MANUAL DE LABORATORIO

BIOTECNOLOGA ALIMENTARIA

INTRODUCCIN

La Biotecnologa es la ciencia llamada a solucionar muchos problemas de ndole mundial en

los campos de la medicina, la industria y el sector agropecuario. En pases como Colombia,
donde la inversin en investigacin es muy precaria; los aportes e iniciativas de
investigacin y desarrollo en el rea de la Biotecnologa Alimentaria, indudablemente,
contribuirn en brindar alternativas de soluciones a la gran ola de hambruna que tienen
muchas poblaciones de este y otros pases del mundo.
Dentro de las herramientas ms valiosas y consistentes con que cuenta el Ingeniero
Agroindustrial y de Alimentos para suplir las necesidades de progreso cientfico,
tecnolgico y de Ingeniera, se encuentra la Interaccin armnica de los diferentes
aspectos de la Biotecnologa Alimentaria; para ello es indispensable la formacin de
profesionales capaces de aplicar y desarrollar conceptos de ingeniera en los procesos
biotecnolgicos realizados en la industria de Alimentos.
El desarrollo de la biotecnologa industrial en Colombia es evidente y se manifiesta en los
diferentes renglones de la economa nacional. Entre las industrias de alimentos que
generan o consumen productos biotecnolgicos se encuentran: las cerveceras y
malteras, productos lcteos fermentados, panificadoras, jugos y nctares, industrias
vincolas y licoreras, etc. La poltica nacional de ciencia y tecnologa, en uno de sus
programas orientados a fortalecer la competitividad del sector productivo y su insercin
en el mercado mundial, reconoce que los adelantos cientficos en biologa molecular y
biotecnologa han tenido gran impacto en los sistemas de produccin; y por ello es
prioritario el fomento a las investigaciones y a la formacin de nuevos profesionales en
estas reas.
Este manual de laboratorio, dirigido a estudiantes de Ingeniera de Alimentos y otras
Ingenieras o reas relacionadas con el sector de la industria agroalimentaria, fue
diseado con mucho esmero y dedicacin para complementar y demostrar en el
laboratorio los referentes tericos discutidos previamente en el aula de clases. Surge,
entonces como una herramienta pedaggica que fortalecer el proces de enseanzaaprendizaje en el desarrollo de programas acadmicos relacionados con la Biotecnologa
Alimentaria.

BIOSEGURIDAD Y BUENAS PRCTICAS MICROBIOLGICAS EN EL

LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA

Desde el primer momento en que el estudiante entra a un laboratorio donde se trabajen

procesos biolgicos microbianos, est expuesto a recibir cualquier clase de infeccin,
dependiendo del microorganismo con el que entre en contacto, ya sea directamente o por
contaminacin cruzada. Para prevenir este tipo de riesgos, el estudiante debe cumplir con
las normas de bioseguridad dentro y fuera del laboratorio. Las normas de bioseguridad
son una recopilacin de los procedimientos de laboratorio ms esenciales que constituyen
la base de tcnicas microbiolgicas y biotecnolgicas apropiadas; stas son
fundamentales para la seguridad en el laboratorio y no pueden sustituirse, en ningn
momento, con equipos especializados; ya que estos no sern ms que un complemento para
facilitar el trabajo y en algunos casos para disminuir la exposicin a sustancias
peligrosas.
Las normas de seguridad que se deben cumplir en un laboratorio donde se trabaje con
material microbiolgico se clasifican en: De orden personal, de orden del laboratorio y de
orden del trabajo microbiolgico.
a) DE ORDEN PERSONAL:
Usar siempre la bata dentro del laboratorio; no se debe llevar puesta fuera del mismo.
Las prendas contaminadas se deben esterilizar antes de lavarlas.
No se deben colocar los bolsos, prendas de vestir, paraguas, carteras, etc. en los
mesones de trabajo. Debe existir un lugar destinado para ello.
Dentro del laboratorio no se permitir al personal comer, beber, fumar ni aplicar
cosmticos.
Se debern lavar las manos al iniciar y al terminar el trabajo; como tambin, despus
de haber manipulado material contaminado y/o infeccioso.
No se deber pasar la lengua por las etiquetas; los materiales no se colocarn en la
boca
No se llevar calzado sin puntera o que no sea cerrado.
No se debe hacer uso de pauelos o bata de laboratorio para limpiar objetos o
instrumentos de trabajo.
No se debe participar del trabajo si se tiene alguna herida, quemadura o rasguo en
las manos o antebrazos; estas deben ser tratadas inmediatamente.

 Se debe comunicar inmediatamente cualquier sospecha de haber contrado alguna

enfermedad como consecuencia del trabajo.
Cuando sea necesario, se deben proteger los ojos y la cara de salpicaduras o impactos;
se utilizaran gafas de seguridad, viseras o pantallas faciales.
No se deber pipetear con la boca; se deben usar pipetas automticas, pera de goma o
auxiliar de pipeteo.
b) DE ORDEN DEL LABORATORIO:
Mantener cerradas las puertas del laboratorio; abrirlas slo en caso de emergencia.
No permitir la entrada de nios a las zonas de trabajo
No debe haber material que no tenga relacin con el trabajo
Debe haber un programa de lucha contra insectos y roedores
Las superficies de trabajo se limpiarn y desinfectarn al menos una vez al da y en
caso de derramamiento fortuito de sustancias potencialmente peligrosas.
No olvidar cerrar la vlvula del gas al terminar cada jornada de trabajo.
La seal internacional de riesgo biolgico debe colocarse en las puertas de los locales
en donde se manipulen microorganismos del grupo de riesgo 2.

c) DE ORDEN DEL TRABAJO MICROBIOLGICO

Estudiar, con anterioridad, las tcnicas y protocolos de las prcticas y experimentos
de laboratorio; esto evitar confusiones y dinamizar el trabajo.
Trabajar, siempre, de manera ordenada, tranquila, constante y metdica; evitando
movimientos y gasto de energa innecesarios.
Llevar, siempre, un registro ordenado de los resultados y modificaciones. Esto
evitar contratiempos desagradables por la prdida de datos importantes.
El material de trabajo (Caldos de fermentacin, cepas, medios, etc) deben ser
tocados, nicamente, con instrumentos estriles; nunca con material contaminado y
mucho menos con las manos.
Limpiar y desinfectar las superficies de trabajo antes y despus de cada jornada.
Cada vez que se derrame material infeccioso, se debe cubrir la zona con papel
absorbente impregnado de desinfectante y dejarlo por un periodo de 15 minutos.
Las pipetas de vidrio, deben tener en su abertura superior un algodn que sirva como
filtro para proteger a la muestra y al manipulador.
Colocar todo material contaminado, tales como: Porta objetos, laminillas, esptulas,
pinzas, pipetas, etc. en recipientes adecuados con soluciones desinfectantes.

 El resto de material contaminado se debe colocar en recipientes especiales para su

posterior esterilizacin.
Al depositar lquidos, virtalos por las paredes.
Recuerde que siempre se debe adicionar cidos al agua y nunca agua a los cidos,
porque ocasiona salpicaduras peligrosas.
No retire cultivos celulares del laboratorio sin previa autorizacin
Las asas deben esterilizarse antes y despus de usarse flamendolas en la llama del
mechero hasta ponerlas al rojo vivo en toda su extensin y luego dejarla enfriar por
espacio de 20 segundos cerca de la llama.
Si se va a repicar de un cultivo a otro, termine por enfriar el asa en este ltimo
Flamee la boca de tubos, balones, Erlenmeyers, etc. antes y despus que introduzca
asas o pipetas
Nunca hable, tosa, estornude o respire fuerte cuando abra un cultivo o est
sembrando
Trabaje lo ms cerca posible al mechero.

RECUERDE SIEMPRE!

Las improvisaciones son el primer paso para un accidente

En todo momento est consciente de lo que hace
En caso de un accidente, acte rpidamente sin perder la calma
Pregunte al profesor si no est seguro de lo que va a hacer
Tenga mucho sentido comn

EXPERIMENTO N 1
TCNICAS PARA MEDICIN DE BIOMASA

1. INTRODUCCIN:
El crecimiento microbiano se pude considerar como el aumento ordenado de todos los
constituyentes qumicos de un organismo, lo cual, para los organismos unicelulares,
conduce a un aumento del nmero de individuos en la poblacin.
Se puede considerar el crecimiento al nivel de individuos dentro de una poblacin (ciclo
celular) o el crecimiento de poblaciones celulares (ciclo de crecimiento). El crecimiento
de las poblaciones celulares se puede subdividir en sistemas cerrados, como el cultivo
intermitente y en sistemas abiertos, como el cultivo alimentado por lotes y el cultivo
continuo.
Para determinar el nmero total de clulas de un cultivo, el mtodo de eleccin es el
recuento microscpico directo. Para clulas de levadura, puede emplearse un
hemocitmetro. Es necesaria una ampliacin de 100X a 400X para visualizar la cmara de
recuento y las clulas en suspensin. Para clulas bacterianas se usa frecuentemente una
cmara de Petroof-Hauser o una de Neubauer y una ampliacin de 1000X a causa del
pequeo tamao de las bacterias. El recuento microscpico directo tiene la ventaja de
que permite observar directamente la morfologa de las clulas estudiadas. Las
morfologas aberrantes o atpicas podran indicar unas condiciones subptimas de
crecimiento o la presencia de un genotipo o fenotipo alterados.
El mtodo ms usado para medir el crecimiento microbiano es secar volmenes conocidos
de cultivo celular lentamente hasta obtener un peso constante. Cuando se trata de
clulas que sedimentan rpidamente, como las levaduras, esto usualmente implica
centrifugacin de muestras del cultivo en tubos de centrfuga prepesados. Para clulas
bacterianas difciles de concentrar por centrifugacin, las muestras de cultivo se filtran
a travs de membranas hidroflicas con un tamao de poro de 0,2 m.
Otro mtodo muy utilizado es el de determinacin de biomasa por densidad ptica. Se
aprovecha la proporcionalidad de la densidad ptica a la masa celular, cuando no se tienen
en el medio de fermentacin otros slidos en suspensin. Este mtodo se basa en la Ley
de Beer y Lamberty; en este caso, se asume que la absorcin del rayo incidente es
proporcional a la concentracin de clulas presentes.

2. OBJETIVO:
Desarrollar la habilidad para medicin la biomasa microbiana que interviene en los
bioprocesos a travs del conocimiento de las tcnicas ms utilizadas para este fin.

