Toxicidad Aguda y Netox Efluentes Uruguay

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INTENDENCIA MUNICIPAL DE MONTEVIDEO (IMM)

DEPARTAMENTO DE DESARROLLO AMBIENTAL
LABORATORIO DE CALIDAD AMBIENTAL
SECCION BIOENSAYOS
MINISTERIO DE EDUCACIN Y CULTURA (MEC)

INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOLGICAS CLEMENTE ESTABLE (IIBCE)
DEPARTAMENTO DE GENTICA TOXICOLGICA Y PATOLOGA CROMOSMICA
FINANCIACIN:
SSeeccrreettaarriiaaddoo ddee M
Caarriibbee ((SSE
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Evaluacin de la toxicidad aguda y genotoxicidad de efluentes industriales vertidos en las principales cuencas hdricas del Municipio de Montevideo, Uruguay
INFORME FINAL
Contenido
1- INSTITUCIONES Y PERSONAL PARTICIPANTE
2- ANTECEDENTES Y JUSTIFICACIN
3- OBJETIVOS
3.1- Objetivo general
3.2- Objetivos especficos
4- MATERIALES Y MTODOS
4.1 - Extraccin de muestras de efluentes industriales
4.2 - Caracterizacin fisicoqumica de los efluentes
4.3 - Preparacin de las muestras
4.4- Batera de bioensayos para determinacin de toxicidad
4.4.1- Ensayo de toxicidad crnica con Selenastrum capricornutum
4.4.2- Bioensayo con Daphnia magna
4.4.3 - Bioensayo de toxicidad aguda con Hydra atenuatta
4.4.4- Bioensayo con Lactuca sativa
4.4.5- Bioensayo con Cnesterodon decemmaculatus
4.5- Ensayos de genotoxicidad
10
4.5.1- Test de aberraciones cromosmicas
10
4.5.2- Ensayo cometa
11
4.6- Definicin de unidades
12
4.7 - Mtodos estadsticos
14
5- RESULTADOS Y DISCUSIN
15
5.1- Caracterizacin fisicoqumica de los efluentes
16
5.2- Bioensayos
18
25
5.4- Comparacin entre resultados de bioensayos, ensayos de genotoxicidad y anlisis FQ
27
5.5- Otras actividades realizadas en el marco del proyecto
30
5.5.1- Anlisis mediante Citometra de Flujo de Selenastrum capricornutum
30
5.5.2- Clasificacin celular mediante citometra de flujo de clulas de Hydra attenuata.
31
5.5.3- Actividades acadmicas
32
6- CONCLUSIONES
33
6.1- Bioensayos
33
6.2- Genotoxicidad
35
7- PERSPECTIVAS
35
8- BIBLIOGRAFA
36
9- ANEXO- Anlisis estadsticos
40
INFORME FINAL
1- INSTITUCIONES Y PERSONAL PARTICIPANTE
INTENDENCIA MUNICIPAL DE MONTEVIDEO (IMM)

LABORATORIO DE CALIDAD AMBIENTAL
Camino al Faro s/n Montevideo
SECCIN BIOENSAYOS
Dr. Julio Espnola Responsable Proyecto

Ing. Ag. Fernando Lorenzo - Asistente de Investigacin
ANLISIS FISICO-QUMICOS
Ing. Qco. Martn Arriola

UNIDAD DE EFLUENTES INDUSTRIALES
Lucas Priz 2357- Montevideo
Ing. Qca. Alicia Raffaele
Lic. Hernn Mndez
QF. Mary Yafalin
Bach. Antonet Calero
MINISTERIO DE EDUCACIN Y CULTURA (MEC)

INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOLGICAS CLEMENTE ESTABLE (IIBCE)
Av. Italia 3318 Montevideo
DEPARTAMENTO DE GENTICA TOXICOLGICA Y PATOLOGA CROMOSMICA
Dr. Wilner Martnez Lpez - Responsable Proyecto
Lic. Leticia Mndez Acua Asistente de Investigacin
UNIVERSIDAD DE LA REPBLICA
FACULTAD DE CIENCIAS
Igu 4225 Montevideo
SECCIN OCEANOLOGA
MSc. Federico Viana - Asistente de Investigacin

FACULTAD DE MEDICINA
Gral. Flores 2125 - Montevideo
UNIDAD DE MTODOS CUANTITATIVOS
Lic. Gustavo Saona Asistente en Anlisis Estadsticos
INFORME FINAL
2- ANTECEDENTES Y JUSTIFICACIN
La contaminacin acutica ha aumentado por la adicin de nuevas sustancias a los cursos de agua,
principalmente derivadas de procesos productivos, pudiendo tener serias consecuencias tanto sobre
la biota circundante como en la salud humana (White et al., 1996; Choi y Meier, 2001). Los txicos
presentes en los efluentes industriales pueden tener efectos agudos, muchas veces letales para los
organismos expuestos, y/o efectos crnicos (subletales). Entre estos ltimos el dao genotxico
representa la afeccin del material gentico de los individuos expuestos, pudiendo ser carcinognico
cuando deriva en la formacin de tumores malignos y/o mutagnico, afectando a las generaciones
futuras (Moutschen, 1985).
Las comunidades humanas que habitan en las mrgenes de arroyos donde son vertidos efluentes
industriales y utilizan agua de estos cauces para riego o su consumo, podran resultar expuestas a
posibles agentes genotxicos. Generalmente en las ciudades las poblaciones con un mayor riesgo
son aquellas de bajos ingresos que habitan en la periferia de la ciudad, instalando asentamientos
irregulares en las mrgenes de arroyos urbanos. La exposicin a agentes genotxicos en forma
prolongada, en muchos casos durante toda su vida, podra conducir a la produccin de alteraciones
genticas en las poblaciones expuestas y en su descendencia, con el consiguiente incremento del
riesgo a largo plazo de padecer cncer, malformaciones congnitas o retardo mental (Henderson et
al., 2000). AGREGAR CITA DE LA IMM SOBRE INCREMENTO DE CONTAMINACION
En Uruguay las emisiones industriales representan una de las principales fuentes de contaminacin
de los recursos hdricos. El departamento de Montevideo constituye la menor de las 19 divisiones
poltico-administrativas que conforman nuestro pas, pero concentra gran parte de las industrias y la
mayora de las actividades de servicio, as como tambin a casi la mitad de la poblacin del pas
(Tabla 1). Por otra parte, resulta altamente significativo el fenmeno de despoblacin de los barrios
centrales, con el crecimiento de las zonas perifricas y del rea Metropolitana Externa a la ciudad,
que se acrecent en el perodo 1985 a 1996 (Tablas 1 y 2).
rea Geogrfica
Montevideo
Urbano
Rural
Resto del pas
Total del pas
Censo 1963
Censo 1975
Censo 1985
Censo 1996
1.202.757
1.163.623
39.134
1.392.753
2.595.510
1.237.227
1.179.986
57.241
1.551.202
2.788.429
1.311.976
1.255.106
56.870
1.643.265
2.955.241
1.344.839
1.290.919
53.920
1.818.924
3.163.763
Tabla 1- Crecimiento demogrfico de la poblacin montevideana y del resto

del pas registrado por los Censos de poblacin de 1963, 1975,
1985 y 1996. Fuente: I.N.E. - Censo General de Poblacin y Vivienda 1996.
Tasa media de crecimiento anual por mil

rea
Montevideo
rea Externa a Montevideo
Uruguay
Tasa
2,34
23,57
6,44
Tabla 2 Crecimiento anual de la poblacin de Montevideo y de todo el

pas. Fuente: I.N.E. - Censo General de Poblacin y Vivienda 1996.
El rea rural y suburbana de Montevideo a pesar de representar el 0,1% de la superficie

agropecuaria total del pas, genera una proporcin significativa del total de rubros frutcolas, vitcolas
y hortcolas. Esta alta concentracin productiva implica explotacin intensiva donde el riego juega un
3
INFORME FINAL
papel principal (Tabla 3). Coexiste con esta realidad la concentracin en Montevideo del 53% del
parque industrial del pas.
A nivel departamental el control de efluentes es realizado por la Unidad de Efluentes Industriales y el
Laboratorio de Calidad Ambiental de la Intendencia Municipal de Montevideo (IMM). A travs del
desarrollo de cursos de entrenamiento y proyectos financiados por el IDRC (Talleres realizados en
Montevideo 1998 y 2003 y Argentina 2000 as como los proyectos Aquatox, 2003; LHA, 2001
y RIB, 2002) dicho Laboratorio adquiri experiencia en la evaluacin de la calidad del agua en
Montevideo a travs del anlisis de sus efectos biolgicos empleando los bioensayos denominados
Lactuca sativa, Allium cepa, Hydra attenuata, Daphnia magna y Selenastrum capricornutum. En
ambos proyectos se reafirm la necesidad de incorporar informacin ecotoxicolgica a la normativa
ambiental nacional. Los bioensayos constituyen un primer acercamiento al efecto que pueden
causar los txicos presentes en los efluentes, pero muchas emisiones industriales contienen
sustancias que, careciendo de un efecto agudo, podran reducir la sobrevida a largo plazo de los
individuos expuestos (Claxton et al., 1998; Houk, 1992). Entre las conclusiones de los mencionados
proyectos se resalt la necesidad de realizar estudios de efectos a mediano y largo plazo, evaluando
la capacidad genotxica del ambiente. Lo expresado anteriormente es reforzado por las
caractersticas demogrficas que presenta la ciudad de Montevideo, similares a las de pases
desarrollados (Tabla 4), y por el importante lugar que ocupan los tumores malignos dentro de las
causas de muerte a nivel nacional (Tabla 5).
Fuentes de agua para riego (Montevideo)
Aguas subterrrneas
Tajamar
Cauces naturales sin represar
Cauces naturales represados
69%
21%
8%
2%
Tabla 3 - Fuentes de agua empleada para riego en la ciudad de Montevideo.
Tasas de natalidad y mortalidad

Tasas anuales por mil
Tasa bruta de natalidad
Tasa bruta de mortalidad
Tasa de mortalidad Infantil
Principales causas de muerte (1997)

Enfermedades del
Tumores malignos
aparato
circulatorio
34.5 %
25.0 %
1975
18.6
10.9
1985
16.6
10.8
29,7
1996
16,7
11.0
16.9
Accidentes y
Infecciones respiratorias
efectos adversos
y neumonas
4.7 %
3.3 %
Tabla 4- Tasas de natalidad y mortalidad de la ciudad de

Montevideo segn los Censos de 1975, 1985 y 1996.
Tabla 5 Principales causas de muerte por % sobre el total de defunciones registradas en

el ao 1997. Fuente: Ministerio de Salud Pblica.
4
INFORME FINAL
En el presente proyecto se llev a cabo la incorporacin a una batera de bioensayos de toxicidad,

Cuenca
Area (Km2) Longitud del curso principal (Km)
Miguelete
Pantanoso
Carrasco
113
66,4
213
Urbanizacin
% Efluentes industriales
Cuerpo receptor final
41%
40%
31%
30%
24%
sin dato
Baha de Montevideo
Baha de Montevideo
Ro de la Plata
21,5
16
3
de metodologas que permitieron evaluar los potenciales efectos crnicos (genotxicos) de los
efluentes industriales que vierten a las principales cuencas hdricas del Departamento de
Montevideo. En las tablas 6 y 7 se caracterizan las mencionadas cuencas y los vertidos industriales
a las mismas.
Con el asesoramiento de la Unidad de Efluentes Industriales de la IMM, se seleccionaron once
ramos industriales considerados prioritarios, distribuidos en las cuencas hdricas del departamento,
cuyos vertidos finales se realizan a cursos de agua e infiltracin a terrenos de zonas suburbanas.
As mismo, se analizaron algunos efluentes cuya disposicin final va primariamente a colector, pero
que a travs de by pass llegan finalmente a cursos de agua.
Tabla 6 Caractersticas de las principales cuencas hdricas del Departamento de Montevideo.
AO 2002
N de INDUSTRIAS CAUDAL (m3/da)
CUENCA
TV
Miguelete
880
G y A (kg/da)
DBO5 kg/da
SST (kg/da)
Amonio (kg/da)
CrT (kg/da)
S (kg/da)
Pb (kg/da)
30
133
78
67
0,37
0,88
0,054
Pantanoso
1005
37
177
151
147
Carrasco
10
0,25
1,45
1,40
0,049
0,01
1,31
0,014
0,002
0,011
Las piedras
500
19
675
145
15
0,003
0,35
Tabla 7 Vertidos industriales en las principales cuencas hdricas del Departamento de

