HPLC

Historia
En 1970 en los EE.UU., Jim Waters fund Waters Corporacin y comenz a vender
instrumentos de HPLC. Esto promovi el uso de HPLC en las reas de anlisis prcticos.
Los sistemas de CL que Waters Corporation desarroll utilizan bomba de alta presin
que genera un rpido flujo de eluyente, y por lo tanto result en una mejora dramtica
en el tiempo de anlisis. Comparados con la "cromatografa de baja presin" los nuevos
tipos se llamaron "cromatografa lquida de alta presin". Por lo tanto, se sola pensar
que HPLC significa cromatografa lquida de alta presin, sin embargo hoy en da es
-Filtracin al Vaco entendido que las siglas HPLC se refieren a Cromatografa Lquida de
Alto Rendimiento. Otro gran cambio a partir de la fecha de Tswett fue los mtodos de
adquisicin de datos. En lugar de observar los cambios de las capas con los ojos, se
acopl el sistema detector y la informacin de datos fueron grabados en hojas de
papel.
Qu es Cromatografa Lquida de Alta Resolucin?
La cromatografa es un mtodo fsico de separacin basado en la distribucin de los
componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o estacionaria y otra
mvil. En la cromatografa lquida, la fase mvil es un lquido que fluye a travs de una
columna que contiene a la fase fija.
El HPLC utiliza una fase mvil lquida para separar los componentes de la mezcla. El
solvente trabaja a una presin de 6,000 psig.
Los componentes o analitos deben ser disueltos en un solvente y se pasan por la
columna cromatogrfica a altas presiones.
La resolucin depende de la interaccin entre el soluto, los componentes y la fase
estacionaria.
Eleccin del solvente
1. No degradar o disolver la fase estacionaria
2. Tener baja viscosidad para reducir las cadas de presin
3. Ser compatible con el detector utilizado. Transparencia ptica (cuando se usan
detectores UV)
4. Se prefieren solventes de punto de ebullicin intermedio.
Filtracin y Desgasificacin de solventes
Las partculas pueden ocasionar costosos daos a la bomba HPLC, al guarda columnas,
y en general causar desgaste del sistema de HPLC. Los fabricantes de los instrumentos
tienen en cuenta este problema y recomiendan que se filtre (0.45 o 0.22 micras) y
desgasifique los solventes HPLC antes de usarlos.
Hay 3 mtodos comunes que se utilizan hoy para la filtracin previa de los Solventes
en HPLC:
-Filtro a la Entrada del Solvente

-Filtracin en Lnea
Existen cuatro mtodos comunes usados para desgasificar solventes en HPLC previos
a su uso:
-Sonificacin
-Burbujear Helio
-Desgasificacin Electrnica en la Lnea del Flujo
-Desgasificacin al Vaco en Lnea
-Temperatura

Preparacin de fase mvil

-Ajuste de pH, parmetro critico en la retencin de solutos ionizables (medir antes de
dosificar modificador orgnico)
-El pH de la solucin aumenta con la incorporacin de un modificador orgnico.
-A valores pH mayores de 7.5 disolucin de slice
-A pH menor a 2 se hidroliza la unin entre la slice y la fase enlazada.
Fase estacionaria
Principales parmetros de la fase estacionaria:
-Tamao de partcula: 3 a 10 m
-Distribucin de partcula: con una desviacin mxima del 10 %
-Tamao de poro: 70 a 300 ;
-rea superficial: 50 a 250 m2/g
-Densidad de la fase (nmero de sitios activos por unidad de rea): 1 a 5 por 1 nm2

