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BIOTECNOLOGA BANCOS DE GERMOPLASMA

"Ao de la Diversificacin Productiva y del Fortalecimiento


de la Educacin",
ASIGNATURA :
BIOTECNOLOGA

DOCENTE

:
MSc. GARCA LPEZ Jhon.

TEMA

:
BANCOS DE GERMOPLASMA

INTEGRANTES :
FLORES SANTOS ALDEMIR
HERRERA CADENILLA JUANCARLOS
RAMOS SONO, Daniel.
SANTAMARIA VELIZ, Olivia.
CICLO

:
2014 - II
LAMBAYEQUE, FEBRERO DEL 2015

BIOTECNOLOGA BANCOS DE GERMOPLASMA

BANCOS DE GERMOPLASMA
I

INTRODUCCION

Desde sus inicios, el hombre ha dependido bsicamente de los vegetales como fuente de energa.
Al aumentar rpidamente la poblacin, se ha hecho necesario implantar tcnicas de explotacin,
en particular agropecuarias, que han contribuido a la destruccin de las poblaciones pioneras
vegetales que fueron producto de siglos de evolucin. Por otro lado, las tcnicas modernas de
produccin de variedades mejoradas altamente homogneas han provocado la reduccin de la
variabilidad gentica de las especies cultivadas, ocasionando una erosin gentica. En este
contexto es cuando se recurre a las fuentes genticas originales de la variabilidad, las que se deben
preservar adecuadamente.
Cuando se habla de preservacin de germoplasma hay que subrayar que el objetivo es conservar,
con la mayor integridad posible, la variabilidad gentica de las poblaciones seleccionadas.
Los recursos fitogenticos son la base de la seguridad alimentaria mundial. Por ello es de suma
importancia mantener la diversidad gentica de las variedades tradicionales y regionales, de los
cultivares mejorados y de plantas silvestres.
La diversidad gentica provee a los agricultores y mejoradores genticos con opciones para
desarrollar nuevos cultivares o hbridos, los cuales pueden ser ms productivos, tener mejores
caractersticas de fruto, flor o estructura de planta, resistencia o tolerancia a patgenos y/o
tolerancia a condiciones ambientales desfavorables.
Anualmente se pierden ms de 15 millones de hectreas de bosque tropical por deforestacin
causada por diversas actividades de desarrollo, como proyectos hidroelctricos, caminos,
urbanizaciones y ciertas prcticas agrcolas (como extensas reas de monocultivos). En estos
bosques se pueden encontrar la diversidad gentica necesaria para el mejoramiento gentico de
muchos cultivos tropicales. El papel de los bancos de germoplasma para reducir esta prdida y
poder conservar muchas especies silvestres, cultivares locales tradicionales, as como variedades
mejoradas, puede ser fundamental .
El concepto de conservacin de los recursos fitogenticos en bancos de germoplasma incluye la
utilizacin de mtodos que capten la mxima diversidad de genotipos, as como el uso de tcnicas
de conservacin y posterior regeneracin que mitiguen sus prdidas a travs del tiempo.
La conservacin de germoplasma de cultivos tropicales se ha tratado de realizar ex situ e in situ.
La va ex situ se realiza en repositorios especiales (en sitios fuera del centro de origen de la
especie) que proveen las condiciones adecuadas para la conservacin de material propagativo por
largo tiempo . Los mtodos de conservacin ex situ incluyen el almacenamiento de semillas,
bancos de genes en campo, colecciones in vitro y jardines botnicos.
El mtodo ms utilizado en la va ex situ son los bancos de semillas. Estos presentan la ventaja
de que se pueden almacenar muchos genotipos en espacios reducidos y es apto para la
conservacin de especies con semillas ortodoxas (semillas que pueden deshidratarse y
almacenarse entre 0 y -20 C por largo tiempo) .
Sin embargo, este mtodo es poco adecuado para la conservacin de especies con semillas
recalcitrantes (semillas que no soportan la deshidratacin, por lo que deben ser almacenadas en
ambientes hmedos y conservan su capacidad germinativa nicamente por corto tiempo).
Esto es crtico porque muchos de los cultivos tropicales de importancia econmica, como palma
aceitera (Elaeis guineensis), cacao (Theobroma cacao), coco (Cocos nucifera), aguacate (Persea
americana), mango (Mangifera indica) y caf (Coffea spp.), poseen este tipo de semilla.
Otra desventaja del uso de semillas en programas de conservacin por medio de bancos de
germoplasma es la dificultad para obtener este tipo de estructuras en algunas especies que tienen
un largo periodo juvenil, como el prsimon (Dyospiros kaki) . Por otro lado, existen plantas que
se propagan principalmente de forma vegetativa, como yuca (Manihot spp.), papa (Solanum spp.),
ame (Colocasia esculenta), cebolla y ajo (Allium spp.), y banano y pltano (Musa spp.), en las
cuales no es tan fcil la obtencin de semillas sexuales.
La va de conservacin in situ involucra el mantenimiento de los recursos genticos en el centro
de origen (sitios donde se dio la especiacin y generalmente se encuentra la mayor diversidad
gentica) o cultivo en campos de productores agrcolas en sistemas de agricultura tradicional. Sus

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requerimientos, en cuanto a espacio y mantenimiento, son similares a los indicados para los
bancos de genes en campo.
Para solucionar los inconvenientes de las vas mencionadas anteriormente se puede recurrir a la
conservacin de especies tropicales en condiciones in vitro.
En esta revisin bibliogrfica se presentan las tcnicas para la conservacin in vitro de
germoplasma en el corto y el largo plazo, que permiten el establecimiento de bancos de
germoplasma en cultivos tropicales y se hace un listado de ejemplos de estos ltimos.
La conservacin de la biodiversidad es un tema que ha venido ganando relevancia de forma
progresiva en nuestra sociedad. La conservacin de la flora silvestre constituye una pieza clave
dentro de este enmarque. No slo se trata de la obligacin tica de preservar este legado que se
nos ha dado para las generaciones venideras o del puro inters cientfico que puede aportar. La
sociedad es cada vez ms consciente de la importancia de la flora silvestre como fuente de
alimentos, aceites y lubricantes, gomas, resinas, ceras, colorantes, fibra, energa, sustancias
aromticas y principios medicinales, por su valor ornamental y por su valor ecolgico como
indicador y elemento restaurador de situaciones ambientales degradadas .
Sin embargo, a pesar del creciente inters suscitado por la diversidad de la flora silvestre, la
actividad humana est ocasionando un progresivo deterioro de la misma. Segn datos del
, el 12,5 % del total aproximado de 250.000 especies vegetales conocidas en nuestro planeta se
encuentra en peligro de extincin.
En consecuencia, gran cantidad de especies vegetales estn desapareciendo antes de ser
identificadas o de que sus propiedades sean mnimamente evaluadas. Hasta el momento slo el
10 % de las especies vegetales han sido evaluadas por su potencial agronmico o medicinal, por
lo que existen un gran nmero de cultivos y principios medicinales por descubrir. En Espaa, la
situacin es similar a la existente en otros pases. Segn datos del Ministerio de Medio Ambiente
(1999), el 12 % de 9.799 taxones de plantas vasculares presentes en Espaa se encuentra en
peligro de extincin. Ante estos datos, se impone la necesidad de tomar medidas conducentes a
la conservacin de la biodiversidad vegetal.
La conservacin toma especial relevancia en nuestros das dado el acelerado proceso de
degradacin ambiental en el que vivimos. Sin embargo, la preocupacin por la conservacin de
los recursos vegetales es tan antigua como la propia civilizacin humana. En el Neoltico, con el
comienzo de la agricultura y el asentamiento de las poblaciones, el crecimiento y la presin de la
poblacin llev al reconocimiento de la necesidad de conservar los recursos biolgicos con objeto
de asegurar un abastecimiento sostenible de alimento para la comunidad.
En cualquier caso, la percepcin de la erosin gentica como un problema a escala planetaria no
tuvo lugar hasta bien entrado el siglo XX. Las seales de alarma comenzaron a tomarse en serio
a mediados de los aos sesenta, al descubrirse que el alto ritmo de desplazamiento de variedades
primitivas cultivadas por la introduccin de nuevos cultivares estaba llevando a un rpido
estrechamiento de la base gentica de las especies cultivadas. La toma de conciencia de esta
situacin determin la puesta en marcha de medidas para la conservacin de los recursos
fitogenticos.
Hoy en da, la conservacin de recursos genticos es aceptada de forma generalizada como una
responsabilidad social, dentro del contexto mucho ms amplio de preservacin de la
biodiversidad. En este escenario, a la prdida de recursos genticos ocurrida por la sustitucin de
variedades tradicionales por cultivares modernos, hay que aadir la ocasionada en especies
vegetales silvestres a consecuencia del deterioro de los ecosistemas naturales por la creciente
actividad humana. La preocupacin por la prdida de la biodiversidad vegetal y la necesidad de
tomar medidas para frenarla qued especialmente patente en la firma del Convenio sobre
Diversidad Biolgica con ocasin de la Conferencia de las Naciones Unidas sobre el Medio
Ambiente y Desarrollo celebrada en Ro de Janeiro
.

