Universidad Francisco de Paula Santander

EXTRACCIN Y PURIFICACIN DEL ADN DE

HONGOS
Jennifer Castro Estrada cdigo: 1610757
Lorena Chaparro cdigo: 1610430
Wendy Restrepo Lizarazo cdigo: 1610708

ResumenEn la prctica de laboratorio se sigui una

serie de pasos que se basa en la metodologa para la extraccin
de ADN de hongos. Cada etapa del procedimiento fue
fundamental para la obtencin de una muestra significativa y
exitosa, para esto se hizo una homogenizacin, una separacin
y purificacin y luego una precipitacin.

ndice

de

TrminosBioseguridad, equipos de

laboratorio, laboratorio, riesgo.

I.INTRODUCCIN

La extraccin y purificacin de cidos nucleicos constituye la

primera etapa de la mayora de los estudios de biologa
molecular y de todas las tcnicas de recombinacin de ADN.
En este caso, los mtodos de extraccin permiten obtener
cidos nucleicos purificados a partir de diversas fuentes para
despus realizar anlisis especficos de modificaciones
genticas mediante la reaccin en cadena de la polimerasa
(PCR). La calidad y la pureza de los cidos nucleicos son dos
de los elementos ms importantes en ese tipo de anlisis. Si
se desea obtener cidos nucleicos muy purificados, que no
contengan contaminantes inhibidores, es preciso aplicar
mtodos de extraccin adecuados. (UFPS, 2013)

II.

OBJETIVOS

Conoce los fundamentos de la extraccin y

purificacin del ADN genmico.

Biologa Molecular

Que el alumno pueda describir y explicar

cada una de las etapas del protocolo y
definir la importancia de cada uno de los
ractivos en las diferentes etapas.
III.

METODOLOGA

1. Ingresar al Laboratorio de Biologa

Molecular con su gua de trabajo, su bata y
cuaderno de laboratorio.
2. Revisar junto con el docente y el asistente
del laboratorio las normas de seguridad y
reconocer los implementos de seguridad de
uso en el laboratorio.
3. Reconocer los materiales y equipos que
vamos a manipular al momento de las
prcticas de Biologa Molecular.
IV.

DATOS Y RESULTADOS

A. Como resultado a la hora de realizar un trabajo

de laboratorio tenemos que seguir las siguientes
normas que ya han sido establecidas.
Independientemente del tipo de riesgo del
laboratorio, existen unas series de normas de
seguridad bsicas para trabajar que se aplican en
todos los casos. Luego, y de acuerdo a las
caractersticas del laboratorio, el trabajo que all se
realice y el material con el que se trabaja, se
aplicarn otras normas ms especficas. Estas
normas se conocen como precauciones universales
de laboratorio, e incluyen:

Acceso limitado al laboratorio

Universidad Francisco de Paula Santander

No beber, comer, fumar, manipular

lentes de contacto ni aplicarse
cosmticos dentro del laboratorio utilizar
las barreras de proteccin primaria
adecuadas:
Guantes.
Ropas protectoras: guardapolvo con
mangas largas, abotonado y/o bata.
No usar el guardapolvo o bata de otra
persona.
Calzado cerrado.
Proteccin facial o/u ocular: gafas o
mscaras. De preferencia, no usar lentes
de contacto en el laboratorio, an con
proteccin ocular.
El cabello debe estar recogido, no solo
en el caso de usar mecheros, sino
tambin para evitar que obstruya la
visin.
No pipetear con la boca.
No oler los reactivos y materiales.
No tocar los materiales y reactivos sin
guantes.
Adoptar procedimientos que impidan la
generacin de aerosoles.
Descontaminar
adecuadamente
las
mesadas, luego de finalizar el trabajo del
da y cada vez que derrame material
qumico o biolgico.
Colocar los residuos en los recipientes
designados a tal fin.
Lavado de manos, luego de manipular
cualquier tipo de material (qumico o
biolgico), despus de sacarse los
guantes y antes de abandonar el
laboratorio.
No trabajar solo en el laboratorio,
cerciorarse de la presencia de otra/s
personas en el servicio.
Almacenar las muestras y los reactivos
en heladeras distintas y siempre
correctamente tapadas.
No utilizar las mismas heladeras ni
mesas para reactivos y muestras que para
los alimentos.

Biologa Molecular

No usar las batas o guardapolvos de

trabajo fuera del laboratorio.

B. Recomendaciones de trabajo:

Averiguar las propiedades fsicas y

qumicas de las sustancias que se van a
utilizar en el protocolo e identificar sus
potencialidades nocivas para la salud.
La manipulacin de compuestos irritables
o txicos debe hacerse siempre en la
cmara extractora.
Antes de preparar mezclas de reaccin en
microtubos se debe etiquetar cada tubo
con marcador indeleble.
Chequear muy bien la toma de volmenes
con la micropipeta y la adicin de la
misma en la mezcla de reaccin.
Conocer el conocimiento de los equipos
de antemano para evitar cualquier
accidente.
Arrojar los desechos en el lugar adecuado
para cada uno.
Dejar organizado el laboratorio despus de
terminar la prctica.

C. Recomendaciones generales de manipulacin de

reactivos peligrosos:

El fenol-cloroformo debe manipularse con

guantes y proteccin respiratoria en cmara
extractora.
El bromuro de etidio debe manipularse con
guantes de nitrilo porque es cancergeno.
Si va a manipular nitrgeno utilice guantes y
proteccin para ojos.
Si va a utilizar el transiluminador de luz UV
no olvide utilizar lentes de proteccin UV.
Informarse y acatar los procedimientos para
desechar sustancias qumicas y biolgicas.
Manejar con cuidado los cidos y bases
concentrados,
utilizando
lentes
de
proteccin y guantes apropiados.

Universidad Francisco de Paula Santander

D. Equipos usados en laboratorio de biologa

molecular:

conocido que algunos microorganismos soportan

dicho tratamiento como los priones.

Fig 3. Fuente de poder

Fuente de poder: Brinda la energa necesaria para

que ocurra la electrophoresis a un determinado
voltaje.

Fig 1. Microcentrfuga

Microcentrfuga: coloca en rotacion una muestra

pequea para separa as cada una de sus fases,
(generalmente una slida y una liquida), en funcin
de la densidad.
Fig 4. Cmara de electroforesis horizontal

Cmara de electroforesis horizontal: Es utilizada

para la migracin especialmente del ADN en gel de
agarosa.

Fig.2 Autoclave

Autoclave: Dispositivo que se utiliza en los

laboratorios para esterilizar, funciona con vapor de
agua a alta presion y temperatura, evitando que el
agua ebulla a pesar de las altas temperaturas. Su
fundamento radica en que coagula las proteinas de
los microorganismos, aunque recientemente se ha
Biologa Molecular

Fig 5. Cmara de electroforesis vertical

Cmara de electroforesis vertical: Se utiliza para

la migracin de ADN y protenas y se usa gel de
poliacrilamida

Universidad Francisco de Paula Santander

Fig 8. Transiluminador UV

Fig 6. Zona de descarte BrEt

Transiluminador UV: Sirve para la observacin

del ADN despus de la migracin del gel, debido a
los rayos uv que emiten, haciendo que se detallen
las franjas del ADN migrado.

Zona de descarte BrEt: En esta zona se descarta

todo el bromuro de etidio utilizado en la prctica, ya
que este compuesto es mutagnico.

Fig. 9. Vortex

Vortex: Es un equipo mezclador, se utiliza para

agitar pequeos tubos con lquido a manera de
vrtice.
E. Reactivos peligrosos en el laboratorio de biologa
molecular:

Fig 7. Incubadora

Incubadora: Es un equipo cerrado que permite

controlar la temperatura, humedad y otras
condiciones necesarias para el desarrollo de un
cultivo microbiologco.

Biologa Molecular

cido actico: peligroso por inhalacin,

manejar con guantes y lentes.
cido clorhdrico: voltil y puede ser fatal
en caso de inhalacin. Se debe utilizar
guantes apropiados y lentes de proteccin y
manipular con extrema precaucin.
Acrilamida: Potente neurotxico que se
absorbe por la piel; evitar inhalar, usar
guantes y tapabocas.
Azul de bromofenol: peligroso por
inhalacin, ingestin o absorcin por la piel.
Usar guantes apropiadas, lentes.

Universidad Francisco de Paula Santander

Bromuro de etidio: potente mutagnico y

txico. Evitar respirar el polvo, utilizar
guantes de nitrilo.
Cloroformo: Compuesto altamente voltil e
irritante, carcingeno. Evitar respirar los
vapores.
Etanol: peligroso por inhalacin, ingestin o
absorcin por la piel. Usar guantes, lentes.
Fenol: Extremadamente txico, altamente
corrosivo y puede causar severas
quemaduras. Peligroso por inhalacin,
ingestin y absorcin por la piel.
Hidrxido de sodio: Altamente txico y
caustico.
Luz UV: Peligroso y puede daar la retina
de los ojos. Es mutagnico y carcinognica.
Tetrametiletilendamina
(TEMED):
Extremadamente destructivo para tejidos,
mucosas y tracto respiratorio, ojos y piel. Su
inhalacin puede ser fatal, puede causar
irritacin o quemaduras.
Tris: peligroso por inhalacin y absorcin
por la piel.
Xilencianol: Inflamable y narctico a altas
concentraciones. Peligroso por inhalacin y
absorcin. Apartar del calor, chispas y
flamas.

V.

DISCUSIONES Y CONCLUSIONES

Como resultado obtenemos el conjunto de

normas que se deben seguir dentro de un
laboratorio para evitar el mnimo riesgo de
peligros o accidentes que puedan ocurrir;
para esto nace la bioseguridad, que es la
encargada de proteger a todo el grupo de
trabajo dentro de un laboratorio.
Como medida obtenemos una serie de
sugerencias para trabajar antes, durante y
despus dentro en un laboratorio, logrando
evitar que ocurra cualquier tipo de riesgo.
Como conclusin, segn el pas donde nos
encontremos, se rigen y establecen pautas y
recomendaciones para tener un ambiente
controlado, en nuestro caso el real decreto

Biologa Molecular

486/1997 del 14 de abril nos brinda las

normas mnimas de seguridad y salud de los
lugares de trabajos. Adems el real decreto
664/1997 del 12 de mayo dentro del marco
normativo de la ley 31/1995 del 8 de
noviembre me define a toda entidad
microbiolgica, celular o no, capaz de
reproducirse o de transferir material gentica
(bacterias, hongos, virus y protozoos).
Podemos concluir que segn al tipo de
laboratorio en el que nos encontremos, el
nivel de bioseguridad ser ms estricto en
algunos casos que en otros.
Para evitar una gran cantidad de riesgos,
debemos
saber
de
antemano
el
funcionamiento y manejo adecuado de los
equipos, as como los reactivos a utilizar.
REFERENCIAS

[1] ICRA. Electroforesis y Fotodocumentador [en lnea].

<http://www.icra.cat/files/equipament/SCT-UTBM
%2003_2.pdf> [citado en 2 de septiembre de 2014]
[2] UNIVERSIDAD NACIONAL DE ROSARIO.
BIOSEGURIDAD [en lnea].
<http://www.fbioyf.unr.edu.ar/evirtual/file.php/84/Unidad
_1_-_Bioseguridad/Bioseguridad.pdf> [citado en 2 de
septiembre de 2014]
[3] UNIVERSIDAD DE ALICANTE. USO DE
TERMOCICLADOR PARA PCR [en lnea].
<http://sstti.ua.es/es/instrumentacion-cientifica/unidad-degenomica-y-proteomica/uso-de-termociclador-parapcr.html> [citado en 2 de septiembre de 2014]
[4] M. Victor,. S. Xavier. Uso de chips de AND (microarrays)
en medicina: fundamentos tecnicos y procedimientos
basicos para el analisis estadistico de resultados. [en
lnea].
<http://www.sc.ehu.es/ccwbayes/docencia/mmcc/docs/div
ulgativos/UsoDeChipsDeADN.pdf> [citado en 2 de
septiembre de 2014]
[5] eHOW. Efectos secundarios del EDTA oral. [en lnea].
<http://www.ehowenespanol.com/efectos-secundariosdel-edta-oral-sobre_106060/> [citado en 2 de septiembre
de 2014]

Universidad Francisco de Paula Santander

ANEXOS
a. Consultar otras sustancias toxicas que se
utilicen en el laboratorio de Biologia
molecular.

Amoniaco: En concentraciones elevadas

irrita la garganta, inflama los pulmones,
daa las vas respiratorias y los ojos. El
amonaco puede producir irritacin de la
piel, sobre todo si la piel se encuentra
hmeda. Este compuesto es gaseoso en
condiciones atmosfricas normales siendo
poco probable su ingestin.
El EDTA: Es la abreviatura de calcio
disdico edathamil, se utiliza para tratar el
envenenamiento por plomo o mercurio.
Provoca:

Los problemas cardacos: El EDTA es un compuesto a

base de calcio que tiene el potencial de causar
arritmia en el corazn. El ritmo cardaco es
controlado por el corazn a travs de seales que
utilizan calcio para comunicarse. Esta comunicacin
es necesaria para contraer el msculo del corazn y
bombear sangre ya sea para el resto del cuerpo o a
los pulmones. Cuando el EDTA se une a los metales
txicos, puede causar una baja concentracin de
calcio en el cuerpo, dejando el corazn con menos
calcio para generar seales, desarrollando as
arritmia.

Biologa Molecular

La diabetes: El EDTA puede interactuar con

los receptores de insulina. La insulina es una
hormona que almacena la glucosa como energa en
el cuerpo. El EDTA afecta especficamente a los
receptores de insulina que se encuentran en el
corazn. Esto no afecta el nmero de receptores
pero disminuye la afinidad de insulina al receptor
a la mitad de los receptores en el tejido cardaco.
Al igual que todos los msculos del cuerpo, el
corazn utiliza la glucosa como energa. Los
diabticos deben tener cuidado cuando toman
EDTA, ya que pueden empeorar su condicin.
B.
Problemas de rin y del hgado: El EDTA
soluble en agua se filtra a travs de los riones y
se excreta en la orina. Las personas con
enfermedad renal deben tener cuidado porque la
concentracin de EDTA ser mayor en el cuerpo
ya que el rin necesita ms tiempo para filtrar el
producto en estos individuos. La sobrecarga del
rin es peligrosa y puede empeorar la
insuficiencia renal. Desequilibrio de electrolitos: El
EDTA puede causar un desequilibrio electroltico
en el cuerpo mientras se une a metales txicos. Si
una persona ya tiene niveles bajos de potasio o
magnesio, el ETDA se puede unir al magnesio o al
potasio causando que los niveles de sangre
disminuyan an ms. Los niveles bajos de potasio
pueden causar arritmia cardiaca debido a que el
corazn utiliza potasio durante la conduccin de la
seal.
C.
La reactivacin de la tuberculosis: La infeccin de
la tuberculosis en los pulmones conduce a una
formacin de masas conocida como un granuloma,
que est formada por la respuesta inmune del
cuerpo para contener la infeccin bacteriana. El
calcio se utiliza para mantener la masa junta. El
EDTA se puede unir al calcio extra del cuerpo
incluyendo al calcio del granuloma de la
tuberculosis. Esto causar la liberacin de las
bacterias activas en el cuerpo.
A.

Universidad Francisco de Paula Santander

Reacciones alrgicas: Al igual que la mayora

de las drogas, el EDTA tambin puede causar
reacciones alrgicas en algunas personas. La
reaccin alrgica se presenta como erupcin
cutnea, picazn, enrojecimiento, hinchazn y
edema.
D.

b. Consultar el uso de los siguientes equipos y

mencinelos:

escasas cantidades de DNA que an no se ha

degradado.
Estudios evolutivos: establecimiento de
relaciones filogenticas de diferentes
especies
vegetales,
animales
y
microorganismos.

Fotodocumentador de geles: La separacin

de las molculas de ADN, procesadas en el
gel de la electroforesis es visualizada y
capturada
en
un
sistema
de
fotodocumentador mediante la adicin de un
colorante especfico que las hace visibles.
En el caso de los genes de agarosa, se le
aade bromuro de etidio, sustancia que se
intercala entre las bases del ADN y cuando
se ilumina con la luz ultravioleta emite
fluorescencia permitiendo la observacin de
ADN y de los marcadores del peso
molecular. La imagen del gel de agarosa es
registrada mediante una cmara digital.

Secuenciador automtico: Con este equipo

podemos determinar el orden de las bases de
los nucletidos en cualquier molcula dada.
Un secuenciador de ADN automtico
inyecta lotes de ADN, de forma automtica,
en la parte superior del gel. Como tal, le
ahorra a los investigadores una enorme
cantidad de tiempo y esfuerzo. Despus
de que los lotes se inyectan, el secuenciador
aplica automticamente una carga negativa a
un extremo del tanque, haciendo que las
hebras migren a distancias variables a travs
del gel. Las diferentes distancias reflejan los
diferentes tamaos de hebras de ADN que
pasan a travs del gel.
Microarrays: Tambien son llamados chip de
ADN, es una superficie slida a la cual se
une una coleccin de fragmentos de ADN.
Las superficies empleadas para fijar el ADN
son muy variables y pueden ser de vidrio,
plstico e incluso de silicio. Los chips de

Termociclador de tiempo real: Teniendo en

cuenta que la PCR (reaccin en cadena de la
polimerasa) consiste en la amplificacin de
fragmentos de DNA mediante el uso de la
enzima DNA polimerasa. Esta enzima tiene
capacidad para sintetizar nuevas cadenas de
DNA mediante la incorporacin de bases
nucleotdicas, a partir de una secuencia corta
conocida (oligo, cebador o primer) que
hbrida de forma complementaria con uno de
los extremos de la hebra. El crecimiento de
la nueva hebra se realiza en sentido 5 a 3.
Los actuales termocicladores son capaces de
realizar rpidos cambios de temperatura que
permiten realizar los tres pasos de la
reaccin de PCR de forma cclica:
desnaturalizacin del DNA, alineamiento o
unin del cebador con la secuencia de DNA
complementaria y extensin de la cadena.
Algunos usos de este equipo son:

La PCR de punto final permite detectar y

controlar fragmentos de ADN de inters
(tcnica de clonaje, recombinacin dirigida,
etc.).
Medicina: Como herramienta de diagnosis,
como por ejemplo, el genotipado de especies
que provocan un determinado cuadro
infeccioso y en el diagnstico de
enfermedades hereditarias presentes en el
genoma.
Paleontologa, antropologa biolgica y
ciencias forenses: permite recuperar las
Biologa Molecular

Universidad Francisco de Paula Santander

ADN se usan para analizar la expresin

diferencial de genes, y se monitorean de
manera simultnea los niveles de miles de
ellos.
Su
funcionamiento
consiste,
bsicamente, en medir el nivel de
hibridacin entre la sonda especfica, y la
molcula diana, y se indican generalmente
mediante fluorescencia y a travs de un
anlisis de imagen, lo cual indica el nivel de
expresin del gen. Suelen utilizarse para
identificar genes con una expresin
diferencial en condiciones distintas.
c. Consultar acerca de las seales que se deben
tener en el laboratorio de gentica y biologa
molecular.
Tcnicamente se debe entender por sealizacin de
seguridad y salud: el conjunto de estmulos que
pretenden condicionar, con la antelacin mnima
necesaria, la actuacin de aquel que los recibe
frente a unas circunstancias que se pretende resaltar.
Hemos de tener en cuenta las siguientes
indicaciones:

Biologa Molecular