3. MATERIALES Y REACTIVOS:
a)

Materiales
Cmaras de Neubauer
Microscopios
Estufa
Desecador
Balanza analtica (6 cifras decimales)
Espectrofotmetro
Centrfuga
Pipetas graduadas
Pipetas automticas
Auxiliar de pipeteo
Beakers
Erlenmeyers
Tubos para centrfuga
Pinzas

b)

Reactivos
Cultivo de Levadura
Agua destilada
Solucin salina isotnica estril (0,85%)

4. PROCEDIMIENTO:

4.1. Preparacin del cultivo madre:

Disolver aproximadamente 0,5 gr. de levadura seca comercial (Saccharomyces

cerevisiae) en un erlenmeyer que contenga 200ml de agua destilada estril.
4.2. Preparacin de las soluciones problema:
En tubos de 20-25 ml, previamente secos en estufa, preparar 6 diluciones de levadura a
partir del cultivo madre, as:
TUBO
ml de agua
ml de cultivo

1 2
10 8
0 2

3
6
4

4
4
6

5 6
2 0
8 10

Cada dilucin de levadura ser medida con las siguientes tcnicas:

4.3. Medicin de la biomasa microbiana por conteo directo en cmara de Neubauer:

Agitar muy bien el cultivo de levadura. Tomar un volumen pequeo (0,1 0,3 mL) con la
pipeta automtica. Depositar una alcuota en la superficie pulida de la cmara de
Neubauer cerca del extremo del cubreobjetos; la suspensin entrar en la cmara por
capilaridad. Una cmara llenada adecuadamente contiene clulas slo en el espacio
contenido entre el cubre y la cmara de recuento. No debera sobrar fluido que se
deposite en los surcos.
Posteriormente se coloca en la platina de un microscopio compuesto y se enfoca el
enrejado con los objetivos de menos aumento (4X y 40X). Para contar las levaduras se
utiliza el cuadro central (Ver figura 1). El cuadro central est sealado con un crculo y
contiene 25 cuadros, cada uno rodeado por un borde de tres lneas. Cada uno de los 25
cuadros a su vez contiene 16 cuadritos. Se debe ajustar la intensidad de la luz de modo
que se hagan visibles tanto las lneas como las clulas. Se deben contar las clulas que se
encuentren dentro de los 5 cuadros marcados (los cuatro de las esquinas y el del centro).
El cuadro central (marcado con el crculo) tiene un rea de 1 mm 2 y una profundidad de
0.1 mm.
Tenga en cuenta los Siguientes aspectos:

 Para aquellas clulas que estn tocando las lneas de los bordes, slo cuente aquellas
que estn en dos de los cuatro bordes (superior e izquierdo); esto evitar que se
repita el conteo.
Si cuenta ms de 50 o menos de 20 clulas por cuadro, repita la toma de muestra o
cambie la dilucin que est usando.
Limpie la cmara con agua destilada estril y squela con gasa o algodn despus de
cada lectura.

1 mm

1 mm

Figura 1. Cmara de Neubauer

4.4. Medicin de la biomasa microbiana por densidad ptica:

Tomar 1 ml de cada muestra problema y preparar en tubos tapa rosca una dilucin de
cada una de ellas de tal forma que la concentracin final de solutos no sobrepase las
1000 ppm. (mxima concentracin de slidos ledas por el espectrofotmetro)

Agitar muy bien. Realizar la lectura de absorbancia en el espectrofotmetro a 540 nm.

4.5. Medicin de la biomasa microbiana por peso seco celular:
Centrifugue los tubos, previamente pesados, que contienen las soluciones originales de
levadura (volumen restante conocido) a 4000 rpm durante 15 minutos. Con ayuda de una
pipeta evacue cuidadosamente el sobrenadante. Posteriormente someta a evaporacin en
estufa el agua restante a una temperatura de 90C durante 20 horas. Pese los tubos y
vuelva a evaporar hasta que haya alcanzado un peso constante.

5.

CLCULOS Y CONSULTAS:

Calcule y reporte la concentracin de cada una de las diluciones problemas (clulas/ml,

Absorbancia y gr de clula/L) .
Elabore una grfica de No Clulas/ml vs Absorbancia. Calcule el valor de R2
Elabore una grfica de gr de clulas/L vs Absorbancia. Calcule el valor de R2
Consulte y explique otros mtodos utilizados para la medicin de la biomasa
microbiana.
Consulte las ventajas y desventajas de cada uno de las tcnicas utilizadas en el
experimento.
Qu son los colorantes supravitales y para qu se usan?

UNIVERSIDAD DE SUCRE
PROGRAMA DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL
LABORATORIOS DE BIOTECNOLOGA
EXPERIMENTO N 2
DETERMINACIN DE AZCARES REDUCTORES POR EL MTODO
DNS (cido 3,5 - dinitrosaliclico)

1. INTRODUCCIN:
Este mtodo nos ayuda a determinar la presencia de grupos carbonilos libres (C=O) en
los tambin llamados azcares reductores. Esto involucra la oxidacin del aldehdo
presente en el grupo funcional. Simultneamente, en presencia de calor el cido 3,5dinitrosaliclico (DNS) se reduce a cido 3-amino,5-nitrosaliclico bajo las condiciones
alcalinas, desarrollndose un color amarillo caf:
oxidacin
grupo aldehdo

DNS

reduccin

grupo carboxilo

cido 3-amino,5-nitrosaliclico

Se adiciona sulfito (no necesario para la reaccin del cambio de color) en el reactivo para
absorber el oxgeno disuelto, ya que ste puede interferir con la oxidacin de la glucosa.
En la reaccin se muestra que una mol de azcar reaccionar con una mol de DNS. Sin
embargo, no cabe duda que se dan muchas otras reacciones, y la estequiometra de la
reaccin es mucho ms complicada que lo previamente descrito. El tipo de reaccin
lateral depende de la naturaleza exacta del azcar reductor. Diferentes azcares
reductores arrojan distintas intensidades de color ; as, se hace necesario calibrar para
cada azcar. Adems de la oxidacin de los grupos carbonilos en el azcar, otras
reacciones laterales como la descomposicin de azcar tambin compiten para la
disponibilidad del cido 3,5-dinitrosaliclico. Como consecuencia, la carboxymetil celulosa
puede afectar la curva de calibracin alterando la intensidad del color desarrollado.

Este es un mtodo conveniente y relativamente barato, aunque su especificidad es

relativamente baja. Cuando los efectos de compuestos extraos no son conocidos, uno
puede incluir efectivamente el llamado control interno para el desarrollo del color en
muestras desconocidas; entonces, una cantidad conocida de azcar se adiciona a esta
muestra. El aumento en la absorbancia en el segundo desarrollo de color es equivalente a
la cantidad incrementada de azcar. Altas concentraciones de protena interfieren en la
determinacin de los azcares reductores. Otra de las ventajas de este mtodo es que el
color final desarrollado es estable hasta 24 horas, es sencillo y rpido.
2. OBJETIVO:
Aplicar una tcnica sencilla, rpida y eficaz para determinar azcares reductores en
caldos y medios de fermentacin que permitan conocer los rendimientos en sustrato y/o
productos.
3. MATERIALES Y REACTIVOS:
a) Materiales

Tubos de ensayo tapa rosca

Pipetas de 1, 5 y 10 ml
Pipeteador automtico
Auxiliar de pipeteo
Matraz aforado de 1000 ml
Frasco color mbar
Espectrofotmetro
Vortex

b) Reactivos
Solucin del cido 3,5 dinitrosaliclico, 1% :
o
o
o
o
o

DNS: 10 g
Fenol: 2 g
Sulfito de sodio anhidro: 0.5 g
Hidrxido de sodio: 10 g
Aforar a 1 litro con Agua destilada

Conservar refrigerado dentro del frasco color mbar.

 Solucin estndar de glucosa :

Disolver 1 gr. de glucosa anhidra en 1000 ml de agua destilada, conservar en
refrigeracin hasta el momento de usarla.

4. PROCEDIMIENTO:
Establecer una escala estndar de 0 a 1000 ppm. Dentro de una serie de tubos de
ensayo, previamente lavados y sumergidos en solucin de cido sulfrico al 5%
durante una noche, introducir: 0; 0.2; 0.4; 0.6; 0.8; y 1 ml de solucin estndar y
completar a 1 ml con agua destilada. Elabore la siguiente tabla al momento de
registrar los datos:
Tubo
1
2
3
4
5
6

ml. de s/n
estndar
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0

ml. de agua
destilada
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0

Concentracin
final (ppm)
0
200
400
600
800
1000

Absorbancia
(575 nm)
-

La determinacin de azcares reductores es efectuada sobre 1 ml de la muestra

convenientemente diluida. La curva estndar y las muestras sufren las siguientes
operaciones:

Adicionar 1 ml del reactivo DNS

Agitar fuertemente en un vortex
Poner a ebullicin durante 5 minutos
Enfriar rpidamente (bao de hielo)
Adicionar 8 ml de agua destilada dentro de cada tubo
Agitar fuertemente en un vortex
Leer absorbancia a 575 nm.

5. CLCULOS Y CONSULTAS:
Grafique la curva de calibracin (Concentracin vs Absorbancia) para la determinacin
de azcares reductores con el mtodo del DNS. Muestre todos los resultados
obtenidos. Calcule el valor de R2.
Calcule la concentracin en azcares reductores (Glucosa) de la muestra problema.
Consulte otros mtodos utilizados para la determinacin de azcares reductores y
glucosa. Qu ventajas y desventajas presentan para su uso en biotecnologa?
ADVERTENCIA!
El reactivo DNS es altamente txico, cancergeno y abortivo. Mucho cuidado al
manipularlo. Usar siempre guantes de ltex.
6. REFERENCIAS:

UNIVERSIDAD DE SUCRE
PROGRAMA DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL
BIOTECNOLOGA
EXPERIMENTO N 3
DETERMINACIN DE ETANOL POR EL MTODO DE WINNICK

1. INTRODUCCIN:
La determinacin de la cantidad de etanol en los productos obtenidos a partir de la
fermentacin alcohlica es una de las principales preocupaciones del biotecnlogo; ya que
ste es un anlisis que requiere de una dotacin adecuada de equipos de medicin o, por
otro lado, de una cantidad considerable de volumen de muestra, como en el caso del
mtodo de destilacin.
El mtodo de Winnick permite determinar bajas concentraciones de alcohol etlico a
travs de la accin oxidante de la solucin 0.4 N de dicromato de potasio en cido
sulfrico 10N, posterior valoracin con Tiosulfato de sodio.
Se diluye la muestra de forma que la cantidad de dicromato utilizada sea suficiente para
oxidar todo el etanol, formando acetaldehdo; de otra manera debe repetirse la prueba
usando una mayor dilucin de la muestra.
El exceso de dicromato se elimina con yoduro de potasio, el volumen de Tiosulfato de
sodio gastado en titulacin se emplea para determinar el porcentaje de etanol en la
muestra teniendo en cuenta la respectiva dilucin. Las reacciones que se manifiestan en
el proceso son:

2K2Cr2O7 + 8H2SO4 + 3CH6O

K2Cr2O7 + 6KI + 7H2SO4

2Na2S2O3 + 2I

2Cr2(SO4)3 + 2K2SO4 + 3C2H4O2 + 11H2O

Cr2(SO4)3 + 4K2SO4 + 7H2O + 6I

Na2S4O6 + 2NaI

2. OBJETIVO:
Aplicar una tcnica rpida y sencilla para la determinacin de alcohol etlico en caldos de
fermentacin alcohlica que pueda ser usado en determinaciones de velocidad de
reaccin.