Montevideo. TV- tipo de vertido. A- arroyos. G y A- grasas y aceites. SST- slidos
suspendidos totales. CrT- cromo total.
3- OBJETIVOS
3.1- Objetivo general
3- OBJETIVOS
Evaluar el impacto a nivel biolgico de fuentes fijas de contaminacin industrial que vierten
sobre cuencas hdricas del Departamento de Montevideo.
3.2- Objetivos especficos
3.2.1 - Evaluar mediante una batera de bioensayos la posible toxicidad y genotoxicidad
producida por efluentes industriales con disposicin final a cursos de agua y terrenos,
en zonas suburbanas de la ciudad de Montevideo.
3.2.2 - Generar informacin cientfica relevante para incidir en la normativa a travs de las
revisiones realizadas por el grupo Interinstitucional GESTA.
INFORME FINAL
INFORME FINAL
4- MATERIALES Y MTODOS
4.1- Extraccin de muestras de efluentes industriales
(Unidad de Efluentes Industriales IMM)
Las muestras de efluentes de las industrias a ser analizadas fueron tomadas en recipientes de
plstico sin cmara de aire. Se tom una muestra de 10 litros que luego de homogeneizada y
fragmentada en recipientes de plstico de menor volumen fue almacenada a una temperatura de 4
C hasta la realizacin de los ensayos (entre los 3 a 5 das posteriores a la toma de la muestra).
(Laboratorio de Calidad Ambiental - IMM)
A partir de una alcuota de cada efluente se realiz su caracterizacin fisicoqumica que incluy los
siguientes parmetros: oxgeno disuelto, conductividad, salinidad, pH, DBO5, DQO, grasas y
aceites, slidos suspendidos totales, slidos sedimentables 1 hora, sulfuros, fsforo, amonio, cromo,
plomo, cadmio y cobre.
4.3- Preparacin de las muestras
Previo a la realizacin de los ensayos se realiz el pre-filtrado (filtro con dimetro de poro (fdp) de 8
m) y el filtrado de las muestras (fdp: 0,22 m).
Debido a que la filtracin de la muestra podra alterar la toxicidad de la misma, ya que las sustancias
txicas podran quedar retenidas en el filtro, la mayora de los bioensayos se realizaron por
duplicado con la muestra con y sin filtrado previo.
4.4- Batera de bioensayos para determinacin de toxicidad
(Laboratorio de Calidad Ambiental IMM y Seccin Oceanologa Facultad de Ciencias)
Se realizaron cinco (5) bioensayos (Hydra atenuatta, Selenastrum capricornutum, Daphnia magna,
Lactuca sativa y Cnesterodon decemmaculatus), representando cada uno a organismos
pertenecientes a diferentes niveles trficos. Los cuatro primeros fueron realizados en el Laboratorio
de Calidad Ambiental de la IMM y el de C. decemmaculatus en la Seccin Oceanologa de la
Facultad de Ciencias, Universidad de la Repblica.
4.4.1- Ensayo de toxicidad crnica con Selenastrum capricornutum (Pseudokirchneriella subcapitata).
Principio
El gnero y la especie de Selenastrum
capricornutum
fueron
modificados
formalmente
a
Pseudokirchneriella
subcapitata (Hindak, 1990). Sin embargo,
para mantener consistencia con la literatura
que la refiere, se emplear en este
procedimiento
su
nombre
original:
Selenastrum capricornutum.
Figura 1 Selenastrum capricornutum
Selenastrum capricornutum es una alga verde (clorofita) unicelular con forma de media luna y un
volumen aproximado de entre 40 y 60 mm3, que puede encontrarse en sistemas acuticos
epicontinentales eutrficos u oligotrficos (Figura 1).
7
INFORME FINAL
Este mtodo puede ser utilizado por s mismo o como parte de una batera para estimar la
potencial fitotoxicidad de aguas dulces superficiales o subterrneas, aguas servidas y otro tipo de
muestras lquidas, tales como: elutriados o lixiviados, agua intersticial de sedimentos o cualquier
compuesto puro soluble en agua. La prueba es especialmente adecuada para ser practicada en
laboratorios que cuenten con una infraestructura bsica, siendo un ensayo sencillo y de bajo
costo. Presenta alta sensibilidad a metales, compuestos orgnicos y especialmente a Herbicidas.
El hipercrecimiento de la poblacin muestral respecto al control negativo puede interpretarse como
indicativo de un exceso de oferta de nutrientes (fsforo, nitrgeno y oligoelementos) que se
presentan en sistemas acuticos eutrficos.
Cuando las clulas son expuestas a muestras que contienen contaminantes txicos, su
reproduccin se ve afectada, alterando la tasa de crecimiento de la poblacin de las algas. El
efecto de inhibicin de la poblacin causada por los agentes txicos en una muestra luego de 72
horas de exposicin, bajo condiciones de temperatura controlada (24 2 C), se determina
comparndolo con el crecimiento normal observado en un sistema libre de agentes contaminantes
conocido como control. Dependiendo del nmero de concentraciones y rplicas preparadas para
el desarrollo del experimento, se determina la CI50 (concentracin de inhibicin media), LOEC
(concentracin mnima a la cual se observa efecto) y NOEC (concentracin a la cual no se
observa efecto).
El protocolo de prueba con el alga Selenastrum capricornutum realizado es una modificacin del
mtodo estndar publicado por la Agencia de Proteccin Ambiental de Canad (Environment
Canada, 1992 EPS1/RM/25). Los cambios introducidos (Blaise et al., 2000) corresponden al uso
de volmenes reducidos (2,6 mL en viales de borosilicato de vidrio de 20 mL) y la cuantificacin
de las clulas mediante una cmara de conteo (Neubauer) utilizando un microscopio ptico .
4.4.2 - Bioensayo con Daphnia magna var Straus
Principio
Dentro del grupo de cladceros, las especies
del gnero Daphnia son las ms utilizadas
como organismos de prueba o de referencia
en pruebas de toxicidad. La amplia
distribucin geogrfica, el importante papel
que cumplen al interior de la comunidad
zooplanctnica, la facilidad de cultivo en el
laboratorio, la reproduccin partenogentica
(lo cual asegura una uniformidad de
respuesta) y el corto ciclo de vida con la
produccin de un alto nmero de cras, han
hecho de este grupo un ideal para la
evaluacin de toxicidad, de carcter
universal.
El gnero Daphnia se ubica dentro del orden
cladcera de la clase crustcea, y especies
como D. magna , D. pulex y D. similis, son
utilizadas extensivamente en pruebas de
toxicidad, por lo cual existe una extensa
informacin sobre las tcnicas de cultivo, los
requisitos de temperatura, luz y nutrientes,

as como su respuesta a muchos txicos.
Figura 2 Daphnia magna
Especficamente, los ensayos de toxicidad

con D. magna (Figura 2) permiten determinar
la letalidad potencial de sustancias qumicas
puras, aguas residuales domsticas e
industriales, lixiviados, aguas superficiales o
subterrneas, agua potable y agua de poro
de sedimentos, entre otros.
En las pruebas de toxicidad con D. magna,
neonatos menores de 24 horas de edad son
7
INFORME FINAL
expuestos a la muestra o compuesto a

probar, por un perodo de 48 horas, al
trmino del cual se cuantifica el nmero de
organismos muertos. Con estos resultados
se establece la proporcin o porcentaje de
mortalidad producida (Norma ISO 6341

(1989-10-01)).
4.4.3 - Bioensayo de toxicidad aguda (efectos letales) con Hydra atenuatta
Principio
Los plipos de agua dulce del gnero Hydra
son microinvertebrados de la clase Hydrozoa
de amplia distribucin geogrfica y se
caracterizan por ser animales pluricelulares,
cuyas clulas se disponen en dos capas: la
epidermis y la gastrodermis, separadas por
una mesoglea gelatinosa, la cual encierra
una cavidad digestiva continua que se
comunica directamente con el exterior a
travs de una abertura o boca (Figura 3).
Algunas de las clulas intersticiales de la
epidermis dan origen a los rganos
caractersticos de defensa y ataque. Los ms
conocidos son los nematocistos, que
corresponden a los miembros ms simples
de esta clase. En el extremo inferior
presentan un pednculo con una base que
se adhiere a diferentes superficies; en el
extremo anterior se encuentra la boca,
rodeada de cinco tentculos (Campbell &
Bode, 1983). Su tamao vara de 5 a 20 mm
de longitud, y de 2 a 3 mm de espesor .
La especie H. atenuatta es empleada como
organismo de prueba por la facilidad de su
cultivo en laboratorio, su rpida reproduccin,
su
estructura
primaria
(ectodermo,
mesodermo y endodermo), que favorece el
intercambio intra e intercelular aumentando
su potencial para la deteccin de txicos, as
como el presentar cambios morfolgicos

fcilmente reconocibles bajo condiciones
progresivas de intoxicacin (Trottier et al.,
1997).
Los ensayos de toxicidad con H. atenuatta
permiten determinar subletalidad y letalidad
potencial de sustancias qumicas puras,
aguas residuales domsticas e industriales,
lixiviados,
aguas
superficiales
o
subterrneas, agua potable y agua de poro
de sedimentos, entre otros.
Las pruebas de toxicidad con H. atenuatta
tienen una duracin mxima de 96 h, tiempo
durante el cual los organismos son expuestos
al txico o muestran problemas. Durante el
ensayo, diariamente se hace un examen
microscpico y se registran los cambios
morfolgicos producidos. La exposicin de
los organismos a compuestos txicos da
lugar a una serie de cambios morfolgicos
(efectos subletales) y, dependiendo de la
concentracin, puede producir la muerte de
los individuos (efectos letales) (Trottier et al.,
1997; Blaise et al., 1997).
Los resultados de las pruebas permiten,
adems de la estimacin de la LC50 y la
EC50, establecer la LOEC, la NOEC y la
TOEC (Blaise & Kusui, 1997) (ver definicin
de unidades, pg.12).
Figura 3 Hydra atenuatta

8
INFORME FINAL
4.4.4 - Bioensayo con Lactuca sativa
Principio
El bioensayo de toxicidad con semillas de
lechuga (L. sativa) es una prueba esttica de
toxicidad aguda (120 horas de exposicin, 5
das), en la que se pueden evaluar los
efectos fitotxicos de compuestos puros o de
mezclas complejas en el proceso de
germinacin de las semillas y en el desarrollo
de las plntulas durante los primeros das de
crecimiento (Figura 4).
Como puntos finales para la evaluacin de
los efectos fitotxicos, se determina la
inhibicin en la germinacin y la inhibicin en
la elongacin de la radcula y del hipocotilo.
Es importante destacar que durante el
perodo de germinacin y los primeros das
de desarrollo de la plntula ocurren
numerosos procesos fisiolgicos en los que
la presencia de una sustancia txica puede
interferir alterando la supervivencia y el
desarrollo normal de la planta, siendo por lo
tanto una etapa de gran sensibilidad frente a
factores externos adversos. Por otra parte,
muchas de las reacciones y procesos
involucrados son generales para la gran
mayora de las semillas, por lo que la
respuesta de esta especie y los datos
obtenidos a partir de la aplicacin de esta
prueba son en gran medida representativos
de los efectos en semillas o plntulas en
general. El xito o aptitud de una plntula
para
establecerse
en
un
ambiente
determinado es relevante para garantizar la
supervivencia de la especie. La evaluacin
del desarrollo de la radcula y del hipocotilo
constituyen indicadores representativos para
determinar la capacidad de establecimiento y
desarrollo de la planta.
Figura 4 Cultivo de Lactuca sativa
Si bien L. sativa no es una especie

representativa de ecosistemas acuticos, la
informacin generada a partir de esta prueba
de toxicidad proporciona datos acerca del
posible efecto de los contaminantes en las
comunidades vegetales cercanas a las
mrgenes
de
cuerpos
de
agua
contaminados, siendo tambin una especie
interesante de considerar por su importancia
desde el punto de vista hortcola. Por otra
parte, es de fcil y rpida germinacin, por lo
que es posible desarrollar la prueba en pocos
das.
El ensayo se desarrolla a 22 2 C; como
agua de dilucin se utiliza agua dura
reconstituida (APHA, 1992). Se realizan tres
rplicas y en cada una de ellas se colocan 20
semillas. El efecto medido es la inhibicin de
la elongacin de la radcula e hipocotilo, e
inhibicin en la germinacin. Cada punto final
se evala comparando el efecto generado en
los organismos expuestos a la muestra con
respecto a la respuesta en los organismos
del control negativo sujetos a las mismas
condiciones de ensayo, excepto por la
ausencia de muestra. Se utiliza como control
positivo Zn (II) (Dutka et al., 1989).
4.4.5 - Bioensayo con Cnesterodon decemmaculatus
Los peces han sido ampliamente empleados en estudios de ecotoxicidad pues suelen manifestar
la mayor complejidad biolgica de las bateras de bioensayos, por tratarse de un vertebrado. En
esta experiencia se ha empleado a la madrecita de agua (C. decemmaculatus ) (Figura 6), un pez
poeclido que frecuenta aguas continentales de nuestra regin. Su uso en bioensayos se ha
desarrollado principalmente en Argentina y ms recientemente en nuestro pas (Di Marzio et al.,
1994, 1998; Viana et al., 2003).
INFORME FINAL
El bioensayo presenta caractersticas agudas, pues los organismos se exponen a la sustancia

problema por un perodo de 96 horas, y estticas, porque durante el mismo no se realiza el
recambio de las diferentes soluciones.
A tales efectos fueron utilizados organismos juveniles de hasta 12 mm. sin discriminar su sexo.
Para el ensayo se emplearon recipientes plsticos de primer uso sumergidos en un bao
termostatizado a temperatura de 20 1 C. El fotoperodo se mantuvo a 12 horas de luz y 12
horas de oscuridad. Los organismos empleados provinieron de un estanque situado en el campo
de la Universidad, aclimatados por ms de 10 das a las condiciones del ensayo, en agua blanda
reconstituida, con una conductividad de 200 S/cm, y saturacin de oxgeno por burbujeo. En el
acuario de aclimatacin se control la mortalidad del lote, siendo esta inferior al 2 %. Los peces
fueron alimentados con una racin diaria de alimento en escamas, y la misma fue suspendida 24
horas antes de iniciado el ensayo (Figura 5).
Figura 5 - Bioensayo esttico de toxicidad aguda

con C. decemmaculatus.
Figura 6- Cnesterodon decemmaculatus

Arriba: hembra; abajo: macho.

(Departamento de Gentica Toxicolgica y Patologa Cromosmica- IIBCE)
Se emplearon dos metodologas de deteccin de genotoxicidad: el test de aberraciones

cromosmicas (AC) y el ensayo cometa en clulas de mamfero mantenidas en cultivo. Estos dos
mtodos evalan distintos tipos de dao a nivel del genoma.
Previo a la realizacin de los ensayos de genotoxicidad se llevaron a cabo ensayos de
citotoxicidad con el fin de determinar aquellas diluciones de los efluentes que no impedan el
crecimiento y desarrollo del cultivo celular. De esta manera, slo fueron consideradas para la
realizacin de los ensayos de genotoxicidad aquellas diluciones en donde los cultivos mostraron
una viabilidad mayor al 90%.
4.5.1- Test de aberraciones cromosmicas (AC)
El test de AC ha sido ampliamente utilizado para evaluar genotoxicidad (Albertini et al., 2000;
Galloway, 2000), dado que es bien conocida la relacin existente entre la produccin de
aberraciones cromosmicas y el inicio de la transformacin oncognica y la muerte celular (Obe et
al., 1992 y 2002). Por otra parte, en el Departamento de Gentica Toxicolgica y Patologa
Cromosmica (IIBCE) se posee amplia experiencia en este test empleando clulas mantenidas en
cultivo (Folle et al., 1995, 1996, 1998; Martnez-Lpez et al., 1996, 1998, 2000).
En el presente trabajo, se expusieron clulas de una lnea celular de hmster Chino (CHO),
ampliamente utilizada en ensayos de genotoxicidad, a diferentes diluciones de los efluentes
industriales. Luego de 20 horas se realizaron los extendidos cromosmicos empleando tcnicas
citogenticas estndar. El anlisis microscpico de las aberraciones cromosmicas fue realizado
10
INFORME FINAL
en 100 metafases completas (18 a 22 centrmeros) de clulas CHO para cada una de las
diluciones analizadas. Los tipos de AC observados fueron agrupados en discontinuidades
(fracturas cromosmicas y de cromtida, gaps) e intercambios (cromosomas dicntricos,
translocaciones, cuadrirradiales, trirradiales, delecciones intersticiales, duplicaciones delecciones,
cromosomas en anillo).
Dado que el anlisis de las AC requiere la presencia de clulas en proceso de divisin, en aquellos
casos en que la proliferacin celular se vio afectada por accin de las sustancias contenidas en los
efluentes industriales no fue posible realizar este anisis.
4.5.2- Ensayo cometa
Este ensayo permite medir el dao producido sobre la molcula de ADN a nivel de clulas
individuales, permitiendo la visualizacin directa de las lesiones con una elevada sensibilidad (Tice
et al., 1990). Por este motivo, en los ltimos aos ha sido ampliamente utilizado en estudios de
genotoxicidad tanto in vitro como in vivo (Belpaeme et al., 1996, 1998; Ralph y Petras,1998; Tice
et al., 2000).
Consiste en una electroforesis en microgel de clulas lisadas embebidas en agarosa. En las
clulas que presentan dao gentico, los fragmentos de ADN producidos dentro del ncleo de la
clula migran hacia el polo positivo de la cuba electrofortica y al ser visualizadas al microcopio
ptico la imagen que presentan se asemeja a la de un cometa (Singh et al., 1988). Cuanto mayor
es el dao gentico, ms grande es la cola del cometa (Figura 7).
En el desarrollo del presente proyecto se trataron cultivos de clulas CHO (por duplicado) con
diferentes diluciones de la muestra y, luego de 20 hs de exposicin, se realizaron los preparados
segn el protocolo diseado por Singh et al. (1988). Luego de ser teidos con bromuro de etidio se
visualizaron en un microscopio de fluorescencia. Se realiz el anlisis de 50 clulas en cada una
de las 2 preparaciones obtenidas por dilucin (1 de cada rplica).
La cuantificacin del dao gentico mediante el ensayo cometa se llev a cabo de dos maneras:
(1) anlisis visual; (2) medicin del parmetro denominado momento de la cola (tail moment), el
cual representa el producto de la intensidad de fluorescencia emitida por la cola del cometa por la
longitud de la cola del cometa (distancia entre el borde de la cabeza (ncleo) y el extremo distal de
la cola) (Figura 8).
En el anlisis visual se tomaron en cuenta 4 categoras definidas del siguiente modo: se consider
de grado 0 a las clulas que no presentaban migracin; de grado 1 a las que la longitud de la cola
del cometa era menor que el dimetro del ncleo; de grado 2 cuando la longitud de la cola del
cometa era igual al dimetro del ncleo; grado 3 cuando dicha longitud era mayor al dimetro del
ncleo; y por ltimo de grado 4 cuando el ncleo se ve reducido y el largo de la cola del cometa es
ms del doble del dimetro del ncleo. Posteriormente se calcul el ndice de dao (ID), sumando
los productos de la cantidad de clulas en cada clase por el nmero de la clase (rango 0 400).
Para la captura, anlisis de imgenes y medicin del parmetro tail moment (Figura 8), se
emple un software especfico de anlisis del Ensayo Cometa. Los datos presentados
corresponden al promedio de los valores de tail moment obtenidos del anlisis de 100 clulas en
cada dilucin (50 clulas por rplica).
11
Grado 0
Grado 1
Grado 3
Grado 2
Grado 4
Figure 7 . Grados de dao gentico considerados

