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Ensayo de toxicidad aguda

con semillas de lechuga
Lactuca sativa L.
Maria Cecilia Sobrero y Alicia Ronco

C lasificacin

del ensayo :

IC

Principio de la prueba
El bioensayo de toxicidad con semillas de lechuga (Lactuca sativa) es una prueba esttica de toxicidad aguda (120 horas de exposicin) en el que se pueden
evaluar los efectos fitotxicos de compuestos puros o de mezclas complejas
en el proceso de germinacin de las semillas y en el desarrollo de las plntulas
durante los primeros das de crecimiento. Como puntos finales para la evaluacin de los efectos fitotxicos, se determina la inhibicin en la germinacin y
la inhibicin en la elongacin de la radcula y del hipocotilo (figura 4.1). Es
importante destacar que durante el perodo de germinacin y los primeros das
Este ensayo apareci publicado originalmente en G. Castillo (ed.). 2004. Ensayos toxicolgicos y mtodos
de evaluacin de calidad de aguas. Estandarizacin, intercalibracin, resultados y aplicaciones. IDRC,
IMTA, Canad. 202 pp. Se reproduce con la autorizacin de la editorial.

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Intercalibrados

Ensayos de toxicidad aguda con semillas de lechuga

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Ensayos para agua dulce

de desarrollo de la plntula ocurren numerosos procesos fisiolgicos en los

que la presencia de una sustancia txica puede interferir alterando la supervivencia y el desarrollo normal de la planta, siendo por lo tanto una etapa de
gran sensibilidad frente a factores externos adversos. Por otra parte, muchas
de las reacciones y procesos involucrados son generales para la gran mayora
de las semillas, por lo que la respuesta de esta especie y los datos obtenidos a
partir de la aplicacin de esta prueba son en gran medida representativos de
los efectos en semillas o plntulas en general. El xito o aptitud de una plntula
para establecerse en un ambiente determinado es de gran importancia para
garantizar la supervivencia de la especie. La evaluacin del desarrollo de la
radcula y del hipocotilo constituyen indicadores representativos para determinar la capacidad de establecimiento y desarrollo de la planta.
A diferencia de la prueba tradicional de germinacin de semillas, la evaluacin del efecto en la elongacin de la radcula y del hipocotilo de las plntulas
permite ponderar el efecto txico de compuestos solubles presentes en niveles
de concentracin tan bajos que no son suficientes para inhibir la germinacin,
pero que sin embargo pueden retardar o inhibir completamente los procesos
de elongacin de la radcula o del hipocotilo, dependiendo ello del modo y
sitio de accin del compuesto. De esta manera, la inhibicin en la elongacin
de la radcula e hipocotilo constituyen indicadores subletales muy sensibles
para la evaluacin de efectos biolgicos en vegetales, aportando informacin
complementaria a la proporcionada al estudiar el efecto en la germinacin. Este
Figura 4.1. Morfologa de la semilla y la plntula de lechuga Lactuca sativa L.

Hipocotilo

Radcula
Semilla

Ensayos de toxicidad aguda con semillas de lechuga

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ensayo puede ser aplicado para la evaluacin de la toxicidad de compuestos