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II BANCO DE GERMOPLASMA
1. Definicin
Los bancos de germoplasma constituyen una de las estrategias ms comunes para preservar la
diversidad biolgica vegetal, porque permiten conservar por mucho tiempo y en un espacio
reducido muestras representativas de diversidad gentica de una gran cantidad de especies de
plantas2. Son colecciones de todo el patrimonio gentico de una especie, mantenido con la
finalidad de preservar su variabilidad. La finalidad de los bancos es proteger especies de inters
que satisfacen una demanda actual, as como aquellas que an no presentan caractersticas de uso
inmediato y podran ser consideradas valiosas en el futuro. Adems, representa la salvaguardia de
especies en peligro de extincin de aquellas zonas que por diversos motivos sufren cambios
dramticos en su ecosistema.
2. Modalidades de conservacin
La conservacin de la biodiversidad puede, en teora, aplicarse a tres niveles de organizacin:
gnica, organsmica y ecolgica. Con los avances de la ingeniera gentica en el aislamiento,
secuenciacin y transferencia de genes, se acerca el momento en el que se establezcan grandes
bancos de genes para su conservacin. Sin embargo, por el momento, en la mayora de los casos,
los genes no se conservan individualmente, sino formando parte de organismos, poblaciones o
ecosistemas. Al igual que los genes de un organismo se asocian entre ellos a travs de mltiples
interacciones, los individuos de una especie o de diferentes especies interaccionan dentro de un
ecosistema. Por ello, cuando se acomete la conservacin con el mximo nivel de informacin el
ecosistema, no slo se conservan cada uno de sus componentes, sino tambin todas sus relaciones
recprocas. Consecuentemente, se considera que la forma ms lgica y el mtodo ms econmico
de conservar una entidad biolgica es dentro del ecosistema del que forma parte. Idealmente, por
tanto, la conservacin de los ecosistemas, y refirindonos al nivel de organismos, la conservacin
de especies amenazadas en sus hbitats naturales, o conservacin in situ, constituye la manera
ms apropiada de enfocar la problemtica de conservacin.
2.1. Conservacin in situ
La conservacin in situ de especies amenazadas implica una adecuada proteccin y gestin de sus
ecosistemas. Existe un gran nmero de figuras de proteccin de espacios naturales en donde la
actividad humana queda condicionada o restringida en mayor o menor medida. No obstante,
frecuentemente la simple restriccin de la actividad humana en el entorno no resulta suficiente
para asegurar la supervivencia de las especies a conservar.
La gestin activa de un ecosistema para conservar una determinada especie puede requerir
medidas de intervencin, como la preservacin del medio fsico en el que se desarrolla la especie
amenazada, la potenciacin de interacciones con otros organismos que lleven implcito un
beneficio para la especie amenazada, y el establecimiento de programas de reforzamiento de
poblaciones existentes, reintroduccin en localidades donde la poblacin ya se haya extinguido
o, incluso, la introduccin de nuevas poblaciones.
Para poder acometer de forma apropiada este tipo de acciones resulta necesario recabar
previamente una gran cantidad de informacin sobre la especie a proteger y su ecosistema.
Por ello, el proceso de conservacin in situ se inicia con el estudio y seguimiento en el tiempo de
las poblaciones, recabando datos demogrficos, genticos y autoecolgicos. La utilizacin de
tcnicas de anlisis de viabilidad de poblaciones constituye otra herramienta de gran valor por su
capacidad diagnstica
y su poder de evaluacin al considerar diferentes alternativas de gestin.
A menudo, las actividades de conservacin in situ se encuentran con problemas de aplicacin
derivados de la necesidad de establecer marcos legales de proteccin de las reas y hbitats
pertinentes, de conflictos de inters con otras actividades humanas, y de falta de una asignacin
continuada y a largo plazo de recursos econmicos a las instituciones encargadas de las tareas de
conservacin. A esto cabe aadir, en numerosas ocasiones, la falta de una informacin bsica
sobre la biologa de las especies a conservar. Este tipo de limitaciones conlleva la necesidad de
desarrollar mtodos de conservacin ex situ, o conservacin fuera del hbitat natural, que sirvan
para complementar las acciones tomadas en los hbitats naturales.

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2.2. Conservacin ex situ


Mientras est universalmente aceptado que el mecanismo ms efectivo y eficiente para la
conservacin es la proteccin de los hbitats, tambin est reconocido que las tcnicas de
conservacin ex situ constituyen componentes crticos en un programa de conservacin global.
Los programas de conservacin ex situ complementan la conservacin in situ almacenando a largo
plazo germoplasma representativo de las poblaciones, permitiendo un mejor conocimiento de las
caractersticas anatmicas, fisiolgicas y bioqumicas del material almacenado, y proporcionando
propgulos para su utilizacin en programas educativos, programas de mejora gentica de
especies cultivadas y en planes de reforzamiento, reintroduccin o introduccin.
Los mtodos de conservacin ex situ implican la recoleccin de muestras representativas de la
variabilidad gentica de una especie y su mantenimiento fuera de las condiciones naturales en las
que la especie ha evolucionado.
Una vez realizada la recoleccin del material a conservar, la conservacin ex situ de especies
amenazadas consta de dos elementos esenciales: el almacenamiento o preservacin del
germoplasma y el desarrollo de mtodos que posibiliten su propagacin. No obstante, tambin
deben tenerse presentes otros elementos relevantes tales como la documentacin y la
caracterizacin del germoplasma almacenado . Conviene tener presente que la reducida
disponibilidad del material vegetal disponible es un factor que siempre acompaa a las actividades
de conservacin de especies raras o amenazadas, de manera que la capacidad de ensayar
protocolos y llevar a cabo experimentos con replicacin se encuentra a menudo muy limitada.
Para solventar este problema, a veces se trabaja simultneamente con especies emparentadas no
amenazadas donde la disponibilidad de material no est limitada.
Las ventajas que proporcionan estos mtodos son control directo sobre el material, fcil
accesibilidad y disponibilidad.
2.3. Los bancos de germoplasma in vitro
Son sitios para la conservacin de los recursos genticos en condiciones controladas de
laboratorio y que involucran diversas tcnicas de cultivo y almacenamiento in vitro. En los
mismos se busca maximizar la diversidad de ejemplares recolectados de poblaciones en campo o
en su centro de origen. La unidad de coleccin que se mantiene en condiciones controladas puede
ser la semilla botnica o explantes vegetativos, dependiendo principalmente del hbito de
crecimiento de la especie.
Para proveer a los explantes y semillas las condiciones adecuadas de almacenamiento in vitro se
han desarrollado tcnicas que permiten mantener una alta diversidad en espacios reducidos, en
condiciones aspticas y a salvo de los riesgos ambientales que podran provocar su prdida . Por
ejemplo, embriones y cotiledones de Arachis retusa fueron conservados in vitro para superar los
problemas de baja viabilidad en el almacenamiento de la semilla sexual, debido al alto contenido
lipdico.
Adems, con el cultivo in vitro se facilita el intercambio de material gentico, ya que muestras
pequeas pueden ser enviadas en condiciones aspticas, incluso a pases con regulaciones
fitosanitarias muy estrictas.
2.3.1. Tipos de almacenamiento in vitro
El almacenamiento in vitro se puede clasificar, segn su duracin, en almacenamiento por
corto plazo (conocido en ingls como short-term storage) y en almacenamiento por largo
plazo (conocido en ingls como long-term storage). En el primer tipo, generalmente se utilizan
tcnicas de cultivo in vitro que fomenten el crecimiento reducido, mientras que en el segundo se
utiliza principalmente la crioconservacin.
2.3.1.1. Almacenamiento por corto plazo y principales factores involucrados
En el almacenamiento por corto plazo los explantes permanecen in vitro hasta por 12 meses,
manejando condiciones de cultivo para retrasar el crecimiento y aumentar los intervalos entre
subcultivos . Por ejemplo, Marin y Duran-Vila (1991) conservaron segmentos nodales juveniles
enraizados de naranja dulce (Citrus sinensis), naranja trifoliada (Poncirus trifoliata), lima