3. MATERIALES Y REACTIVOS:
a) Materiales:

Microburetas
Soporte universal
Erlenmeyers de 50 ml
Balones aforados de 250 y 500 ml
Pipetas de 1, 5 y 10 ml
Balanza
Beakers
Varillas de agitacin

b) Reactivos:

cido Sulfrico 10 N
Dicromato de potasio 0.4N en H2SO4 10N
Solucin de Yoduro de potasio 3N (KI)
Solucin reactivo de almidn soluble
Tiosulfato de sodio 0.1 N+

4. PROCEDIMIENTO:
a) Preparacin de Reactivos:

CIDO SULFRICO 10N:

Disolver 138.9 ml de H2SO4 (densidad 1,84 gr/ml y 96% de pureza) con agua destilada
hasta aforar a 500 ml.

ADVERTENCIA ! : Se presenta una reaccin altamente exotrmica; por lo que se debe

adicionar lentamente el cido al agua (nunca lo contrario). Hacer esto con el

baln sumergido en bao de agua con hielo. Al enfriarse la solucin, se produce una
contraccin de volumen que se debe corregir adicionando ms agua destilada hasta
alcanzar el volumen final.

DICROMATO DE POTASIO 0.4 N EN H2SO4 10 N:

Pesar 19.614 gr. de Dicromato de potasio previamente seco a 100C durante 4-6 horas y
disolverlo en el H2SO4 10 N hasta completar un volumen de 1000ml.

SOLUCIN DE YODURO DE POTASIO 3 N:

Disolver 49.8 gr. De yoduro de potasio (KI) en suficiente agua destilada y aforar en un
baln de 100 ml.

SOLUCIN REACTIVO DE ALMIDN SOLUBLE:

Pesar 1 gr. de almidn soluble. Verter lentamente con agitacin constante en 200 ml de
agua destilada hirviente. Hervir hasta obtener un lquido ligero y translcido. Dejar
decantar y usar nicamente el lquido sobrenadante.
En un recipiente limpio y bien tapado, esta solucin puede durar hasta dos meses. El
reactivo es propenso a contaminarse con hongos.

TIOSULFATO DE SODIO 0.1 N:

Preparar a partir de un stock comercial para 1 L de solucin.

b) Determinacin:
Realizar una curva patrn en tubos de ensayo con tapa que contengan 5 ml. de las
siguientes concentraciones: 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14% de etanol. A stas diluciones y a la
muestra se someten al siguiente proceso:
Realizar una dilucin 1:9 (muestra: agua) para cada tubo.

 Adicionar exactamente 1 ml de solucin de Dicromato de potasio 0.4 N en H 2SO4 10 N

dentro de un erlenmeyer pequeo (20-50 ml).
Adicionar 2 ml de la solucin a estudiar
Dejar en reposo durante 5 minutos
Transcurrido el tiempo, adicionar 1 ml de solucin de yoduro de potasio 3N y mezclar.
Adicionar 2 gotas de solucin de reactivo de almidn soluble.
Titular con solucin volumtrica de Tiosulfato de sodio 0.1 N con agitacin cuidadosa
hasta obtener un cambio ntido hacia un color azul marino.
Restar el volumen de Tiosulfato gastado por el blanco al momento de construir la
curva de calibracin.

5. CLCULOS Y CONSULTAS:
Grafique la curva de calibracin para las diluciones de alcohol realizadas. Calcule el
valor R2 y muestre la ecuacin que explique la curva.
Calcule el porcentaje de alcohol de la muestra problema utilizando la curva de
calibracin.
Consulte otros mtodos para determinar alcohol etlico. Explique las ventajas y
desventajas para su uso.

6. REFERENCIAS:

UNIVERSIDAD DE SUCRE
PROGRAMA DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL
BIOTECNOLOGA
EXPERIMENTO N 4
EVALUACIN DE CULTIVOS LCTICOS

1. INTRODUCCIN:
Las Bacterias lcticas tienen la capacidad de fermentar la lactosa contenida en la leche a
cido lctico, como es el caso de
Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc y
Pediococcus. Esta capacidad bacteriana puede ser explotada industrialmente para
obtener productos como el Yogurt y el Kumis. El Yogurt es un producto obtenido por la
simbiosis entre el Lactobacillus bulgaricus y Streptococos thermophylus; los cuales se
pueden obtener de la leche desnatada concentrada por evaporacin.
Una de las etapas ms importantes del proceso de obtencin del producto fermentado es
el cultivo, ya que aporta a la leche las bacterias acidolcticas responsables del proceso
de acidificacin. Este cultivo consta exclusivamente de especies termoflicas; que para
el caso del yogurt son : L. bulgricus y St. Thermophylus. El cultivo no debe contener
especies no termoflicas. La produccin de cada una de las especies vara a lo largo del
proceso; al comienzo es de 1:1 a 2:5. Durante la incubacin se favorece el desarrollo de
St. Thermophylus hasta el punto de alcanzar una proporcin de 5:1 que se equilibra
nuevamente al final del proceso. Por otra parte, el L. bulgaricus proporciona el aroma
caracterstico del yogurt.

2. OBJETIVO:
Conocer y evaluar la fabricacin de cultivos lcticos utilizados en la industria del yogurt a
travs de un seguimiento en el comportamiento de la acidez, el pH, relacin cocos/bacilos
y rendimientos (YP/S , YX/S) a intervalos regulares de tiempo.

3. MATERIALES Y REACTIVOS:
a) Materiales:

Balanza
Frascos tapa rosca de 250 ml
Erlenmeyer de 500 ml
Pipetas de 5 y 10 ml
Pipetas de 1 ml
Tubos de ensayo
pHmetro
Bureta
Bao Mara
Cmara de Neubauer

b) Reactivos:

NaOH 0,1 N
Fenolftaleina 2%
Azul de metileno
Leche descremada en polvo
Cultivo Lctico de Yogurt
Agua destilada estril

4. PROCEDIMIENTO:

4.1. Preparacin del Cultivo.

En 3 frascos con tapa rosca reconstituir 200 ml de leche en polvo descremada (8%,
12%, y 16%)
Pasteurizar en bao mara a 80C por 30 minutos.
Los gramos de leche en polvo se calculan con la siguiente ecuacin:

Volumen total x % deseado

gr de Leche = ----------------------------------------100 - % de Humedad Leche P.
Volumen de agua = Volumen deseado - gr de leche en polvo
Enfriar a 43 C.
Inocular cada concentracin con 3% de cultivo de yogurt. AGITAR BIEN!
Incubar a 43 C por 3 horas. NO AGITAR!
Refrigerar a 4 C por 2 horas. NO AGITAR!
4.2. Actividad Del Cultivo Madre:
Medir el pH cada 30 minutos con ayuda de un pHmetro.
Medir la acidez cada 30 minutos tomando 9 ml del cultivo, adicionar 2 gotas de
fenolftaleina al 2%. Titular con NaOH 0,1 N hasta que persista el color rosa plido
por 30 segundos. Expresar la acidez en porcentaje de cido lctico:

ml NaOH gastado x 0,1N x meq-gr cido lctico

% cido Lctico = --------------------------------------------------------------- x 100
ml muestra

4.3. Relacin Cocos Bacilos:

Realizar conteo en cmara de Neubauer cada 60 minutos y observar la relacin coco bacilo en cada intervalo de tiempo. (Incluir una gota de azul de metileno en la dilucin
para colorear las bacterias)

4.4. Rendimientos ( YX/S, YP/S) :

Realizar los balances de masa respectivos y encontrar los rendimiento de Sustrato en
biomasa (YX/S) y sustrato en producto (YP/S), considerando que para una concentracin
de 12,5 % de slidos existen 4,7% de lactosa.

5. CLCULOS Y CONSULTAS:

Grafique el incremento de slidos Vs acidez.

Grafique el incremento de slidos Vs pH
Grafique el incremento celular de cada bacteria en funcin del tiempo
Calcule los respectivos rendimientos para cada intervalo de tiempo y muestre los
rendimientos globales de la fermentacin. Compare resultados.

Qu problema representa el hecho de encontrar levaduras, en alto porcentaje, en

productos como el yogurt?
Qu efecto tiene en el pH y la acidez en el aumento de slidos dentro de un cultivo
lctico?

6. REFERENCIAS:

UNIVERSIDAD DE SUCRE
PROGRAMA DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL
BIOTECNOLOGA
EXPERIMENTO N. 3
EVALUACIN DE LA PRODUCCIN DE VINO DE FRUTAS

1. INTRODUCCIN:
La historia de la fermentacin se remonta ms all de nuestros conocimientos. El
hombre, tal como lo conocemos; es decir, el hombre que trabaja y lucha, aparece en la
escena con una jarra de vino. Su realidad vincola se aproxima ms a nuestra experiencia
de vida con la expansin de la dominacin griega, iniciada 1000 aos a. C., fue entonces
cuando el vino lleg por primera vez a los pases en los que se sentara su verdadero
hogar: Italia y Francia. Los ltimos noventa aos han presenciado la revolucin industrial
de los licores y, sobre todo, en los ltimos 25 aos el fundamento cientfico de la
elaboracin de los licores ha clasificado la situacin de tal modo que tcnicas que antes
parecan imposibles hoy son fciles de realizar.
Los microorganismos que intervienen en la fermentacin del vino son principalmente
levaduras del gnero Saccharomyces, y dentro de este gnero, la especie que ha sido
tradicionalmente utilizada es S. Cerevisiae. Var. Ellipsoideus
La fabricacin del vino ms que ciencia es un arte. Aunque la uva es la fruta comnmente
ms usada, tambin pueden usarse muchas otras frutas como los melocotones, ciruelas,
manzanas y duraznos para la fabricacin de vinos. Los procedimientos de fabricacin del
vino de uva casero son bastante sencillos. Simplemente se inocula el jugo de la uva con un
cultivo iniciador de levaduras adquirido en un supermercado. La fermentacin primaria
tarda aproximadamente una semana; durante ese tiempo la mayora del azcar
originalmente presente en el jugo se convierte en etanol por accin de las clulas de
levadura, al mismo tiempo se produce dixido de carbono. El exceso de clulas de
levadura son posteriormente removidas del mosto de uva junto con otros sedimentos, y
una fermentacin secundaria ms lenta permite desarrollar el sabor final del vino. Puede
adicionarse azcar (sacarosa o glucosa) para lograr alcanzar el porcentaje de alcohol
deseado o para modificar el sabor del vino. El tipo de vino puede ser clasificado segn el
color del vino. Otra clasificacin est basada en el contenido de azcar presente en el
producto final, como se muestra en la tabla 1.

