Prctica 7

Aislamiento e Identificacin
de Staphylococcus Aureus presente
en leche vaca y garganta.

Objetivo
El alumno aislar e identificar bacterias presentes en muestras de
la cavidad nasofarngea y de garganta, as como de leche de vaca
enferma de mastitis.

Introduccin
Las personas y animales con enfermedades infecciosas pueden presentar una variedad de signos y sntomas, algunos
evidentes y fciles de reconocer y otros oscuros y desorientadores.
El enrojecimiento difuso e hinchazn de garganta, las secreciones serosas o purulentas de heridas o membranas mucosas,
y la acumulacin de pus en abscesos o cavidades orgnicas, que producen a menudo dolor, tumefaccin y aumento de
color en el rea, son signos directos de infeccin que se requiere un cultivo inmediato a fin de establecer el organismo
causante, de modo que se pueda iniciar la terapia apropiada.
La correcta recoleccin de una muestra para su cultivo es posiblemente la etapa ms importante en el aislamiento de
microorganismos responsables de enfermedades infecciosas. Una muestra deficientemente recogida puede ser el motivo
del fracaso de aislar el microorganismo causante y la recuperacin de contaminantes puede conducir a una terapia
incorrecta o aun perjudicial.

11

Prctica 7
Aislamiento e Identificacin
de Staphylococcus Aureus

Prctica 7
Aislamiento e Identificacin
de Staphylococcus Aureus

Mtodo

Son varios los conceptos bsicos para la correcta recoleccin de muestras:

1.- La muestra para cultivo debe ser material del verdadero sitio de infeccin y debe recogerse con un mnimo de contaminacin de tejidos, rganos o secreciones adyacentes.
2.- Se debe establecer perodos ptimos para la recoleccin de muestras a fin de tener la mejor oportunidad de aislar los
microorganismos causantes.

Primera Sesin: Aislamiento Primario

3.- Obtener suficiente cantidad de muestra para llevar acabo las tcnicas de cultivo solicitadas.

1. Prepare dos cajas de Petri con agar sangre siguiendo las indicaciones del profesor.

4.- Utilizar dispositivos de recoleccin, recipientes para las muestras y medios de cultivo adecuados para asegurar el ptimo
aislamiento de microorganismos.

2. Tomar la muestra de la cavidad oral y sembrarla en caja de Petri, siguiendo la tcnica descrita a continuacin:

5.- Siempre que sea posible, obtener las muestras antes de la administracin de antibiticos.
6.- El envase recolector de la muestra debe estar correctamente rotulado.

a. Se debe dirigir hacia la cavidad oral abierta la luz de la lmpara de mano por sobre el hombro de la
persona que obtiene la muestra, de modo que el hisopo pueda ser guiado hacia la faringe posterior.
b. Se instruye a la persona para que respire profundo y la lengua se hace descender suavemente con el
abate lenguas.

La flora microbiana usual de garganta, faringe y nariz consiste en estreptococos - Hemolticos, especies de Nisseria,
Staphylococcus epidermidis, S. aureus, S. pneumoniae, varias espcies de Haemophilus difteroides y numerosas especies
de bacterias anaerobias.
La mastitis es una enfermedad de mamferos que causa la inflamacin de la glndula mamaria. Puede ser causada por S.
aureus, Mycobacterium, Arenobacterium, entre otros.
En la mayora de los casos las muestras de la garganta y leche de vaca se recogen con la finalidad de aislar estreptococos
-hemolticos de los grupos A y B.

c. El hisopo se desliza entonces entre los pilares tonsilares y por detrs de la vula, cuidando de no tocar
las paredes laterales de la cavidad bucal. Indicarle a la persona que emita un aah sirve para elevar la vula y
ayuda a reducir en reflejo de la nausea (figura 1).
d. En ese momento el hisopo se debe pasar rpidamente de un lado a otro de la faringe posterior a fin
de obtener una muestra adecuada.
e. Una vez recogida la muestra, el hisopo se debe colocar y sostener inmediatamente a un costado de
un mechero encendido, para evitar su contaminacin.
f. Se abre la caja de Petri que contiene el agar sangre y se realizar el cultivo, con tcnica de estra cruzada.
g. Cierre la caja de Petri con parafilm o plstipack y rotulela con los datos de la persona que se tom la
muestra.

