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Introduccin a la

[Prctica 4: Fermentacin Alcohlica] Biotecnologa

RESUMEN
El siguiente reporte est elaborado en miras de comprender y conocer los procedimientos
establecidos en el proceso de fermentacin alcohlica a partir de la melaza, saber la cantidad
necesaria que se necesita de sta para poder desarrollar la fermentacin, para llevarse a cabo, se
usaron los microorganismos Saccharomyces Cerevisiae, estos asimilan una determinada cantidad
de glucosa, para ello se hizo uso de una solucin de melaza al 10% m/m, se regul a su vez el pH a
4.5 aproximadamente, ya que a ese pH se obtiene un ptimo desempeo de los microorganismos
y la solucin puede estar relativamente protegida de las influencias bacterianas, se hizo uso de
tres enlenmeyer, dos de 125 ml, en el cual se coloc agua destilada en uno, para oxigenar la
solucin de melaza y agua corriente en el otro para desalojar el CO2 producto de la fermentacin
que se llev a cabo, y un erlenmeyer de 500ml donde se coloc 300 ml de solucin de melaza, se
inocul la cepa Saccharomyces Cerevisiae en rea de mechero con el asa bacteriolgica en 50 ml
de solucin de melaza contenida en un beaker de 125 ml, se dej a la solucin de melaza con la
cepa contenida en ella en un sistema junto con agua destilada en reposo durante 24 horas a
temperatura ambiente, luego en rea de mechero se agreg los 50 ml de melaza inoculada a los
300 ml de melaza contenida en el erlenmeyer de 500ml, para despus montar el sistema de tres
erlenmeyer antes descrito y se pueda llevar a cabo la fermentacin, para luego poder observar lo
que iba sucediendo en perodos de 24 horas con la solucin en pleno proceso de fermentacin.

INTRODUCCIN TERICA

slo una pequea cantidad de la energa


potencial disponible se libera.1

Fermentacin Alcohlica

La fermentacin alcohlica tiene como


objetivo biolgico proporcionar energa
anaerbica a las levaduras en ausencia
de oxgeno,
para
ello
disocian
las molculas de glucosa y
obtienen
la energa necesaria
para
sobrevivir,
produciendo el alcohol y CO2 como desechos
consecuencia de la fermentacin. Las
levaduras y bacterias ocasionantes de este
fenmeno son microorganismos muy
habituales en las frutas y cereales y otorgan

La fermentacin alcohlica es un proceso


biolgico anaerbico realizado por las
levaduras y algunas clases de bacterias,
originado
por
la
actividad
de
microorganismos que procesan los hidratos
de carbono que dan como resultado
liberacin de energa, obtencin de alcohol
etlico, CO2 y otros productos como por
ejemplo, molculas de ATP que luego
digieren los mismos microorganismos. En
estos
productos
se
emplea
el
microorganismo Saccharomyces Cerevisae.
Hay
muchos
tipos
diferentes
de
fermentacin,
pero
en
condiciones
fermentativas solamente se efecta una
oxidacin parcial de los tomos de carbono
del compuesto orgnico y, por consiguiente,

Snchez-Marroqun,
A.;
1953;
THE
BIOCHEMICAL
ACTIVITY
OF
SOME
MICROORGANISMS OF PULQUE; Mxico;
Memorial del Congreso de Cientficos Mexicanos;
IV Centenario de la Universidad de Mxico; p. 49.

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[Prctica 4: Fermentacin Alcohlica] Biotecnologa


en gran medida al sabor de los productos
fermentados. Una de las importantes
caractersticas de estos microorganismos es
que viven en ambientes completamente
carentes de oxgeno (O2), mxime durante la
reaccin qumica, por esta razn se dice que
la
fermentacin
alcohlica
es
un
proceso anaerbico.2

El proceso de fermentacin se lleva a cabo


acorde a la siguiente reaccin:

Azucares + levaduras ==> Etanol + CO2 +


Calor + Otras sustancias
Las
levaduras
son microorganismos
mesfilos, esto hace que la fermentacin
pueda tener lugar en un rango de
temperaturas desde los 13-14C hasta los 3335C. Dentro de este intervalo, cuanto mayor
sea la temperatura mayor ser la velocidad
del proceso fermentativo, corriendo el riesgo
de una alta mortalidad en la poblacin de la
levaduras interrumpiendo la fermentacin y
siendo tambin mayor la proporcin de
productos secundarios. Sin embargo, a
menor temperatura es ms fcil conseguir un
mayor grado alcohlico, ya que las altas
temperaturas que hacen fermentar ms
rpido a las levaduras llegan a agotarlas
antes. La temperatura ms adecuada para
realizar la fermentacin alcohlica se sita
entre los 18-23C.
Entre los productos secundarios obtenidos
en el proceso de fermentacin tenemos:

Glicerina
cido actico
Butilenglicol
Acetaldehdo
cido pirvico
Etil y Vinil fenoles, entre otros. 3

Parmetros a considerar en el proceso de


fermentacin alcohlica y efectos sobre los
resultados
1. Nutrientes y Activadores
Las levaduras fermentativas necesitan los
azcares para su catabolismo, es decir para
obtener la energa necesaria para sus
procesos vitales, pero adems necesitan
otros substratos para su anabolismo como
son nitrgeno, fsforo, carbono, azufre,
potasio, magnesio, calcio y vitaminas,
especialmente tiamina (vitamina B1). Por ello
es de vital importancia que el medio
disponga
de
una base
nutricional
adecuada para poder llevar a cabo la
fermentacin alcohlica.
El nitrgeno es de todos el ms importante,
una deficiencia de estos nutrientes har que
a la levadura no le quede mas remedio que
atacar contra su pesar las gigantescas
protenas, liberndose H2S.

cido succnico
2. Inhibidores

Pederson, Carl S.; 1971; MICROBIOLOGY OF


FOOD FERMENTATIONS; Wesport, Conneticut;
AVI Publishing; p. 228-229.
3

Snchez-Marroqun, A.;1953; THE BIOCHEMICAL


ACTIVITY OF SOME MICROORGANISMS OF
PULQUE; Mxico; Memorial del Congreso de
Cientficos Mexicanos; IV Centenario de la
Universidad de Mxico; p. 49.

Pederson, Carl S.; 1971; MICROBIOLOGY OF


FOOD FERMENTATIONS; Wesport, Conneticut;
AVI Publishing; p. 229.
http://www.biologia.edu.ar/metabolismo/met4
/levaduras.htm

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[Prctica 4: Fermentacin Alcohlica] Biotecnologa


Es importante evitar la presencia de
inhibidores como por ejemplo: restos de
productos fitosanitarios y cidos grasos
saturados de cadena corta.
3. Temperatura
sta variable es afectada tanto por agentes
funcionales como por dificultades materiales
(prdidas debidas a la evaporacin de etanol
al trabajar con temperatura elevada).
Se debe tener en cuenta que para cada
levadura existe una temperatura ptima de
desarrollo, en la cual se muestra activa.
Adems, se tiene una zona independiente de
la temperatura ptima en la cual la levadura
an presenta actividad; a medida que se
aleja de la temperatura ptima su actividad
disminuye
notablemente.
Para
el
microorganismo Saccharomyces Cerevisae se
obtiene un progreso favorable entre 28-35
C, convenientemente 30 C.
4. pH
Este factor es de elevada importancia en el
control de la contaminacin bacterial como
tambin al efecto en el crecimiento de las
levaduras, en la rapidez de fermentacin y
en la formacin de alcohol. Cuanto ms
inferior el pH del entorno, tanto menor el
riesgo de infeccin, pero si se ocupa un pH
muy bajo, la fermentacin tomar ms
tiempo, ya que la levadura no se desarrolla
de la manera favorable. El pH ms apropiado
para la progresin de la Saccharomyces
Cerevisiae se encuentra entre 4.4 - 5.0, con
un pH de 4.5 para su desarrollo ptimo.
5. Aireacin
El aire es un factor decisivo en toda
fermentacin, ya que su presencia hace ms
vigoroso el crecimiento de la levadura. Hay
tres puntos de vista de gran importancia que
favorecen el rendimiento debido a una
buena aireacin:

El libre y constante abastecimiento de


oxgeno de cada clula en el sustrato.
La eliminacin rpida del CO2 , porque en
concentraciones relativamente bajas inhibe
el crecimiento.
El conservar en suspensin las clulas de
levadura, a fin de que en la tumultosidad de
la mezcla se reforme constantemente el
contacto entre la membrana celular y el
sustrato nutritivo.
Al iniciar la fermentacin se debe cuidar que
la aireacin no sea muy elevada, porque el
contenido alcohlico del entorno es reducido
y pueden propagarse fcilmente los mohos
que atacan a las levaduras del cultivo.
6. Concentracin del sustrato
El carbono es suministrado por los azcares
contenidos en la materia prima, siendo la
concentracin de azcar un valor que se
debe considerar ya que afecta la velocidad
de la fermentacin, el comportamiento y el
desarrollo de las clulas de la levadura.
Suele ser provechosa una concentracin de
azcar del 10 al 18%, el valor ms comn es
del 12%. Cuando se ocupan concentraciones
de azcar muy altas, del orden de 22%, se
aprecia una irregularidad respiratoria en la
levadura y una bajada de la rapidez de
fermentacin; por el contrario, al ocupar
concentraciones muy bajas, el proceso
resulta antieconmico ya que solicita un
mayor volumen para la fermentacin. Por
esto se maneja como sustrato la melaza, que
tiene de 10 - 15% de azcar.4

Pederson, Carl S.; 1971; MICROBIOLOGY OF


FOOD FERMENTATIONS; Wesport, Conneticut;
AVI Publishing; p. 230.

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Levaduras
Las levaduras dentro de su membrana nica,
se encuentran partculas densas, de
polifosfato, cuando crecen en condiciones
aerbicas, y en especial si la concentracin
de glucosa es escasa se observan varias
mitocondrias en el interior de cada clula.
Cada mitocondria est rodeada por una
doble membrana. Las mitocondrias albergan
a los citocromos a los enzimas respiratorios y
al sistema responsable de la biosntesis de
adenosin trifosfato (ATP) a travs de la
oxidacin completa de la glucosa. Son, por
tanto, las responsables del metabolismo
oxidativo de los azcares, que se degradan a
dixido de carbono y agua; el ATP que
sintetizan almacena la energa qumica
derivada de estas reacciones.5
Estructura celular de la saccharomyces
cerevisiae
La estructura celular de la saccharomyces
cerevisiae es parecida a la de cualquier clula
eucariota, contiene vacuolas, mitocondrias,
aparato de golgi, ncleo, etc.

Crueger,
W.,
Crueger,
A.;
1989;
BIOTECNOLOGA, MANUAL DE MICROBIOLOGA
INDUSTRIAL; Zaragoza, Espaa; Editorial Acribia,
S.A.; p 105-108.

http://www.cervezadeargentina.com.ar/articul
os/levadura.htm
http://www.biologia.edu.ar/metabolismo/met4
/levaduras.htm
http://www.porquebiotecnologia.com.ar/educa
cion/cuaderno/ec_53.asp

Fig. 1: Diagrama de la seccin transversal de una


clula en reposo de la
Saccharomyces Cerevisiae:
ER, retculo endoplsmico; M, mitocondrias; N,
ncleo; Nm, membrana nuclear; Nn, nuclolo;
Pi, invaginacin; Pl, plasmalerna; V, vacuola; Vp,
granulo de polimetafosiato; W, pared celular;
Ws, cicatriz de gemacin; L granulo lipdico.

Las levaduras se multiplican por gemacin.


Una zona debilitada de la pared permite que
se forme una prolusin del citoplasma, a la
que, de inmediato, se provee de pared. A
medida que crece, van emigrando a la gema
los orgnulos de la clula madre, incluido un
ncleo (tras su divisin). Finalmente, la gema
alcanza su tamao definitivo, lo que no
implica necesariamente su separacin de la
clula madre.
La pared celular es permeada por algunos de
las enzimas segregadas por la levadura; el
ms importante es la invertasa, que hidroliza
la sacarosa antes de que penetre en la clula;
entre ellos se encuentra tambin la
fosfatasa.
Las clulas que tienen un desarrollo
apresurado contienen
varias vacuolas,
mientras que las que llegan a su madurez,
slo una. Se encuentran partculas densas
dentro de la membrana que estn hechas de

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polifosfato, a stas partculas se les suele
llamar grnulos de velutina. Si la
concentracin de glucosa es poca y se
encuentran en un entorno aerbico se
aprecian diversas mitocondrias dentro de la
clula.6
En condiciones anaerbicas, o cuando las
concentraciones de glucosa son altas, las
mitocondrias parecen atrofiarse y perder, al
menos temporalmente, su
actividad
bioqumica, transformando la glucosa en
cido pirvico siguiendo la fase de reaccin
de gliclisis, lo especifico de stas levaduras
es que pueden degradar el cido pirvico a
etanol mediante el siguiente proceso:

Fig 2: Diagrama de la Fermentacin Alcohlica.


