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1.
REACTIVOS
A) (Solucin A) Solucin de Na2Co3 al 2% y tartrato de sodio y potacio al 0.02% en NaOH 0.1N.
Na2Co3 (Carbonato de Sodio)
2g-------- 100mL
10g------- 500mL
Tartrato de sodio y potacio
0.02g-----100mL
0.10g----- 500mL
NaOH (Hidroxido de Sodio)
40g------ 1N
4.0----- 0.1N---- 1000mL
2.0g----------------- 500mL
B) (Solucin B) Solucin de CuSO4 al 0.5% en agua destilada.
CuSO4 (Sulfato de Cobre)
0.5g ------10mL
1.25-------250mL
C) Solucin cupro-alcalina, 50mL de la Solucin A con 1mL de la Solucin B.
se prepara al momento de usarse
D) Reactivo de folin-Ciocalteu diluido en una proporcion 1:1 en agua destilada
E) Solucion estandar. Albumina bovina 0.3mg en 1mL de agua destilada
CURVA ESTANDAR
TUBO
0
1
2
3
4
5
ASB
(l) [ ]
--- ----50---0.015
1000.03
1500.045
2000-06
250---0.075
H2O
(l)
250
200
150
100
50
----
SOL. C
(Ml)
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
*
Leer a 550nm
SOL.D
(l)
100
100
100
100
100
100
**
Espectrofotometra:
Los mtodos espectrofotomtricos se basan en la interaccin materia-energa. La radiacin EM interacciona
con la materia produciendo algn efecto, se dice que materia absorbe energa. Se lleva la materia desde un
estado fundamental a un estado excitado. Dependiendo de la cantidad de energa aplicada, la interaccin
ocurrir a distintos niveles. Con ello se distinguen varios tipos de espectroscopia segn sea el tipo de
interaccin con la REM:
Para el caso de la espectrofotometra UV-visible la interracin ocurre a nivel de los e- de la capa de valencia
existe un cambio en la distribucin electrnica.
Absorcin UV-visble : Para que ocurra la absorcin de una radiacin UV-visible en molculas orgnicas, se
requiere que la energa absorbida corresponda al salto de un orbital poblado a uno desocupado. En el caso
molecular, los niveles no son tan discretos por lo que existe una gamma de frecuencias posibles.
Absorcin y Emisin: Cuando se absorbe energa se pasa de un estado fundamental a un estado excitado.
Este estado excitado vuelve a su estado basal luego de un cierto periodo de desfase, ocurriendo emisin de
radiacin (no siempre puede ocurrir, la energa se puede disiparse de otras formas). Este fenmeno da origen
a otro tipo de espectroscopa como la espectroscopia de luminiscencia, fluorescencia.
Cada analito molecular tiene un mximo de absorcin en la zona del UV-visible. Atendiendo a esta para
cada sustancia y a la intensidad en que se absorbe la radiacin se disea un mtodo para cuantificar la
cantidad de sustancia .
Absorcin de la Luz
Procedimiento experimental:
Anlisis Cuantitativo:
Para efectuar el anlisis la radiacin de la fuente luminosa debe ser monocrmatica . Se debe elegir mximo
para obtener la mxima sensibilidad y minimizar los errores. El espectrofotmetro contiene un monocromador,
que transforma la luz policromtica en monocromtica. Depende de la calidad de este, que tan buena es esta
transformacin.
Se debe establecer el rango de concentracin donde la relacin con la absorbancia es lineal. Depende de la
absorbilidad de la sustancia. Solo debera usarse el rango lineal.
Existe un rango de absorbancia ptima para la medicin (alrededor de 0.15-0.7). Esto debido a que en la zona
de alta absorbancia se producen desviaciones como consecuencia de que la luz que logra pasar es casi nula
y se confunde con el ruido de fondo. Este rango depende de la calidad del aparato, incluso hay algunos que
llegan a valores de 3 en absorbancia, pero llevan implcito cierto error. Esto se conoce como desviaciones
instrumentales.
Tambin pueden ocurrir desviaciones qumicas de la ley de Beer producto de que las especies que forman la
muestra interactan y se desva de la linealidad. Esto ocurre a altas concentraciones.
Para construir la curva de calibracin se toman valores limite de concentracin en los valores 0.15-0.7 de A y
luego se toma un par de puntos ms. Lo ideal es que la curva de calibracin se construya en las mismas
condiciones que la muestra (misma matriz). Cuando no procede esto, se puede eliminar el efecto de la matriz
si se aplica el Mtodo de Adicin Estndar.
Componentes de un Espectrofotmetro
1.
2.
3.
4.
Fuentes radiantes:
Lampara de Tungsteno no tiene una longitud de onda constante en su radiacin, lo que obliga a calibrar
el instrumento cada vez que se cambia la longitud de onda.
Permite medir solo en el rango del espectro visible.