Equipo

Bomba
En la primera etapa del desarrollo del HPLC, la bomba fue la parte ms importante del
sistema. El desarrollo del HPLC se puede decir que fue dado por el desarrollo del
sistema de bombeo. La bomba se colocaba en lo ms alto del sistema CL y generaba
un flujo del reservorio del disolvente al sistema. En esta etapa el requisito ms
importante del sistema era poder generar una alta presin. Sin embargo, hoy en da, la
generacin de alta presin es normal y lo que ms preocupa ms hoy en da es
proporcionar una presin constante en cualquier condicin, para proporcionar un
caudal controlable y reproducible dado que el cambio en la proporcin del flujo puede
influir el anlisis en gran medida.
La mayora de las bombas utilizadas en los sistemas LC actuales generan el flujo con
un movimiento de vaivn de un pistn de motor (bombas de pistn). Debido a este
movimiento del pistn, se produce "pulsos". Ha habido grandes mejoras del sistema
para reducir esta pulsacin y las bombas recientes crean un pulso muy inferior a las
antiguas bombas. Sin embargo, los anlisis actuales requieren una sensibilidad muy
alta para cuantificar una pequea cantidad de analitos, e incluso un pequeo cambio
en la velocidad del flujo puede influir en el anlisis. Por lo tanto, las bombas necesarias
para el anlisis de alta sensibilidad tienen que ser muy precisas.
Inyector
Un inyector se coloca al lado de la bomba. El mtodo ms simple es utilizar una
jeringa, y la muestra se introduce en el flujo de eluyente. Ya que la precisin de la
medicin por CL tiene mucho que ver con la reproducibilidad de la inyeccin de la
muestra, el diseo de los inyectores es un factor importante. El mtodo de inyeccin
ms utilizado se basa en lazos de muestreo. El uso de muestreador automtico (autoinyector) del sistema tambin es ampliamente utilizado ya que permite una serie de
inyecciones repetitivas en un tiempo programado.
Columna
La separacin se lleva a cabo dentro de la columna, por lo tanto, se puede decir que la
columna es el corazn de un sistema de CL. La teora de la cromatografa en columna
no ha cambiado desde la poca de Tswett, sin embargo ha habido una continua mejora

en el desarrollo de la columna. Las columnas recientes suelen estar preparados en una

carcasa de acero inoxidable, en lugar de columnas de vidrio utilizadas en el
experimento de Tswett. En general, el material de relleno que se utiliza es de gel de
slice o de polmeros en comparacin con el carbonato de calcio utilizado por Tswett.
El eluyente utilizado para la CL vara de cido a solventes bsicos. La mayora de la
cubierta de la columna es de acero inoxidable y es tolerante a una gran variedad de
disolventes. Sin embargo, para el anlisis de algunos analitos como las biomolculas y
los compuestos inicos, el contacto con el metal no es deseable, por lo tanto columnas
con cubierta de politer ter cetona (PEEK) se utiliza en su lugar.
Detector
La separacin de los analitos se realiza dentro de la columna, mientras que un detector
se utiliza para observar la separacin obtenida. La composicin del eluyente es
consistente cuando no hay analito est presente, en cambio la presencia del analito
cambia la composicin del eluyente. Lo que el detector hace es medir estas
diferencias. Esta diferencia se observa como una forma de seal electrnica. Hay
diferentes tipos de detectores disponibles. Diferentes tipos detector y se explican en la
leccin 6.
Registracin de Datos
El cambio en eluyente detectado por un detector es una forma de seal electrnica, y
as no es visibles a nuestros ojos. En otros tiempos, la pluma- papel-registrador grfico
se utilizaba muy popularmente. Hoy en da, una computadora con un posesor de base
de datos (integrador) es ms comn. Hay varios tipos de procesadores de datos, e
incluye un sistema simple que consiste en construir la impresora y el procesador de
textos, y un tipo de computadora personal que consta de monitor, teclado e impresora.
Tambin hay programas que estn diseados especficamente para el sistema LC.
Ofrece no slo la adquisicin de datos, pero tambin caterticas como mximo de
ajuste, la correccin de lnea base, el clculo automtico de la concentracin, la
determinacin del peso molecular, etc.
Los componentes introducidos hasta el momento son los fundamentos del sistema LC.
A continuacin se presentan algunos equipos opcionales se utiliza con el sistema
bsico de LC.
Desgasificador
El eluyente utilizado para anlisis con LC puede contener gases como oxgeno que son
no visibles a nuestros ojos. Cuando el gas est presente en eluyente, este se detecta
como un ruido y causas una lnea base inestable. Generalmente los mtodos que se
utilizan incluye el burbujeo (burbujeo de gas inerte), uso de bomba de vacio, sistema
destilacin, y / o calentamiento y agitacin. Sin embargo, estos mtodos no son
convenientes cuando el disolvente se deja por un perodo de tiempo determinado (por
ejemplo, durante un anlisis largo). El desgasificador usa unos tubos de membrana de
polmero especial para eliminar los gases. Los numerosos pequeos poros en la
superficie del tubo de polmero permite que el aire pase a travs mientras que previene
cualquier otro lquido pasar a travs del poro. Mediante la colocacin de esta tubera
bajo el contenedor de baja presin, crea las diferencias de presin dentro y fuera de la
tubera (mayor en el interior del tubo). Esta diferencia hace que el gas disuelto se
mueva a travs de los poros y eliminar el gas. En comparacin con el tipo clsico de
desgasificacin por lotes, el desgasificador se puede utilizar on-line, es ms
conveniente y eficiente. Muchos de los nuevos sistemas HPLC contienen un
desgasificador.
Horno de columna
La separacin con LC es a menudo muy influenciada por la temperatura de la columna.
Con el fin de obtener resultados repetibles, es importante mantener una temperatura