Tabla 1. Clasificacin de vinos segn el contenido de azcar.

TIPO DE VINO
Vino Seco
Vino semi dulce
Vino Dulce

GRAVEDAD ESPECFICA
1.085 1.100
1.120 1.140
1.140 1.160

CONT. DE AZCAR (%P/P)

21 25
29 33
33 - 37

2. OBJETIVO:
Evaluar el efecto del contenido de azcar (Fructosa) en el proceso de la fermentacin
del vino de frutas.
3. MATERIALES Y REACTIVOS:
a) Materiales:

Fermentador estril de 1 L. (Erlenmeyer)

Manguera estril
Gasa estril
Cinta de enmascarar y bistur
Rollo de papel aluminio
Beaker de 500 ml
Colador
Mortero grande
Pipetas estriles de 1, 5 y 10 ml.
Bao mara
Tubos de ensayo estriles

b. Reactivos:

4 Kg. de Uvas o corozo, manzana, mango, pia, maracuy

Fructosa
Levadura para vino (Saccharomyces cerevisiae)
Azufre en polvo o Metabisulfito de sodio
Agua destilada

4. PROCEDIMIENTO:
Seleccionar las uvas alto grado de madurez (12 15 Brix) y sanidad. Lavar la uva con
abundante agua. Quitar manualmente las pepas de la fruta. Macerar manualmente
(Usar guantes) en un recipiente grande para sacar el jugo de la uva (mosto).
Curar el fermentador, previamente limpio y estril, con sulfuroso. Pesar 1 gr. de
Azufre y cubrirlo con un pedazo de algodn alrededor de una varilla delgada. Quemar
el azufre y flamear en el interior del fermentador con los gases sulfurosos para
evitar la posterior contaminacin del vino. Evitar un exceso de sulfuroso en el
fermentador que pueda alterar las caractersticas organolpticas. En su defecto, se
puede usar Metabisulfito de sodio al 1,5% para el curado del fermentador
esparciendo esta solucin por toda la superficie del recipiente.
Verter el mosto de uva en el fermentador, adicionar agua en relacin 2:1 (Mosto :
Agua). Adicionar la cantidad de fructosa correspondiente a cada ensayo y agitar.
(Ver tabla).
Sacar la muestra inicial y determinar: Azcares reductores, %Alcohol, pH y Acidez.
Ensayo
1
2
3

Conc. de Fructosa adicionada (gr/L)

50
100
200

Pasteurizar el mosto en bao mara a 65C durante 20 minutos. Agitar suavemente 2 o

3 veces para distribuir el calor.
Enfriar en bao de hielo hasta temperatura ambiente (28 30C)
Inocular el mosto con un preinculo de Levadura S. Cerevisiae para vino (2%). .
Adicionar al fermentador y agite hasta disolver.
Tapar el fermentador con la gasa estril (Bien ajustada) y conectar la manguera como
se muestra en la figura.
Permitir que se realice la fermentacin primaria por un periodo de 8 das.
Luego de los 8 das, realizar un frotis del velo de crecimiento y colorear con azul de
lactofenol, observe la morfologa; realice una siembra en agar malta; incube durante 5
das a temperatura ambiente y anote los resultados obtenidos.
realizar un trasciego del mosto (separar el vino del sedimento acumulado en el fondo
del fermentador, evitar la agitacin) a otro fermentador en las mismas condiciones de
esterilidad y curado.
Ajustar nuevamente todos los accesorios y continuar con la fermentacin secundaria
por un periodo de 8 das ms. Realizar otro Frotis para observar la morfologa
microbiana.

MONTAJE DEL FERMENTADOR PARA LA PRODUCCIN DE VINO

TAPN O GASA

MANGUERA ESTERIL

MOSTO

AGUA DESTILADA

FERMENTADOR
Al cabo de los 8 das, realizar otro trasciego y finalmente dejar fermentar por 2
semanas ms.
Filtrar el vino obtenido, lo ms higinicamente posible con ayuda de un papel filtro y
utilizando una bomba de vaco.
Pasteurizar a 65C por 20 minutos. Posterior enfriamiento a 4C.
Degustar el vino y anotar sus caractersticas sensoriales.
Envasar el restante en botellas de vidrio oscuro y permitir su envejecimiento.
Determinar en cada trasciego: Azcares reductores, porcentaje de alcohol etlico,
pH y acidez expresada en cido lctico.
NOTA: Todo material que entre en contacto con el caldo de fermentacin debe estar
previamente estril para evitar una contaminacin. Utilice siempre el mechero para sacar
las muestras.
5. CLCULOS Y CONSULTAS:
A travs de un grfico de barras analice los resultados obtenidos entre la
concentracin de azcar adicionada Vs. Porcentaje de alcohol obtenido.
A travs de un grfico de barras analice los resultados obtenidos entre la
concentracin de Azcares reductores Vs. %Alcohol.
Calcule los rendimientos de sustrato en producto (Yp/s) puntuales y globales de cada
ensayo. Analice los resultados.
Realice los balances de masa de cada proceso y calcule los rendimientos de cada uno.
Incluya costos - beneficios.

 Cmo evitar la contaminacin por bacterias acticas en la produccin industrial de

vino?
Cules son los principales defectos fsicos de los vinos?
Qu anlisis organolpticos le hara a un vino?
Qu diferencia existe entre un vino espumoso y un vino tradicional?
Qu exigen las normas ICONTEC para la calidad de los vinos?
6. REFERENCIAS:

UNIVERSIDAD DE SUCRE
PROGRAMA DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL
BIOTECNOLOGA ALIMENTARIA
EXPERIMENTO N 6
CINTICA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO EN FERMENTACIN BATCH
SUMERGIDA
1. INTRODUCCIN:
El conocimiento de la cintica del cultivo permite predecir el desarrollo de la
fermentacin y evaluar rendimientos y productividades, datos importantes en el diseo
de estrategias de produccin y optimizacin de procesos. Las clulas consumen los
nutrientes requeridos para crecimiento y los convierten en nuevas clulas y productos
metablicos. La velocidad de estos procesos vara con el desarrollo del cultivo. A medida
que las clulas crecen se acumulan en el medio los productos finales del metabolismo
celular. Frecuentemente, estos componentes alteran el pH y la reologa del medio;
factores decisivos sobre la actividad celular y los mecanismos de transporte.
El procedimiento apropiado para una fermentacin batch es, primero que todo, inocular
un frasco pequeo de caldo nutriente con un cultivo puro; ya sea de una caja de petri,
tubo de cultivo lquido o tubo inclinado con agar slido. El frasco inoculado debe agitarse
constantemente a temperatura controlada. Una vez alcanzada la fase de crecimiento, se
inocula una pequea cantidad de medio de cultivo de este frasco a otro de mayor volumen.
Este proceso se repite una o dos veces ms con el objetivo de adaptar la cepa microbiana
a las condiciones y nutrientes del medio a utilizar en el estudio de la cintica
fermentativa. Un proceso similar se lleva a cabo a nivel industrial, de tal manera que se
van aumentando los volmenes de medio para, finalmente, ser inoculado al fermentador
de mayor volumen.
Cuando se trabaja con cultivos puros, se debe operar con el cuidado de evitar la
contaminacin que puede presentarse por cualquier exposicin al aire, agua, tacto, etc.;
de tal manera que, todo elemento que entre en contacto con el interior del fermentador
debe ser previamente esterilizado.

2. OBJETIVO:
Estudiar la cintica del crecimiento de Saccharomyces cerevisiae en fermentacin batch
sumergida y determinar experimentalmente los parmetros cinticos de la ecuacin de
Monod.
3. MATERIALES Y REACTIVOS:
a) Materiales:
Erlenmeyer de 1L
Agitador magntico
Manguera de venoclisis estril
Jeringas desechables de 5 ml
Tapones de caucho con orificios
Balanza analtica
Tubos de ensayo previamente secos por 24 horas.
Bistur
Silicona
b) Reactivos:
Levadura (Saccharomyces cerevisiae)
C6H12O6 (Glucosa anhidra)
NaNO3
K2HPO4
MgSO4.7H2O
KCl
FeSO4.7H2O
CaCl2
(NH4)2SO4
4. PROCEDIMIENTO:
a) Preparacin del preinculo:
Inocular aproximadamente 2 gr. de levadura en 300 ml de medio de cultivo (diseado
segn necesidades nutricionales de la levadura y utilizando los nutrientes disponibles).
Agitar. Incubar a 28-30 C por 18 24 horas.
c) Diseo, Formulacin y preparacin del medio nutriente:

 Utilizando la composicin de una levadura tpica y la disponibilidad de los nutrientes

antes mencionados, disear el medio de crecimiento que ser utilizado para la
produccin de 8 gr de levadura /L de medio. (Traer clculos listos).
Introducir los nutrientes en un fermentador (erlenmeyer) de 1 L, adicionar agua
destilada hasta completar 720 ml (Tener en cuenta el 2% de prdidas en la
esterilizacin). Agitar muy bien con una varilla de vidrio; si es necesario, se debe
calentar un poco mientras se agita.
Tapar el fermentador con una gasa y esterilizar en autoclave a 121C, 15 PSI durante
15 minutos.
c) Inoculacin y Fermentacin:
Inocular el fermentador con 80 ml de preinculo (10% del volumen final). Realizar
este paso lo ms aspticamente posible.
Instalar los accesorios del fermentador aerobio; (ver figura).
Realizar la fermentacin a 28 C, 300 rpm, y 1,5 vvm (Volumen de aire por volumen de
medio por minuto) durante 36 horas continuas.
Determinar cada 2 horas: Peso seco celular (X) y Concentracin de Glucosa (S).
MONTAJE DEL FERMENTADOR BATCH

Muestreo

Bomba de
Aire

Agitador
magntico

Trampa de
gases

5. CLCULOS Y CONSULTAS:
Graficar Log. [X] Vs. Tiempo. Analizar el comportamiento.
Graficar [S] Vs. Tiempo. Analizar el comportamiento.
Determinar experimentalmente los parmetros cinticos de la ecuacin de Monod:
Velocidad especfica de crecimiento (max.), Constante de saturacin (Ks) y el
rendimiento de sustrato en biomasa (Yx/s).
Aplicar los mtodos integral y diferencial (utilizar las relaciones lineales de
Lineweaver-Burk, Langmuir y Eadie-Hofstee) de anlisis del modelo de Monod en la
fase exponencial del crecimiento microbiano.
Qu se entiende por crecimiento diuxico?. Explique.

