UNIVERSIDAD POLITCNICA SALESIANA

AREA EN CIANCIAS DE LA VIDA

CARRERA DE BIOTECNOLOGA DE LOS RRNN
Ctedra de Gentica Molecular
Integrantes:

Karina Quishpe
Estefana Valle

D. M. Q. 05/01/2015

APLICACIN DE MICROARRAYS EN EL ESTUDIO DE CASOS DE

CNCER DE TERO
OBJETIVO GENERAL

Determinar las diferencias de los perfiles de expresin entre clulas

cancergenas infectadas con VPH y clulas cancergenas sin infeccin
por VPH.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

Investigar el mecanismo de replicacin de las principales especies

oncognicas del VPH implicados en el desarrollo del cncer del tero.
Elegir los pacientes candidatos del estudio a partir del diagnostico
histopatolgico de cncer de tero.
Obtener las muestras de clulas cancergenas de los individuos
participantes.
Seleccionar los genes implicados en el desarrollo de cncer de tero.
Disear sondas para cada gen seleccionado del perfil de expresin.
Extraer el mRNA total del tejido obtenido.
Sintetizar y marcar el cDNA.
Hibridar en microarrays.
Analizar los perfiles de expresin gnica obtenida.

INTRODUCCIN
En Quito segn los datos ms actualizados del Hospital oncolgico Soln
Espinosa, la mayor incidencia de cncer femenino es el cncer de tero
(crvix invasor e in situ), siendo tambin el que presenta ndice ms alto de
mortandad (Hospital "Soln Espinosa Ayala" SOLCA Quito, 2010). Una de las
posibles causas para el desarrollo de este padecimiento es la infeccin del
papiloma virus humano, especialmente para las variedades 16 y 18 que
causan en el 80% de los casos, este tipo de cncer (Vallejo, 2014), sin
embargo esta presuncin no es definitiva dados los distintos factores que
intervienen en el desarrollo de la infeccin y del cncer.

Se han encontrado distintas publicaciones a nivel acadmico en el pas

relacionadas con los estudios de cncer y la infeccin de VPH, en las que se
describen y validan mtodos moleculares de anlisis para la deteccin de
este virus, pero en ninguno de los estudios revisados, se contrastan los
perfiles de expresin entre las pacientes diagnosticadas con cncer de tero
y las que adems de esta enfermedad, padecen la infeccin del VPH.
Sera importante conocer si existe algn tipo de diferencia o particularidad
con respecto a la expresin gnica de estas clulas oncognicas debido al
complejo mecanismo de accin del virus sobre el husped, ya que durante
el ciclo de replicacin del ADN viral este inserta su genoma en el ADN
alterando el ciclo celular y manteniendo a la clula permanentemente en
fase S para utilizar la maquinaria celular en la replicacin de su ADN, sin
embargo estas clulas malignas son incapaces de replicar el ADN del virus
en las siguientes generaciones, ya que solo poseen una parte del genoma
del virus que se haba insertado en un inicio en su ADN, disminuyendo
progresivamente; segn la bibliografa, la cantidad de virus. Por lo
anteriormente descrito, se han realizado a nivel mundial diversos estudios
que clarifiquen el paradigma de este virus y sus implicaciones en el
desarrollo del cncer de tero, adems ampliar las perspectivas del
tratamiento de esta enfermedad catastrfica al determinar que factores se
encuentran implicados, por tanto se propone para este caso la aplicacin de
microarrays en el anlisis de distintos genes involucrados en estos
padecimientos.
Complicaciones descritas del virus del VPH en el cncer de tero
En la actualidad se ha establecido que la infeccin persistente por tipos
oncognicos de VPH es una causa aparentemente necesaria del cncer de
crvix ya que segn varios estudios, este tipo de cncer tiene ADN de algn
tipo de VPH de alto riesgo. La mayora de virus que infectan el rea genital
son del gnero alpha, sin embargo es importante su genotificacin debido a
las diferencias en las lesiones que producen (Ministerio de Salud, 2013).
Las mujeres sexualmente activas de cualquier edad pueden infectarse con
VPHs oncognicos, sin embargo el cncer con virus oncognicos es raro y la
prevalencia de VPH en mujeres de 40 aos o mayores no se relaciona con la
alta tasa de cncer cervical. Es la persistencia de VPHs oncognicos lo que
da lugar a las lesiones precancerosas y potencialmente el cncer invasor, lo
que puede llevar aos para su desarrollo (Lizano, 2009)

DISEO EXPERIMENTAL
Pacientes incluidas
Son elegibles para este estudio las pacientes que tengan un
diagnstico de cncer de crvix y sean mayores a 18 y menores de
60 aos, no se tomarn en cuenta las pacientes que no tengan la
edad requerida o no hayan consentido la participacin