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mexicana (C. aurantifolia), toronja (C. paradisi) y limn Eureka (C. limon) durante un ao
mediante esta tcnica.
Como parte de las estrategias empleadas para disminuir el crecimiento de los explantes y
aumentar los intervalos entre subcultivos, est el reducir la temperatura de los cuartos de
crecimiento, modificar los medios de cultivo y otros factores ambientales que se deben tomar en
cuenta para optimizar el almacenamiento.
Factores que se deben tomar en consideracin para el almacenamiento por corto plazo.
a. Temperatura
Se produce una reduccin en la actividad metablica y, en consecuencia, en el crecimiento de los
explantes, al disminuir la temperatura de cultivo (esta temperatura depende de los requerimientos
de cada especie) . Generalmente se utilizan temperaturas alrededor de los 4 C para cultivos de
clima templado y entre 10 y 15 C para el germoplasma tropical. El control de la temperatura se
combina usualmente con otros factores para lograr un crecimiento reducido. En banano,
temperaturas reducidas se han combinado con reduccin en la intensidad lumnica o la completa
supresin de luz. La propagacin vegetativa de los tallos de banano normalmente se realiza a 22
C con una intensidad lumnica de 3000 lux. Si n embargo, para su almacenamiento por corto
plazo, se colocan a 15 C bajo una intensidad lumnica de 1000 lux.
Si se mantienen los explantes a temperaturas bajas (inferiores a 4 C) por perodos prolongados,
pueden presentarse daos fisiolgicos, causados por el fro, que inciden en cambios en el
metabolismo, en el contenido de protenas, y en la composicin y funcionamiento de las
membranas . Estos problemas pueden ser reversibles cuando no hay exposicin prolongada a esta
condicin. Generalmente, las plantas tropicales son sensibles a daos por fro y la temperatura de
almacenamiento depende de la sensibilidad particular de cada especie. Por ejemplo,
Gangopadhyay et al. (2005) determinaron que la temperatura de almacenamiento ptima para
microtallos encapsulados de pia (Ananas comosus L.) era de 8 oC para un periodo de 45 a 60
das.
En las especies no tropicales, la reduccin de temperatura acta, muchas veces, como seal para
romper el estado de reposo de los explantes e inducir la activacin de su crecimiento. Por ejemplo,
el almacenamiento de lirio (Lilium longiflorum L.) a bajas temperaturas (0-10 C) indujo la
ruptura del estado de reposo que llev, consecuentemente, a su germinacin y floracin. Por lo
tanto, su almacenamiento in vitro debi ser realizado a 25 C, en medio de cultivo con todas las
sales minerales (a un cuarto de su concentracin) y vitaminas del medio Murashige y Skoog
(1962) (MS) y una concentracin alta de sacarosa (9%) por 28 meses. Esta medida permiti
mantener una viabilidad superior al 84% . Adems, en ese trabajo, el manejo de la temperatura se
combin con una reduccin de los nutrientes disponibles en el medio de cultivo, aspecto que
tambin es de gran importancia, como se discutir a continuacin. Ambas medidas permitieron
retardar el proceso de crecimiento y prolongar el almacenamiento.
b. Medio de cultivo
La reduccin en la concentracin de elementos minerales y/o carbohidratos metabolizables (por
ejemplo, sacarosa) en el medio de cultivo puede ser una estrategia importante para la reduccin
del crecimiento del explante. Otras medidas pueden ser el aumentar el potencial osmtico del
medio (especialmente mediante el uso de carbohidratos no metabolizables, como el manitol), el
uso de concentraciones mayores de gelificantes, la adicin de ciertos reguladores de crecimiento
(como el cido abscsico [ABA]), o de otras sustancias (como el cloruro de magnesio) para reducir
daos en el explante. Como consecuencia de las medidas anteriores, el explante absorbe los
nutrientes ms lentamente y ocurre una reduccin en el crecimiento . Por ejemplo, para disminuir

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un problema de necrosis en explantes de banano in vitro, se suplement el medio de cultivo con


50-100 mg/l de cloruro de magnesio. Con esta medida se logr la recuperacin del 90% de los
explantes que se encontraban en estados iniciales de necrosis .
En el caso de Curcuma longa, una planta aromtica tropical utilizada en la cocina del medio
oriente y asitica, el uso de agar y altas concentraciones de sacarosa (10%) en el medio de cultivo
permiti su almacenamiento durante 23 semanas .
c. Recipiente de cultivo
El volumen del recipiente de cultivo puede ser determinante para definir la frecuencia de
subcultivos y el almacenamiento ptimo de los explantes . Por ejemplo, en Curcuma longase
utilizaron envases con capacidad de 180 ml para el almacenamiento a corto plazo (durante seis
semanas) y de 2,5 l para el almacenamiento ms prolongado (durante 23 semanas). Esto permiti
una optimizacin en el almacenamiento de esta especie al utilizar eficientemente al volumen del
recipiente segn las necesidades de crecimiento del explante .
d. Modificacin del ambiente gaseoso
La reduccin del crecimiento se puede lograr tambin al disminuir el nivel de oxgeno disponible
para los explantes. Sin embargo, bajo esas condiciones de almacenamiento, a menudo se
desarrollan tejidos hiperhdricos, necrticos y con crecimiento ms lento. La hiperhidricidad es
un desorden fisiolgico que se caracteriza por la apariencia vidriosa e hinchada en los tejidos,
tallos turgentes, acuosos e hipolignificados y rganos translcidos, verdes, quebradizos y con
deformaciones en la cutcula y epidermis. Cabe mencionar que la necrosis de explantes, a causa
de la reduccin de oxgeno, se ha logrado disminuir al adicionar nitrato de plata, giberelinas,
fructuosa, calcio, cido ascrbico y/o carbn activado al medio de cultivo.
Un mtodo para la modificacin del ambiente gaseoso consiste en bajar la presin parcial del
oxgeno usando atmsferas controladas o disminuyendo la presin atmosfrica de la cmara. Esto
ha permitido el almacenamiento in vitro de especies tropicales sensibles a bajas temperaturas.
Otro mtodo para limitar el nivel de oxgeno disponible es el uso de una capa de aceite mineral o
medio lquido para cubrir los explantes .
e. Encapsulacin
En la tcnica de encapsulacin se recubren embriones somticos, yemas gametofticas (en
brifitas) o pices, con una cubierta gelatinosa, como por ejemplo de alginato de calcio, para
formar "semillas sintticas". La proteccin que provee el encapsulamiento confiere, a la vez,
resistencia contra la deshidratacin y las bajas temperaturas durante el almacenamiento por corto
plazo . Por ejemplo, pices de fresa de la variedad comercial "Senga Sengana" y moras de la
variedad comercial "Norma" permanecieron encapsulados durante nueve meses. El medio de
encapsulacin contena alginato de calcio y el medio nutritivo con todas las sales minerales y
vitaminas de MS. Cada pice permaneci dentro de la estructura gelatinosa en forma de perla,
almacenado en oscuridad a 4 C.Otros ejemplos fueron realizados con microtallos (2-5 mm) de
pia encapsulados tambin con alginato de calcio y almacenados a 4 C. Estos mantuvieron la
viabilidad y la capacidad de brotacin hasta por 45 das (Soneji et al. 2002). Embriones somticos
encapsulados de Citrus reticulata Blanco cv. Mandarino Tardivo di Ciaculli se mantuvieron
viables por 60 das a 4 C . En el caso de la papaya (Carica papaya L.), Castillo et al. (1998)
mencionaron el potencial que presenta la encapsulacin de embriones somticos para el
almacenamiento de germoplasma, la produccin y la propagacin de clones, el fcil manejo, y la
facilidad para implementar la automatizacin a gran escala.

