan en un congelador a 70C hasta conseguir que los taquizotos se congelen gradualmente.

vii)

Al da siguiente se transfieren a nitrgeno lquido, mantenindolos bien aislados mientras se

transfieren.

viii) Este material estabilizado puede ser empleado para inocular ratones o cultivar el parsito en cultivo de
tejidos. Cuando se saca del congelador, la muestra se descongela rpidamente en agua templada.

Produccin de taquizotos de Toxoplasma en cultivos de tejidos

i)

Se puede cultivar Toxoplasma gondii y mantener en cultivo de tejidos mediante pases dos veces por
semana en clulas de rin de mono verde africano (Vero).

ii)

Las clulas y el parsito se cultivan en medio IMDM suplementado con 50 UI/ml de penicilina, 50 g/ml
estreptomicina y suero fetal bovino al 2%.

iii)

Los taquizotos se recogen a partir de frascos de cultivo de tejidos raspando la monocapa celular
mediante un raspador celular estril.

iv)

Se emplean frascos de cultivo de tejidos de 25cm2 que han sido sembrados con 1 105 clulas Vero,
se aaden taquizotos en una relacin de dos taquizotos por clula de la monocapa y se incuban a
37C en un incubador con atmsfera humidificada y un 5% de CO2. Se recogen despus de 34 das.

Preparacin de taquizotos intactos para ser utilizados en la prueba IFI

i)

Se prepara una suspensin de 4 107/ml taquizotos de la cepa de T. gondii RH en PBS.

ii)

Se aade formaldehdo (40%) hasta conseguir una concentracin final de 0,2% (v/v).

iii)

Se incuba a 4C durante toda la noche y se divide en alcuotas empleando tubos cerrados

adecuadamente que se mantienen congelados hasta su uso.

Produccin de antgeno soluble para la tcnica ELISA

i)

Se prepara una suspensin de taquizotos de la cepa de T. gondii RH en PBS.

ii)

Se centrifuga a 2.000 g durante 15 minutos, se conserva el precipitado y se resuspende en nueve

veces su volumen en agua destilada.

iii)

Se rompen los taquizotos mediante tres ciclos de congelacin y descongelacin.

iv)

Entonces se sonica la preparacin de antgeno durante 20 segundos a 4C y una amplitud de

20 micras.

v)

Se extrae cualquier residuo celular mediante centrifugacin a 10.000 g durante 30 minutos a 4C.

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vi)

Se retiene el sobrenadante y se conserva a 20C hasta su uso. (La estimacin de protenas esperada
tiene un valor de entre 2 y 4 g/ml.)

Protocolo para la prueba IFI

El siguiente es un protocolo para realizar una prueba IFI de deteccin de anticuerpos IgG antiToxoplasma
en suero ovino. Slo requiere pequeas modificaciones para las pruebas en diferentes especies o para la
medida de anticuerpos IgM.
i)

Se limpia el nmero necesario de portas multiprueba de 15 pocillos para cultivo de tejidos (Flow
laboratorios) y se deja secar.

ii)

Se colocan 5 l de una preparacin de taquizotos intactos en cada pocillo y se dejan sacar.

iii)

Se fijan en metanol durante 10 minutos.

iv)

Se realizan dos lavados de 10 minutos en PBS 0,3 M, pH 7,4.

v)

Se aaden 5 l del suero ovino problema (diluido en PBS) a cada pocillo. (Se preparan diluciones
seriadas de los sueros problema, p. ej. 1/16, 1/32, etc. hasta 1/1.024.) Se debe incluir un suero control
positivo y negativo en cada prueba as como una muestra con slo PBS. Se incuban 30 minutos a
temperatura ambiente.

vi)

Se realizan dos lavados de 10 minutos en PBS.

vii)

A cada pocillo se aaden 5 l de una dilucin apropiada de IgG de conejo anti-oveja conjugada a
isotiocianato de fluorescena, diluidos en colorante azul de Evan filtrado al 2% en PBS, y se incuban
durante 30 minutos a temperatura ambiente.

viii) Se realizan tres lavados de 10 minutos en PBS.

ix)

Se colocan los portas bajo cubreobjetos con glicerol tamponado (nueve partes de PBS y una de
glicerol) o Citifluor (Citifluor Ltd, Londres).

x)

Se examina mediante un microscopio de fluorescencia, provisto de objetivos 20 x y 40 x.