NOTAS:
Lleve todos los materiales necesarios para el experimento: Bata, tapaboca, gorro,
alcohol, algodn, mangueras, silicona, jeringas, bistur, etc.
Siempre tenga presente la prudencia dentro del laboratorio y no olvide las normas de
bioseguridad: No comer, no fumar, no dormir, mantener la calma ante situaciones de
peligro y actuar siempre con conciencia...
Trabaje en orden y mantenga siempre limpio y despejado su lugar de trabajo; evite la
contaminacin visual y auditiva.
Organice previamente con sus compaeros la distribucin de espacios y tiempos en el
trabajo prctico. Lleve una tabla organizada de registro de datos y distribuyan
homogneamente los turnos de trabajo.

6. REFERENCIAS:

UNIVERSIDAD DE SUCRE
PROGRAMA DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA
EXPERIMENTO N 7
EVALUACIN DE LA PRODUCCIN DE VINAGRE DE FRUTAS
(FERMENTACIN ACTICA)

1. INTRODUCCIN:
La fermentacin actica es la oxidacin del alcohol etlico a cido actico por bacterias
que tienen esta capacidad y muestran un alto rendimiento como el Acetobacter aceticum,
A. Schuzenbachii y A. Curvum. El vinagre es una solucin acuosa de cido actico, se
obtiene mediante la fermentacin por oxidacin de una solucin diluida de etanol. El
proceso metablico se basa en la conversin, bajo accin de la alcohol deshidrogenasa, en
acetaldehdo y del acetaldehdo hidratado en cido actico por la accin de la
acetaldehdo deshidrogenasa:
C2H5OH ---- CH3CHO + H2O

CH2CH(OH)2 ---- CH3COOH + H2O

Consecuentemente se requieren 2 etapas; una anaerobia de produccin de etanol con

levaduras y otra aerbica para su oxidacin con Acetobacter sp. El vinagre es descrito
como un producto derivado por fermentacin con un contenido mnimo de 4% (p/p) de
cido actico y caracterstico sabor derivado de la materia prima utilizada. As existen
vinagres de frutas, miel, malta, vino, sidra, etc; siendo los tres ltimos los ms comunes.
Como producto de partida para su obtencin se recomienda el etanol, que se obtiene por
fermentacin de las levaduras como Saccharomyces cerevisiae. En la segunda fase el
alcohol producido es oxidado por las bacterias acticas formndose cido actico, poco
aldehdo, steres y acetona que le comunican sabor.
En los procesos modernos, se emplean casi que exclusivamente, como materia prima,
alcoholes baratos que proceden de industrias de fermentacin o alcohol etlico sinttico
en solucin acuosa de 4 a 11 volmenes, enriquecido con melaza de caa o remolacha,
fuentes inorgnicas, oligoelementos y biocatalizadores.

2. OBJETIVO:
Evaluar el proceso de obtencin de vinagre de frutas (Pltano, banano o mango),
realizando un seguimiento a sus variables ms importantes: Alcohol, acidez, pH, Aireacin
y examen microscpico.

3. MATERIALES Y REACTIVOS:
a)

Materiales:
Licuadora
Cuchillos
Coladores
Recipientes grandes
Frasco de vidrio con tapa (Fermentador)
Gaza
Beakers
Erlenmeyers de 100 ml
Pipetas estriles de 1, 5 y 10 ml
Portaobjetos
Buretas
pHmetro
60 cm de manguera de 1/2 de dimetro.

b)

Reactivos:
Pltanos, bananos y mangos bien maduros (4 Kg. de cada uno)
NaOH 0,1N
Fenolftalena
Sobre de levadura (Saccharomyces cerevisiae)
Cepa de Acetobacter sp.
Reactivos para determinar alcohol
2. PROCEDIMIENTO:

Seleccionar frutas con un alto ndice de madurez, libres de enfermedades y ataque de

insectos.
Licuar, a baja velocidad, la fruta que ha sido previamente lavada y pelada hasta
obtener 3 litros de zumo. Si es necesario, adicione agua en relacin 2:1 (Zumo:Agua).

 Pasteurizar los 3 litros de zumo de fruta a 65C por 20 minutos. Enfriar a 28 -30C
en un bao de hielo a 4C. Uno de los grupos debe trabajar con la flora nativa de la
fruta; por lo tanto no debe pasteurizar, como tampoco inocular.
Diluir 2 gr. de levadura comercial en 300 ml de mosto, agitar bien.
Inocular la dilucin de levaduras en el resto del mosto, agitar bien. Determinar la
concentracin de alcohol, acidez expresada en cido actico y pH inicial.
Realizar un orificio de 1 pulgada de dimetro a la tapa del fermentador, introducir la
manguera de desfogue y rellenar el espacio con gasa bien ajustada. Realizar una
trampa de gases. Tapar bien el fermentador y permitir que ocurra la fermentacin
alcohlica durante 8 das a 28-30 C.
Finalizado el tiempo de fermentacin alcohlica, determinar la concentracin de
alcohol alcanzada (debe estar entre 10 14%, si es necesario estandarice utilizando
alcohol etlico) , el pH final (debe estar entre 3-4, ajustar si es necesario).
Determinar estas variables cada 4 das una vez empezado el proceso.
Finalizada esta etapa, el lquido claro se transvasa e inocula con Acetobacter aceti.
(diluir esta bacteria en un 5% del mosto y agitar bien).
Tapar el fermentador con una gasa para dejar entrar oxgeno al proceso. Permitir que
se d la fermentacin
actica hasta alcanzar un 4-5% de cido actico
(aproximadamente 2 semanas).
Filtrar el vinagre obtenido con papel filtro o un cedazo fino y determinar %de acidez,
pH, alcohol residual y examen microscpico (realice un frotis de la Acetobacter en
medio YGC).
Pasteurizar a 65C por 20 minutos. Enfriar inmediatamente en un bao de hielo a 4C.
Envasar en botellas de vidrio transparente previamente esterilizadas.

3. CLCULOS Y CONSULTAS:
Graficar el desarrollo de: %alcohol, %acidez y pH Vs. Tiempo para cada etapa del
proceso (Fermentacin alcohlica y actica).
Calcule los rendimientos obtenidos para este proceso, segn la fruta utilizada.
Qu controles deben realizarse a lo largo del proceso de acetificacin y por qu?
Qu alteraciones pueden presentarse durante el proceso de elaboracin del vinagre
de frutas?. Cmo se pueden evitar estas alteraciones?. Explique.
Qu parmetros de calidad exige el ministerio de salud en materia de vinagre de
frutas?

6. REFERENCIAS:

UNIVERSIDAD DE SUCRE
PROGRAMA DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA
EXPERIMENTO N 8
DETERMINACIN DEL COEFICIENTE VOLUMTRICO DE TRANSFERENCIA DE
OXGENO (KLa)

1. INTRODUCCIN:
En los procesos de fermentacin aerbicos es necesario un suministro adecuado de
oxgeno que satisfaga los requerimientos metablicos de los organismos empleados. La
oxidacin de la fuente de carbono y su transformacin en clulas, productos y CO 2
establece una demanda de oxgeno que es esencial satisfacer a travs de la aireacin y
mezclado del cultivo. Es indispensable conocer los requerimientos de oxgeno del cultivo
para asegurarse de que su suministro sea suficiente.
En una fermentacin aerbica por lotes la masa celular y por consiguiente la demanda de
oxgeno aumenta exponencialmente. En estas condiciones generalmente no es posible
mantener constante la concentracin de oxgeno disuelto (CL)
en el caldo de
fermentacin, por la necesidad de equilibrar la velocidad de demanda de oxgeno (VDO)
con la velocidad de transferencia de oxgeno (VTO) mediante la manipulacin de las
variables de operacin.
El oxgeno suministrado usualmente mediante burbujeo de aire al caldo es transferido
desde una burbuja hacia el lquido y luego hacia la pared celular y a travs de la pared.
La mayor resistencia a la transferencia de oxgeno se presenta en la superficie de
separacin gas-lquido entre la burbuja y el volumen del lquido. Este fenmeno se
manifiesta mediante una diferencia de concentraciones que limita la velocidad de
transferencia de oxgeno:
VTO = dCL / dt = KLa. (C* - CL)
Donde, VTO: velocidad de transferencia de oxgeno g/(litro. s) ; KLa : coeficiente
volumtrico de transferencia de masa, s-1 ; C* : Concentracin de oxgeno en el caldo, g/L

2. OBJETIVO:
Determinar y evaluar el coeficiente volumtrico de transferencia de oxgeno (K La) en un
caldo de fermentacin con variaciones en la velocidad de agitacin utilizando el mtodo
dinmico de desgasificacin.
3. MATERIALES Y REACTIVOS:
a)

Materiales:
Fermentador de 1 Litro de capacidad
Medidor de oxgeno disuelto (Oxmetro)
Gasa
Mangueras para suministro y salida del aire
Jeringa para toma de muestras
Silicona
Cronmetro
Agitador magntico
Sistema de aireacin
Cmara de Neubauer
Microscopios

b) Reactivos:
Cepa de levadura (Saccharomyces cerevisiae)
Caldo de fermentacin (igual que en el experimento N6)
4. PROCEDIMIENTO:
Inocule en un 10% del volumen de fermentacin el preinculo de levadura (24 horas de
adaptacin) en el fermentador de 1L que contiene el caldo de fermentacin estril.
Realice el arreglo correspondiente de los accesorios del fermentador (mangueras,
tapn, agitador, suministro de oxgeno, etc).
Antes de accionar el suministro de aire, realice una lectura del oxgeno disponible con
el sistema agitado.
Suministre la mayor cantidad de aire posible (1-2 vvm). Espere que el sistema logre
estabilizarse en cuanto a la concentracin de oxgeno disuelto (10 minutos).
Asuma el tiempo cero y comience a medir cada 10 segundos el oxgeno disuelto
durante 10 minutos continuos.

 Suspenda el suministro de aire y continu midiendo la misma variable (cada 5

segundos) hasta alcanzar una concentracin de oxgeno disuelto similar a la inicial
cuando el sistema no era aireado.
Reiniciar la aireacin y anotar inmediatamente (cada 5 segundos) la concentracin de
oxgeno disuelto hasta alcanzar la concentracin del tiempo cero.
Nota: Cada grupo de trabajo realizar la experiencia a una velocidad de agitacin
diferente: 300, 600 y 900 rpm.

MONTAJE DEL SISTEMA

Filtro

OXMETRO

Sensor
Filtro
Bomba de
Aire

Agitador
magntico

Trampa de
gases

5. CLCULOS Y CONSULTAS:
Grafique CL Vs. Tiempo. Utilice todos los resultados continuos del proceso.
Calcule la velocidad de respiracin del cultivo [(O2).x].
Reporte las diferencias entre la transferencia de oxgeno hacia la solucin y la
demanda de oxgeno por la respiracin del cultivo [KLa.(C* - CL) - (O2).x].