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2.3.1.2. Almacenamiento por largo plazo y principales factores involucrados


El almacenamiento por largo plazo es muy seguro por lo que se usa extensivamente en agricultura,
horticultura, y forestera para la investigacin y el monitoreo ambiental. Esta tcnica permite
almacenar semillas, semillas sintticas, meristemas y pices, polen, clulas , callos y suspensiones
celulares .Adems, requiere de poco espacio y mantenimiento .
Se considera que el almacenamiento por largo plazo es una prctica til para evitar la variacin
somaclonal en plantas con propagacin vegetativa y permite mantener los explantes sin alteracin
alguna bajo estas condiciones, prcticamente por tiempo indefinido .Papa y caf (son dos especies
difciles de almacenar por otros mtodos. El caf produce semillas recalcitrantes, las cuales
pierden viabilidad con rapidez durante el almacenamiento convencional y los bancos de
germoplasma ex situ presentan altos costos de mantenimiento. Es por esto que el almacenamiento
por largo plazo es una alternativa adecuada. Los embriones de caf pueden preservarse en
nitrgeno lquido (NL) hasta por un ao, sin que estos sufran prdida de viabilidad o alteraciones
por variacin somaclonal.
Para el almacenamiento por largo plazo, generalmente se utiliza la crioconservacin, aunque
existe tambin la posibilidad de utilizar otras tcnicas de cultivo in vitro en condiciones de
crecimiento reducido. La crioconservacin permite el almacenamiento de clulas, tejidos u
rganos vegetales vivos a temperaturas extremadamente bajas (-80 C). Esta tcnica permite el
almacenamiento durante perodos prolongados (mayores a un ao) utilizando NL, el cual
normalmente se encuentra a -196 C. En algunas ocasiones, se combina el NL con otros gases
inertes (como el helio y el argn).

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El nitrgeno lquido se utiliza porque detiene todas las actividades metablicas, inmediatamente
al hacer contacto con el explante y, a la vez, permite que los tejidos conserven la viabilidad sin
que ocurran alteraciones fisiolgicas.
El proceso de crioconservacin se inicia con el acondicionamiento criognico, que incluye el
enfriamiento (como se describi anteriormente con el uso de temperaturas bajas durante el
almacenamiento por corto plazo) y la aplicacin de sustancias crioprotectantes, luego el
almacenamiento a -80 C y por ltimo el proceso de recuperacin.
El tratamiento con sustancias crioconservantes o crioprotectantes previene el dao por fro en los
tejidos al desplazar el agua que se encuentra intra e intercelularmente. Esta remocin de agua
evita la ruptura de las membranas en las clulas. Estas sustancias crioprotectantes contienen
concentraciones altas de sacarosa (0,4 M), glicerol (15%), dimetil sulfxido (DMSO ) (15%),
etilenglicol y/o polivinil alcohol. Sin embargo, la plasmlisis excesiva y el choque osmtico
tambin pueden tener efectos negativos sobre el tejido, provocando daos despus de la
descongelacin y durante la regeneracin.
Tcnicas de crioconservacin
La crioconservacin clsica incluye la deshidratacin inducida en condiciones estriles en una
cmara de flujo laminar, el pre-enfriamiento paulatino de los materiales (se utilizan diferentes
gradientes de temperatura, por ejemplo: 10, 8, 4, -20 y -40 C, as como diferentes tiempos de
permanencia en esas temperaturas), la inmersin en NL sin crioprotectantes y, posteriormente, el
almacenamiento a 80 C. Sin embargo, nuevas tcnicas basadas en la eliminacin parcial de
agua en los tejidos y el congelamiento inmediato de los explantes han desplazado parcialmente a
la tcnica clsica. Estas nuevas tcnicas son: (1) vitrificacin, (2) encapsulacin deshidratacin,
(3) encapsulacin vitrificacin, (4) precrecimiento, (5) precrecimiento deshidratacin, (6)
desecacin y (7) enfriamiento de gotas.
1) Vitrificacin
La vitrificacin es un proceso que promueve la deshidratacin celular y "solidificacin" de
lquidos en ausencia de cristalizacin (se evita la formacin de cristales de hielo intracelulares
que daan los tejidos). Con la "solidificacin" se induce un estado con una estructura molecular
aleatoria pero que posee propiedades fsicas y mecnicas similares a un slido. Esta transicin del
agua lquida a una fase amorfa cambia la conformacin estructural celular hacia una apariencia
vidriosa. La vitrificacin es realizada previa al congelamiento por medio de una sustancia
crioprotectante.
Esta tcnica se recomienda para rganos complejos, como pices de tallos, tejidos embriognicos
y cultivos de clulas. Adems de los compuestos usuales, mencionados anteriormente, en la
solucin crioprotectante se han adicionado tambin otras sustancias. Por ejemplo, protenas
anticongelantes como albmina de suero bovino (BSA), epinefrina o el aminocido prolina (PRO)
para incrementar la sobrevivencia, una vez terminada la fase de crioconservacin, en meristemas
apicales de papa. Wang y colaboradores (2005) desarrollaron un protocolo donde se utiliz PRO
en la solucin crioprotectante y se obtuvo una sobrevivencia de alrededor de 80% para explantes
de los cultivares taiwaneses de papaya "Tai-nung, Red Lady y Florida". Otro agente
crioprotectante es el Supercool X1000 , que es un polmero de alcohol de polivinilo, el cual tiene
una funcinsimilar a las protenas anticongelantes al inhibir la formacin de hielo durante la
crioconservacin .
Se ha encontrado que soluciones crioprotectantes, con productos como DMSO, pueden ser txicas
para algunas especies tropicales. Por lo tanto, la mezcla de la solucin crioprotectante y el
producto debe ser cuidadosamente seleccionada . Una vez aplicada la solucin lquida

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crioprotectante e inducida la vitrificacin, los tejidos se congelan con NL. Posterior al tratamiento
con la solucin crioprotectante y el NL, los explantes son almacenados a -80 C .
Pennycooke y Towill (2000) utilizaron una mezcla crioprotectante de DMSO, sacarosa y glicerol
durante 26 minutos a 22 C para conservar pices de tallo de camote (Ipomoea batatas) y lograron
la regeneracin, ocho semanas despus del descongelamiento, con una sobrevivencia mayor al
80%.
Durante el descongelamiento, los explantes generalmente se colocan en un bao de Mara a 40
C por uno a dos minutos y luego son lavados con medio de cultivo suplementado con sacarosa
(0,41,2 M). Posteriormente, los explantes se colocan en el mismo medio de cultivo para su
recuperacin y regeneracin en condiciones de adecuadas luz .
La vitrificacin en este contexto no debe ser confundida con el fenmeno de hiperhidricidad
descrito anteriormente, ya que en artculos anteriores a 1992 se usaba el mismo trmino.
Debergh et al. (1992) sugirieron el uso de la palabra hiperhidricidad en el segundo caso para evitar
confusiones.
2) Encapsulacin deshidratacin
La encapsulacin - deshidratacin se ha utilizado con pices de tallo y tejidos embriognicos. Los
explantes se precultivan en una solucin con concentracin alta de sacarosa (0,5-0,75 M) y luego
son encapsulados en alginato de calcio o en polioxietilen glicol (PEG); despus se les aplica una
deshidratacin en la cmara de flujo laminar (cuatro a cinco horas), se congelan con NL y se
mantienen a -80 C por el perodo de almacenamiento. El descongelamiento se realiza en bao de
Mara a 40 C por uno a dos minutos y se cultivan en medio para la recuperacin del crecimiento
y regeneracin .
(3) Encapsulacin vitrificacin
La encapsulacin - vitrificacin es similar al anterior en cuanto al uso de alginato de calcio para
la encapsulacin. Se diferencia del mismo por no utilizar el precultivo de los explantes en una
solucin con alta concentracin de sacarosa, sino ms bien por el uso de una solucin
crioprotectante (como se menciona en la primera tcnica) a 0 C por unas horas, en su lugar, y
por haber sido usado especficamente para meristemas. Los meristemas son encapsulados en
medios que contienen altas concentraciones de azcares (glicerol 2 M y/o sacarosa 0,4 M). Se
congelan inmediatamente con NL y se mantie nen a -80 C. El proceso de descongelamie nto es
similar al utilizado en la tcnica de encapsulacin deshidratacin.
(4) Precrecimiento
El precrecimiento se ha utilizado especficamente para embriones cigticos y somticos. La
tcnica involucra el cultivo in vitro previo de los embriones en presencia de crioprotectantes por
varios das. Posteriormente, los embriones se congelan directamente en NL, para luego
almacenarlos a -80 oC. El proceso de descongelamiento es similar a la tcnica de encapsulacin
deshidratacin .
(5) Precrecimiento deshidratacin
En el precrecimiento - deshidratacin se utilizan segmentos de tallo previamente cultivados en un
medio alto en sacarosa, ABA o PRO. Posteriormente estos se desecan en flujo de aire y se
congelan directamente en NL. El proceso de descongelamiento es similar a la tcnica mencionada
para la vitrificacin . Esta tcnica tambin ha sido utilizada con callos embriognicos de yuca
(Manihot esculenta) provenientes del Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) en