constante. Tambin para algunos anlisis, como el azcar y los cidos orgnicos, se
puede obtener mejor resolucin a temperatura elevada (50 ~ 80 C). Tambin es
importante mantener una temperatura estable para obtener resultados repetibles,
incluso cuando se analiza a una temperatura de ambiente. Hay posibilidades de que los
diferentes cambios de temperatura haga que los resultados de la separacin sean
diferentes. Generalmente las columnas se mantienen dentro del horno de columna
(calentador columna).

Ventajas y desventajas de la cromatografa liquida HPLC

Ventajas
-Velocidad de anlisis
-Alta resolucin
-Resultados cuantitativos
-Buena sensibilidad
-Automatizacin
-Amplio espectro de aplicaciones

Desventajas
-Instrumentacin costosa
-Difcil anlisis cualitativo
-No existe detector universal
y sensible
-Elevado costo de operacin
-Experiencia indispensable

Aplicaciones
La cromatografa lquida de alta presin a pesar de ser una tcnica relativamente
nueva, se cuenta que describe numerosas aplicaciones en la literatura qumica. En la
mayora de los casos, stas consisten en determinaciones de sustancias cuyo anlisis
por otra tcnica cromatogrfica resulta muy difcil. Estos resultados comprenden:

Compuestos inicos: como aminocidos, sales inorgnicas, cidos orgnicos,

etc.

Compuestos de alto peso molecular: como polmeros, hidrocarburos

polinucleares, productos naturales, etc.

Compuestos termolbiles y no voltiles: como vitaminas, pesticidas, esteroides,

plastificantes, drogas y un producto muy grande de otros productos farmacuticos.

En los problemas relacionados con la contaminacin ambiental, la HPLC se

utiliza para la contaminacin de algunos pesticidas (insecticidas, larvicidas,
hervicidas, etc.). Tambin es posible la determinacin de hidrocarburos
aromticos polinucleares que son contaminantes atmosfricos muy importantes
En cromatografa lquida el anlisis de compuestos vitamnicos es posible en
corto tiempo.
El bioqumico con frecuencia en un campo de investigacin es el que plantea el
problema de analizar compuestos voltiles y de alto peso molcula. Por
ejemplo, se han efectuado determinaciones de constituyentes de cidos
nucleicos (nucletidos, nuclesidos) por cromatografa de intercambio inico.
En el campo bioqumico la determinacin de esteroides en cromatografa lquida
ha sido el de deteccin, ya que slo el detector de luz ultravioleta es lo bastante
sensible para poner de manifiesto estos compuestos a bajas concentraciones,
pero no todos los esteroides absorben en la regin ultravioleta. Esto ha dado
lugar a la formacin de compuestos derivados de los esteroides que absorben
en el ultravioleta a fin de hacer posible el anlisis.
El anlisis de medicamentos es tambin una aplicacin muy interesante, la
determinacin de los componentes activos de una tableta analgsica. Tambin
el anlisis de barbitricos, anticonceptivos, etc.

En caso de que el compuesto analizar sean de alto peso molecular, se usa

cromatografa de permeacin o de exclusin. Es posible combinar dos o ms
tcnicas cromatogrficas para efectuar separaciones difciles. La de permeacin
es til en el estudio de polmeros, facilitando la determinacin de la distribucin
de pesos moleculares, y en la investigacin de productos naturales para
efectuar separaciones de acuerdo con el peso molecular.
En separaciones segn el tipo qumico su finalidad no es la separacin de
compuestos individuales, sino de grupos diferentes de sustancias presentes en
las mezcla.

Bibliografa

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%2F%2Fexa.unne.edu.ar%2Fquimica%2Fquimica.analitica%2Farch_descargas
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