 Calcule el coeficiente volumtrico de transferencia de oxgeno (KLa) para el cultivo

sumergido en fermentacin batch de la Saccharomyces cerevisiae en glucosa.
Compare el resultado obtenido con el reportado en la bibliografa. Analice las
diferencias si las hay.
Consulte las principales ventajas y desventajas que pueda tener este mtodo en
comparacin a los otros que ya usted conoce.
Qu otros factores pueden alterar el valor del KLa en un sistema de fermentacin?.
Explique.

6. REFERENCIAS:

UNIVERSIDAD DE SUCRE
PROGRAMA DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA
EXPERIMENTO N 9
OBTENCIN DE ENZIMAS (GLUCOAMILASA DEL A. niger)

1. INTRODUCCIN:
Cada microorganismo produce una gran variedad de enzimas, la mayora de las cuales slo
se fabrican en pequeas cantidades y estn implicadas en procesos celulares. Sin
embargo, algunos microorganismos producen ciertas enzimas en mayores cantidades y en
lugar de mantenerlas dentro de la clula, la excretan al medio. Habitualmente, las
enzimas extracelulares son capaces de digerir materiales nutrientes insolubles tales
como celulosa, protena y almidn, siendo transportados los productos de la digestin al
interior de la clula, en donde son utilizados como nutrientes para el crecimiento.
Comercialmente se producen enzimas, procedentes de bacterias y de hongos; el proceso
usualmente es aerbico. Generalmente la enzima se forma en pequeas cantidades
durante la fase activa de crecimiento, pero se acumula en grandes cantidades durante la
fase estacionaria del crecimiento.
El Aspergillus niger es un hongo filamentoso perteneciente a los Deuteromicetos (hongos
imperfectos) y se encuentra presente en la microflora del aire. El A. niger es
denominado comnmente Moho negro. Las especies de los Aspergillus producen
numerosas enzimas extracelulares muy utilizadas en biotecnologa.
Muchas especies de Aspergillus se desarrollan bien a 37C, siendo el rango global de
temperatura entre 25 37C. Estos mohos se desarrollan a concentraciones cidas altas
y variadas, pH entre 2 y 9, siendo 5,5 el ptimo. El A. niger es considerado un
microorganismo GRAS (seguro) para la produccin de enzimas utilizadas industrialmente;
tales como: -amilasa, glucoamilasa, celulasa, pectinasa, catalasa, glucosaoxidasa,
proteasa y lipasa.

2. OBJETIVOS.
Obtener un extracto crudo de la enzima glucoamilasa a partir de una fermentacin batch
sumergida del Aspergillus niger .
3. MATERIALES Y REACTIVOS:
a) Materiales.

Fermentador de 500 ml
Agitador magntico
Bomba de aire
Manguera de venoclisis y suministro de aire
Bistur
Guantes estriles
Gasa
Algodn
Silicona
Jeringa
Cmara de Neubauer

b) Reactivos

NaOH 0.1 N
HCl 0,1N
Solucin salina estril (0,85%)
Agua estril
Medio de crecimiento (descrito abajo)

4. PROCEDIMIENTO
a) PREPARACIN DEL MICROORGANISMO:
La cepa pura de Aspergillus niger debe ser repicada en agar PDA y/o Saboreau para
su correspondiente masificacin y conservacin. Se incubar a 30C durante 4-5 das.
posteriormente, si no es utilizada de inmediato, se conservar en refrigeracin a 4 C
hasta el momento de usarse.

b) MEDIO DE CRECIMIENTO:
Para la produccin de la biomasa y de la enzima en estudio, el A. niger se har crecer en
un medio lquido compuesto por:
-

KNO3
KCl
MgSO4.7H2O
FeSO4
Peptona
Maltosa
Agua destilada
Tween 80
Aceite
pH final

2gr.
0.5gr.
1gr.
0.02 gr.
20 gr.
20 gr.
1L
0.1 %
0.1%
5.5

c) FERMENTACIN:
-

La inoculacin al fermentador de 300 ml se realiza raspando suavemente una caja de

agar que contenga el hongo sobre una solucin salina isotnica estril; adicionndolo al
medio de cultivo antes mencionado en una concentracin del 10%. Tratar de alcanzar
una concentracin inicial de esporas del orden de 2 5 x 107 esporas/ ml, contadas en
cmara de Neubauer.

Realizar el montaje del fermentador para un sistema aireado y agitado como se ha

construido en los experimentos anteriores. (300 rpm y 1.8 vvm).

Permitir que ocurra la fermentacin por un periodo de 96 horas bajo las condiciones
antes anotadas. Tomar muestras cada 24 horas para rectificar el pH del medio
(Ajustar si es necesario utilizando base o cido).

Despus de las 96 horas de fermentacin, determinar la concentracin de biomasa

lograda y filtrar el caldo de fermentacin con ayuda de una bomba de vaco; de tal
forma que se logre la separacin del micelio y del extracto de enzimas.

Centrifugar el extracto obtenido a 2500 rpm x 15 minutos (previo enfriamiento a 46C para evitar desnaturalizacin de la enzima). Descartar el residuo.

Guardar el extracto en refrigeracin para determinarle su actividad enzimtica en el

prximo experimento.

ADVERTENCIA !
Tener mucho cuidado al manipular las esporas del hongo. Use siempre la bata, tapaboca y
gorro. Lvese bien las manos antes de salir del laboratorio.

5. CLCULOS Y CONSULTAS:
Calcule los rendimientos de sustrato en producto obtenidos (Yp/s)
Calcule los rendimientos de sustrato en biomasa obtenidos (Yx/s)
Consulte qu otros microorganismos son utilizados para la produccin de glucoamilasa.
Consulte el diagrama de flujo utilizado a nivel industrial para la obtencin de esta
enzima.
Investigue en qu procesos es utilizada esta enzima.

6. REFERENCIAS:

UNIVERSIDAD DE SUCRE
PROGRAMA DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA
EXPERIMENTO N 10
DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA Y PARMETROS DE LA
ECUACIN DE MICHAELIS-MENTEN (Vmax y Km)

1. INTRODUCCIN:
La bsqueda de informacin para encontrar informacin para determinar las propiedades
de las enzimas, para su uso a nivel industrial en el diseo de bioreactores es necesario
discriminar modelos que nos permitan calcular la velocidad intrnseca de reaccin, uno de
los modelos mas usados son los modelos de Michaelis Menten y Briggs y Haldane.
El mecanismo del modelo de Michaelis - Menten se puede describir de la siguiente
manera:
ES

k1

k2

ES

k3

EP

k4

E : Enzima
S: Substrato
ES: Complejo enzima-substrato
P : Producto
K : Constantes de reaccin.
Cuando se mezcla la enzima mas el substrato, se forma un complejo ES e
inmediatamente, se rompe para formar E + S e E + P . Para Conseguir el modelo
matemtico, Michaelis - Menten se asume lo siguiente:
a El estudio se basa en velocidades iniciales, la concentracin de producto en este
caso puede ser considerada despreciable, de forma que la reaccin inversa prcticamente
ocurrir.
b la mezcla de enzima con el substrato ocurre la formacin de un complejo ES, que
d [ ES ]
0
permanece a una concentracin constante,
dt
complementando tenemos:

d [ ES ]
[ E ][S ]K1 [ E ][ P]K 4 [ ES ]K 2 [ ES ]K 3 0
dt

K 2 K 3 [ E ][S ]

Km
K1
[ ES ]
Nota: la constante Km, es la
constante de Michaelis-Menten, puede ser
aproximadamente igual la constante de disociacin del complejo [ES], as la constante K 3
es generalmente menor que K1 y K2, asi mismo:
Km

K 2 K3 K 2

K1
K1

Por otro lado, el total de enzima que participa en la reaccin [Eo] es igual a suma de la
enzima libre [E] con una enzima en forma de complexo [ES], que ser:

E 0 E ES
Visto as K3 es menor que K1 e K2, la transformacin de ES en E + P ser la etapa
limitante del proceso, que es
v K 3 E 0

De la misma forma, toda la enzima esta participando da reaccin, entonces la velocidad

de reaccin estar en su mximo:
v max K 3 E 0

entonces tenemos:

[ E ][ S ]
v
[ ES ]
Km

v max [ Eo ] [ E ] [ ES ]

v v max

[ E ][ S ]
[S ]
Km

[ E ][S ] Km [ S ]
[E]
Km

[S ]
: Ecuacin de Michaelis-Menten
Km [ S ]

De esta ecuacin se tiene que:

Se [S] >> Km v = v max (reaccin de orden cero)

Se [S] << Km v

v max
[ S ] (reaccin de primer orden)
Km

v max
Km = [S]
2
La determinacin de las constantes Km e v max de Ecuacin de Michaelis-Menten difcil
de ser obtenida a partir do grfico v = fs (s), pues v max es una asintota sujeta a
grandes imprecisiones. Existen maneras mas prcticas de se obtener estas constantes,
siguiendo la tcnica de linearizacion de ecuacin. Existen 3 tipos corrientes de
linearizaion para a ecuacin de Michaelis-Menten: Ecuacin de Lineweaver- Burk,
Ecuacin de Eadie-Hanes y ecuacin de Hofstee,

Se v

2. OBJETIVO:
Medir la actividad enzimtica de una glucoamilasa fngica (A. niger) y los parmetros de
Michaelis-Menten (Vmax y Km) en diferentes condiciones de reaccin (Concentracin de
sustrato, Velocidad de agitacin y temperatura).
3. MATERIALES Y REACTIVOS:
a) Materiales:

Biorreactor de 500 ml (Erlenmeyer)

Agitador magntico
pHmetro
Balanza analtica
Balones aforados
Estufa
Pipetas
Termmetros

b) Reactivos:

Maltosa
Bufer citrato y fosfato
NaOH 0,1N
HCl 0,1N

 DNS

4. PROCEDIMIENTO:
Preparar 5 soluciones de maltosa con las siguientes concentraciones: 5%, 10%, 15%,
20% y 25% en biorreactores de 500 ml.
Estabilizar el pH a 4,3 con una solucin Buffer citrato; HCl o NaOH 0,1N;
dependiendo del pH inicial.
Estabilizar la temperatura de biorreaccin segn se asigne a cada grupo (25C, 45C y
65C).
Estabilizar la velocidad de agitacin segn se asigne a cada grupo (200, 400 y 600
rpm).
Realizar una dilucin en agua destilada (1:50) de la enzima glucoamilasa fngica a
utilizar (densidad 1,2 gr/ml).
Adicionar 1 ml de solucin enzimtica en cada biorreactor agitado continuamente bajo
las condiciones ambientales de cada trabajo.
Tomar, exactamente, 1 ml de muestra en los siguientes tiempos: 0, 5, 10, 15, 20, 25, y
30 minutos de biorreaccin.
Inactivar la enzima en agua hirviendo (100C) durante 5 minutos, posterior choque
trmico en bao de hielo (4C).
Determinar la concentracin de glucosa (Producto) presente en cada muestra
utilizando la tcnica del DNS.