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Colombia y del Instituto Internacional de Agricultura Tropical (International Institute of Tropical


Agriculture [IITA]) en Nigeria. Los callos se trataron previamente con una solucin
crioprotectante alta en sacarosa, se deshidrataron y, posteriormente se congelaron con NL .
6) Desecacin
La desecacin se ha utilizado slo con semillas recalcitrantes y estructuras haploides como polen
y vulos. En ella se realiza primero la desecacin de los tejidos o semillas en una cmara de flujo
laminar o en un aparato con aire comprimido estril o en slica gel y, luego se congelan las
estructuras con NL . Por ejemplo, en el caso de caf, esta tcnica permiti mantener la viabilidad
de los embriones durante al menos un ao . En el caso de tejidos haploides, como por ejemplo el
polen de palma aceitera, la desecacin fue realizada por medio de vaco. El polen fue mantenido
en almacenamiento durante ocho aos y, posteriormente, se observ que al germinar present una
viabilidad del 62%. Como comparador, este mismo polen se almacen en fro (entre -10 y -20 C)
y a temperatura ambiente. En el primer caso, el polen permaneci viable durante un ao y en el
segundo caso, permaneci viable solamente durante siete das .
7) Enfriamiento de gotas
En enfriamiento de gotas se ha realizado con pices de tallos, los cuales son pretratados con una
solucin crioprotectante y luego colocados sobre papel aluminio, de manera que se formen gotas
pequeas de crioprotectante con el pice en el centro. Los explantes se congelan directamente con
NL . Un ejemplo exitoso fue realizado con pices de tallo de 18 cultivares de Colocasia
esculenta (ame). Los pices fueron desecados previamente con flujo de aire estril y colocados
en un medio de cultivo MS suplementado con glicerol (2 M) y sacarosa (0,4 M). Luego, estos se
colocaron en una solucin crioprotectante que consisti de medio lquido MS con glicerol (3,26
M), etiln glicol (2,42 M), DMSO (1,9 M) y sacarosa (0,4 M). Gotas de este medio con los pices
de C. esculenta se colocaron sobre una superficie plana con papel de aluminio y fueron congeladas
con NL. En esta investigacin se obtuvo una tasa de regeneracin de entre 73 y 100% .
Tcnicas de cultivo de tejidos para el almacenamiento por largo plazo
Adems de la crioconservacin, tambin existe la posibilidad de almacenar tejidos in vitro por
largo plazo sin el uso de NL, retrasando el crecimiento al controlar factores como el estrs
osmtico del medio . Esto se logra utilizando azcares no metabolizables por las plantas como el
manitol o el sorbitol. Adicionalmente, se puede usar reguladores de crecimiento que reduzcan la
tasa de crecimiento y bajas temperaturas. Bessembinder et al. (1993) mantuvieron clones de C.
esculenta durante ocho aos a 9 C, con ciclos de transferencia cada tres aos. En otro ejemplo,
se mantuvieron los meristemos de cultivares comerciales de banano almacenados entre 28 y 30
meses en medios de cultivo con la mitad de la concentracin de las sales minerales, a 22 oC con
un fotoperiodo de 16 horas luz y transferencia cada dos meses . Sin embargo, es importante sealar
que tiempos mayores de cultivo in vitro podran inducir tasas ms altas de variacin somaclonal

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III ALMACENAMIENTO DE GERMOPLASMA


El almacenamiento de germoplasma de especies amenazadas tiene lugar en forma de colecciones
de plantas y en los bancos de germoplasma.
1. Colecciones de plantas
Las colecciones de plantas constituyen el mtodo tradicional de conservacin ex situ de recursos
fitogenticos. Bajo esta denominacin se pueden considerar tanto los jardines botnicos como las
colecciones de plantas en campo. No obstante, el almacenamiento de germoplasma de especies
amenazadas en forma de colecciones de plantas tan slo tiene lugar bajo el cuidado de los jardines
botnicos.
Los jardines botnicos pueden considerarse las primeras instituciones implicadas en la
conservacin ex situ de recursos vegetales. El establecimiento de colecciones de diferentes tipos
de plantas se remonta a la antigedad, estando en muchos casos vinculado a prcticas religiosas.
Sin embargo, el gran desarrollo de los jardines botnicos tal como los conocemos en la actualidad
lleg de la mano de las grandes potencias coloniales, que establecieron numerosos jardines en sus
posesiones de ultramar y en sus propios pases como mtodo de introduccin de plantas y cultivos
exticos.
En la actualidad hay cerca de 1.500 jardines botnicos por todo el mundo, de los cuales ms de
500 desarrollan actividades de conservacin. Los jardines botnicos cultivan alrededor de 80.000
especies, de las cuales un 10 % se encuentra en peligro de extincin
2. Bancos de germoplasma
La conservacin ex situ de germoplasma de especies raras y amenazadas est basada
esencialmente en la utilizacin de los bancos de germoplasma. Los bancos de germoplasma son
centros orientados al almacenamiento mediante propgulos de una parte representativa de la
variabilidad gentica correspondiente a una determinada especie. Dentro de esta categora
podemos distinguir los bancos de semillas, los bancos de cultivo in vitro, los bancos de polen y
los bancos de genes o bancos de ADN.
2.1. Bancos de semillas
El almacenamiento de semillas ha interesado a la humanidad desde el inicio de la agricultura hace
10.000 aos. Los antiguos agricultores almacenaban semillas para su utilizacin en la siembra del
siguiente ao o como reserva de alimento. Sin embargo, no es hasta mediados del presente siglo
cuando se inicia de forma sistemtica el almacenamiento de semillas con fines cientficos o de
conservacin. El almacenamiento del material a conservar en forma de semillas constituye uno
de los procedimientos de conservacin ex situ ms vlidos y extendidos en la actualidad. Se ha
podido comprobar que el almacenamiento de semillas a largo plazo constituye una operacin
relativamente simple y econmica en trminos de tecnologa, infraestructuras, personal y gastos
de mantenimiento
De esta manera, resulta posible mantener un gran nmero de semillas de diferentes especies
vegetales durante largos perodos de tiempo y con un mnimo riesgo de daos genticos. Las
semillas presentan una serie de caractersticas que hacen que su almacenamiento sea el mtodo
ms eficaz y econmico para la conservacin ex situ de especies vegetales. Por un lado, las
semillas son unidades adaptadas a la dispersin en el tiempo y, por tanto, capaces en la mayora
de los casos de permanecer viables, de forma natural, durante largos perodos de tiempo). En
segundo lugar, el pequeo tamao de las semillas, unido a la posibilidad de que cada una de ellas
posea una constitucin gentica diferente, asegura la conservacin de una gran diversidad
gentica en un espacio reducido.
La conservacin de semillas posee mayores requerimientos tcnicos que las colecciones de
plantas. Sin embargo, estas ltimas resultan caras en trminos de mano de obra y espacio, y slo
permiten el mantenimiento de un nmero reducido de individuos por especie.
Adems, las colecciones de plantas resultan vulnerables frente a desastres naturales como
incendios, tornados, plagas y enfermedades.
La conservacin de semillas ofrece como mnimo un servicio de seguridad y apoyo a otras
tcnicas de conservacin, mientras que, en el otro extremo, puede constituir la nica opcin
disponible cuando los ltimos ejemplares de una especie estn a punto de desaparecer (. Por ello,