Recoleccin de informacin
Se realizar un cuestionario para obtener la siguiente informacin:
edad y diagnstico de cncer en el grupo uno; y en el grupo dos
adems de lo anterior, el diagnstico previo de VPH.
Toma de muestras y validez
Se tomarn muestras del tejido cervical de las participantes y se
fijarn en parafina
las muestras del grupo uno sern vlidas con la presentacin del
diagnstico mdico y el anlisis histopatolgico
las muestras del grupo dos adems del diagnstico y del anlisis
histopatolgico, se realizar un anlisis de PCR para la deteccin de la
presencia del virus, y adems una genotipificacin utilizando RFLPs

Diseo Experimental del anlisis de Microarray para expresin

gnica

Diseo y produccin del chip

preparacin de la muestra

hibridacin

escaneado del chip

anlisis de la imagen

Genes utilizados en la sonda

TP53, tumor protein p53: ID del gen 7157 y es de tipo codificante,
se localiza en 17p13.1. Este gen codifica una protena supresora de
tumores mediada por activacin transcripcional, empaquetamiento
de ADN y dominios de oligomerizacin. La protena codificada
responde a diversos estmulos celulares para regular la expresin de
genes objetivos, de modo que induce a la clula a detener el ciclo
celular, apoptosis, senescencia, reparacin de ADN o cambios en el
metabolismo. Las mutaciones en este gen estn asociadas con una
variedad muy grande de cnceres en humanos, incluyendo cnceres

hereditarios. El splicing alternativo de este gen y el uso alternativo de

promotores resultan en mltiples transcriptos e isoformas.
Adicionalmente las isoformas han sido mostradas como resultado de
la traslacin alternativa de los codones de iniciacin (HGNC, 2014).
En la carcinognesis del VPH la protena E6 codificada por el virus
puede asociarse con el producto del gen p53 y marcarlo para su
degradacin, a travs de la va ubiquitna, este mecanismo tambin
produce su retencin en el citoplasma bloqueando su translocacin
hacia el ncleo inhibiendo su funcin, independientemente del
proceso de degradacin (Lizano, 2009).

RB1, retinoblastoma 1: ID del gen 5925 de tipo codificante, se

encuentra en 13q14.2. La protena codificada es un regulador
negativo del ciclo celular y fue el primer supresor de genes
encontrado.
La
protena
codificada
tambin
estabiliza
la
heterocromatina constitutiva para mantener la estructura. La activa
es la forma hipofosforilada se une al factor de transcripcin E2F1.
Defectos en este gen causan diversos tipos de cncer, el ms
estudiado; el cncer retinoblastoma (HGNC, 2014).
En la carcinognesis del VPH la protena E7 codificada por el virus
interacta con la protena pRB induciendo su degradacin, de esta
forma evita la progresin celular hacia la fase S del ciclo celular. La
degradacin de esta protena induce la activacin del factor de
transcripcin E2F, que induce la activacin de genes involucrados en
la sntesis del ADN durante la fase S del ciclo celular (Lizano, 2009).
BRCA1: gen en el cromosoma 17 que, por lo general, ayuda a
suprimir el crecimiento de las clulas. Una persona que hereda ciertas
mutaciones (cambios) en un gen BRCA1 tiene un riesgo mayor de
contraer cncer de mama, de ovario, de prstata y de otros tipos de

cncer.

 BCL2: Protena que ayuda a controlar la supervivencia o destruccin

de una clula al impedir un tipo de muerte celular que se llama

apoptosis. El gen BCL2 se encuentra en el cromosoma 18, y en

muchas leucemias y linfomas de clulas B se observa la transferencia
del gen BCL2 a un cromosoma diferente. Esto hace que se elaboren
cantidades tan grandes de BCL2 que podra impedir la muerte de las
clulas cancerosas. Tambin se llama protena 2 de la
leucemia/linfoma de clulas B. Este gen se encuentra sobre
expresado en las lesiones de alto grado y cncer cervical, lo que
evidencia un efecto directo del HPV sobre el BCL2. Esto se podra
deber a la previa mutacin de p53 por el HPV
TERT, Telomerase reverse transcrptase: ID del gen 7015 del tipo
codificante y se encuentra 5p15.33, la telomerasa es una
ribonucleoprotena que mantiene los extremos de los telmeros
mediante la adicin de la repeticin de dicho telmero TTAGGG. Esta
enzima tiene actividad transcrptasa inversa codificada por este gen, y
un componente de ARN que sirve como molde para la repeticin del
telmero.

eE el mecanismo de la infeccin del Virus la protena E6 activa el

mecanismo de la telomerasa, presentando esta anormalidad en el
90% de las clulas inmortalizadas cancerosas, produciendo erosin
progresiva del ADN desembocando en la inestabilidad cromosmica
(HGNC, 2015).
PROTOCOLO DE MICROARRAYS DE DNA
1. Diseo y fabricacin del microarray.
a) Seleccin de los genes que se incorporan al experimento, en
este caso son: p53, rb1, brca1 y bcl2.
b) Se realizan mltiples copias de cada uno de los genes (p53,
rb1, brca1 y bcl2) mediante PCR, y los productos (sondas) que
en este caso son genotecas de cDNA, se depositan en los
sustratos.