en el anlisis visual.
Figure 8 Imagen obtenida mediante software de

anlisis de imgenes. La lnea celeste
indica el final de la cola del cometa. Las
curvas celeste y roja (parte inferior)
representan el perfil de intensidad de
fluorescencia en la cabeza (ncleo celular)
y la cola del cometa respectivamente.
4.6- Definicin De Unidades

Para las pruebas de toxicidad se utilizaron las siguientes unidades:
LC50: Concentracin Letal 50 % - Corresponde a la concentracin del efluente a la cual se
produce la muerte del 50 % de la poblacin expuesta.
EC50: Concentracin efectiva 50% - Corresponde a la concentracin del efluente a la cual se
produce un cambio (definido como punto final) en el 50% de la poblacin expuesta.
IC50: Concentracin de Inhibicin 50 %- Corresponde a la concentracin del efluente a la cual se
produce un efecto inhibitorio del 50 % de la poblacin
expuesta.
UT: Unidades de Toxicidad - Corresponde a la inversa de la LC/EC/IC50, de acuerdo al algoritmo
UT = 100 / LC/EC/IC50
Las unidades de toxicidad (UT) resultan ms convenientes para la visualizacin de los resultados
dado que a diferencia de la LC/EC/IC50 se incrementa, en forma directamente proporcional a la
toxicidad.
TER: Tasa de emisiones txicas
Otra forma de expresin de resultados de gran utilidad para el caso de emisiones, es aquella que
adems de considerar la toxicidad de las muestras simples obtenida para cada bioensayo, incluye
en el clculo el caudal de la fuente emisora. La ventaja de la aplicacin de esta unidad es que al
considerar el caudal permitir evaluar el impacto sobre el cuerpo receptor. A iguales unidades de
toxicidad la tasa de emisin txica al ambiente vara en forma proporcional al caudal vertido. Es as
que efluentes industriales muy txicos pero con escaso caudal no generan tanto impacto sobre el
cuerpo receptor, como s lo hacen efluentes poco txicos pero con alto volumen de vertido.
La desventaja de esta unidad se basa en que el clculo de la misma debe hacerse para cada
ensayo y/o punto final en particular no permitiendo la evaluacin integrada de varios ensayos en un
mismo resultado.
INFORME FINAL
INDICE PEEP (Potential Ecological Effects Probe)

Este ndice fue desarrollado y utilizado originalmente en el marco del Plan de Accin del ro St.
Lawrence para poder comparar el efecto txico de los efluentes industriales vertidos sobre el
referido curso.
La aplicacin del algoritmo permite unificar el resultado de varios ensayos de toxicidad con diversos
puntos finales en un nico valor, logrando una equilibrada ponderacin de los efectos txicos sobre
varios niveles trficos, adems de que considera tambin el caudal del efluente.
La suma de estas dos cualidades aporta relevante informacin sobre el impacto del mismo sobre el
cuerpo receptor.
Frmula terica del clculo del ndice PEEP (P):
P = log 10 [1 + n ( suma de Ti /N) Q]
Donde n = nmero de puntos finales que exhiben respuesta txica
N = nmero total de puntos finales
Ti = Resultados obtenidos en cada bioensayo, expresado en Unidades de Toxicidad
(UT = 100/ LC/EC/IC50)
Q = caudal en m3/hora
El resultado obtenido, un nmero entero entre 0 y 10, define una escala que permite comparar la
magnitud del impacto de diversos efluentes sobre un cuerpo receptor.
Si bien la tasa de emisiones txicas (TER) nos da una idea del posible impacto ecolgico que tiene
la descarga de un efluente, ya que considera el caudal vertido, presenta la desventaja de que los
resultados se obtienen considerando aisladamente la toxicidad sobre cada uno de los organismos
expuestos. Sin embargo, el ndice PEEP nos permite integrar los resultados de toxicidad, a la vez
que considera los caudales vertidos. Si bien una idea ms acabada del efecto ecotoxicolgico debe
considerar el caudal del cuerpo hdrico receptor que lamentablemente a los efectos de este trabajo
no se pudo obtener, informacin cientfica manejada por la EPA a partir de los trabajos de Eagleson
et al. (1990), consideran que los resultados de ensayos biolgicos de 3 niveles trficos realizados en
el laboratorio, alcanzan una predictibilidad del efecto en los ecosistemas del orden del 88%.
En el presente trabajo se adapt el ndice PEEP original, calculndolo en base a los cuatro o cinco
bioensayos de acuerdo a los datos disponibles que fueron: inhibicin de la reproduccin de S.
capricornutum, inhibicin del crecimiento y germinacin de L. sativa, ensayo letal con H. atenuatta,
ensayo letal con D. magna y ensayo letal con C. decemmaculatus.
NOEC ("No-Observed-Effect Concentration") - Concentracin Sin Efectos Observados
Es la concentracin mayor en una serie de diluciones que no presenta diferencias significativas en
los efectos biolgicos respecto del control.
LOEC ("Lowest-Observed-Effect Concentration)- Concentracin Mnima con Efectos Observados.
Es la concentracin mnima de una serie de diluciones que presenta diferencias significativas en los
efectos biolgicos respecto del control.
Finalmente se calific la calidad del agua de las estaciones de muestreo utilizando el ndice de
Toxicidad (Bulich, 1982 y Coleman & Quereshi, 1985), que define categoras de toxicidad en
relacin a los valores de LC/EC50 obtenidos. (Tabla 8). Dicho ndice se utiliza de rutina en la
calificacin de los resultados obtenidos por el Sistema Internacional Microtox.
13
INFORME FINAL
LC/EC 50
1 a 25
26 a 50
51 a 75
76 a 99
100 o +
INDICE
1
2
3
4
5
CATEGORA
Muy Txica
Txica
Moderadamente Txica
Levemente Txica
No Txica
Tabla 8 - Indice y categoras toxicolgicas.
4.7 - Mtodos estadsticos

En todos los tests estadsticos se consider como significativo un valor p menor a 0,05.
Determinacin del bioensayo ms sensible. Descriptivos para LC/EC/IC50%, UT y Categoras
Toxicolgicas.
El bioensayo agudo ms sensible se determin mediante ANOVA de dos factores (bioensayo como
factor fijo y muestra como bloque). Se utiliz el test de Tukey B para los contrastes a posteriori
debido a que algunas muestras no fueron analizadas por todos los bioensayos, presentando
tamaos de muestra distintos (Zar, 1996). Para la determinacin del bioensayo ms sensible se
consider el total de muestras analizadas con el bioensayo de C. Descenmaculatus (incluyndose:
8145, 8327, 8466 y 8712) para lo cual se trabaj con los valores lmite y promedio de los casos
donde la LC/IC 50% no fue determinada en forma precisa.
Para el clculo de la EC/IC50% en los bioensayos de D. magna e H. atenuatta se utilizaron tres
mtodos estadsticos, segn la calidad de los datos experimentales obtenidos, dos paramtricos:
Probit anlisis, Moving Average y uno no paramtrico: trimmed Spearman-Karber. Los dos
estadsticos primeramente nombrados realizan la transformacin del dato en arco seno.
Estas transformaciones se realizaron utilizando el Programa desarrollado en lenguaje Basic por
Charles E. Stephan, U.S. EPA, y revisado por Richard G. Clements, U.S. EPA, Washington, DC para
correr en programa DOS.
Para el clculo de la EC50% de los ensayos con S. capricornutum y L. sativa se utiliz el sistema
estadstico: A Linear Interpolation Method for Sublethal Toxicity: The Inhibition Concentration (ICp)
Approach (Version 2.0) June 1993 U.S. Environmental Protection Agency Environmental Research
Laboratory Duluth, MN 55804.
Anlisis de la concordancia entre los bioensayos con y sin filtrado previo de la muestra.
Los bioensayos que se efectuaron con efluente filtrado y no filtrado fueron analizados para
determinar la equivalencia de los resultados en ambas situaciones. Para ello, se realiz un test de
Student para muestras apareadas, se determin el coeficiente de correlacin de Pearson (CCP) y el
coeficiente de concordancia (CC) (Lin, 1989; Zar, 1996). Si bien el test de Student y el CCP son dos
mtodos estadsticos frecuentes en la bsqueda de equivalencias entre ensayos el CC es el ndice
ms adecuado de la reproducibilidad de los resultados aun con bajos tamaos de muestra (Lin,
1989). Se consideran correlaciones y concordancias estadsticamente relevantes a partir de un valor
de 0,7.
Anlisis estadstico en ensayos de genotoxicicdad.
Con el fin de explorar la relacin dosis-respuesta se ajust un modelo de regresin de Poisson por el
mtodo de mxima verosimilitud (Edler 1992, Venables y Ripley 1999). Se consideraron como
estadsticamente relevantes los modelos con cocientes de verosimilitud (LRT) significativos
(p<0,05).
Para determinar las diluciones que presentaron diferencias estadsticamente significativas respecto
del control negativo se realiz un test de Chi-cuadrado con la tabla constituida por los conteos con y
sin presencia del evento (AC) para cada dilucin. Cuando el test de Chi-cuadrado fue significativo se
realizaron comparaciones mltiples con respecto al control (Zar, 1996).
14
INFORME FINAL
El ensayo cometa fue analizado mediante un anlisis de varianza de dos factores (diluciones como
factores fijos y rplicas como bloques) empleando un Modelo Lineal Generalizado (MLG) para datos
con distribucin Gamma y mediante una funcin de ligamiento inversa (Lah et al., 2005; Venables
and Ripley, 1999). En los casos donde el anlisis de varianza fue significativo se determin que
dosis difera del control negativo mediante la construccin de intervalos de confianza al 95%.
Comparacin entre resultados de bioensayos y parmetros fsico-qumicos

Se efectu un anlisis de correlacin mediante el coeficiente no paramtrico de Spearman entre los
bioensayos y las variables fsico-qumicas (Zar, 1996). Se consideraron para el anlisis los
bioensayos ms sensibles de H. atenuatta, D. magna y L. sativa (en todos los casos fue el ensayo
no filtrado), y S. capricornutum y C. decemmaculatus. En el caso en que se emple un efluente
combinado (8287/8) se tom el valor promedio de los resultados de los anlisis fsico-qumicos para
la exploracin de sus efectos en los bioensayos.
5- RESULTADOS Y DISCUSIN
En el desarrollo del presente proyecto se realiz el anlisis de 29 muestras: 22 procedentes de
efluentes industriales, 3 de origen pluvial y 1 de vertedero municipal. Las muestras procedentes de
efluentes industriales correspondieron a 11 ramos industriales diferentes. En una de las curtiembres,
adems del efluente final, se analizaron muestras de los vertidos producidos en las etapas de
pelambre, curtido y tintado (Tabla 9).
Origen
Fecha de
extraccin
17-8-04
5-10-04
1-2-05
3-2-05
17-2-05
22-2-05
24-2-05
5-3-05
5-3-05
30-8-05
6-9-05
Tipo
Caudal
vertido
(m3/da)
C
A
C
C
C
C
C
A
A
I
I
1600
500
25
55
600
15
550
30
25
50
60
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
7107
7217
7515
7521
7561
7563
7568
7574
7579
8145
8175
Curtiembre 7
Frigorfico 1
Curtiembre 2
Curtiembre 3
Curtiembre 4
Curtiembre 5
Curtiembre 8
Curtiembre 6
Curtiembre 9
Curtiembre 1
Pinturera
12
8227
Metalrgica
13-9-05
40
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
8254
8287/88
8327
8363
8396
8439
8440
8466
8532
8534
8603
8636
8673
8710
8711
8712
Qumica 1
Refinera
Textil
Aceitera
Maltera
Qumica 2
Grasera
Frigorfico 2
Gas natural
Pozo Vertedero
Pluvial Alaska I
Pluvial Alaska II
Pluvial Alaska III
Curtiembre 9 - curtido
Curtiembre 9 - efluente
Curtiembre 9 - pelambre
20-9-05
27-9-05
4-10-05
18-10-05
25-10-05
8-11-05
8-11-05
15-11-05
20-12-05
21-12-05
10-1-06
17-1-06
31-1-06
14-2-06
14-2-06
14-2-06
A
A
A
A
A
I
A
A
A
---A
A
A
C
C
C
130
900 m3/h
140
700
700
5
50
650
25
---------------1600
----
15
INFORME FINAL
29
8713
Curtiembre 9 - tintado
14-2-06
----
Tabla 9 - Total de muestras analizadas.

C: vertido a colector; I: infilracin a terreno; A: vertido a curso de agua.
16
INFORME FINAL

N
Registro
Tipo
Industria
Grasas
Slidos Slidos
CF
DBO5 DQO
y
Sulfuros Sediment. Susp. Fsforo T
Cromo Plomo Cadmio Cobre Amonio
pH
(ufc/100
(mg/l) (mg/l) Aceites (mg/l) (1 hora) Totales (mg/l P)
(mg/l) (mg/l) (mg/l) (mg/l) (mg/l)
ml)
(mg/l)
ml/l
(mg/l)
Lmite decreto 253/79 y 5,5 s/lm

modificativos para
9,0
infiltracin a terreno
200
s/lm
s/lm
0,3
0,05
s/lm
< 0,03
<0,1
15
8145
Cur
7,6
2.000
5.900
900
680
23
3.100.000
12
<0,3
8175
Pinturas
7,3
<5
s/d
<25
<0,1
14
0,8
<100
<0,1
<0,3
8185
Pinturas
<0,1
<0,3
8439
Qumica
<0,1
<0,3
< 0,03
<0,1
2,5
0,05
7,4
Lmite resol. 761/96

6,0 para vertido a curso de
9,0
agua
7574
Cur
9,1
270
s/d
60
30
210
260
82
<25
20
50
150
5.000
0,3
<25
<0,1
30
0,9
1.000
< 0,1
< 0,3
<0,1
<0,3
<0,03
<0,1
interf
80
7217
Frigorfico
7,5
120
480
40
80
17
1.600.000
8227
Metalrgica
4,8
interf
640
<25
<0,1
240
0,5
<1000
5
170
8254
Qumica
6,7
1.700
4.700
90
<0,1
180
0,8
290.000
2,6
<0,3
<0,03
<0,1
8287
Refinera
7,5
interf
90
<25
<0,1
s/d
<0,5
3.000
<0,3
<0,3
<0,03
<0,1
8288
Refinera
7,1
100
<25
<0,1
s/d
<0,5
1.000
<0,1
<0,3
<0,03
<0,1
1,2
<0,1
<0,3
8327
Textl
9,1
200
s/d
50
<0,1
s/d
12.000
8363
Aceitera
6,2
60
s/d
<25
0,4
150
56
<1000
8396
Maltera
6,9
170
s/d
<25
<0,1
170
17
14.000
8439
Qumica
7,4
270
s/d
<25
20
4.400
<0,1
interf
1,1
37
<0,3
< 0,03
<0,1
2,5
8440
Grasera
8,0
800
s/d
<25
1,6
180
54
8.000
8466
Frigorfico
8,1
60
s/d
<25
<0,1
80
18
s/d
8532
Gas
7,1
10
s/d
< 25
<0,1
<10
<0,5
<1000
s/d
s/d
250
90.000
s/d
s/d
210
6.600.000
s/d
s/d
340
43
8534
Volcadero
7,3
240
s/d
1.300
10
8541
Volcadero
7,6
1.300
s/d
210
<0,1
8603
Plv Alaska
7,8
300
s/d
s/d
10
8633
Plv Alaska (F)
8636
Plv Alaska
8655
Plv Alaska (F)
8673
Plv Alaska
8675
Plv Alaska (F)
7,7
7,6
Lmite decreto 253/79 y

5,5 modificativos para
9,5
vertido a colector
7107
7,1
7515
Cur
Cur
7,3
7521
Cur
11,1
7561
Cur
6,6
7563
Cur
6,0
7568
Cur
9,4
7579
8710
Cur
Cur
8735
Cur
8711
Cur
8734
Cur
8712
Cur
8733
Cur
8713
Cur
8732
Cur
620
800
s/d
s/d
700
s/d
s/db
170
400
20
400
3
3,7
5,2
3.700.000
2.400.000
37
14
4,4
<0,3
< 0,3
< 0,3
5,6
<0,3
0,3
<0,3
4,2
< 0,03
< 0,1
97
66
9,4
<0,3
< 0,03
< 0,1
0,5
<0,3
< 0,03
< 0,1
0,05
200
10
0,3
4.100
290
14
0,6
12
<0,3
120
420
1.500
190
<0,1
<0,1
8,9
<0,7
27
1500
2.900
80
140
12
14
<0,3
59
550
930
< 50
20
<0,1
0,6
<0,3
s/d
690
1.200
80
4,6
6,6
<0,7
53
1.400
3.500
130
<0,1
40
<0,3
130
1600
7,3
280
700
90
<0,1
<0,1
7,3
3,6
23
4,8
460
s/d
s/d
<0,1
<0,1
380
<0,3
s/d
340
<0,3
7,2
780
s/d
s/d
15
12,8 17.000
8,6
2.800
s/d
s/d
s/d
s/d
1.000
100
420
44
0,8
<0,3
0,4
<0,3
<0,1
<0,7
s/d
s/d
18
<0,3
11
<0,3
s/d
s/d
s/d
Tabla 10 - Resultados de los anlisis fsico-qumicos. Con color rojo se sealan los valores que estn por
encima del valor indicado como lmite en el decreto 253/79 y la resolucin 761/96. s/d: sin datos de
laboratorio. interf: interferencia en el anlisis. F: filtrada.
17
INFORME FINAL
Del total de muestras de origen indutrial estudiadas 17 (77,3%) incumplen con la normativa en los
niveles de emisin de algn parmetro fsico-qumico (FQ) (Tabla 10). Las industrias que presentan
un mayor nmero de parmetros (6) por encima de los lmites estipulados en la normativa,
corresponden a los rubros de Grasera (8440) y Qumica (8254) (Tabla 11). Los parmetros FQ en
los que ms se incumple fueron DBO y el cromo ambos en un 47,1% (8/17).
Muestra
Rubro
Parmetros
8363
Aceitera 1
fsforo total
8145
Curtiembre 1
GyA; cromo
7515
Curtiembre 2
cromo
7521
Curtiembre 3
pH; DBO5; sulfuros; SS; cromo
7561
Curtiembre 4
sulfuros
7563
Curtiembre 5
cromo
7574
Curtiembre 6
pH; amonio
7107
Curtiembre 7
DBO5; GyA; sulfuros; cromo
7568
Curtiembre 8
DBO5; cromo
7579
Curtiembre 9
cromo; plomo
7217
Frigorfico 1
DBO5; sulfuros; fsforo total ; CF; amonio
8440
Grasera 1
DBO5; sulfuros; SST; fsforo total; CF; amonio
8396
Maltera 1
DBO5; SST; fsforo total; CF; amonio
8227
Metalrgica 1
pH; SST
8254
Qumica 1
DBO5; GyA; SST; CF; cromo; amonio
8439
Qumica 2
Slidos totales
8327
Textil 1
pH; DBO5; CF
Tabla 11 - Resumen de los parmetros fsico-qumicos en los cuales las industrias presentan
niveles por encima de los lmites establecidos en la normativa. GyA: Grasas y Aceites;
SS: slidos sedimentados; SST: slidos suspendidos totales.
N: cantidad de parmetros en los que se incumple con la normativa.
18
INFORME FINAL
5.2 - Bioensayos
El uso de varios bioensayos conformados con especies de distintos niveles trficos produce un
significativo incremento de la capacidad de deteccin cuali y cuantitativa de txicos. Los resultados
presentados en las siguientes tablas muestran distintas respuestas de sensibilidad de los
bioensayos considerados individualmente frente a diferentes efluentes.
A continuacin se presentan en las siguientes tablas los resultados obtenidos de las pruebas de
toxicidad.
INDUSTRIA
N
Registro
Rubro
H. atenuatta
LC50
D. Magna
LC50
L. Sativa
IC50
F
S/F
S/F
S/F
No
3,42
No
6,59
No
No
16,49
No
S. Capricornutum C. decemmaculatus
EC50
LC50
F
S/F
48,09
5,15
No
No
16,21
No
7107
Curtiembre 7
7217
Frigorfico 1
7515
Curtiembre 2
No 2,97
17,68 6,53
16,91
5,32
69,02
No
100
No
7521
Curtiembre 3
7,79
1,27
3,03
2,61
23,09
No
2,94
No
7561
Curtiembre 4
4,42
3,58
13,23
14,23
No
44,89
4,33
No
7563
Curtiembre 5
No
9,57
No
6,48
No
No
23,28
No
7568
Curtiembre 8
No
0,69
7574
Curtiembre 6
7579
Curtiembre 9
No
8145
Curtiembre 1
0,76
8175
Pinturas
40,71 5,05
S/D
0,59
No
6,48
No
59,42
4,19
No
45,24
21,76
S/D
No
100
100,00
No
No
0,32
0,37
No
79,47
25,30 36,63
3,24
9,61
No
No
1,38
100,00
No
1,51
No
0,84
No
0,66
100,00 100,00
4,42
3,00
3,55
15,23
1,31
0,50
100,0
0
30,46
100,0
0
6,74
0,45
0,41
17,13
5,71
No
0.46
No
No
100,00
100,00
8227
Metalrgica
3,58
8254
Ind Qumica 1
8363
Aceitera
8396
Maltera
0,59
100,0
0
41,04
100,0
0
7,98
71,69
100,00 100,00
100,00
19,2
8439
Ind Qumica 2
65,34 61,43 100,00 64,48
62,55 44,85
88,53
30,4
8440
Grasera
3,47
25,23 33,00
18,92
6,11
8466
Frigorfico 2
47,65
No
100,00
No
34,50
10,50
100,00
No
8287/88 Refinerra
8327
Textl
2,29
100,00 100,00
32,24
13,13
100,00 100,00
34,02
No
93,10
57,17
62,53 48,95
100,00
100,00
62,34
11,67
7,82
8532
Gas
8534
Volcadero
2,75 1,79 13,48 17,76 100,00 100,00

100,0 100,0 100,00 100,00 100,00 100,00
0
0
No 5,42
No
31,10
No 100,00
8603
8636
P. Alaska I
6,43
3,37
65,78
34,37
100,00 100,00
P. Alaska II
2,23, 4,11
33,52
41,47
100,00 100,00
100,00
No
8673
P. Alaska III
5,13
4,08
12,88
9,07
48,24 37,06
NO color
No
8710
SF Curtido
No
0,019
No
0,013
No
13,32
M. Color
1,57
8711
Curtiembre E. Final
No
2,29
No
6,10
No
14,34
C.P.
8,50
8712
Pelambre
No
0,015
No
0,21
No
13,85
M. Color
No
8713
Tintado
No
14,99
No
27,89
No
25,99
M. Color
5,30
Tabla 12 - Los resultados de los bioensayos se expresan en unidades LC/EC/IC 50 (dependiendo del
bioensayo considerado). Ver Definicin de Unidades en Materiales y Mtodos). F: muestra
filtrada; S/F: muestra sin filtrar.
19
INFORME FINAL
INDUSTRIA
N Registro
Rubro
CAUDAL
3
m /da
H. atenuatta
UT
F
D. mMagna
UT
S/F
S/F
7107
Curtiembre 1
1600
29,24
15,17
7217
Frigorfico 1
500
33,67
6,06
7515
Curtiembre 2
25
7521
Curtiembre 3
55
7561
Curtiembre 4
600
7563
Curtiembre 5
15
7568
Curtiembre 6
550
7574
Curtiembre 7
30
7579
Curtiembre 8
8145
8175
5,66
L. sativa
UT
F
15,31
5,91
18,80
1,45
12,84
78,74
33,00
38,31
4,33
22,62
27,93
7,56
7,03
10,45
S. capricornutum C. decemmeculatus
PEEP
UT
UT
S/F
2,08
19,42
5,02
6,17
4,36
1,00
2,82
34,01
3,93
23,09
4,56
4,30
2,66
2,23
15,43
15,43
1,68
23,87
5,01
4,60
1,00
1,00
2,56
25
1,26
30,86
2,91
Curtiembre 9
50
131,58 169,49 312,50 270,27 3,95 2,73
10,41
Pinturas
60
8227
Metalrgica
40
8254
Ind Qumica 1
8287/88 Petrolera
144,93
S/F
2,46
19,80
2,21
119,05
27,93
130
3
22,62
151,52 1,00 1,00

33,33
28,17
4,39
72,46
6,57 76,34
1,00
4,09
66,23
3,91
1,00
0,00
169,49 200,00 222,22 243,90 5,84 17,51
4,78
900 m /h
1,00
1,00
1,00
1,00
Textl
140
2,44
3,28
3,10
7,62
1,00 1,00
2,94
8363
Aceitera
700
1,00
1,00
1,07
1,75
1,60 2,04
1,00
1,00
3,03
8396
Maltera
700
12,53
14,84
1,60
1,39
1,00 1,00
1,00
5,21
3,96
8439
Ind Qumica 2
1,53
1,63
1,00
1,55
1,60 2,23
1,13
3,29
1,70
8440
Grasera
50
28,82
43,67
8,57
12,79
3,96 3,03
5,29
16,37
3,61
8466
Frigorfico 2
650
36,36
55,87
7,42
5,63
1,00 1,00
2,10
4,50
8532
Gas
25
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00 1,00
1,00
0,00
3,22
1,00
2,90
15,55
29,67
1,52
2,91
1,00 1,00
1,00
S/DQ
24,33
2,98
2,41
1,00 1,00
1,00
S/DQ
24,51
7,76
11,03
2,07 2,70
8327
S/N
Volcadero
8603
P. Alaska I
8636
P. Alaska II
8673
P. Alaska III
8710
Sub-E. Curtido
8711
Curtiembre E. Final
8712
Sub-E. Pelambre
8713
Sub-E. Tintado
18,45
19,49
1600
1,00
3,16
9,52
S/DQ
S/DQ
5263,16
7692,31
7,51
63,69
43,67
16,40
6,97
11,76
6666,67
476,19
7,22
6,67
3,59
3,85
S/DQ
5,10
S/DQ
18,87
S/DQ
Tabla 13 - Los resultados de los bioensayos estn expresados en UT y PEEP. EN el caso del PEEP se
seleccion el mayor valor de toxicidad entre las opciones de las muestras filtradas y sin filtrar.
La utilizacin de las UT ofrece la ventaja de una interpretacin ms adecuada de los resultados

obtenidos al presentar una relacin directamente proporcional con la toxicidad de la muestra a
diferencia de lo que ocurre con las Unidades LC50 cuya relacin es inversamente proporcional.
Esto quiere decir que a menor valor de LC50 mayor es la toxicidad de la muestra, en tanto, para las
UT un mayor valor de la misma se corresponde con una mayor toxicidad.
En funcin de los valores de UT, las empresas ms contaminantes para cada bioensayo fueron:
Qumica 1 (8254), Curtiembre 1 (8145), Metalrgica (8227) y Pintura (8175). Para estas empresas
se observ una buena concordancia entre los resultados de muestras filtradas y no filtradas (Tabla
14).
N
Rubro
8254
8145
8227
8175
qu
cur
met
pin
H. atenuatta
(F)
169,5
D. magna
(F)
L. sativa
(F)
S. capricornutum
(F)
312,5
H. atenuatta
(no F)
200,0
D. magna
(no F)
L. sativa
(no F)
C. decemmaculatus
(no F)
217,4
270,3
6,6
76,3
72,5
Tabla 14 - Efluentes ms txicos respecto de los valores de UT de los distintos bioensayos (F: filtrado; no F:
no filtrado). cur: curtiembre; met: metalrgica; pin: pintura; qu: qumica.
20
INFORME FINAL
La unidad TER definida como la tasa de emisiones txicas, se compone del producto de las UT por
el caudal de emisin del efluente. Este hecho introduce un elemento sustancial para la evaluacin
del impacto de la toxicidad producida por el efluente. Por esta razn, dos efluentes con el mismo
valor de toxicidad tendrn impactos diferentes proporcionales a sus caudales de emisin. Al igual
que para las unidades de toxicidad la debilidad que presenta esta medida radica en que debe ser
estimada para cada ensayo utilizado no permitiendo la integracin de los resultados obtenidos por
varios bioensayos simultneamente.
En funcin de los valores TER las empresas ms contaminantes para cada bioensayo fueron:
Qumica 1 (8254), Frigorfico 2 (8466), Curtiembres 7 y 8 (7107 y 7568) (Tabla 15).
N
Rubro
8466
8254
7107
7568
fri
qu
cur
cur
H. atenuatta
(F)
23636
D. magna
(F)
L. sativa
(F)
28889
759
S. capricornutum
(F)
H. atenuatta
(no F)
D. magna
(no F)
L. sativa
(no F)
31707
31068
C. decemmaculatus
(no F)
28261
3327
79710
Tabla 15 - Efluentes ms txicos respecto de los valores de TER de los distintos bioensayos (F: filtrado; no F:
no filtrado). cur: curtiembre; fri: frigorfico; qu: qumica.
Segn surge del anlisis de la toxicidad presentado en las tablas 14 y 15, el uso de diferentes
unidades de toxicidad, en este caso, UT y TER, identifican diferentes industrias como las de mayor
impacto txico.
Otra alternativa para la evaluacin del impacto txico de los efluentes es el uso del Potential
Ecological Effects Probe. Este ndice rene el resultado de varios ensayos y/o puntos finales de
cada ensayo, con lo cual mejora la capacidad umbral de deteccin cuali y cuantitativa de los toxicos
potencialmente presentes adems de incluir el valor del caudal de emisin. El resultado final es un
valor entero en una escala de 0 a 10 que facilita la interpretacin y la comparacin del impacto de
efluentes provenientes de diverso rubros sobre el cuerpo receptor final.
Las empresas estudiadas presentaron un valor promedio PEEP de 3,8 (DE= 0,96), un mnimo valor
de 1,7 para la industria Qumica 2 (8439) y un mximo de 5,1 que correspondi a la Curtiembre 7
(7107) (Tablas 13 y 16). No se consideraron los efluentes 8287/88 (Refinera) y 8532 (Gas Natural)
dado que no presentaron toxicidad para ninguno de los bioensayos realizados.
PEEP
N
20
Promedio
3,80
Mediana
3,95
Media Geomtrica
3,67
DE
0,96
Mnimo
1,70
Mximo
5,10
Tabla 16 - Valores de PEEP para los bioensayos. DE: desvo estndar
El comportamiento de este ndice mostr una aceptable reproducibilidad en relacin a la aplicacin

del mismo durante el desarrollo del proyecto Los bioensayos como herramienta para la evaluacin
de la toxicidad de los efluentes industriales en Uruguay. Informe final proyecto IDRC ejecutado
durante el ao 2002, para una distribucin de industrias similar (Figuras 9 y 10).
21
INFORME FINAL
ndice PEEP
5
4
3
2
1
pintureria
pesquera
lactea
oleaginosa
pintureria
textil
lactea
oleaginosa
textil
licuado de gas
carnica
lanera
quimica
pesquera
carnica
laboratorio
carnica
curtiembre
malteria
chacinados
lactea
carnica
curtiembre
carnica
curtiembre
carnica
lanera
petroquimica
curtiembre
Ramo industrial
Figura 9 - ndices PEEP para cada uno de los efluentes. Ao 2002
Comparativo Toxicidad Industrias
I. PEEP
6,00
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
Curtiembre 10 (E. Final)
Curtiembre 9
Curtiembre 8
Curtiembre 7
Curtiembre 6
Curtiembre 5
Curtiembre 4
Curtiembre 3
Curtiembre 2
Curtiembre 1
Textl
Pinturas
Petrolera
Metalrgica
Maltera
Ind Qumica 2
Ind Qumica 1
Grasera
Gas
Frigorfico 2
Frigorfico 1
Aceitera
0,00
Figura 10 - Indices PEEP para cada uno de los efluentes. Ao 2005
De la observacin de los valores medios de LC50%, IC/EC50% y UT resulta que los bioensayos se
ordenan desde un mximo de sensibilidad a un mnimo de la siguiente forma (Tablas 17 a 20;
Figuras 11 y 12): H. atenuatta, D. magna, C. decemmaculatus, S. Capricornutum y L. sativa.
N
H. atenuatta
18
D. magna
18
S. Capricornutum 22
16
L. sativa
Promedio
28,33
39,29
49,73
65,52
Mediana
7,11
24,58
34,26
65,79
Media Geomtrica
9,72
16,78
24,65
53,86
DE
37,36
37,78
43,31
35,18
Mnimo
0,59
0,32
1,38
15,23
Mximo
100,00
100,00
100,00
100,00
Tabla 17 - Valores de LC50% e IC/EC50% para los bioensayos empleando muestras filtradas.
N
H. atenuatta
28
D. magna
28
C. decemmaculatus 12
L. sativa
24
Promedio
17,02
23,83
31,96
58,62
Mediana
3,83
11,10
9,50
48,52
Media Geomtrica
3,50
7,68
10,52
41,02
DE
31,72
29,25
41,87
36,83
Mnimo
0,02
0,01
0,50
1,31
Mximo
100,00
100,00
100,00
100,00
Tabla 18 - Valores de LC50% e IC/EC50% para los bioensayos empleando muestras no filtradas.
22
INFORME FINAL
D. magna
H. atenuatta
S. Capricornutum
L. sativa
N
18
18
22
16
Promedio
36,32
29,84
11,22
2,40
Mediana
4,51
14,19
2,92
1,52
Media Geomtrica
5,96
10,29
4,06
1,86
DE
86,03
46,31
17,31
1,89
Mnimo
1,00
1,00
1,00
1,00
Mximo
312,50
169,49
72,46
6,57
Tabla 19 - Valores de UT para los bioensayos empleando muestras filtradas.

N
H. atenuatta
28
D. magna
28
C. decemmaculatus 12
L. sativa
24
Promedio
466,81
323,41
34,61
6,18
Mediana
26,22
9,32
10,64
2,06
Media Geomtrica
28,58
13,01
9,50
2,44
DE
1565,46
1448,23
61,95
15,39
Mnimo
1,00
1,00
1,00
1,00
Mximo
6666,67
7692,31
217,39
76,34
Tala 20 - Valores de UT para los bioensayos empleando muestras no filtradas.
100
150
125
75
UT
UT
100
50
75
50
25
25
0
N=
0
18
18
16
22
Hydra
Daphnia
Lactuca
Selenastrum
N=
28
28
24
12
Hydra
Daphnia
Lactuca
Cnesterodon
bioensayos filtrados
bioensayos no filtrados
Figura 11 - Grfico de cajas y lneas de

valores de UT para los bioensayos
bioensayos filtrados.
Figura 12 - Grfico de cajas y lneas de los

valores
de
UT
para
los
no filtrados.
.
Los valores medios del ndice TER tambin determinan el mismo orden de los bioensayos,
mantenindose H. atenuatta como la ms sensible y de mayor valor TER, y L. sativa como la
menos sensible (Tabla 21 y 22).
H. atenuatta
D. magna
S.capricornutum
L. sativa
N
15
15
19
13
Promedio
6716,60
5440,07
4938,75
338,02
Mediana
1117,32
1122,87
700,00
198,18
Media Geomtrica
1109,75
857,31
677,33
163,05
DE
9035,63
9072,99
8719,49
351,85
Mnimo
7,65
5,00
5,65
7,99
Mximo
23636,36
28888,89
31067,96
1119,46
Tabla 21 - Valores de TER para los bioensayos provenientes de muestras filtradas.
H. atenuatta
D. magna
C.
decemmaculatus
L. sativa
N
24
24
Promedio
810333,8
551215,6
Mediana
9430,17
3346,03
Media Geomtrica
DE
6343,80
2710281,09
3417,55
2508861,08
11
18970,32
3645,83
3023,47
20
2758,16
812,81
556,48
Mnimo
8,14
7,75
Mximo
10666666,67
12307692,31
29965,99
16,45
101910,83
4098,98
11,15
12012,01
Tabla 22 - Valores de TER para los bioensayos provenientes de muestras no filtradas.
23
INFORME FINAL
En la clasificacin de las categoras toxicolgicas se encuentra que la mayora de los bioensayos

sealan un predominio de muestras muy txicas, con la excepcin de L. sativa (Tabla 23 y 24;
Figuras 13 y 14).
H. atenuatta
12 (66,6 %)
2 (11,1 %)
1 (5,6 %
3 (16,7 %)
18 (100 %)
Muy Txica
Txica
Moderadamente Txica
Levemente Txica
Total
D. magna
9 (50,0 %)
3 (16,7 %)
2 (11,1 %)
4 (22,2 %)
18 (100 %)
S. capricornutum
10 (45,5 %)
3 (13,6 %)
0 (0,0 %)
9 (40,9 %)
22 (100 %)
Total
34 (45,9 %)
11 (14,9 %)
6 (8,1 %)
23 (31,1 %)
74 (100 %)
C. decemmaculatus
8 (66,7 %)
1 (8,3 %)
0 (0,0 %)
3 (25,0 %)
12 (100 %)
Total
55 (59,8 %)
14 (15,2 %)
5 (5,4 %)
18 (19,6 %)
92 (100 %)
L. sativa
3 (18,8 %)
3 (18,8 %)
3 (18,8 %)
7 (43,6 %)
16 (100 %)
Tabla 23 - Categoras Toxicolgicas en muestras filtradas.

H. atenuatta
23 (82,1 %)
1 (3,6 %)
1 (3,6 %)
3 (10,7 %)
28 (100 %)
Muy Txica
Txica
Moderadamente Txica
Levemente Txica
Total
D. magna
19 (67,9 %)
4 (14,3 %)
3 (10,7 %)
2 (7,1 %)
28 (100 %)
L. sativa
5 (20,8 %)
8 (33,3 %)
1 (4,2 %)
10 (41,7 %)
24 (100 %)
100%
100%
75%
75%
% de CT
% de CT
Tabla 24 - Categoras Toxicolgicas en muestras no filtradas.
50%
50%
25%
25%
0%
0%
Hydra
Daphnia
Lactuca
Hydra
Selenastrum
Daphnia
Muy Txica
Txica
Moderadamente Txica
Lactuca
Cnesterodon
Bioensayo
Bioensayo
Muy Txica
Levemente Txica
Figura 13 - Distribucin porcentual de las

categoras toxicolgicas (% de CT)
para los bioensayos filtrados.
Figura
Txica
Moderadamente Txica
Levemente Txica
14 - Distribucin porcentual de las

categoras toxicolgicas (% de CT)
para los bioensayos no filtrados.
Del ANOVA para los bioensayos filtrados resulta que H. atenuatta es el ms sensible pero no difiere
significativamente de D. magna (Tablas 25 y 26; Figura 15). A su vez, D. magna y S. capricornutum
estn en un siguiente nivel de sensibilidad y no difieren entre s. Luego S. capricornutum y L. sativa
forman un tercer grupo sin diferencias significativas.
Fuente de Variacin
Bioensayo filtrado
Muestra
Factor
Fijo
Aleatorio
Error
Tipo IV SC
15963,762
77959,254
27999,84
Gl
3
24
46
CM
5321,254
3248,302
608,692
F
8,742
5,337
Valor-p
< 0,001
< 0,0001
Tabla 25 - Anlisis de varianza para los bioensayos H, atenuatta, D. magna, S. capricornutum

y L. sativa, con muestras filtradas.
Bioensayo filtrado
H. atenuatta
D. magna
S. capricornutum
L. sativa
18
18
22
16
Promedios de los conjuntos homogneos

A
28,3278
39,2883
B
39,2883
49,725
49,725
65,52
Tabla 26 - Comparacin mltiple, test de Tukey B, para los bioensayos H, atenuatta, D.

magna, S. capricornutum y L. sativa, con muestras filtradas.
24
100
100
90
90
80
80
70
70
60
60
Indicador
Indicador
INFORME FINAL
50
40
50
40
30
30
20
20
10
10
Hydra
Daphnia
Lactuca
Selenastrum
Hydra
Bioensayo filtrado
Daphnia
Lactuca
Cnesterodon
Bioensayos no filtrado
Figura 15 - Intervalos de confianza al 95% para

los bioensayos filtrados, el indicador
fue la DL50% o IC/EC50.
Figura 16 - Intervalos de confianza al 95% para los

bioensayos no filtrados, el indicador fue
la DL50% o IC50%.
.
En el ANOVA para los bioensayos no filtrados nuevamente H. atenuatta resulto el ms sensible pero
sin diferir significativamente de D. magna y C. decemmaculatus (Tablas 27 y 28; Figura 16). El
bioensayo con L. sativa fue significativamente distinto de los restantes.
Fuente de Variacin
Factor
Tipo IV SC
Gl
CM
Valor-p
Bioensayo no filtrado
Fijo
23757,617
7919,206
15,06
< 0,0001
Muestra
Aleatorio
69090,042
28
2467,501
4,692
< 0,0001
Error
33654,723
64
525,855
Tabla 27 - Anlisis de varianza para los bioensayos H. atenuatta, D. magna, C. decemmaculatus y

L. sativa, con muestras no filtradas.
Bioensayo no filtrado
H. atenuatta
28
Promedios de los conjuntos homogneos

A
17,0155
D. magna
28
23,82929
C. decemmacultaus
16
25,80438
L. sativa
24
58,62
Tabla 28 - Comparacin mltiple, test de Tukey B, para los bioensayos H. atenuatta, D. magna, C.
decemmacultaus y L. sativa, con muestras no filtradas.
Del anlisis de correlacin entre muestras filtradas y no filtradas resultan valores para el coeficiente
de Pearson mayores a 0,9 y coeficientes de concordancia mayores a 0,8 (Tablas 29 y 30).
Particularmente los coef. de concordancia elevados (CC>0,8) indican una equivalencia entre los
valores obtenidos para una muestra por ambos mtodos.
Bioensayos
CCP
IC95%
H. atenuatta (F) & H. atenuatta (no F)
18
0,973
0,928 0,990
D. magna (F) & D. magna (no F)
18
0,922
0,798 0,971
L. sativa (F) & L. sativa (no F)
14
0,976
0,924 0,993
Tabla 29 - Correlacin de Pearson entre los bioensayos filtrados (F) y no filtrados (no F).
Bioensayos
CC
IC95%
H. atenuatta (F) & H. atenuatta (no F)
18
0,968
0,912 0,988
D. magna (F) & D. magna (no F)
18
0,894
0,739 0,959
L. sativa (F) & L. sativa (no F)
14
0,969
0,907 0,990
Tabla 30 - Coeficiente de Concordancia (Lin, 1989 ) entre los bioensayos filtrados (F) y
no filtrados (no F).

25
INFORME FINAL
Fueron realizados el test de aberraciones cromosmicas y el ensayo cometa para 28 muestras

provenientes de 11 ramos industriales diferentes.
Diluciones
N Muestra 50%
7107 (P) NC
NC
7217
7515 (P) NC
7521 (P) NC
12
7561
13
7563
NC
7568
NC
7574
NC
8145
--8175
--8227
--8254
8
8287
9
8327
10
8363
6
8396
9
8439
8
8440
10
8466
8532 (P) NC
NC
8539
NC
8603
NC
8636
NC
8673
8710 (P) NC
8711 (P) NC
NC
8712
NC
8713
25%
36 *
12
21*
19*
14
12
NC
18*
12,5% 6,25% 3,125%

32 *
30 *
31 *
9
12
11
23*
18*
16*
18*
16*
14
10
11
12
14
10
12
12
16*
14*
14
17*
16*
1,56%
-----------------
NC
NC
NC
NC
NC
------9
8
10
6
6
8
11
16
7
12
NC
7
8
10
8
6
9
7
9
6
12
14
10
12
13
12
35*
21*
8
9
9
7
7
8
7
7
7
7
14
8
20#
11
9
31*
20*
7
7
10
9
8
7
6
6
8
8
12
9
10
14
8
30*
23*
6
8
7
8
6
--6
7
6
--13
8
------21*
18*
NC
NC
NC
NC
NC
NC
10
12
10
NC
11
NC
0,78%
------------------5
7
8
9
9
--5
8
7
--11
6
---------------
0,39%
------------------6
6
5
6
6
--7
7
6
--9
7
---------------
0%
5
4
6
5
6
5
6
7
6
5
6
6
7
8
6
5
6
6
7
7
8
7
8
6
7
6
7
6
LOEC
3,125
3,125
6,25
3,125
3,125
1,56
1,56
Tabla 31 - Frecuencia de aberraciones cromosmicas encontradas en 100 clulas analizadas al azar. NC: no
clulas. (#) en este caso se observ un nmero mayor a lo previsto de clulas endoreduplicadas
(clulas que duplicaron su material hereditario pero no alcanzaron la divisin celular), lo que puede
ser debido a una carencia de nutrientes durante el cultivo celular en este punto experimental.
(P): se indican las muestras que presentaron un buen ajuste al modelo de Poisson (p<0,05) por el
mtodo de mxima verosimilitud, lo que indica una buena relacin dosis-respuesta.
(*): Diluciones que presentaron diferencias estadsticamente
significativas con respecto al control negativo (test de Chi-cuadrado,
p<0,05) (ver anexo - tabla 2).
26
INFORME FINAL
5 m
Fig. 17 Aberraciones cromosmicas encontradas en el anlisis de las

muestras procedentes de curtiembres (Flechas: Gaps y fracturas
de cromtida).
En relacin al anlisis de las aberraciones cromosmicas se observ un predominio de las

aberraciones cromosmicas de tipo cromtida (Figura 17). La mayora de los agentes qumicos no
radio-mimticos inducen alteraciones cromosmicas de tipo cromtida, es decir que las lesiones
primarias inducidas por estos agentes mutagnicos requieren que la clula pase por la fase de
duplicacin celular para convertir esta lesin en una aberracin cromosmica.
Se observ que 7 muestras (7107, 7515, 7521, 7568, 7574, 8710 y 8711), todas procedentes de
curtiembres, produjeron un aumento estadsticamente significativo (p<0,05) en la frecuencia de
aberraciones cromosmicas con respecto al control negativo en casi todas las diluciones evaluadas
(Anexo, Tabla 2).
Para cada una de las muestras se calcul el LOEC (Lowest-Observed- Effect Concentration). En 2
de ellas, ambas procedentes de la misma industria (efluente final y etapa de curtido), el LOEC fue de
1,56 (8710 y 8711), en otras cuatro industrias fue de 3,125 (7107, 7515, 7568, 7574) y en la restante
de 6,25 (7521). El resultado sobre genotoxicidad obtenido en 5 de ellas: 7107, 7515, 7521, 8710 y
8711 est apoyado con una relacin dosis-respuesta positiva (buen ajuste al modelo de regresin de
Poisson (p<0,05); mtodo de mxima verosimilitud). Una muestra procedente de una industria de
gas natural (8532), a diferencia de las industrias antes mencionadas, a pesar de no mostrar
genotoxicidad, present una buena relacin dosis-respuesta (Tabla 31 y anexo - Tabla 1).
Cabe destacar que la industria que present los valores menores de LOEC (mayor nivel de
genotoxicidad) coincide con la industria que posee el segundo mayor caudal de emisin (ver Tabla
9), y a su vez, presenta niveles de cromo elevados (ver Tabla 10).
27
INFORME FINAL
Diluciones
N
muestra
7515
7521
7561
7563
7568
8145
8175
8227
8254
8287
8327
8363
8396
8439
8440
8466
8532
8539
8603
8636
8673
8710
8711
0,85
0,53
0,89
0,68
1,29
1,93
0,96
0,71
0,55
0,72
0,71
0,63
0,59
0,77
0,71
0,93
0,64
0,69
0,63
0,65
1,64
0,40
0,51
ND
ND
ND
ND
ND
2,63
1,67 *
1,17 *
0,47
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
2,73
0,75
1,15
0,51
0,85
1,57 *
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
8713
0,51
ND
ND
0%
0,195% 0,39% 0,78%
1,56%
3,125%
6,25%
12,5%
25%
ND
ND
ND
ND
ND
2,01
0,67
1,09
0,67
0,86
2,87 *
ND
0,84
ND
1,30
0,57
0,78
0,62
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
1,54
0,80
0,98
0,70
0,85
1,35 *
ND
0,63
1,66 *
1,16
0,49
0,49
0,70
ND
ND
ND
ND
0,63
3,73 *
2,13 *
1,67 *
3,31 *
1,30
1,17
0,65
1,73 *
0,61
0,75
1,06
0,72
0,64
0,92
ND
0,68
0,46
0,68
0,72
0,49
1,14
0,59 *
0,54
1,06
1,75 *
0,60 *
2,11 *
1,05
1,41
0,88
2,34 *
ND
1,43 *
0,88
0,33
0,56
1,47 *
2,00
0,99
0,61
0,67
0,45
0,58
1,32 *
0,41
0,46
3,11 *
2,61 *
1,55 *
0,69
1,49
ND
1,10 *
ND
ND
0,53
0,80
0,61
0,80
2,47 *
1,25
1,09
0,53
0,73
0,36
0,83 *
0,47
0,80 *
0,57
1,03
0,98 *
0,88
0,53
1,51
ND
ND
ND
ND
ND
0,93
0,70
0,59
1,51 *
1,27
1,09
0,54
0,63
0,75
1,81 *
0,93
1,46 *
ND
ND
ND
0,60 *
0,45
0,64
0,65 *
50%
0,89 *
1,52
0,61
6,15 *
ND
ND
ND
ND
0,95
0,72
0,59
0,62
0,40
0,51
0,83
0,80
0,66
0,65
2,53 *
5,10 *
ND
ND
2,29 *
Tabla 32 - Resultados del ensayo cometa. Los datos presentados corresponden al promedio de
los valores de tail moment de 100 clulas en cada dilucin- (50 clulas de cada
rplica) analizadas al azar. ND: no existen datos.
(*) Diluciones que presentaron diferencias estadsticamente significativas con
respecto al control negativo (Anlisis de varianza (MLG)), ver anexo Tabla 3).
En el ensayo cometa, en 14 de las 24 muestras analizadas se encontraron diferencias

estadsticamente significativas entre al menos una de las diluciones y el control negativo (7515,
7521, 7561, 7563, 7568, 8175, 8227, 8287, 8327, 8439, 8636, 8673, 8710 y 8713). Las mismas se
distribuyen de la siguiente manera: 7 muestras provenientes de curtiembres, 1 pinturera, 1
metalrgica, 1 refinera, 1 textil, 1 industria qumica y 2 de origen pluvial (Tabla 32, anexo 1 - Tabla
3).
Los resultados provenientes de ambos ensayos de genotoxicidad coincidieron en 4 de las muestras
analizadas y slo en un caso el ensayo de las aberraciones cromosmicas present genotoxicidad
cuando el ensayo cometa no. Por otro lado, tanto en el test de aberraciones cromosmicas como en
el ensayo cometa pudo observarse un incremento del grado de genotoxicidad en el rubro
curtiembres.
De todos modos, el ensayo cometa permiti determinar dao gentico en un mayor nmero de
industrias que el obtenido mediante el test de aberraciones cromosmicas. Este hecho puede ser
debido a que el ensayo cometa es ms sensible que el test de aberraciones cromosmicas a la hora
de detectar dao gentico, debido a que busca la presencia de lesiones a nivel del ADN y no de la
estructura cromosmica en s misma.
5.4- Comparacin entre resultados de bioensayos, ensayos de genotoxicidad y anlisis FQ
Para realizar un anlisis comparativo de los resultados obtenidos entre los bioensayos y los ensayos
de genotoxicidad se gener una tabla que indica la categora toxicolgica y la presencia de
28
INFORME FINAL
genotoxicidad (Tabla 34). Los valores de la categora toxicolgica se tomaron de muestras no

filtradas en aquellos casos en que hubo un doble procesamiento (filtrado y no filtrado).
De la comparacin de ambos tipos de ensayos resulta que siempre que el ensayo de aberraciones
cromsomicas mostr un efecto positivo, los bioensayos de H. atenuatta, D. magna y C.
decemmaculatus fueron muy txicos (CT=1; Tabla 33). El bioensayo de L. sativa mostr resultados
desde muy txico a moderadamente txico (1<= CT <= 3) para las muestras con genotoxicidad
determinada por la frecuencia de las aberraciones cromosmicas. Con Selenastrum se observaron
resultados de muy txico y no txico.
Los bioensayos agudos ms sensibles (H. atenuatta y D. magna) slo en un caso indicaron
ausencia de toxicidad frente a un ensayo cometa que indic genotoxicidad (muestra 8287). El hecho
de evidenciar genotoxicidad en ausencia de toxicidad aguda estara indicando la presencia de un
dao cuyas consecuencias podran observarse mucho tiempo luego de ocurrida la exposicin a los
agentes contaminantes, y que a su vez, podra estar relacionado con la induccin de cnceres y
tumores.
Categoras Toxicolgicas de las industrias

7107
Genotoxicidad
Rubro
H.atenuatta
D.magna
L.sativa
S.capricornutum
C.decemmaculatus
AC
Cometa
Curtiembre
-----
-----
7217
Frigorfico
-----
-----
7515
Curtiembre
-----
-----
7521
Curtiembre
-----
7561
Curtiembre
-----
*
*
*
7563
Curtiembre
-----
-----
7568
Curtiembre
-----
*
*
7574
Curtiembre
-----
-----
7579
Curtiembre
-----
-----
-----
8145
Curtiembre
8175
Pinturera
8227
Metalurgia
-----
--------
8254
Qumica
-----
8287
Refinera
-----
*
*
8327
Textil
8363
Aceitera
8396
Maltera
8439
Qumica
8440
Grasera
8466
Frigorfico
8532
Gas natural
-----
8534
Vertedero
8603
Pluvial I
-----
8636
Pluvial II
-----
8673
Pluvial III
-----
-----
8710
Curtiembre
-----
8711
8712
8713
8713
Curtiembre
Curtiembre
Curtiembre
Curtiembre
1
1
1
1
1
1
2
2
1
1
2
2
-----------------
1
1
1
1
*
-------
*
----*
*
Tabla 33 - Se comparan los resultados de los bioensayos agudos y la genotoxicidad. Para los bioensayos agudos se
indica la categora toxicolgica y para los ensayos de genotoxicidad se sealan los que presentaron efectos
significativos respecto del control (*). Muestras con datos faltantes (-).AC: aberraciones cromosmicas.
29
INFORME FINAL
Las variables FQ que presentaron correlaciones significativas con los bioensayos fueron: DBO,
DQO, grasas y aceites, y amonio (Tabla 34).
pH
DBO
DQO
GYA
SULFUROS
SS
SST
FOSFORO
CF
CROMO
PLOMO
CADMIO
COBRE
AMONIO
H. atenuatta
D. magna
L. sativa
C.decemmaculatus
S.capricornutum
rs
-0,225
0,008
0,279
-0,114
-0,147
Valor-p
0,249
0,967
0,187
0,675
0,514
28
28
24
16
22
rs
-0,48
-0,55
-0,702
-0,905
-0,428
Valor-p
0,011
0,003
<0,001
<0,001
0,047
27
27
23
15
22
rs
-0,734
-0,781
-0,405
-0,8
-0,44
Valor-p
0,007
0,003
0,32
0,2
0,175
12
12
11
rs
-0,396
-0,527
-0,162
-0,619
-0,438
Valor-p
0,076
0,014
0,533
0,032
0,053
21
21
17
12
20
rs
-0,137
-0,03
-0,3
-0,255
-0,278
Valor-p
0,486
0,878
0,154
0,34
0,211
28
28
24
16
22
rs
-0,019
-0,041
-0,444
-0,4
-0,158
Valor-p
0,959
0,911
0,271
0,6
0,736
10
10
rs
-0,056
-0,159
-0,502
-0,463
-0,09
Valor-p
0,837
0,556
0,057
0,177
0,77
16
16
15
10
13
rs
-0,243
-0,093
-0,083
0,006
-0,231
Valor-p
0,365
0,732
0,778
0,986
0,448
16
16
14
10
13
rs
-0,4
-0,174
0,153
-0,612
-0,031
Valor-p
0,125
0,519
0,603
0,046
0,917
16
16
14
11
14
rs
-0,26
-0,161
-0,153
-0,221
-0,334
Valor-p
0,255
0,486
0,545
0,513
0,223
21
21
18
11
15
rs
-0,135
-0,391
-0,027
-0,541
-0,091
Valor-p
0,56
0,079
0,914
0,086
0,747
21
21
18
11
15
rs
0,408
0,408
0,133
0,0
-0,272
Valor-p
0,363
0,363
0,802
0,728
rs
0,408
0,408
0,133
0,0
-0,272
Valor-p
0,363
0,363
0,802
0,728
rs
-0,471
-0,385
-0,255
-0,775
-0,421
Valor-p
0,036
0,094
0,34
0,014
0,073
20
20
16
19
Tabla 34 - Coeficiente de correlacin de Spearman (rs) entre los parmetros fsico-qumicos y la LC50% de los
bioensayos.
30
INFORME FINAL
El estudio de correlacin entre las variables FQ y los bioensayos (Tabla 34) debe considerarse como
exploratorio de posibles relaciones. Debido a que no todas las muestras tienen la medicin de todas
las variables y en muchos casos los valores de la misma estuvieron en el lmite de deteccin de la
tcnica (considerndose para el anlisis el valor umbral). Sin embargo, se destaca la correlacin
observada entre el amonio en H. atenuatta que ya ha sido observado en otros estudios y tambin en
este caso con C. decemmaculatus. La DBO fue la variable que se correlacion con todos los
bioensayos.
5.5 Otras actividades realizadas en el marco del proyecto
5.5.1- Anlisis mediante Citometra de Flujo de Selenastrum capricornutum
La Citometra de Flujo es una poderosa herramienta que permite realizar el recuento de
partculas o clulas marcadas con una sustancia fluorescente que se encuentran suspendidas
en una columna lquida a una velocidad de 6.000 eventos por segundo. En este sentido, la
aplicacin de esta tecnologa para el recuento de algas que poseen clorofila como colorante
fluorescente, ha permitido realizar el recuento de todo el ensayo en un tiempo breve y con una
gran precisin debido a que es posible manejar valores absolutos del recuento de algas y no
estimaciones realizadas a travs del empleo de una cmara cuenta glbulos (Figura 18).
Figura 18 - Recuento de algas (Selenastrum carpicornutum) mediante citometra de flujo

provenientes de cultivos expuestos a diluciones crecientes de un efluente industrial proveniente del
sector Curtiembre. La regin (R1) que contiene puntos de color verde corresponde a las poblaciones
de algas.
Concentracin efectiva 50%
Intervalo de Confianza al 95%
Indice de toxicidad
N
Registro
Citometra
Cmara
Citometra
Cmara
Citometra
Cmara
7107
5,1473
5,1468
5,1356 5,1596
5,0307 5,2872
(I)
(I)
7217
16,2115
20,5046
7,9448 32,3496
13,0258 25,1535
(I)
(I)
7515
> 100
> 100
(V)
(V)
31
INFORME FINAL
7521
2,1251 (*)
2,9433
0,2962 (**)
0,6041 (**)
--
--
7561
4,1365
4,3327
3,8464 4,5207
4,0689 4,6288
(I)
(I)
Tabla 35 - Anlisis comparativo del recuento de algas (Selenastrum capricornutum) mediante Citometra
de Flujo y Cmara Cuenta Glbulos (Neubauer).
(*) Concentracin efectiva 25%, (**) Desvo estndar.
En la Tabla 35 se muestran valores de recuento de algas provenientes del ensayo crnico

empleando Selenastrum capricornutum realizados mediante citometra de fluljo y cmara Neubauer.
Se destaca la buena correlacin existente entre ambas tcnicas para el pequeo nmero de
muestras analizadas.
Finalmente, se destaca una marcada tendencia hacia una correlacin directa entre los ensayos de
toxicidad, la prueba de genotoxicidad y la calificacin a travs de los parmetros fsico-qumicos. Sin
embargo, la falta de concordancia entre los ensayos fsico-qumicos, los bioensayos y el ensayo
Cometa en relacin al efluente proveniente del rubro matadero, podra explicarse por la elevada
concentracin de amonio que no presenta un efecto genotxico.
La utilizacin de la citometra de flujo para el recuento de algas empleadas en el bioensayo con
Selenastrum capricornutum ha determinado un avance tcnico en nuestro proyecto permitiendo
realizar su anlisis en un tiempo menor. Estudios comparativos empleando la tcnica de uso
corriente (se estn llevando a cabo con el fin de validar el uso de la citometra de flujo para el
recuento de algas empleadas en el bioensayo antes mencionado. Por otro lado, resulta de inters
poder confirmar, empleando un mtodo cuantitativo poderoso como lo es la citometra de flujo, los
resultados obtenidos mediante el recuento empleando una cmara Neubauer.
5.5.2- Clasificacin celular mediante citometra de flujo de clulas de Hydra attenuata.
Aplicacin del ensayo cometa para estudios de genotoxicidad en clulas de este organismo.
Durante el desarrollo del Proyecto Watertox coordinado por el IDRC de Canad, se determin que el
bioensayo con Hydra attenuata se presenta como uno de los mas sensibles y confiables, dentro de
una batera de ensayos que incluyen, Daphnia magna, Lactuca sativa, Selenastrum capricornutum y
Allium cepa (Environmental Toxicology, vol. 15, 2000, Special Issue).
En tal sentido, en el marco del presente proyecto nos planteamos la posibilidad de poner a punto
una metodologa que permitiera realizar un anlisis de genotoxicidad en clulas provenientes de
organismos expuestos a efluentes industriales.
El ensayo cometa ha sido aplicado a clulas de Hydra atenuatta expuestas a sustancias txicas, y si
bien algunos autores sugieren la utilizacin de este ensayo para evaluar efecto genotxico sobre las
clulas de estos organismos, los datos son an muy escasos y sus resultados presentan una
enorme variabilidad en cuanto al efecto genotxico. Este hecho ha sido interpretado como debido a
que la aplicacin del ensayo se est llevando a cabo en un pool de clulas de Hydra atenuatta de
diferentes orgenes embrionarios, y por ende, con diferentes niveles de exposicin a las sustancias
txicas.
Por tanto, nos hemos planteado la posibilidad de realizar una clasificacin de los distintos grupos
celulares presentes en Hydra attenuata mediante citometra de flujo para poder luego aplicar el
ensayo cometa a un grupo homogneo de clulas de este organismo.
A continuacin en la Figura 19 se presenta el anlisis citomtrico de distintas poblaciones celulares
de Hydra attenuata en relacin a la incorporacin de un pigmento fluorescente proveniente de la
fuente de alimentacin, un micro-crustceo denominado Artemia salina.
32
INFORME FINAL
Figura 19 Anlsis citomtrico de las distintas poblaciones de clulas de Hydra atenuatta. En diferentes
colores se representan las distintas poblaciones celulares. En los grficos superiores se
compara la distribucin de las distintas poblaciones celulares de Hydra atenuatta en relacin
a un parmetro fluorescente (FL2- fluorescence 2 channel) y al tamao celular (SSC- side
scatter) tanto en el cultivo de este organismo como en el agua donde el mismo habita. En
los grficos inferiores se muestra una secuencia de mediciones citomtricas partiendo de un
nmero diferente de individuos (100, 50 y 25 de izquierda a derecha), de modo de poder
demostrar qu poblaciones celulares corresponden a clulas de Hydra attenuatta y qu
poblaciones corresponden a clulas provenientes de Artemia salina (grfico de la derecha).
La investigacin se encuentra en curso abocada a determinar el origen de estos diferentes grupos

celulares as como el ingreso de la pigmentacin a los mismos. Existen numerosas evidencias en la
naturaleza que la pigmentacin pude ser transferida a las clulas de los organismos a travs de la
alimentacin. Un ejemplo muy conocido es el caso del Salmn, el cual naturalmente es incoloro pero
adquiere un tinte rojizo debido a los pigmentos asimilados durante su alimentacin. En este sentido,
dado el enorme inters en aplicar el test de Hydra attenuata en ensayos de toxicidad aguda, resulta
importante la eventualidad de contar con un ensayo de genotoxicidad empleando este mismo
bioindicador.
5.5.3- Actividades acadmicas
Las actividades que se detallan a continuacin no fueron previstas originalmente en el proyecto pero
fueron consideradas de gran importancia para un mejor desarrollo del mismo.
1) Presentacin de la metodologa de trabajo del proyecto, as como resultados preliminares de la
evaluacin conjunta de la toxicidad aguda y genotoxicidad de 2 efluentes industriales en
ECOTOX 2004 llevado a cabo en Octubre 2004 (Brasil). Dicha actividad fue apoyada
econmicamente por el SEMA-IDRC, la Comisin Sectorial de Investigacin Cientfica (CSIC) de
la Universidad de la Repblica y el Programa de Desarrollo de las Ciencias Bsicas de Uruguay
(PEDECIBA).
Esta actividad permiti establecer importantes contactos con diversos centros de la regin.
Deseamos destacar especialmente la vinculacin con el FEPAM (Fundaao Estadual de
Pesquisa Ambiental) de Porto Alegre quien nos ha asesorado permanentemente en la puesta en
marcha de los test de genotoxicidad aplicados al estudio de los efluentes industriales.
2) Realizacin de una estada tcnica de 4 meses sobre Ensayo Cometa en la Universidad de Ulm
(Alemania) a cargo del Prof. Gnter Speit, reconocido experto mundial en la materia (Abril 2005
Agosto 2005).
33
INFORME FINAL
La Lic. Leticia Mndez del Departamento de Gentica Toxicolgica del IIBCE realiz un
entrenamiento sobre el Ensayo Cometa empleando las preparaciones obtenidas del
procesamiento de 8 muestras provenientes de efluentes industriales, mayoritariamente del rubro
Curtiembres. Adems de haber tenido la oportunidad de discutir los resultados obtenidos en
estas 8 muestras analizadas mediante Ensayo Cometa, ha tenido la oportunidad de
familiarizarse con los ltimos avances en la realizacin de la misma as como con la obtencin
de medidas cuantitativas, previstas a llevar a cabo en nuestro proyecto luego de adquirido un
sistema de captura y anlisis de imgenes.
La Lic. Mndez ha realizado, a su vez, una estada tcnica de entrenamiento en la empresa
MetaSystems (GMBH Alemania) en un software diseado para anlisis de cometas empleando
las imgenes obtenidas en el Laboratorio del Prof. Speit con el fin de poder realizar medidas
cuantitativas tales como Porcentaje de ADN migrado y el denominado Momento de la Cola o
Tail Moment, parmetros que permiten estimar de manera objetiva el dao gentico producido
por el agente al que han sido expuestas las clulas CHO en nuestro estudio.
3) Realizacin de una estada tcnica de 2 semanas en el Laboratorio de Radiobiologa de la
Comisin Nacional de Energa Atmica de Buenos Aires, Argentina (Agosto 2005).
La Lic. Ins Prsper (Becaria del Departamento de Gentica Toxicolgica) realiz un
entrenamiento en el uso del software para captura y anlisis de imgenes provenientes del
ensayo cometa adquirido en el marco del presente proyecto.
4) Aplicaciones de la Citometra de Flujo en Ecotoxicologa. VII Jornadas Rioplatenses sobre
Citometra de Flujo. Biosidus. Buenos Aires, Argentina. Octubre 30, 2004.
Se presentaron resultados preliminares acerca de las actividades cientficas mencionadas en los
items 5.5.1 y 5.5.2.
5) Curso sobre Biomarcadores de genotoxicidad y susceptibilidad gentica. Realizado en el marco
del Congreso LatinoAmericano de Mutagnesis, Carcinognesis y Teratognesis Ambiental
(ALAMCTA) realizado en Mendoza (Argentina) en Noviembre 1 4, 2005.
Durante el mencionado curso se presentaron las metodologas bsicas empleadas para estudios
de genotoxicidad as como aquellas tcnicas empleadas para evaluar genotoxicidad de muestras
provenientes de efluentes industrials y muestras de sangre provenientes de personas expuestas
a sustancias agrotxicas.
6- CONCLUSIONES
El presente trabajo conjuntamente con: Los bioensayos como herramienta para la evaluacin de la
toxicidad de los efluentes industriales en Uruguay, informe final proyecto IDRC (2002), son los dos
nicos antecedentes cientficos que aportan informacin sistemtica y relevante sobre los efectos
txicos de los efluentes industriales en Uruguay. Los resultados obtenidos en este trabajo se alinean
con los anteriores permitiendo concluir que las metodologas utilizadas presentan una buena
reproducibilidad, permitiendo la generacin de informacin confiable (referido a la aplicacin de
ensayos biolgicos) para evaluar el impacto txico de los efluentes industriales. Por otro lado, se
han llevado a cabo, por primera vez en el pas, ensayos de genotoxicidad para efluentes industriales
en clulas de mamfero.
6.1- Bioensayos
La aplicacin de bioensayos en forma de batera de varios niveles trficos es una herramienta
metodolgicamente correcta y segura para evaluar toxicidad frente al uso de ensayos individuales o
de un solo nivel trfico. Ver Tablas 14 y 17 a 20 y Figuras 11 y 12.
Sobre la definicin de los ensayos a incluir en dicha batera y siguiendo los lineamientos
internacionales de integrarla con tres niveles trficos, podemos aclarar que para la informacin
procesada en este trabajo la batera debera integrarse al menos con uno de los siguientes tres
ensayos.
34
INFORME FINAL
Ensayo con Hydra attenuata; Daphnia magna y /o Cnesterodon descenmaculatus, ya que de la

comparacin de los valores obtenidos de todos ellos no surgen diferencias estadsticamente
significativas respecto a sus sensibilidades (Tablas 27 y 28 Figuras 15 y 16). La eleccin de cual o
cuales de los tres podr realizarse sobre bases de conveniencia econmica o de adecuacin a la
capacidad instalada.
Para la expresin cruda del valor obtenido del ensayo se recomienda el uso de la unidad de
toxicidad (UT) frente a: la dosis letal 50%, la concentracin efectiva 50% y la concentracin de
inhibicin 50%, ya que la utilizacin de las UT ofrece la ventaja de una interpretacin ms adecuada
de los resultados.
En lo referente a la expresin de los resultados mediante unidades o ndices que nos permitan
interpretar mejor el posible impacto txico producido, se concluye que la mejor alternativa es el
ndice PEEP.
En lo referente al estado de toxicidad que presentan los efluentes industriales analizados y
clasificados por categoras, se concluye claramente que la mayora de los bioensayos sealan un
predominio de muestras calificadas en la peor categora, I muy txica, con la excepcin del ensayo
realizado con Lactuca (Tabla 23 y 24; Figuras 13 y 14).
Estos resultados condicen con la evaluacin de cumplimiento o incumplimiento de la calidad de los
efluentes de acuerdo a los lmites establecidos en la normativa vigente donde del total de muestras
estudiadas 17 (77%) incumplen con la normativa en los niveles de emisin de algn parmetro
fsico-qumico (FQ) (Tablas 10 y 11).
Nuestros resultados muestran claramente el correcto valor predictivo de los ensayos en relacin a
las determinaciones fisicoqumicas y posiblemente su capacidad para determinar efectos biolgicos
de sustancias no contempladas en los anlisis qumicos o sustancias con efectos txicos aditivos
por sinergismos.
En relacin a si el filtrado de las muestras afecta el resultado de los ensayos de toxicidad queda
estadsticamente demostrado que dicho procedimiento no produce diferencias significativas respecto
a las muestras crudas (Tablas 29 y 30). Este aspecto metodolgico siempre a sido tema de debate y
la informacin recabada permite tomar una posicin con base estadstica.
6.2- Genotoxicidad
Aspectos tcnicos:
Se destaca la observacin de un mayor grado de genotoxicidad producida por las emisiones
provenientes del sector curtiembre, el cual fuera estudiado en detalle durante el desarrollo del
presente proyecto a travs de la realizacin de un nmero mayor de muestras provenientes de este
sector as como del estudio de las diferentes etapas que ocurren en el procesamiento del cuero en
una de las principales empresas de nuestro pas determinado por el caudal de emisin que posee.
En particular, el test de aberraciones cromosmicas present diferencias significativas con el control
negativo (Test de Chi-cuadrado) para 7 de las 8 muestras provenientes de curtiembres (7107, 7515,
7521, 7568, 7574, 8710 y 8711). Con excepcin de la muestra 7574 las restantes presentaron, en el
anlisis fsico-qumico, concentraciones elevadas de cromo. En el caso de la muestra 7574 los
parmetros que se encontraron alterados fueron pH y amonio.
El ensayo cometa present un mayor grado de variabilidad en los resultados que el test de
aberraciones cromosmicas, pero permiti evidenciar un mayor efecto genotxico.
Aspectos generales:
Los datos que se recabaron en relacin a la genotoxicidad observada luego de la exposicin a
efluentes industriales mediante la ejecucin del presente proyecto son los primeros obtenidos en
35
INFORME FINAL
nuestro pas y complementaron los estudios de toxicidad aguda llevados a cabo por la IMM y la Red
Interinstitucional de Bioensayos. De esta forma la Intendencia dispondr de nuevas tcnicas para la
evaluacin de los riesgos potenciales a mediano y largo plazo para los pobladores que habitan
zonas prximas a sitios de emisin de desechos industriales, directa e indirectamente afectados por
los txicos contenidos en los mismos. Finalmente, esta informacin podr ser tenida en cuenta en la
normativa de control de los efluentes industriales tanto a nivel local como nacional, a travs de la
presentacin de los resultados al grupo de normas GESTA AGUA (grupo de estandarizacin
interinstitucional y multidisciplinario que estudia las posibles modificaciones de la normativa).
La evaluacin prevista en el pluvial Alaska mostr la presencia de toxicidad y genotoxicidad (Tabla
33). La elevada densidad de poblacin que habita en sus mrgenes sugiere la necesidad de aplicar
una batera de biomarcadores de exposicin y de efecto, a fin de valorar los posibles riesgos en la
salud de los individuos que all habitan.
7- PERSPECTIVAS
Las perspectivas de la aplicacin de los bioensayos en la Normativa Nacional se est llevando a
cabo a travs de la participacin de un representante de la Red Interinstitucional de Bioensayos en
el grupo GESTA AGUA.
El grupo GESTA AGUA lleva ya casi dos aos de discusin habindose logrado actualmente el
consenso sobre la necesidad de la aplicacin de ensayos de toxicidad en los efluentes industriales
y las aguas superficiales. La futura discusin se establecer sobre los criterios a utilizar referidos a
que bioensayos y que unidades aplicar para una mejor interpretacin del impacto txico. Tambin se
abrirn instancias de discusin sobre los lmites exigibles. Consideramos de alto valor para la
dilucidacin de estos criterios el aporte de los resultados de la investigacin de este proyecto.
Sin perjuicio de lo anteriormente expuesto se proceder a la conformacin de un grupo
multidisciplinario a nivel municipal para la integracin a la normativa de los ensayos de toxicidad.
En Uruguay hasta el momento no existen datos acerca de los efectos genotxicos de los efluentes
industriales sobre los organismos que habitan los cursos hdricos afectados, ni sobre la poblacin en
contacto con ellos. Por tanto, la aplicacin de metodologas dirigidas a la evaluacin genotxica,
constituye un complemento imprescindible en la valoracin de los efectos a largo plazo de los
efluentes.
En particular, se ha planteado conjuntamente con la Unidad de Efluentes Industriales as como con
el Departamento de Toxicologa de la Facultad de Medicina, la realizacin de un trabajo conjunto en
relacin a la evaluacin de un posible efecto genotxico en la poblacin de trabajadores del cuero
en sus distintas etapas de procesamiento.
Por otro lado, se prev la evaluacin con biomarcadores de exposicin a aquellas poblaciones que
viven en las proximidades de los sitios de emisin de aquellos efluentes que presenten
genotoxicidad.
Finalmente, consideramos que el desarrollo del presente proyecto permiti establecer las bases
para continuar con un trabajo coordinado entre ambas Instituciones con el fin de abordar otras
problemticas en relacin a la contaminacin ambiental, con especial nfasis en los cauces de agua
dulce.
8 BIBLIOGRAFA
APHA- AEEA-WPCF (1992). Mtodos normalizados para el anlisis de aguas potables y residuales, Editorial
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INFORME FINAL
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40
INFORME FINAL
9 - ANEXO ANLISIS ESTADSTICO

Genotoxicidad
% de aberraciones cromosmicas
Rubro
LRT
Valor-p
7107
Curtiembre
3,2648
0,0291
13,13
<0,001
7217
Frigorfico
2,3581
0,0144
1,05
0,31
7515
Curtiembre
2,7731
0,0268
6,60
0,01
7521
Curtiembre
2,7193
0,0238
4,71
0,03
7561
Curtiembre
2,4168
0,0064
0,96
0,33
7563
Curtiembre
2,4960
0,0076
1,53
0,22
7568
Curtiembre
2,5744
0,0288
1,13
0,29
7574
Curtiembre
2,7127
0,0196
3,00
0,08
8145
Curtiembre
8175
Pinturera
1,9539
0,0285
0,85
0,36
8227
Metalurgia
2,0222
0,0330
1,27
0,26
8254
Qumica
2,1669
0,0283
1,04
0,31
8287
Refinera
2,2150
0.0006
0,01
0,93
8327
Textil
2,1362
0,0052
0,59
0,44
8363
Aceitera
2,1693
0,0094
1,80
0,18
8396
Maltera
2,0384
-0,0001
<0,01
0,99
8439
Qumica
2,1657
0,0048
0,51
0,48
8440
Grasera
2,1220
0,0043
0,39
0,53
8466
Frigorfico
2,3159
0,0057
0,69
0,41
8532
Gas natural
2,5067
0,0226
4,58
0,032
8534
Vertedero
2,2143
0,0038
0,07
0,79
8603
Pluvial I
2,3949
0,0154
1,26
0,26
8636
Pluvial II
2,5503
0,0094
0,10
0,75
8673
Pluvial III
2,2317
0,0148
0,99
0,32
8710
Curtiembre
3,0427
0,0739
19,15
<0,001
8711
Curtiembre
2,8863
0,0434
4,50
0,034
8712
Curtiembre
8713
Curtiembre
NC
NC
2,2399
0,0208
0,46
0,50
Tabla 1 - Estimacin de los parmetros de la regresin de Poisson (Ln[]=

+*X), valor del cociente de verosimilitud (LRT) y significancia
del modelo (valor-p<0,05).
41
INFORME FINAL
% de aberraciones cromosmicas
Rubro
Valor-p
NOEC
D sig
LOEC
4a7
3,13
3,13
7107
Curtiembre
<0,001
7217
Frigorfico
0,17
7515
Curtiembre
0,003
4a7
7521
Curtiembre
0,004
5a7
7561
Curtiembre
0,75
7563
Curtiembre
0,16
7568
Curtiembre
0,032
4y5
3,13
7574
Curtiembre
0,030
4, 5 y 7
3,13
8175
Pinturera
0,82
8227
Metalurgia
0,89
8254
Qumica
0,76
8287
Refinera
0,98
8327
Textil
0,97
8363
Aceitera
0,49
8396
Maltera
0,99
8439
Qumica
0,95
8440
Grasera
0,96
8466
Frigorfico
0,62
8532
Gas natural
0,40
8534
Vertedero
0,94
8603
Pluvial I
0,06
8636
Pluvial II
0,77
8673
Pluvial III
0,67
8710
Curtiembre
<0,001
3a6
1,56
8711
Curtiembre
<0,001
3a6
1,56
8713
Curtiembre
0,44
3,13
6,25
Tabla 2 - Resultado del test de Chi-cuadrado (valor-p<0,05), se indican las diluciones que resultaron
significativamente distintas del control (diluciones: 1= 0,39; 2= 0,78; 3= 1,56; 4= 3,13; 5= 6,25; 6=
12,5; 7= 25,0; 8= 50,0) y los valores de las diluciones NOEC y LOEC.
42
INFORME FINAL
Rubro
LRT
Valor-p
NOEC
D sig
7515
Curtiembre
69,63
<0,001
3,125 y 12,5
7521
Curtiembre
32,80
<0,001
3,125 a 50,0
7561
Curtiembre
14,65
0,012
3,125 a 12,5
7563
Curtiembre
165,31
<0,001
3,125 y 6,25
7568
Curtiembre
28,28
<0,001
50,0
8145
Curtiembre
36,18
<0,001
**
8175
Pinturera
35,79
<0,001
0,195 y 12,5
8227
Metalurgia
32,59
<0,001
0,195 ; 3,125 y 6,25
8254
Qumica
5,20
0,39
8287
Refinera
33,34
<0,001
6,25
8327
Textil
109,40
<0,001
0,36 a 1,56
8363
Aceitera
15,15
0,01
**
8396
Maltera
6,13
0,52
8439
Qumica
79,68
<0,001
8440
Grasera
9,69
0,14
8466
Frigorfico
9,86
0,20
8532
Gas natural
15,20
0,033
8534
Vertedero
1,15
0,99
8603
Pluvial I
15,27
0,009
**
8636
Pluvial II
23,94
<0,001
12,5 a 50,0
8673
Pluvial III
93,42
<0,001
6,25 y 50,0
8710
Curtiembre
21,68
<0,001
3,125 ; 12,5 y 25,0
8711
Curtiembre
2,10
0,72
8713
Curtiembre
44,58
<0,001
LOEC
1,56 ; 6,25 a 25,0
**
6,25
12,5
3,125 ; 25,0 y 50,0
** Las diluciones significativas presentaron menor efecto genotxico que el control.
Tabla 3 - En la tabla se presenta el resultado del anlisis de varianza (MLG). Se indica el valor del cociente de
verosimilitud para el factor dilucin y su valor-p. Adems se seala que dosis presentaron diferencias
significativas (D sig) respecto del control. Los valores NOEC y LOEC slo se determinaron para las muestras
con cocientes de verosimilitud significativos y con un comportamiento dosisrespuesta montono.
43

Toxicidad Aguda y Netox Efluentes Uruguay

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Toxicidad Aguda y Netox Efluentes Uruguay

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E

INTENDENCIA MUNICIPAL DE MONTEVIDEO (IMM)

MINISTERIO DE EDUCACIN Y CULTURA (MEC)

3.1- Objetivo general

3.2- Objetivos especficos

4.1 - Extraccin de muestras de efluentes industriales

4.2 - Caracterizacin fisicoqumica de los efluentes

4.3 - Preparacin de las muestras

4.4- Batera de bioensayos para determinacin de toxicidad

4.4.1- Ensayo de toxicidad crnica con Selenastrum capricornutum

4.4.2- Bioensayo con Daphnia magna

4.4.3 - Bioensayo de toxicidad aguda con Hydra atenuatta

4.4.4- Bioensayo con Lactuca sativa

4.4.5- Bioensayo con Cnesterodon decemmaculatus

4.5- Ensayos de genotoxicidad

4.5.1- Test de aberraciones cromosmicas

4.5.2- Ensayo cometa

4.6- Definicin de unidades

4.7 - Mtodos estadsticos

5.1- Caracterizacin fisicoqumica de los efluentes

5.3- Ensayos de genotoxicidad

5.4- Comparacin entre resultados de bioensayos, ensayos de genotoxicidad y anlisis FQ

5.5- Otras actividades realizadas en el marco del proyecto

5.5.1- Anlisis mediante Citometra de Flujo de Selenastrum capricornutum

5.5.2- Clasificacin celular mediante citometra de flujo de clulas de Hydra attenuata.

5.5.3- Actividades acadmicas

9- ANEXO- Anlisis estadsticos

1- INSTITUCIONES Y PERSONAL PARTICIPANTE

INTENDENCIA MUNICIPAL DE MONTEVIDEO (IMM)

Dr. Julio Espnola Responsable Proyecto

Ing. Qco. Martn Arriola

MINISTERIO DE EDUCACIN Y CULTURA (MEC)

MSc. Federico Viana - Asistente de Investigacin

Lic. Gustavo Saona Asistente en Anlisis Estadsticos

Tabla 1- Crecimiento demogrfico de la poblacin montevideana y del resto

Tasa media de crecimiento anual por mil

Tabla 2 Crecimiento anual de la poblacin de Montevideo y de todo el

El rea rural y suburbana de Montevideo a pesar de representar el 0,1% de la superficie

Tabla 3 - Fuentes de agua empleada para riego en la ciudad de Montevideo.

Tasas de natalidad y mortalidad

Principales causas de muerte (1997)

Tabla 4- Tasas de natalidad y mortalidad de la ciudad de

Tabla 5 Principales causas de muerte por % sobre el total de defunciones registradas en

En el presente proyecto se llev a cabo la incorporacin a una batera de bioensayos de toxicidad,

Area (Km2) Longitud del curso principal (Km)

Cuerpo receptor final

Tabla 6 Caractersticas de las principales cuencas hdricas del Departamento de Montevideo.

Tabla 7 Vertidos industriales en las principales cuencas hdricas del Departamento de

Figura 1 Selenastrum capricornutum

requisitos de temperatura, luz y nutrientes,

Figura 2 Daphnia magna

Especficamente, los ensayos de toxicidad

expuestos a la muestra o compuesto a

mortalidad producida (Norma ISO 6341

4.4.3 - Bioensayo de toxicidad aguda (efectos letales) con Hydra atenuatta

como el presentar cambios morfolgicos

Figura 3 Hydra atenuatta

4.4.4 - Bioensayo con Lactuca sativa

Figura 4 Cultivo de Lactuca sativa

Si bien L. sativa no es una especie

4.4.5 - Bioensayo con Cnesterodon decemmaculatus

El bioensayo presenta caractersticas agudas, pues los organismos se exponen a la sustancia

Figura 5 - Bioensayo esttico de toxicidad aguda

Figura 6- Cnesterodon decemmaculatus