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entre todos los mtodos de conservacin, los bancos de semillas son los ms utilizados al ser
simultneamente prcticos y econmicos.
En general, se utiliza el trmino coleccin base para las colecciones almacenadas a largo plazo,
mientras que el trmino coleccin activa es aplicado a colecciones almacenadas a medio plazo
y se utiliza el trmino colecciones de trabajo para referirse a colecciones de mejoradores
almacenadas con objetivos a corto plazo. Por motivos de seguridad, a menudo se guardan
duplicados de las colecciones base en otros bancos de semillas.
Aunque el almacenamiento en bancos de germoplasma est universalmente aceptado como parte
integral de los programas de conservacin de plantas silvestres, las muestras de semillas de plantas
silvestres almacenadas en bancos de germoplasma suponen menos del 2 % del total de
germoplasma almacenado, destinado esencialmente a plantas cultivadas.
a. Semillas ortodoxas y semillas recalcitrantes
Las semillas se clasifican como ortodoxas o tolerantes a la desecacin cuando son capaces de
mantener su viabilidad tras ser desecadas a menos de 5-10 % de contenido en humedad. Por el
contrario, las semillas recalcitrantes o sensibles a la desecacin pierden viabilidad cuando se
desecan por debajo de un lmite crtico, habitualmente entre 12-30 % de contenido en humedad.
Existe una tercera categora en la que las semillas tienen caractersticas de almacenamiento
intermedias entre las ortodoxas y las recalcitrantes. Las semillas intermedias pueden ser desecadas
a contenidos de humedad similares a los de las semillas ortodoxas. Sin embargo, las semillas, una
vez desecadas, se daan al someterlas a bajas temperaturas y su viabilidad desciende rpidamente
durante el almacenamiento. Por ello, la determinacin del comportamiento de las semillas de una
especie constituye un tema trascendental de cara a su conservacin a largo plazo. Las semillas de
especies con semillas ortodoxas pueden ser conservadas en bancos de semillas convencionales
bajo condiciones de baja temperatura y humedad. Por el contrario, las especies con semillas
intermedias o recalcitrantes no pueden mantenerse de esta manera.
Afortunadamente, la mayora de las especies silvestres de las zonas templadas del planeta forman
semillas ortodoxas. Las semillas recalcitrantes se encuentran en especies acuticas, especies con
semillas de gran tamao, especies procedentes de zonas tropicales y algunas especies arbreas de
clima templado como Quercus, Acer y Aesculus .
.
b. Principios de conservacin de semillas
El principio bsico para la conservacin de semillas es la limitacin de los cambios qumicos que
son originados por el metabolismo o los procesos de envejecimiento. Se sabe desde hace tiempo
que unas condiciones de baja temperatura y bajo contenido en humedad prolongan la longevidad
de las semillas. De acuerdo a las reglas de Harrington, existe una relacin exponencial entre la
longevidad de las semillas, la temperatura y el contenido de humedad de almacenamiento, de
manera que la longevidad de una semilla se duplica por cada reduccin de 5 C en la temperatura
y por cada reduccin de un 1 % en el contenido de humedad. De acuerdo con este modelo, las
semillas conservadas a muy bajas temperaturas y con muy bajos contenidos de humedad deberan
mantenerse viables durante milenios. Sin embargo, Vertucci y Roos (1990) y Ellis et al.
(1990) han mostrado que existen lmites a los efectos beneficiosos de la desecacin sobre la
longevidad y que estos lmites dependen de la composicin qumica de la semilla.
Tambin se ha comprobado que, en contra de lo establecido por las reglas de Harrington, los
efectos de la temperatura y el contenido de humedad no son independientes. De todas formas, el
uso apropiado de estos dos factores proporciona una va aceptable para la conservacin a largo
plazo de muestras de semillas en bancos de germoplasma.
c. Conservacin de semillas ortodoxas en bancos de semillas convencionales
Los mtodos para la manipulacin de las semillas, el envasado, los ensayos de germinacin y el
envo de muestras de semillas han sido evaluados en profundidad y se encuentran estandarizados
para el caso de especies cultivadas y, en principio, son igualmente aplicables a las especies
silvestres.
Una vez que las semillas llegan al banco, stas se desecan hasta un contenido de humedad de 3-7
%. A continuacin se limpian, se cuentan y se ensayasu viabilidad antes de colocarlas en
recipientes. Los recipientes utilizados para el almacenamiento suelen ser tarros de vidrio, tubos
de ensayo, latas metlicas hermticas y bolsas de aluminio laminado.

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Los mtodos de conservacin convencionales normalmente incluyen el almacenamiento a


temperaturas comprendidas entre 5 C y 20 C. En la conservacin a largo plazo las semillas se
almacenan normalmente a 18 C, mientras que en la conservacin a medio plazo se utiliza una
temperatura de 0 a 10 C.
Independientemente de las condiciones de almacenamiento utilizadas, la viabilidad de las
muestras debe ser controlada peridicamente. Si el porcentaje de germinacin es inferior al 85 %
del valor inicial en muestras almacenadas en colecciones a largo plazo y al 65 % del valor inicial
en colecciones activas, se recomienda su regeneracin ya sea mediante nuevas recolecciones o
por multiplicacin a partir de las semillas viables. La regeneracin mediante recoleccin en
muchos casos no es posible al haber desaparecido las poblaciones naturales y la multiplicacin
inevitablemente conlleva alteraciones en la composicin gentica de las muestras, originando,
frecuentemente, una disminucin de la variabilidad gentica y, en cualquier caso, prdida de
genotipos. Por ello, resulta prioritario garantizar unas condiciones adecuadas de almacenamiento
para retrasar en lo posible la regeneracin.
A cada muestra de semillas le corresponde informacin sobre el lugar de recoleccin, viabilidad
inicial y mtodos para la ruptura de la dormicin. Igualmente importante resulta el nmero de
identificacin del banco, el nombre de la especie y su localizacin en las cmaras de
almacenamiento. De forma adicional, la muestra de semillas puede ser caracterizada y evaluada
bajo criterios genticos, fenotpicos y agronmicos. Toda esta informacin sobre las colecciones,
de gran importancia para el futuro uso de las muestras almacenadas, se organiza e incluye en una
base de datos.
Conviene hacer una distincin entre el diseo y los procedimientos utilizados en un banco de
semillas de especies cultivadas y los llevados a cabo en un banco de semillas de especies
silvestres. Los bancos de semillas de especies cultivadas manejan miles de accesiones de especies
cuyas semillas son habitualmente de considerable tamao. En consecuencia, estos bancos de
semillas necesitan mucho ms espacio y cierto nmero de facilidades adicionales para cumplir
sus objetivos. Por el contrario, los bancos de semillas de especies silvestres normalmente poseen
menos accesiones y las semillas almacenadas son ms pequeas. El desecado puede realizarse
mediante desecantes qumicos, un mtodo poco prctico para bancos de semillas de especies
cultivadas. El gel de slice se vende con un indicador de cobalto que posee un color azul. Cuando
absorbe humedad se torna rosa y permite detectar la presencia de cualquier agujero o grieta en el
envase. Las ampollas de vidrio cerradas a la llama utilizadas en muchos bancos de semillas de
especies silvestres son probablemente los envases ms adecuados para el almacenamiento de
semillas, pero son demasiado caros y requieren demasiada mano de obra para los bancos de
semillas de especies cultivadas .
La conservacin de semillas de especies silvestres ha experimentado un gran desarrollo en Espaa
a lo largo de las ltimas dcadas. El Banco de Germoplasma del Departamento de Biologa
Vegetal de la Universidad Politcnica de Madrid ha sido pionero en estas actividades y en la
actualidad cuenta con cerca de 9.500 accesiones de semillas.
Otras instituciones que cuentan con bancos de semillas de especies silvestres son el Jardn
Botnico de Crdoba, el Jardn Botnico de Madrid, el Jardn Canario, el Jardn Botnico de
Valencia, el Jardn Botnico de Sller (Mallorca) y el Jardn Botnico Marimurtra de Blanes
(Girona) . El resto de los pases de la regin mediterrnea posee una cobertura de bancos de
semillas de especies silvestres mucho ms escasa. Desde la Organizacin para la Investigacin
Fitotaxonmica del rea
Mediterrnea (OPTIMA) se estn llevando a cabo diversas iniciativas encaminadas a trasladar el
ejemplo de Espaa al resto de pases del Mediterrneo .
d. Crioconservacin de semillas ortodoxas
A la conservacin de material vivo a muy bajas temperaturas se le conoce con el nombre de
crioconservacin . En la crioconservacin se persiguen temperaturas inferiores a 130 C para
alcanzar unas condiciones de ausencia de agua en estado lquido, baja energa cintica molecular
y una difusin extremadamente lenta, y as lograr que las reacciones qumicas se encuentren
prcticamente paralizadas. Bajo estas condiciones, se postulan longevidades extremadamente
largas y slo limitadas por la acumulacin de lesiones genticas producto de la radiacin de fondo.