Con un resultado negativo del suero problema los parsitos intactos aparecern rojos debido a la
autofluorescencia del colorante azul de Evan. Tambin pueden presentar un casquete fluorescente verde en
un extremo del parsito (fluorescencia polar no especfica). Con un suero problema positivo los parsitos
presentarn fluorescencia roja y al menos el 80% de ellos en un pocillo dado estarn rodeados por una
banda continua de fluorescencia verde. En una oveja/cabra adulta un ttulo se considerar positivo cuando
los pocillos muestren resultado positivo a diluciones 1/64 y ser negativo a diluciones 1/32. Para
corderos/cras y suero fetal, los ttulos sern 1/32 y 1/16, respectivamente.
Un ejemplo de sistema en porta se indica a continuacin:
Muestra 1
1/16

1/32

1/512

1/1024

1/1256

1/128

1/64

1/128

1/256

PBS only

|
|
|

1/1024

1/512

1/64

1/32

1/16
Muestra 2

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNSTICO

La nica vacuna disponible es una preparacin viva producida comercialmente para ovejas (Toxovax, Intervet
BV, Pases Bajos; Toxovax, AgVax, Ag Research, Nueva Zelanda), y actualmente con licencia de uso en Gran
Bretaa, Irlanda, Francia, Espaa y Nueva Zelanda. Consiste en cultivo de tejidos en los que se desarrollan
taquizotos de T. gondii S48 atenuados por mas de 3000 pases en ratones. La vacuna estimula la inmunidad
protectora efectiva durante al menos 18 meses despus de una nica inyeccin subcutnea, pero como es

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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

Captulo 2.10.12. Toxoplasmosis

incapaz de producir quistes tisulares, las ovejas no permanecen con una infeccin vacunal persistente. La
vacuna tiene un corto periodo de validez y supone un riesgo potencial para individuos inmunodeprimidos y
hembras en estado de gestacin (2).

REFERENCIAS
1.

BURG J.L., GROVER C.M., POULETTY P. & BOOTHROYD J.C. (1989). Direct and sensitive detection of a
pathogenic protozoan, Toxoplasma gondii, by polymerase chain reaction. J. Clin. Microbiol., 27, 17871792.

2.

BUXTON D. (1993). Toxoplasmosis: the first commercial vaccine. Parasitol. Today, 9, 335337.

3.

BUXTON D. (2000). Toxoplasmosis and neosporosis. En: Diseases of Sheep, Martin W.B. & Aitken I.D., eds.
Blackwell Science, Oxford, UK, 8694.

4.

DESMONTS G. & REMINGTON J.S. (1980). Direct agglutination test for diagnosis of Toxoplasma infection:
method for increasing sensitivity and specificity. J. Clin. Microbiol., 11, 562568.

5.

DUBEY J.P. & BEATTIE C.P. (1988). Toxoplasmosis of Animals and Man. CRC Press, Boca Raton, Florida,
USA.

6.

ELLIS J.T. (1998). Polymerase chain reaction approaches for the detection of Neospora caninum and
Toxoplasma gondii. Int. J. Parasitol., 28, 10531060.

7.

LIND P. & BUXTON D. (2000). Veterinary aspects of Toxoplasma infection. En: Congenital Toxoplasmosis;
Scientific Background, Clinical Management and Control, Ambroise-Thomas P. & Petersen E., eds.
Springer, Paris, France, 261269.

8.

MUNDAY B.L. & CORBOULD A. (1971). The application of the Toxoplasma indirect fluorescent-antibody test to
sheep sera. Aust. J. Med. Technol., 2, 36.

9.

SABIN A.B. & FELDMAN H.A. (1948). Dyes as microchemical indicators of a new immunity phenomenon
affecting a protozoon parasite (Toxoplasma). Science, 108, 660663.

10. UGGLA A., SJOLAND L. & DUBEY J.P. (1987). Immunohistochemical demonstration of toxoplasmosis in fetuses
and fetal membranes of sheep. Am. J. Vet. Res., 48, 348351.
11. VOLLER A., BIDWELL D.E., BARTLETT A., FLECK D.G., PERKINS M. & OLADEHIN B. (1976). A microplate enzymeimmunoassay for toxoplasma antibody. J. Clin. Pathol., 29, 150153.
12. WASTLING J.M., NICOLL S. & BUXTON D. (1993). Comparison of two gene amplification methods for the
detection of Toxoplasma gondii in experimentally infected sheep. J. Med. Microbiol., 38, 360365.

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