6

Snchez-Marroqun,
A.;
1953;
THE
BIOCHEMICAL
ACTIVITY
OF
SOME
MICROORGANISMS OF PULQUE; Mxico;
Memorial del Congreso de Cientficos Mexicanos;
IV Centenario de la Universidad de Mxico; p. 49.

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MTODOS

4. Se deja la solucin como muestra la


figura 3, por 24 horas.

Materiales utilizados:

1 Erlenmeyer de 500 ml con tapn


de hule bihoradado.
2 Erlenmeyer de 125 ml con tapn
de hule monohoradado.
1 Asa bacteriolgica.
2 Varillas de vidrio huecas y dobladas
1 mechero.
1 refractmetro.
1 beaker 100 ml.
pH metro.

Reactivos:

Levaduras (saccharomyces cerevisae)


cido Sulfrico.
Agua destilada.
Agua Estril.
Melaza

Procedimiento:
1. Se prepar 350 ml de solucione de
melaza al 10 % m/m y se le midi su
pH y los Brix.
2. Se regul el pH a 4.5 acidulando con
cido sulfrico.
3. En un erlenmeyer 500 ml se coloc
300 ml de solucin de melaza y el
resto se verti en otro erlenmeyer
de 250 ml para poder inocular con
un asa bacteriolgica esta solucin,
despus de haber esterilizado todo
el equipo y las soluciones. La cepa
usada
es
la
Saccharomyces
Cerevisiae.

Fig 3: Disposicin del equipo para la


incubacin de la cepa por 24 h.

5. Luego de trascurrido el tiempo, se


vierte la solucin de melaza
inoculada con la cepa en los 300 ml
de la melaza guardada para
comenzar la fermentacin en su
etapa efectiva. Esto se realiza en el
rea del mechero para asegurar la
esterilidad y la no produccin de
compuestos no deseados.
6. Ahora se colocan los instrumentos
de manera semejante a la figura 4, se
deja transcurrir otro perodo de 24
horas.

Fig. 4: Sistema de fermentacin.

Finalmente se tomaron nuevamente los


grados Brix y el pH de la solucin de melaza.

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Final: 9 gramos de sacarosa por 100 g de
solucin.

CLCULOS Y RESULTADOS
Los datos obtenidos a partir de la prctica
fueron:

Inicio
Final
(24 h despus)

Brix
14

pH
4.5

3.7

Tabla 1: Datos de la prctica.

Los grados Brix miden la concentracin en


gramos de la sacarosa por 100 g de solucin,
es decir que para cada caso tenamos:
Inicio: 14 g de sacarosa por 100 g de
solucin.

Entonces hubo una disminucin de 5 gramos


de sacarosa por cada 100 g de solucin. Lo
cual es esperado debido a que las levaduras
transforman el azcar en alcohol.
Para el pH, al irse produciendo la
fermentacin, la concentracin de iones
hidronio (H3O+) se incrementa debido a la
reduccin del azcar a alcohol, lo cual
acidifica la solucin de melaza.
Ambos efectos tanto de disminucin de los
grados Brix como del pH son los efectos
deseados en la fermentacin.

BIBLIOGRAFA
2,3,4; Pederson, Carl S.; 1971; MICROBIOLOGY OF FOOD FERMENTATIONS; Wesport,
Conneticut; AVI Publishing; p. 228-230.
1,2,6; Snchez-Marroqun, A.; 1953; THE BIOCHEMICAL ACTIVITY OF SOME MICROORGANISMS
OF PULQUE; Mxico; Memorial del Congreso de Cientficos Mexicanos; IV Centenario de la
Universidad de Mxico; p. 49.
4; Crueger, W., Crueger, A.; 1989; BIOTECNOLOGA, MANUAL DE MICROBIOLOGA INDUSTRIAL;
Zaragoza, Espaa; Editorial Acribia, S.A.; p 105-108.

Pginas de Internet consultadas:


5; http://www.cervezadeargentina.com.ar/articulos/levadura.htm
consultada el da Sbado 5 de Junio de 2010 a las 23:47 horas.
3,5; http://www.biologia.edu.ar/metabolismo/met4/levaduras.htm
consultada el da Sbado 5 de Junio de 2010 a las 23:58 horas.
5; http://www.porquebiotecnologia.com.ar/educacion/cuaderno/ec_53.asp
consultada el da Domingo 6 de Junio de 2010 a las 11:55 horas.