puros solubles, de aguas superficiales (lagos, ros), aguas subterrneas, aguas
para consumo humano, aguas residuales domsticas e industriales, adems
de lixiviados de suelos, sedimentos, lodos u otras matrices slidas (Bowers et
al, 1997; Cheung et al, 1989; Dutka, 1989). A diferencia de otras pruebas en
las que se consideran algas o plantas acuticas sumergidas como organismo
de diagnstico, el bioensayo con semillas permite evaluar la fitotoxicidad
de muestras coloreadas o con elevada turbiedad de manera directa y sin
necesidad de filtracin previa, reducindose as las interferencias debidas al
pretratamiento y simplificando el procedimiento de prueba.
Si bien L. sativa no es una especie representativa de ecosistemas acuticos,
la informacin generada a partir de esta prueba de toxicidad proporciona datos
acerca del posible efecto de los contaminantes en las comunidades vegetales
cercanas a las mrgenes de cuerpos de agua contaminados, siendo tambin
una especie interesante de considerar por su importancia desde el punto de
vista hortcola. Por otra parte, es de fcil y rpida germinacin por lo que es
posible desarrollar la prueba en pocos das.
Este bioensayo de toxicidad ha sido recomendado y aplicado por diferentes
organismos de proteccin ambiental para la evaluacin ecotoxicolgica de
muestras ambientales y compuestos puros, adems de la evaluacin del efecto
fitotxico de plaguicidas sobre especies no blanco, necesarios para el registro
de estos compuestos (OECD, 1984; Wang, 1987; USEPA, 1989).
En la incorporacin de esta prueba en una batera de bioensayos es
importante considerar el compromiso entre la sensibilidad de la especie L.
sativa, el reducido tiempo de exposicin de la prueba con semillas, los bajos
costos asociados y que no requiere equipamiento sofisticado, en particular
en la aplicacin a muestras ambientales o en el monitoreo de procesos de
detoxificacin, saneamiento, control de efluentes o reuso de bioslidos.

Material

Cajas Petri de 100 mm de dimetro

Matraces aforados de 50 mL
Pipetas volumtricas de 1, 2, 5 y 10 mL
Regla u otro elemento de medicin
Pinzas
Toallas de papel
Bolsas plsticas

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Ensayos para agua dulce

Papel de filtro Whatman No. 3 (o equivalente), 90 mm de dimetro. El

papel de filtro que se seleccione como sustrato de germinacin debe tener
las siguientes caractersticas: trama amplia y porosa que asegure una buena
capacidad de retencin de lquido; resistencia de la fibra del papel para
que las radculas crezcan por su superficie sin atravesarlo, situacin que
dificultara la remocin de las plntulas sin daarlas; ausencia de residuos
txicos (por ejemplo, blanqueadores; y que no promueva el desarrollo de
hongos (no asociados a las semillas).

Equipo
Cmara oscura de temperatura controlada (22 2 C).

Reactivos
Agua dura reconstituida (APHA, 1992). Para su preparacin se recomienda
utilizar reactivos grado ACS y agua destilada en vidrio o de calidad Millipore
Super Q. La forma de preparacin de esta agua se muestra en ensayo de toxicidad aguda con el cladcero Daphnia Magna de este documento.

Organismos de prueba
En este ensayo se usan semillas de lechuga de la especies L. sativa L variedad
mantecosa.
Obtencin, control y conservacin de las semillas
La obtencin de las semillas de lechuga se realiza en semilleras locales,
procurando que sean semillas sin curar (sin fungicidas o plaguicidas), con
buen poder germinativo y baja variabilidad en la elongacin de la radcula e
hipocotilo.
Verificacin de la viabilidad de las semillas
Previo a la implementacin de la prueba, es recomendable verificar que cada
lote nuevo de semillas que se utilice tenga un porcentaje de germinacin
superior al 90%, sincronizacin en la germinacin y baja variabilidad de
la elongacin de la radcula e hipocotilo (coeficiente de variacin < 30%).

Ensayos de toxicidad aguda con semillas de lechuga

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Es necesario adems caracterizar las condiciones de germinacin del lote