5. CLCULOS Y CONSULTAS:

 Calcular la actividad enzimtica de la glucoamilasa fngica (A. niger) expresada en U.I

(cantidad de la enzima que produce 1 mol de glucosa/minuto) y en AGU (1 AGU es la
cantidad de enzima que fragmenta 1 mol de maltosa/minuto).
Calcular el nmero de recambio de la enzima (# molculas de sustrato transformadas
por unidad de tiempo por molcula de enzima).
Graficar la formacin de producto en funcin del tiempo ( [P] vs [t] ) y calcular las
velocidades iniciales para cada concentracin de sustrato.
Graficar las velocidades iniciales en funcin de cada concentracin de sustrato ( [Vel.]
vs [S] ).
Determinar los parmetros de Michaelis-Menten (Vmax y Km) utilizando los mtodos
de Limeweaver-Burk, Eadie-Hofstee y Langmuir.

6. REFERENCIAS:

UNIVERSIDAD DE SUCRE
PROGRAMA DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL
LABORATOIOS DE BIOTECNOLOGA
EXPERIMENTO N 11
DETERMINACIN DE PROTENAS POR EL MTODO DE LOWRY

1. INTRODUCCIN:
Las protenas reaccionan con el reactivo de Folin Ciocalteu para dar un complejo de
color azul (debido a la reaccin del cobre alcalino con la protena). La intensidad del color
depende del nmero de aminocidos aromticos y enlaces peptdicos presentes. El color
cambiar segn la clase de protena. La solucin azul muestra una absorbancia mxima a
750 nm.
Las variaciones por este mtodo pueden ser debidas por el pH, el tiempo de la reaccin,
la concentracin de los reactivos o las interferencias de sustancias como azcares y
productos celulsicos. En este mtodo el color no es estrictamente proporcional a las
concentraciones ms altas de protenas. Este mtodo es desaconsejable cuando las
muestras presentan un fuerte contenido de ligno celulosa y/o contienen fenoles;
adems, tiene un rango de linealidad entre 0 300 mg/L . Dentro de sus principales
ventajas est el permitir la medicin del contenido de protenas en fracciones
enzimticas, mediciones en mezclas de tejidos con protenas y mediciones de cantidades
muy pequeas de protenas o de soluciones muy diluidas.

2. OBJETIVO:
Ofrecer al estudiante una tcnica rpida y sencilla para la determinacin de protenas
enzimticas en caldos de fermentacin.

3. MATERIALES Y REACTIVOS:
a) Materiales:

Espectrofotmetro
Balanza analtica
Agitador de tubos (Vortex)
bao de mara
Centrfuga
Tubos de ensayo
Gradillas
Pipetas de 1 y 5 ml
Balones aforados de 100 o 50 ml
Frasco de color mbar.

b) Reactivos:

Tartrato doble de Na y K.
Carbonato de calcio
Sulfato de cobre
Reactivo de Folin Ciocalteu
Seroalbmina bovina
Agua destilada

4. PROCEDIMIENTO:
Realizar una curva de calibracin de 0 a 300 mg/L. En 7 tubos de ensayo que estn
muy bien lavados, adicione: 0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 ml de solucin de
seroalbmina bovina y completar a 1 ml con agua destilada.
A 1 ml de muestra, convenientemente diluida, y a cada tubo de la curva patrn,
adicionar 0,5 ml de NaOH 2 N y agitar en vortex.
Calentar sin agitacin en bao de mara a temperatura de ebullicin durante 10
minutos.
Enfriar en bao de hielo y adicionar 0,5 ml de cido sulfrico 2,6 N y agitar en vortex.
Adicionar 0,9 ml de solucin A y agitar en vortex. llevar a 50 C por 10 minutos y
posteriormente enfriar.

 Adicionar 0,1 ml de solucin B y agitar en vortex; reposar en la oscuridad por 10

minutos. Adicionar 3 ml de solucin C y agitar en Vortex; llevar a 50 C por 10 minutos
y enfrar.
Leer la absorbancia a 750 nm.

4.1. PREPARACIN DE REACTIVOS:

Solucin A: Disolver o,5 g de tartrato de sodio y potasio en 12 ml de agua destilada y
25 g de carbonato de sodio en 125 ml de NaOH 0,1N.
Solucin B: Disolver 1 g de sulfato de cobre en 90 ml de agua destilada y 20 g de
tartrato de sodio y potasio en 10 ml de NaOH 1N.
Solucin C: Diluir el reactivo de Folin-Ciocalteu con agua destilada en relacin 1:14 al
momento de usarlo.

5. CLCULOS Y CONSULTAS:

Grafique la curva de calibracin (linealizada) para la determinacin de protenas por el

mtodo de Lowry. Muestre todos los resultados obtenidos. Calcule el valor de R2.
Calcule la concentracin de protenas en la muestra problema.
Consulte otros mtodos utilizados para la determinacin de protenas en extractos
enzimticos. Qu ventajas y desventajas presentan para su uso en biotecnologa?.

6. REFERENCIAS:

UNIVERSIDAD DE SUCRE
PROGRAMA DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL
LABORATORIOS DE BIOTECNOLOGA
EXPERIMENTO N 12
AISLAMIENTO DE ENZIMAS POR PRECIPITACIN
CON SULFATO DE AMONIO

1. INTRODUCCIN:
El aislamiento de enzimas es un proceso de fundamental importancia en biotecnologa
alimentaria, especialmente cuando tenemos disponibles caldos o extractos donde se
encuentran solubilizadas varias protenas enzimticas extradas de una misma clula
microbiana. La solubilidad de una protena depende de la cantidad presente y de la
concentracin de la sal presente en la solucin. A concentraciones bajas, la presencia de
sal estabiliza varios grupos cargados de la molcula de protena, atrayendo as protenas
a la solucin y aumentando la solubilidad de la protena. Esto es comnmente conocido
como Salting-in. Sin embargo, cuando la concentracin de sal es aumentada, se alcanza
un punto de mxima solubilidad de la protena .
Adems, si se incrementa la
concentracin de sal, esto implicar que menos agua habr disponible para la
solubilizacin la protena. Finalmente, la protena comienza a precipitar cuando no hay
suficientes molculas de agua para interactuar con las molculas de protenas. Este
fenmeno de precipitacin en presencia de sales en exceso es conocido como SaltingOut.
Muchos tipos de sales han sido empleadas para efecto de separacin y purificacin de
protenas. De estas sales, el sulfato de amonio ha sido la ms ampliamente utilizado
debido a su alta solubilidad y bajo costo. Como las enzimas son protenas, la purificacin
puede ser llevada a cabo siguiendo el mismo procedimiento de una protena; pero se debe
poner mucha atencin para evitar la perdida de la actividad enzimtica por
desnaturalizacin bajo condiciones adversas.

2. OBJETIVO:
Recuperar enzimas por precipitacin con sulfato de amonio a partir de soluciones que las
contengan.

3. MATERIALES Y REACTIVOS

a) Materiales:

Tubos ependorf
Pipetas
Balanzas
Centrifuga
Buretas

a) Reactivos:
Solucin de enzimas
Solucin saturada de Sulfato de amonio (NH4)2SO4

4. PROCEDIMIENTO:
Para la solucin saturada de sulfato de amonio: Adicione 750 g de sulfato de amonio a
1000 ml de agua destilada en un beaker; agite la solucin a la temperatura del
laboratorio con un agitador magntico durante 15 minutos hasta saturacin. Deje
decantar el sobrenadante despus que los slidos no disueltos hayan sedimentado. No
es necesario filtrar.
4.1. Aislamiento de Fungal Glucoamilasa.
Realice la lectura de la absorbancia de la solucin de enzima a utilizar en un
espectrofotmetro a 577 nm. de longitud de onda. Esta medida ser usada en el
calculo del rendimiento de recuperacin de la enzima.
Pipetear 4 ml de la solucin de glucoamilasa cuya concentracin debe estar en 20 g/L
de la enzima.
Adicione por goteo lento, mientras agita, solucin de sulfato de amonio saturada hasta
que se empiece a formar un precipitado. Realice la lectura del volumen de sal gastado
Es importante evitar la no uniformidad de la concentracin de la sal durante su
adicin.
Concentraciones localizadas o puntos muertos podran iniciar
prematuramente la precipitacin de otras protenas y afectar la pureza de la protena

a cristalizar. Es de anotar que la precipitacin de la protena no es instantnea, y esta

podra llegar a requerir de 15 a 20 minutos para alcanzar el equilibrio.
Centrifugar la mezcla a 10000 rpm por 15 minutos. Recolecte el precipitado muy
cuidadosamente, descargando el sobrenadante lentamente con ayuda de una pipeta. En
caso que los cristales de la enzima precipitados al adicionar la sal no sean demasiado
pequeos, se puede obviar la centrifugacin y proceder con una filtracin.
Reconstituya la solucin original de la enzima adicionando 4 ml de agua destilada al
precipitado. Esta agua puede ser adicionada as : Primero 2 ml y agite para redisolver
el precipitado, transfiera la mayor cantidad posible de esta solucin en otro tubo
limpio. Contine lavando el primer tubo con otro ml de agua y adicinelo tambin en el
segundo tubo donde reposan los 2 ml. Finalmente, adicione el resto de agua para
completar los 4 ml en este tubo.
Mida la absorbancia de la solucin de enzima reconstituida con un espectrofotmetro
a 577 nm. de longitud de onda
4.2. Aislamiento De Proteasas:
Proceda de igual forma que en el asilamiento de la fungal glucoamilasa; excepto que
debe adicionar 4 ml de una solucin de Proteasa y el sobrenadante puede ser retirado
por centrifugacin.

5. CLCULOS Y CONSULTAS:
Del volumen de sulfato de amonio saturado adicionado a la solucin de protena para la
precipitacin, calcule la concentracin en trminos de porcentaje de saturacin.
A partir de la absorbancia leda antes y despus del aislamiento, calcule el porcentaje
de la enzima recuperada.
Consulte otros mtodos para el aislamiento de enzimas. Ventajas y desventajas.

6. REFERENCIAS:
- JAKOBY, W.B. Crystallization as a purification technique, Enzyme Purification and
Related Techniques, in Methods in Enzymology; Vol. 22; Jakoby, W.B, Academy Press,
1971.