c) Las sondas (genotecas de cDNA) son adheridas mediante

capilaridad o microinyeccin (Stanford microarrays)
2. Preparacin de la muestra e hibridacin.
a) Paralelamente al diseo y fabricacin del microarray que
contiene los genes (sondas) cuya expresin se desea estudiar,
deben prepararse las muestras problema (dianas: mRNA de las
clulas del tero) en las que se desea estudiar la expresin de
estos genes.
b) Extraccin de todo el mRNA de las clulas del tero en las
condiciones que se desea estudiar, y posterior marcaje del
mRNA.
3. Hibridacin
a) Una vez preparadas y marcadas las muestras problema (mRNA
de las clulas del tero) se depositan sobre las sondas en el
microarrays de DNA.
b) Esto har que los cDNAs de las muestras problema se puedan
hibridar con los de cada gen contenido en las sondas del
microarray de DNA.
c) Tras la hibridacin, el microarray se lava para eliminar el
material que no se ha hibridado.
d) La deteccin de la hibridacin es un paso clave para
determinar qu sondas se han unido a sus dianas
complementarias procedentes de la muestra.
e) Posteriormente se realiza el Escaneo del microarray, anlisis de
imagen y de resultados.
Muestra A: mujeres
infectadas con VPH y

Muestra B:
mujeres con

mRNA

mRNA

cDNA

cDNA

Hibridaci
n

Lavar
exceso

Lectura

PERFILES DE EXPRESION GENICA

Preparar Microarrays

Aislar RNA y marcar

Mezclar, hibridar sondas y analizar datos

RESULTADOS ESPERADOS PARA EL DISEO

El diseo de microarrays de DNA, da como resultado la cuantificacin de
expresin gnica segn lo que se desee estudiar, en este caso en relacin
con de la muestra 1 (mujeres infectadas con VPH y con cncer) vs muestra
2 (mujeres con cncer sin infeccin con VPH), se desea conocer si los genes
p53, rb1, brca1 y bcl2, estn involucrados o tienen relacin tanto en la VPH
como en el cncer de uterino. Por lo que en el diseo de los microarrays de
ADN, se puede diferenciar varias sondas con diferentes colores, en las
cuales se puede observar:
El chip tendr 4 opciones de respuesta identificables

negro: sonda sin hibridar

Caf: una sonda de cada uno hibridada
Roja: hibridaciones para la sonda 1
Verde: hibridaciones para la sonda 2
Amarillo: dos sondas de cada tipo hibridadas

El estudio realizado, estima que el VPH si est relacionado con cncer, ya

que se encuentran involucrados los genes p53 p53, rb1, brca1 y bcl2. En
este caso el gen bcl2 y brca1 se encuentra sobre expresados en las lesiones
de alto grado y cncer cervical, lo que evidencia un efecto directo del HPV
sobre el bcl2 y brca1, esto se podra deber a la previa mutacin de los genes
p53 y rb1 por el HPV, por lo que estos genes supresores tumorales se
encuentran silenciados o acallados epigenticamente, y de esta manera se
destaca el surgimiento del cncer de crvix. Estos eventos genticos
incluyen tanto activacin exagerada de oncogenes, como supresin de la
funcin normal de genes supresores tumorales. Hay que tomar en cuenta y
considerar que no es necesario estar infectados con VPH para poder adquirir
cncer de tero.

Referencias
HGNC. (03 de Enero de 2014). NCBI. Obtenido de TP53 tumor protein p53
[ Homo sapiens (human) ]: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/7157

Hospital "Soln Espinosa Ayala" SOLCA Quito. (2010). Estadsticas del

Registro Hospitalario de Tumores. Quito.
Lizano, &. e. (2009). Infeccin por virus del Papiloma Humano:
Epidemiologa, Historia Natural y Carcinognesis. Revista de
cancerologa, 205-216.
Ministerio de Salud. (25 de octubre de 2013). Estudio del Virus de Papiloma
Humano para la Prevencin del Cncer Crvico-Uterino. Obtenido de
Pgina oficial del Ministerio de Salud del Ecuador:
http://bonsai.com.ec/minsalud/estudio-del-virus-de-papiloma-humanopara-la-prevencion-del-cancer-cervico-uterino/
Vaca Llerena, D. (2012). Identificacin del virus de papiloma humano
mediante PCR - RFLP y posterior genotipificacin en muestras de
tejido cervical parafinado, con diagnstico histopatolgico de
displasia severa o cncer in situ, procedentes del Hospital SOLCA
Ncleo Quito. Quito: Escuela Politcnica del Ejrcito.
Vallejo, F. (6 de Mayo de 2014). En Ecuador se inicia la campaa de
vacunacin contra el papiloma virus. El Comercio.