de semillas, evaluando la respuesta frente a la luz (fotoblastismo positivo o
negativo: germinacin en presencia o ausencia de luz, respectivamente) y la
temperatura ptima de germinacin.
Con el fin de reducir la variabilidad en los resultados, para el caso de semillas no seleccionadas y que presenten gran heterogeneidad en el tamao, es
conveniente realizar una seleccin previa descartando las fracciones de mayor
y menor tamao y utilizando solamente la fraccin ms numerosa y de tamao
intermedio. La fraccin de menor tamao puede presentar un alto porcentaje
de semillas vanas, mientras que las semillas de mayor tamao pueden ser ms
vigorosas, variando la sensibilidad frente a los compuestos txicos.
Si no es posible obtener lotes de semillas con poder germinativo igual o
mayor al 90%, se debe aumentar el nmero de semillas por caja para obtener
un nmero mnimo de 18 semillas germinadas. Por otra parte, si se desea
aumentar la confiabilidad de los resultados, o en caso de contar con semillas
que posean una alta variabilidad en la elongacin de la radcula de los controles
negativos, an habindolas seleccionado de tamao uniforme, se recomienda
aumentar el nmero de rplicas por tratamiento.
Las semillas seleccionadas se almacenan fraccionadas a 4 C, en oscuridad
y en ambiente seco. Conservadas en estas condiciones mantienen su vigor al
menos durante 2 aos. Un indicador de la reduccin de la vitalidad y envejecimiento de las semillas es la reduccin en el poder germinativo y el aumento
en la variabilidad de las medidas de elongacin de radcula e hipocotilo en el
control negativo. En este caso se recomienda realizar las pruebas de toxicidad
utilizando un nuevo lote de semillas.

Procedimiento de prueba
Preparacin de las diluciones
Para realizar una curva dosis respuesta se recomienda preparar un mnimo
de 5 o 6 diluciones de la muestra o compuesto a estudiar de manera que se
obtengan valores de toxicidad intermedios entre el 100 y 0%. Para las muestras
ambientales se recomienda el uso de un factor de dilucin de 0.3 o 0.5 para
la preparacin de la serie de diferentes concentraciones. El uso de un factor
de 0.3 permite evaluar la toxicidad considerando el intervalo entre el 100% y
1% de la muestra realizando 5 diluciones (100, 30, 10, 3 y 1%). Al aplicar un
factor de dilucin de 0.5, es necesario utilizar mayor nmero de diluciones

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Ensayos para agua dulce

para abarcar el mismo intervalo de concentraciones (100, 50, 25, 12, 6, 3 y

1.5%) pero se obtiene mayor precisin en los resultados. Para la preparacin
de cada dilucin se utiliza agua dura reconstituida (es posible el uso de agua
mineral dura para consumo humano), realizando el control negativo con el
agua de dilucin empleada.
Para el caso de las muestras cuya toxicidad es desconocida, previo a la
realizacin de la prueba definitiva, se sugiere hacer una prueba exploratoria
(ensayo preliminar) utilizando diluciones logartmicas (100, 10, 1, 0.1, 0.01)
que permitan establecer el intervalo de concentracin conveniente para obtener valores de efecto entre 100 y 0%, necesarios para calcular la CI50.
Control de calidad de pruebas
Es importante establecer cuales son los valores de elongacin en el control
negativo, as como la sensibilidad de las semillas frente al compuesto txico
de referencia (control positivo), determinando para cada lote de semillas el
valor de CE50. Se realizan cartas control para evaluar el crecimiento en los
controles negativos (promedio 2 de la elongacin de la radcula) y de la
sensibilidad frente al compuesto txico de referencia (promedio 2 de la
CE50 para el Zn(II) preparado a partir de sulfato de zinc).
Como se mencion anteriormente, la reduccin en el poder germinativo (<
90%) y el aumento en la variabilidad de las medidas de elongacin de radcula
e hipocotilo en el control negativo a lo largo del tiempo, son indicadores de
la reduccin de la vitalidad y envejecimiento de las semillas. En este caso se
recomienda utilizar un nuevo lote de semillas.
Desarrollo de la prueba
En la figura 4.2 y la tabla 4.1 se resume el procedimiento del ensayo de toxicidad aguda con semillas. Para llevar a cabo el ensayo se deben realizar los
siguientes pasos:

Colocar en cada caja Petri un disco de papel de filtro

Marcar correctamente cada caja con la dilucin correspondiente, as como
la fecha y hora de inicio y trmino del bioensayo
Saturar el papel de filtro con 4 o 5 mL de la dilucin evitando que se formen
bolsas de aire
Con la ayuda de una pinza, colocar cuidadosamente 20 semillas, dejando

Ensayos de toxicidad aguda con semillas de lechuga

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espacio suficiente entre las semillas para permitir la elongacin de las

races.
Tapar las cpsulas y colocarlas en bolsas plsticas para evitar la prdida de
humedad. Dado que algunas variedades de semillas de lechuga requieren
oscuridad para que se produzca la germinacin (semillas fotoblsticas negativas), las cajas de Petri deben cubrirse de la luz inmediatamente despus
de colocarlas las semillas en su interior y durante el perodo de ensayo
Incubar por 120 horas (5 das) a una temperatura de 22 2 C
Realizar repeticiones para cada dilucin ensayada.
Tabla 4.1. Condiciones recomendadas para las pruebas de toxicidad aguda
con Lactuca sativa L.

Tipo de ensayo
Temperatura
Calidad de luz
Volumen de la solucin de prueba
Agua de dilucin
Nmero de semillas por rplica
Nmero de rplicas
Duracin de la prueba
Efecto medido

Resultado final
Aceptabilidad de los resultados


Control positivo

Esttico
20 2 C
Oscuridad
4 mL
Agua dura reconstituida
20
3
120 horas
Inhibicin en la elongacin de la radcula
e hipocotilo. Inhibicin en la germinacin
CE50 o CI50 o % inhibicin
Germinacin > 90%
Control positivo y negativo de acuerdo
con los valores admitidos en las cartas control
Zn (II) a partir de ZnSO4

Medida de los puntos finales de evaluacin de la

fitotoxicidad
Cada punto final se evala comparando el efecto generado en los organismos
expuestos a la muestra con respecto a la respuesta en los organismos del control
negativo, sujetos a las mismas condiciones de ensayo, excepto por la ausencia
de muestra. Terminado el perodo de exposicin (120 horas), se procede a
cuantificar el efecto en la germinacin y en la elongacin de la radcula y del
hipocotilo.

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Ensayos para agua dulce

Figura 4.2. Esquema general del procedimiento de prueba de toxicidad

con semillas de lechuga Lactuca sativa L.

22 2 C

Oscuridad

Control negativo
(agua dura
reconstruida)

4 mL de
inhibicin

120 h

Control positivo
Zn (II)

Control positivo
Zn (II)

Diluciones de la muestra
120 h de exposicin
Ensayo esttico

(mm)

Registro de signos de fitotoxicidad

(necrosis, efectos en pelos absorbentes)

(mm)

Registro de semillas germinadas

Medicin de la elongacin de la radcula y
del hiopocotilo

Clculo del % de inhibicin

Clculo de la CI50

Evaluacin de efectos fitotxicos agudos

Efecto en la germinacin

Registrar el nmero de semillas que germinaron normalmente, considerando

como criterio de germinacin la aparicin visible de la radcula.

Ensayos de toxicidad aguda con semillas de lechuga

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Efecto en la elongacin de la radcula e hipocotilo

Utilizando una regla o papel milimetrado, medir cuidadosamente la longitud

de la radcula y del hipocotilo de cada una de las plntulas, correspondientes a cada concentracin del compuesto txico o dilucin de muestra y a
los controles. La medida de elongacin de la radcula se considera desde el
nudo (regin ms engrosada de transicin entre la radcula y el hipocotilo)
hasta el pice radicular. La medida de elongacin del hipocotilo se considera
desde el nudo hasta el sitio de insercin de los dos cotiledones (figura 4.3).
La figura 4.4 muestra los distintos estadios de la semilla durante la prueba de
germinacin y elongacin.
Figura 4.3. Esquema de plntula de Lactuca sativa al finalizar el perodo de exposicin

Figura 4.4. Estadios por los que atraviesa la semilla Lactuca sativa
durante el ensayo de germinacin y elongacin
1