Materiales y Equipos

Abate lenguas
Hisopos estriles
Cajas de Petri con medio de cultivo agar sangre
Tubos de ensayo con medio de cultivo agar sangre
Tubos de ensayo con medio de cultivo agar glucosa triptona
(en g/L: D-glucosa, 10; triptona, 10; extracto de levadura, 1; rojo de
fenol, 0.04; agar, 15)
Perxido de hidrgeno al 30%, conservado en refrigerador en
frasco obscuro.

Muestra de sangre
Muestra de leche de vaca
Portaobjetos
Microtubos
Jeringa esteril de 10mL
Aguja de puncin o un palillo aplicador
Micropipeta de 20L
Puntas de 20L
Lmpara de mano
Mechero de gas
Marcador
Incubadora

Figura 1.Anatoma de la cavidad oral para toma de la muestra.

1.- Paladar Blando

2.- Amigdala palatina
3.-vula
4.- Secrecin blanco amarillenta
5.- Lengua

Prctica 7
Aislamiento e Identificacin
de Staphylococcus Aureus

Prctica 7
Aislamiento e Identificacin
de Staphylococcus Aureus

3.Tomar la muestra de leche de vaca y sembrarla en caja de Petri, siguiendo la tcnica descrita a continuacin:
a.En un microtubo haga una dilucin 1/10 de la muestra de leche de vaca enferma de mastitis. Mezcle vigorosamente
el frasco con leche antes de tomar la muestra.

Aislamiento
primario

c. Interpretacin: Por la presencia del rojo de fenol,

cuando se produce la fermentacin de la glucosa y el pH
del medio baja, el indicador cambia de color rojo a

b.Inocule 10 L del microtubo con la dilucin siguiendo la tcnica de extensin en placa.

c.Cierre la caja de Petri con parafilm o plstipack y rotlela.

Tincin de
Gram

amarillo.
Negativo
Tercera Sesin: Identificacin ( Segunda Pate)

4.Coloque en la estufa de cultivos las dos cajas e incbelas de 24 a 36 h a 37C.

Positivo

Segunda Sesin: Aislamiento Primario

A. Con el asa, transfiera a E. coli del cultivo en caldo

1. Analice la morfologa colonial de los organismos que crecieron en la placa de agar sangre, de acuerdo a ello, seleccione
las colonias que pueden ser de S. aureus. Identifique cada colonia con una clave. Bajo las condiciones proporcionadas se
observan colonias medianas, cremosas, brillantesy blancas (despus de 48h se ven amarillas).

Nutritivo a un tubo inclinado con agar Nutritivo y un tubo

Prueba de la
catalasa

con caldo Nutritivo.

Negativo

B. Con la aguja inoculadora transfiera E. coli a un

2. Realice una tincin de gram y determine si los organismos desarrollados son gram negativos o gram positivos.
3. A las bacterias gram positivas seleccionadas, les realizar la prueba de catalasa (figura 2):
a. Con una aguja de puncin o un palillo aplicador con la punta aguzada transferir clulas del centro de una
colonia bien aislada a la superficie de un portaobjeto.
b. Aadir una o dos gotas de perxido de hidrgeno al 3% (diluir la solucin inicial al 30% con agua destilada). Se
recomienda no aadir el organismo al reactivo (invirtiendo el orden), especialmente cuando se utilizan agujas o asas
que contienen hierro ya que se pueden producir resultados falsos positivos.
c. Interpretacin: la rpida aparicin y produccin sostenida de burbujas de gas o efervescencia indica una
reaccin positiva, dado que unas bacterias pueden poseer enzimas distintas de la catalasa, capaces de descomponer
el perxido de hidrgeno, unas pocas burbujas diminutas formadas a los 20 o 30 segundos, no se considera prueba
positiva

tubo hondo con agar Nutritivo. Esto se hace sumergiendo

Positivo

la aguja con el inoculo dentro del tubo sin tocar las

paredes de este. Penetrando el medio a 2/3 partes del

Fermentacin
de la glucosa

fondo y la aguja es retirada del tubo (figura 3 a, b y c).