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Las tcnicas de crioconservacin utilizan normalmente nitrgeno lquido (196 C) debido a su


coste relativamente bajo.
Los protocolos para el almacenamiento en nitrgeno lquido de semillas ortodoxas fueron
establecidos por Stanwood y Baas (1981). Se ha podido comprobar que las semillas ortodoxas de
un gran nmero de especies son capaces de sobrevivir a la crioconservacin en nitrgeno lquido
. En algunas especies se han observado roturas de las semillas y agrietamiento de las cubiertas
seminales . Sin embargo, un control cuidadoso de la velocidad de enfriamiento, el contenido de
humedad de la semilla y la velocidad de descongelacin pueden ser cruciales para obviar estos
daos.
Las semillas pequeas son las que se adaptan mejor a esta tcnica, mientras que las especies con
semillas grandes y con alto contenido en lpidos son las ms problemticas.
Las semillas se almacenan normalmente en recipientes especficamente diseados para tal efecto
en la fase de vapor del interior de tanques que contienen nitrgeno lquido, aproximadamente a
peridicamente para mantener las semillas
almacenadas a la temperatura de 160 C.
Las semillas ortodoxas no suelen requerir un enfriamiento gradual. Sin embargo, cuando el
contenido de humedad de las semillas es alto puede resultar necesario una desecacin previa de
las mismas, ya que el contenido de humedad de las semillas es uno de los factores ms importantes
para controlar la respuesta de la semilla a la exposicin a nitrgeno lquido. Nuestros estudios han
mostrado que las semillas de numerosas especies silvestres y cultivadas que tras la recoleccin
presentan contenidos de humedad entre 4 y 12% pueden ser almacenadas directamente en
nitrgeno lquido, sin necesidad de desecacin previa ni de un enfriamiento gradual. La
descongelacin de las semillas crioconservadas se lleva a cabo colocndolas directamente a
temperatura ambiente al sacarlas de los tanques de crioconservacin.
En estas circunstancias se evita la necesidad de llevar a cabo controles de viabilidad, responsables
de una disminucin significativa del nmero de semillas almacenadas, y se soslayan los riesgos
de cambio gentico asociados a los procesos de multiplicacin. Otras ventajas de las tcnicas de
crioconservacin son la ausencia de controles de temperatura y humedad durante el
almacenamiento, la inexistencia de daos por parsitos y patgenos y, en teora, una viabilidad
indefinida. Por ello, los bancos de crioconservacin de semillas ortodoxas constituyen una
alternativa interesante a los bancos de semillas convencionales, principalmente para muestras de
las que no se dispone gran cantidad de semilla y de las que no es factible realizar nuevas
recolecciones . Estas tcnicas han sido utilizadas con xito en varias especies raras o amenazadas
de
Espaa, como Coronopus navasii (Cav.) DC., Vella pseudocytisus L., Cistus osbeckiifolius Webb
ex Christ. y Helianthemum polygonoides, Peinado et al. . De igual manera, diversas especies
amenazadas estn siendo conservadas mediante crioconservacin de semillas por parte de
instituciones de Estados Unidos y Australia.
Adems de semillas ortodoxas, las esporas de pteridofitos y briofitos tambin pueden ser
crioconservadas. As, por ejemplo, se han logrado conservar con xito esporas del helecho
arborescente amenazado Cyathea spinulosa y del helecho
Asplenium billotii (Iriondo, no publicado).
Las tcnicas de crioconservacin pueden igualmente resultar especialmente tiles en el
almacenamiento de semillas recalcitrantes y la conservacin de otros propgulos como pices de
tallos, yemas o meristemos para los que no existen en la actualidad otras alternativas para la
conservacin a largo plazo.
e. Conservacin de semillas recalcitrantes
Las semillas recalcitrantes tienen longevidades cortas que oscilan entre unas pocas semanas y
varios meses . Los tres factores que contribuyen a la corta longevidad de las semillas almacenadas
son: sensibilidad a la desecacin, daos por fro y problemas de contaminacin microbiana y
germinacin durante el almacenamiento asociados a su alto contenido en humedad.
Se sabe que la velocidad de desecacin, el estado de desarrollo, la temperatura y la concentracin
de O2 son factores que afectan al contenido crtico de humedad de las semillas recalcitrantes .
Esto indica que la expresin de la sensibilidad a la desecacin es un carcter multifactorial en el
que las condiciones ambientales y el metabolismo juegan un papel fundamental. Las semillas

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recalcitrantes se caracterizan a menudo por su incapacidad para limitar su metabolismo o por