4
2
3

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Ensayos para agua dulce

Antes de retirar las plntulas de las cajas Petri para evaluar el efecto en
los puntos finales anteriormente mencionados, es importante realizar una
observacin detallada del estado general de las mismas y del crecimiento de la
radcula sobre el papel de filtro. Informar cualquier indicador de fitotoxicidad
o de crecimiento anormal en las plntulas tratadas y en los controles (pices
radiculares con necrosis, pelos absorbentes poco desarrollados, radculas
con crecimiento ensortijado, necrosis en los cotiledones, etc.). La necrosis
(presencia de tejido muerto) se evidencia como manchas localizadas de
coloracin parda, blanca o marrn. Al evaluar el efecto en la germinacin,
consignar adems aquellas semillas con germinacin anormal (emergencia
de cotiledones o cotiledones e hipocotilo solamente, pero sin emergencia de
la radcula) o con desarrollo de hongos.
Un procedimiento factible de realizar para facilitar la medicin de la
radcula e hipocotilo, es proceder a congelar las cajas Petri correspondientes
a todos los tratamientos y descongelarlas a medida que se van midiendo
(no conservar el material luego de ser descongelado). De esta manera las
plntulas descongeladas adquieren una consistencia blanda, favoreciendo la
medicin. Si se procede a evaluar el efecto sobre las plantas descongeladas es
importante proceder de igual manera con todas las rplicas de la prueba. Este
procedimiento reduce la variabilidad en las medidas, principalmente cuando el
crecimiento de las radculas es ensortijado o no es parejo. Por otro lado, antes
de congelar el material se debe realizar previamente la observacin general de
efectos fitotxicos en las plantas vivas al finalizar el perodo de exposicin.

Expresin de resultados
Se realizan los siguientes clculos:
Promedio y desviacin estndar de la elongacin de la radcula y del hipocotilo de las plntulas de cada repeticin
Porcentaje de inhibicin del crecimiento de la radcula y del hipocotilo
con el promedio de elongacin para cada dilucin respecto del promedio
de elongacin del control negativo
Porcentaje de inhibicin en la germinacin
Con los datos anteriores, se elabora la grfica dosis-respuesta, colocando
en la ordenada el porcentaje de inhibicin y en la abscisa la concentracin.
Mediante un mtodo grfico o el uso de programas estadsticos, se calcula
la concentracin que produce el 50% de inhibicin (CI50/CE50) para cada

Ensayos de toxicidad aguda con semillas de lechuga

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punto final evaluado. Para el caso de muestras en donde la inhibicin es

inferior al 50%, o para determinar el valor correspondiente al NOEC o
LOEC, se realiza el anlisis de comparacin de medias (t Student, Dunnett)
para verificar la significancia estadstica en el porcentaje de efecto.
Interpretacin de los resultados
Los efectos cuantificados sobre la elongacin de la radcula o del hipocotilo son
efectos subletales. La inhibicin en la germinacin podra considerarse como un
efecto letal siempre y cuando podamos corroborar que finalizada la exposicin
a una muestra las semillas no germinaron por muerte del embrin y que no
existe simplemente un retraso en el proceso de germinacin, mantenindose
la viabilidad de la semilla. Al evaluar la fitotoxicidad de muestras ambientales
complejas o con compuestos voltiles, en algunos casos se ha observado que al
finalizar el perodo de exposicin la inhibicin en la germinacin es elevada,
pero si se extiende el perodo de ensayo, sin renovar la exposicin a la muestra,
las semillas comienzan a germinar. La vitalidad de las semillas que no han germinado es posible verificarla mediante la prueba de tetrazolium para viabilidad
(Ellis et al., 1985), pudiendo de esta manera asignarle con certeza a la inhibicin
de la germinacin, el valor e importancia de un efecto letal. No obstante esto,
la inhibicin en la germinacin registrada al finalizar la prueba, se considera
fitotoxicidad aunque el efecto en la germinacin sea reversible.
Otro aspecto a considerar es el mayor desarrollo en la elongacin de
la radcula o el hipocotilo en algunas muestras con respecto al control. La
exaltacin en un punto final u hormesis no debe ser interpretada como un
efecto favorable o estimulante. Si bien es posible que muchos compuestos
(por ejemplo Cu, Zn) a bajas concentraciones produzcan exaltacin por ser
micronutrientes vegetales, esta respuesta debe ser evaluada de manera conjunta
con los efectos registrados en otras pruebas. En la aplicacin de la prueba con
semillas a muestras ambientales conjuntamente con otros organismos como
parte de una batera, se ha detectado en diferentes ocasiones que la exaltacin
en la respuesta en el hipocotilo o radcula se corresponde con toxicidad frente
a otros ensayos de la batera.