Negativo

C. Usando el asa hacer una transferencia de tubo a

tubo inclinado. Esto se hace rayando suavemente la super-

Positivo

ficie del tubo inclinado en forma de serpiente parecido a

una S (figura 3d).

Prueba de la
coagulasa

Negativo

D. Colocar los tubos en una gradilla e incubarlos a 35

C por 24 a 48 horas. Despus de este tiempo examinar

4. A las bacterias catalasa positivos seleccionadas, les realizar la prueba de fermentacin de glucosa, de acuerdo al
siguiente procedimiento (figura 2):
a. En un tubo inclinado con agar glucosa y triptona, inocule por puncin hasta una profundidad de la mitad de su
altura, las colonias seleccionadas.
b. Coloque en la estufa de cultivos las cajas e incbelas de 24 a 36 h a 37C.

todos los tubos para ver la presencia de crecimiento

bacteriano. El crecimiento es indicado por la turbidez en el
cultivo del caldo; en el cultivo de tubo inclinado por la

Positivo

apariencia de un color de naranja a rojo; y solo se aprecia

Figura 2. Esquema de identificacin de S. aureus.

una lnea de inoculacin en el tubo hondo.

Prctica 7
Aislamiento e Identificacin
de Staphylococcus Aureus

E. Interpretacin: Se considera una reaccin positiva si en un lapso de entre 15 a 20 segundos por la aparicin de un
precipitado granular o la formacin de grumos blancos. La prueba se considera negativa, si no se observa aglutinacin en 2 o
3 minutos. Esta prueba solo se considera presuntiva y todos los cultivos que den negativos o positivos tardos deben verificarse
mediante la prueba en tubos debido a que algunas cepas de Staphylococcus aureus producen coagulasa libre que no reacciona
en la prueba en portaobjeto.

Cuestionario
1. Cules son las pautas que indican que se recogi la cantidad suficiente de muestra?
2. Menciona por lo menos 4 especies bacterianas anaerobias que se desarrollan en la garganta.
3. Indique que microorganismos se identifican en cada prueba realizada en el diagrama de la figura 2.
4. Explique el principio de cada una de las pruebas bioqumicas realizadas en la prctica.
5. Investigue y argumente una secuencia de pruebas para el aislamiento e identificacin de tres bacterias que sean:
a. Bacilos Gram positivos.
b. Cocos Gram negativos.
c. Bacilos Gram negativos.

Referencias
1.Bartlett R.C. Ellner P.D. and Washington J.A. Cultive techniques and procedures in clinical microbiology. Washington
, DC. American society for microbiology 1974.
2.Harley, J. P. y Prescott, L. 2002. Laboratory Exercises in Microbiology. McGrawHill . 5th Edition. EUA.
3.Kulica, G. P., et al: Differential identification of mycobacteria. I. Test on catalase activity. Am Rev Respr Dis, 94: 400-405, 1966.
4.Lorian V. Medical microbiology In care of patients. Baltimore, Williams & wilkins. 1977.
5.McLeod, M. B., and Gordon J: Catalase production and sensitiveness to hydrogen peroxide amongst bacteria with a scheme
of classification based on these principles. J. Pathol Bacteriol, 26:326-331, 1923.
6.McFaddin, J.F: Biochemical test for identification of medical bacteria. Pp 41-52. Baltimore, Williams and Wilkins 1976.
7.Prescott, L., Harley, J. P. y Klein, D.A. 2004. Microbiologa. 4. Edicin. McGraw Hill.
8.Reller, L.B. Blood culture techniques; clinical factors in detection of bacteremia in cultures. Research study, University of
Colorado school of medicine.personal communication.