disponer de un sistema de eliminacin de radicales libres incompleto y, en consecuencia, por
quedar expuestas durante largos perodos a los radicales libres.
Para mantener la viabilidad, las semillas recalcitrantes se conservan a una temperatura tan baja
como sea posible bajo condiciones que mantengan un contenido de humedad de las semillas
ligeramente superior al lmite crtico y aseguren un aporte de oxgeno para la respiracin . Dado
que la longevidad de las semillas bajo estas condiciones es tan slo del orden de semanas o meses,
estas especies se conservan habitualmente en colecciones de campo.
En la actualidad se estn desarrollando mtodos para que los tejidos puedan ser expuestos a
temperaturas inferiores a 0 C sin que se forme hielo letal. Estos mtodos requieren optimizar el
contenido de humedad de la semilla y enfriar los tejidos hasta una temperatura apropiada y a una
velocidad adecuada de manera que tanto los daos por desecacin como por congelacin sean
evitados .
Uno de estos mtodos est orientado a semillas recalcitrantes que son extremadamente sensibles
a la desecacin y no pueden sobrevivir a contenidos de humedad inferiores al 60 % (por ejemplo,
ctricos). Estas semillas se almacenan en un estado de vitrificacin en el que no se forman cristales
de hielo a pesar de encontrarse a temperaturas inferiores a 0 C . Estos cristales de hielo se evitan
mediante el tratamiento de las semillas con sustancias crioprotectoras y la utilizacin de
velocidades de enfriamiento extremadamente rpidas (hasta 2.000 C/min). Las sustancias
crioprotectoras previenen la desnaturalizacin de los constituyentes de la clula durante la fase de
desecacin y estabilizan el estado de vitrificacin. Se ha observado que muchos sistemas
vegetales recopilan este tipo de sustancias durante determinados estados de desarrollo. As,
durante la maduracin de la semilla, las semillas ortodoxas acumulan cantidades masivas de
azcares y protenas que se consideran protectoras frente a varios tipos de estrs. Las sustancias
protectoras de sntesis habitualmente utilizadas son el dimetil sulfxido (DMSO) y el etilenglicol.
Una vez que se optimiza el contenido de humedad en la semilla, los tejidos se enfran rpidamente
con nitrgeno lquido. La descongelacin de las muestras crioconservadas tambin es crtica y
normalmente se lleva a cabo de forma rpida para evitar la formacin de hielo.
Una segunda aproximacin a la conservacin de semillas recalcitrantes consiste en separar los
ejes embrionarios de los cotiledones, desecarlos y almacenarlos en nitrgeno lquido. La
recuperacin de la planta tras el almacenamiento es mediante tcnicas de cultivo in vitro. As, por
ejemplo, se han realizado ensayos en este sentido con Quercus faginea y Corylus avellana,
habindose obteniendo tasas de recuperacin del 60 y 80 %, respectivamente.
f. Bancos de cultivo in vitro
Si bien la conservacin ex situ en bancos de semillas constituye la alternativa ms utilizada, en
ciertas especies surgen problemas de propagacin o conservacin que impiden o dificultan el uso
de dicha solucin. Este sera el caso de: a) especies con semillas recalcitrantes; b) especies que
no producen semilla, con baja o nula fertilidad o con produccin reducida de semillas o de polen
; c) clones con elevado grado de heterocigosis que han sido seleccionados por sus caractersticas
en una poblacin natural y que deben ser mantenidos mediante propagacin vegetativa. La
conservacin por semilla permite el almacenamiento de los genes del clon, pero puede resultar
dificil recuperar la combinacin heterocigtica para la que fueron seleccionados los clones; d)
especies perennes con ciclos de vida muy largos que no producen semilla hasta cierta edad. Estas
especies se suelen propagar vegetativamente para acortar la entrada en produccin, aunque posean
semillas viables y con capacidad de ser conservadas en un banco de germoplasma; e) especies
con una poblacin natural extremadamente reducida donde la mera recoleccin de semillas pueda
afectar a la supervivencia de la poblacin. En estos casos, las tcnicas de almacenamiento o
conservacin in vitro constituyen una alternativa vlida a la conservacin de semillas de especies
raras o amenazadas.
Los protocolos de conservacin in vitro se atienen, en todos los casos, a las siguientes etapas: a)
obtencin del explanto; b) establecimiento del cultivo; c) almacenamiento;
d) recuperacin de un cultivo viable; e) regeneracin de plantas.
En este protocolo el almacenamiento es normalmente la etapa que implica ms costes, tanto en
equipamiento como en personal. En el caso de que el cultivo se mantenga en condiciones

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normales (crecimiento continuo), los repicados debern hacerse en intervalos que oscilarn de
varios das a varios meses, dependiendo del tipo de cultivo y de las especies.
Adems, en estas circunstancias, los subcultivos estn expuestos a un continuo riesgo de prdidas
por accidente o contaminacin, a lo que hay aadir el riesgo de alteraciones genticas (variacin
somaclonal) .
El perodo comprendido entre repicados puede extenderse induciendo un crecimiento limitado del
cultivo mediante reduccin de la temperatura y/o iluminacin, estrs osmtico, reduccin de la
presin parcial de oxgeno, desecacin del material vegetal, o alteracin de los medios de cultivo,
eliminando componentes nutritivos o incorporando retardantes de crecimiento. Entre estas
alternativas, la utilizacin de bajas temperaturas y la manipulacin de los componentes del medio
de cultivo son las ms aconsejables desde un punto de vista prctico, por su eficacia y simplicidad.
Si bien las tcnicas de almacenamiento in vitro se han aplicado de forma extensiva en la
conservacin de recursos fitogenticos de plantas cultivadas , existen muy pocos precedentes de
aplicacin en especies amenazadas .
En Espaa se han utilizado las tcnicas de almacenamiento in vitro mediante crecimiento limitado
con Centaurium rigualii, Coronopus navasii, Lavatera oblongifolia, Limonium calaminare,
Limonium catalaunicum, Limonium dufourii, Limonium estevei y Limonium gibertii (Iriondo y
Prez, 1991; Martn, 1993). Las mejores condiciones de almacenamiento
C
en medio MS slo o suplementado con 4,44 M benciladenina (BAP) + 0,54 M cido
naftalenactico (NAA).
La conservacin in vitro a largo plazo pasa por el almacenamiento del material cultivado bajo
condiciones de crioconservacin. Al igual que con la crioconservacin de las semillas, a estas
bajas temperaturas el metabolismo queda totalmente paralizado, con lo que se garantiza la
conservacin del material durante un perodo indefinido de tiempo. La crioconservacin del
material cultivado in vitro plantea mayores dificultades que la crioconservacin de semillas,
debido al mayor contenido en humedad presente en los tejidos. Para superar este problema se
llevan a cabo tratamientos previos con sustancias crioprotectoras y se desarrollan protocolos
especficos de congelacin y descongelacin.
La aplicacin de estas tcnicas al almacenamiento de especies amenazadas ha sido hasta el
momento muy escasa. En Espaa se ha experimentado con las tcnicas de crioconservacin de
vitrificacin y encapsulacin-deshidratacin en Centaurium rigualii y en Antirrhinum
microphyllum.
g. Bancos de ADN
Con el avance de las tcnicas de ingeniera gentica que posibilitan la transferencia de genes entre
especies totalmente distintas, una nueva alternativa que comienza ahora a perfilarse es la
instalacin de bancos de ADN. Entre sus ventajas estn la pequea cantidad de material vegetal
necesaria para su almacenamiento y la posibilidad de transferir genes a genotipos o especies
relacionadas. Esta tcnica puede ser utilizada con especies amenazadas o incluso extintas tomando
muestras del material en vivo o a partir de especmenes de herbario. En los bancos de ADN, el
ADN extrado de individuos de una determinada poblacin se almacena a bajas temperaturas
(congeladores a 80 C o tanques de nitrgeno lquido). En la actualidad, esta alternativa slo
presenta utilidad en el caso de especies o gneros cuyo genoma ha sido profundamente estudiado
y donde se conocen las secuencias de numerosos o importantes genes. Sin embargo, es posible
que en un futuro este tipo de bancos vaya extendindose a medida que se vayan implantando las
tcnicas de ingeniera gentica en los procesos de mejora y obtencin de nuevos cultivares.
h. Otros bancos de germoplasma
Los bancos de polen y los bancos de yemas vegetativas son otras dos opciones de conservacin
que en principio podran ser aplicables a la conservacin de especies raras o amenazadas. En
ambos casos, el almacenamiento se realiza a bajas temperaturas, siendo aplicables las tcnicas de
crioconservacin. Los bancos de polen tienen la ventaja de que requieren un mnimo espacio y
resultan aplicables tanto a especies con semillas ortodoxas como a especies con semillas
recalcitrantes. Sin embargo, slo conservan la mitad del genoma, el polen tricelular resulta muy
difcil de almacenar, necesita de una coleccin de campo que proporcione flores femeninas para
llevar a cabo una propagacin convencional y los propgulos no estn directamente disponibles.
Los bancos de yemas vegetativas se utilizan en la actualidad en la conservacin de clones de

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especies frutales y requieren la puesta a punto de la tcnica de injerto sobre planta patrn. Esta
tcnica podra ser aplicable a determinados casos de especies arbustivas o arbreas en peligro de
extincin.

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IV TUNEL DEL FIN DEL MUNDO

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V CONCLUSIONES

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VI REFERENCIAS BILIOGRAFICAS
SANCHEZ-CHIANG, Neiva and JIMENEZ, Vctor M. Tcnicas de conservacin in
vitro para el establecimiento de bancos de germoplasma en cultivos tropicales. Agron.
Mesoam [online]. 2010, vol.21, n.1 [cited

2014-12-16], pp. 193-205 . Available from:

<http://www.scielo.sa.cr/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S165913212010000100020&lng=en&nrm=iso>. ISSN 1021-7444.

VII ANEXOS