Aceptabilidad de los resultados

El ensayo deber repetirse en caso de que:

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Ensayos para agua dulce

En el control negativo el porcentaje de germinacin sea inferior al 90 % y

exista una alta variabilidad en la elongacin de la radcula (coeficiente de
variacin > 30%)
En el control positivo el porcentaje de germinacin sea inferior al 90 %
y la variacin de la sensibilidad de las semillas se encuentre fuera de lo
permitido por las cartas control
Existan posibles interferencias en el proceso normal de germinacin o
desarrollo de las plntulas en los controles
Se presente toxicidad del sustrato. Cuando se reemplaza el papel utilizado
por otras marcas ms econmicas o se utiliza papel de filtro cualitativo en
planchas, hay que tener en cuenta los posibles efectos txicos del papel. Si
se ha tenido buenos resultados con una marca o calidad determinada de
papel, es conveniente no variar el sustrato de ensayo.
Se presente suciedad de las cajas Petri. Si no es posible utilizar material desechable, es importante asegurar un enjuague minucioso del material para
evitar la presencia de residuos de detergente u otra solucin de limpieza.
Se presente un exceso de agua o de muestra utilizada para embeber el papel, lo que determina una baja disponibilidad de oxgeno necesario para el
normal desarrollo del proceso de germinacin. El papel de filtro utilizado
como sustrato de germinacin de las semillas debe estar bien mojado, con
sobrante de lquido para evitar la desecacin, pero en ningn caso las semillas
deben quedar sumergidas.
Se presente un dficit hdrico durante el perodo de exposicin. Se recomienda envolver las cpsulas con una bolsa plstica para evitar que el
papel de filtro de las mismas pierda agua durante el ensayo. Si se esta experimentando con compuestos voltiles, no deben colocarse en una misma
bolsa cpsulas que correspondan a diferentes concentraciones de ensayo.
Tambin se puede colocar dentro de la cmara de cultivo un recipiente con
agua para generar un ambiente hmedo, reduciendo as la evaporacin.
Hay que tener en cuenta que la prdida de humedad de las cpsulas genera
una concentracin del compuesto cuya toxicidad estamos evaluando y, por
lo tanto, las conclusiones a las que arribaremos sern errneas.
Se produzca una exposicin a la luz durante el proceso de imbibicin.
Inmediatamente despus de colocar las semillas sobre el papel filtro, se
recomienda tapar y envolver las cajas Petri, cubrindolas de la luz (para el
caso de semillas fotoblsticas negativas).
Se presente una elevacin de la temperatura de ensayo. Las semillas de
L. sativa expuestas a una temperatura superior (apenas unos grados) a

Ensayos de toxicidad aguda con semillas de lechuga

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la ptima para la germinacin, no germinarn aunque se les coloque

posteriormente a temperaturas inferiores (termodormancia o dormancia
inducida por la temperatura).

Bibliografa
American Public Health Association (APHA). 1992. Mtodos normalizados para el
anlisis de aguas potables y residuales. Editorial Daz de Santos, S.A., Madrid.
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