UNIVERSIDAD DE SUCRE
PROGRAMA DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL
LABORATORIOS DE BIOTECNOLOGA
EXPERIMENTO N 13
INMOVILIZACIN DE ENZIMAS CON
ALGINATO DE SODIO
1. INTRODUCCIN:
El mtodo de atrapamiento de enzimas en alginatos es el mtodo ms simple de
inmovilizacin. Los alginatos son disponibles comercialmente como alginatos de sodio
solubles en agua. El Alginato, comercialmente est disponible como cido algnico, sal de
sodio y comnmente llamado Alginato de sodio, es un polisacrido lineal aislado
normalmente desde algas marinas, de all el nombre de Alginato. El coopolimero consiste
de dos cidos urnicos: cido D- Mannurnico (M) y Acido L- Gulurnico, que es el
componente de los esqueletos de las algas, y tiene propiedades fuertes y flexibles.
El cido algnico puede ser soluble o insoluble en agua dependiendo del tipo de sal
asociada, en sales de sodio, lcalis metlicos y amonio es soluble, mientras que en sales de
cationes polivalentes Ej. Calcio, es soluble con excepcin del magnesio. Los cationes
polivalentes son los responsables del entrecruzamiento de las molculas polimricas. El
proceso simplemente cambia iones calcio por iones sodio

2 Na(Alginato) + Ca++ -------> Ca(Alginato)2 + 2 Na+

El enlace inico que forma la estructura del gel es termoestable sobre un rango de 0 a
100 C; sin embargo es fcilmente redisuelto por inmersin del gel de Alginato en una
solucin conteniendo altas concentraciones de sodio, potasio y magnesio.
Manteniendo la relacin sodio: calcio 25:1 ayuda a la desestabilizacin del gel, en todo
caso se recomienda incluir iones de calcio 3 mM en el sustrato. Por otra parte, bferes
de citrato o fosfato pueden causar desestabilizacin del gel de Alginato. El Alginato es
ampliamente usado en los productos alimenticios, farmacuticos, textiles y la industria
del papel. Por las propiedades del Alginato es utilizado como espesante, estabilizante,
formacin de geles y formacin de pelculas

2. OBJETIVO:
Inmovilizar enzimas utilizando la tcnica de inmovilizacin por atrapamiento con Alginato
de sodio.
3. MATERIALES Y REACTIVOS:
a) Materiales

Beakers
Probeta Graduada
Balanza
Pipetas
Gotero o jeringa
Agitador de vidrio

b) Reactivos
Alginato de sodio
CaCl2
Enzimas

4. PROCEDIMIENTO:
Prepare una solucin de 2 al 4% (W/W) de Alginato de sodio con una solucin buffer
apropiada para el funcionamiento de la enzima. Adicione Alginato de sodio en polvo a
agua en agitacin y no al contrario para evitar la formacin de grumos, contine con
la agitacin hasta completa disolucin, deje en reposo por 30 minutos para eliminar
burbujas de aire que puedan quedar atrapadas posteriormente y producir flotacin de
las esferas formadas.
Preparar una solucin de cloruro de calcio (CaCl2 .6H2O) 0.15 a 0.2 molar
Disolver de 15 a 20 mg de enzima en 1.0 ml del buffer preparado para la enzima.
Disolver esta cantidad de enzima En 50 mililitros de solucin de Alginato.
Las perlas o esferas se forman por goteo de la solucin de Alginato ya sea por gotero
o jeringa a una altura suprior a 20 cm sobre la superficie de la solucin de cloruro de
calcio previamente agitada ( ver figura) , el tamao de las perlas depender de la
presin que se ejerza sobre el Alginato por el equipo que produzca el goteo; el tamao
parea estas condiciones es de aproximadamente de 0.5 a 2 mm de dimetro.

 Mantenga la agitacin de la solucin por 20 30 minutos. antes de filtrar las perlas.

Lave las perlas con una cantidad apreciable del buffer apropiado
Mantngalas en un lugar fresco bajo condiciones de esterilidad para su posterior uso.

5. CLCULOS Y CONSULTAS:
Es posible la utilizacin de Alginato en la inmovilizacin de clulas?, explique las
ventajas y desventajas.
Explique un modelo terico que explique la perdida de actividad Enzimtica en la
utilizacin de enzimas inmovilizadas
Cmo determinara usted experimentalmente la perdida de Actividad Enzimtica en
la inmovilizacin de enzimas?

6. REFERENCIAS:
S. Ohlson, P.-O. Larsson, and K. Mosbach, Steroid transformation by living cells
immobilized in calcium alginate, European J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 7, 103, 1979.
J. Vaija, et al., Appl. Biochem. Biotechnol., 7, 51, 1982.
J. M. Lee and J. Woodward, Biotech. Bioeng., 25, 2441, 1983.
F. Gordon, immobilization of encimes and cells, Methods in Biotechnology, Humana
Press, 1977

UNIVERSIDAD DE SUCRE
PROGRAMA DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL
LABORATORIOS DE BIOTECNOLOGA
EXPERIMENTO N 14
EVALUACIN EXPERIMENTAL DEL CALOR GENERADO POR METABOSLIMO
MICROBIANO

1. INTRODUCCIN:
Las clulas consumen los sustratos que proveen la energa y las materias primas
requeridas para la sntesis de nueva masa adicional. La energa libre de las sustancias
nutritivas utilizadas es mayor que la de las clulas y productos del metabolismo. Las
clulas utilizan eficientemente la energa qumica, pero, como en todos los procesos
reales, parte de la energa disponible en el sustrato es liberada como calor.
El balance de energa de un proceso es uno de los aspectos importantes de la
Biotecnologa Alimentaria por la necesidad de mantener una temperatura ptima para
crecimiento o para formacin de productos. El calor generado por metabolismo o calor de
reaccin puede calcularse a partir de una serie de mediciones de la temperatura media
del caldo de fermentacin en un reactor operado en condiciones inestables y realizando
el respectivo balance de calor en el sistema (Aproximacin de Uhlich). El biorreactor
puede ser un tanque provisto de agitacin, intercambiador de calor y sensor de
temperatura. Las prdidas de calor por radiacin y evaporacin son despreciables.

2. OBJETIVO GENERAL:
Realizar el balance de energa en un proceso de fermentacin discontinuo operado en
estado inestable y evaluar experimentalmente el calor generado por la actividad
metablica durante el crecimiento de Saccharomyces cerevisiae en una fermentacin
batch sumergida.

3. MATERIALES Y REACTIVOS:
b) Materiales:
Biorreactor de 6 Litros, tipo batch con agitacin mecnica y serpentn de
enfriamiento.
Bao termostatado con recirculacin de agua.
Termmetros
Soportes
Mangueras para recircular el agua
Erlenmeyer de 500ml
c) Reactivos:

Cepa de Levadura (Saccharomyces cerevisiae)

Medio de crecimiento (Diseado y formulado por el estudiante)
Agua destilada
Glucosa
Sulfato de Amonio
Fosfato de Potasio
Sulfato de Sodio

4. PROCEDIMIENTO:
Realizar, con buenas prcticas microbiolgicas, un preinculo (600 ml) con el mismo
medio que va a ser utilizado para la fermentacin. Incubar por 18-24 horas. La
frmula emprica de la levadura a utilizar es: CH1.64N0.16O0.52P0.01S0.005.
Realizar el montaje del biorreactor de 6 litros con sistema de agitacin mecnica,
aireacin, serpentn de enfriamiento, termmetros y adaptado al bao termostatado
con recirculacin de agua. (Ver figura).
Inocular el preinculo al caldo de fermentacin en un 10% del volumen final a trabajar
en el experimento (5400 ml de caldo + 600 ml de preinculo).
Iniciar el bioproceso en condiciones estables, (dT/dt)=0, activando todos los sistemas
que intervienen (Agitacin 300 rpm, recirculacin de agua a la temperatura inicial del
caldo). Tomar la lectura de temperatura cada 5 minutos durante los primeros 40

minutos. Ir graficando la temperatura registrada en funcin del tiempo (Ver grafica).

Esta primera etapa corresponde al perodo comprendido entre t=A y t=B. El
intercambiador remueve el calor generado en el biorreactor. La ecuacin de balance
de energa aplicable en esta etapa del ensayo es:

QMET + QAG = QINT = FMa.CpA.(TFE TFA)

(Ec. 1)

Donde,
QMET, QAG, QINT = Calor generado por metabolismo, calor generado por agitacin y
dispersin de gases y Calor intercambiado, respectivamente., (KW Kj/s).
FMa= Velocidad de flujo de masa de agua (Kg/s)
CpA = Calor especfico del agua (Kj/Kg.C).

TFE TFA = Temperaturas del agua efluente y afluente al intercambiador,

respectivamente, (C).
Desconectar el sistema de recirculacin de agua (Intercambiador). Realizar las
lecturas de temperatura cada 20 minutos durante 120 minutos. En esta etapa el calor
de intercambio es Cero (QINT =0), en el tiempo t=B, seguir graficando.
El calor generado por metabolismo se acumula en el sistema y la ecuacin de balance de
energa aplicable en esta etapa es:

QMET + QAG = QAC

(Ec. 2)

QAC = V.CP.(dT/dt) =V.HR.rS

(Ec. 3, Uhlich))

Donde:
QAC = Calor Acumulado en el Biorreactor (KW)
(dT/dt) = Variacin de la temperatura del caldo de fermentacin con el tiempo, (C/s). Es
la pendiente de la curva en le figura entre t = B y t = C.

CP = Capacidad calorfica global del biorreactor (4,228 Kj/LC)

V= Volumen del caldo (Litros)
rS = Velocidad de consumo del sustrato (Mol de C en sustrato/L.s)
HR = Calor de reaccin (Kj/mol de C en sustrato)

Finalmente, el intercambiador se conecta nuevamente en el tiempo t= c (Ver figura).

El calor acumulado en el reactor es removido del sistema y la ecuacin de balance de
energa aplicable en esta etapa del experimento, inmediatamente despus de t= c es:

QAC = QINT

La velocidad de consumo del sustrato se realizar cada 20 minutos utilizando la

tcnica del DNS para determinar glucosa.

Fig.1 MONTAJE DEL BIORREACTOR.

Motor
(TFe) H2O
Termmetro

(TFa) H2O

Aislante Trmico

Aire

Bomba de Aire

Temperatura (T)

C
Tiempo (t)

Figura 2: Grfica Tiempo Vs. Temperatura

5. CLCULOS Y CONSULTAS:
Realice el balance global de energa en el sistema. Consulte propiedades trmicas de
las sustancias y materiales de construccin utilizados.
Calcule el calor generado por la actividad metablica del microorganismo utilizado en
la fermentacin a travs de la ecuacin de Uhlich.
Grafique el comportamiento de la temperatura en funcin del tiempo durante cada
etapa del bioproceso.
Grafique el comportamiento del sustrato en funcin del tiempo.
Proponga otra metodologa para determinar el calor generado por la actividad
metablica de un microorganismo.

6. REFERENCIAS: