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PIRACICABA
Estado de So Paulo Brasil
Maio-2005
PIRACICABA
Estado de So Paulo - Brasil
Maio-2005
Permitida a cpia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte O autor
DEDICATRIA
DEDICO
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Cludio Rosa Gallo, pela oportunidade, ensinamentos, orientao, amizade e
confiana na realizao deste trabalho e pelo enorme exemplo profissional;
Ao Prof. Dr. Ernani Porto pelo apoio, incentivo e sugestes, alm da grande amizade;
s tcnicas Ceclia Nogueira, Denise Baptista e Rosalina Ocangne, pela ajuda na
realizao deste trabalho e pela confiana que sempre depositaram em mim;
Ao Laboratrio de Microbiologia de Alimentos da ESALQ/USP pela contribuio com os
materiais utilizados;
Profa Dra Marlia Oetterer, pelo incentivo e confiana na minha capacidade em realizar o
mestrado;
Profa Dra Gilma Lucazechi Sturion, pela grande contribuio nas correes do meu
trabalho;
Dra Maria Fernanda (ITAL) pela grande ajuda e sugestes no trabalho;
s bibliotecrias, Bia e Midiam pelo constante apoio e preocupao com o meu trabalho;
Lia pela ateno e auxlio nas tradues;
s secretrias Gislaine, Mrcia e Regina pela amizade e ateno;
Aos amigos e companheiros do curso de Mestrado em Cincia e Tecnologia de Alimentos;
SUMRIO
Pgina
LISTA DE FIGURAS.............................................................................................
ix
LISTA DE TABELAS............................................................................................. xi
RESUMO ................................................................................................................ xii
SUMMARY............................................................................................................. xiv
1 INTRODUO....................................................................................................... 1
1.1 Objetivos .............................................................................................................. 2
2 REVISO DE LITERATURA ............................................................................... 3
2.1 A importncia e a qualidade do leite.................................................................... 3
2.2 Etapas crticas para a contaminao do leite........................................................ 4
2.3 Contaminantes comuns do leite ........................................................................... 4
2.3.1 Bactrias aerbias mesfilas ............................................................................. 5
2.3.2 Bactrias aerbias termfilas e psicrotrficas................................................... 6
2.3.3 O grupo coliforme ............................................................................................. 7
2.3.3.1 Coliformes totais............................................................................................. 7
2.3.3.2 Coliformes fecais............................................................................................ 8
2.3.3.3 Escherichia coli.............................................................................................. 9
2.3.4 Staphylococcus coagulase positiva ................................................................... 9
2.3.5 Salmonella......................................................................................................... 13
2.4 Inovao nos mtodos de anlise microbiolgica................................................ 15
2.4.1 O sistema SimPlate para coliformes totais e E. col ........................................ 15
2.4.2 Kits rpidos para deteco de Salmonella......................................................... 16
2.4.2.1 O kit 1-2 Test da BioControl. 16
2.4.2.2 O kit Salmonella Rapid Test da Oxoid.. 17
vii
viii
LISTA DE FIGURAS
Pgina
1
(+)
pontos
de
destruio
trmica
(x)
.........................................................................................................................
20
24
25
26
27
30
10
29
28
31
32
12
36
43
Mdias do NMP de coliformes fecais (45C) obtidas pela tcnica dos tubos
mltiplos e de E. coli pelo mtodo SimPlate, encontradas para as amostras
de leite tipos A, B, C e leite cru analisadas antes da pasteurizao no
laboratrio e aps a mesma .............................................................................
14
48
15
53
16
17
62
20
61
19
60
18
54
63
67
LISTA DE TABELAS
Pgina
1
34
34
34
4.
35
42
47
53
55
58
66
9
10
RESUMO
O leite um dos alimentos mais completos da natureza e sua importncia
baseada em seu elevado valor nutritivo, como riqueza de protenas, vitaminas, gordura,
sais minerais e a alta digestibilidade. Esses fatores so relevantes para consider-lo um
excelente meio de cultura para a maioria dos microrganismos. A pasteurizao
necessria e tem a finalidade de eliminar os microrganismos patognicos, alm de
diminuir ao mximo o nmero de microrganismos em geral, mas alguns deles ainda
podem sobreviver ao tratamento trmico aplicado. O objetivo do presente trabalho foi
avaliar a condio microbiolgica e a eficcia da pasteurizao industrial do leite tipos
A, B, C e as condies microbiolgicas do leite cru, atravs da enumerao de bactrias
aerbias mesfilas, termfilas e psicrotrficas, Staphylococcus coagulase positiva,
determinao do Nmero Mais Provvel (NMP) de coliformes totais e fecais e pesquisa
de Salmonella spp. em 30 amostras de leite comercializado no municpio de PiracicabaSP. Com base na legislao do DIPOA (Brasil, 2002) os resultados mostraram que
44,4% das amostras de leite tipo A apresentaram-se fora do padro microbiolgico para
aerbios mesfilos. Para coliformes totais e fecais, o mesmo leite apresentou 66,7% e
xiii
SUMMARY
Milk is one of the most valuable of all foods in nature and its importance is
based on its high nutritive value. Milk is rich in proteins, vitamins, fat, mineral salts, and
high digestibility. These factors are relevant for it to be considered an excellent culture
medium for most microorganisms. Pasteurization is necessary and its main purpose is to
eliminate pathogenic microorganisms, in addition to reducing to the maximum the
number of microorganisms in general. However, some of them may still outlive the
thermal treatment applied. The aim of this project was to evaluate the microbiological
conditions and efficiency of the industrial pasteurization of type-A,-B and-C milk, and
the microbiological conditions of raw milk, through the number of mesophillic,
thermophilic and psychrotrophic aerobe bacteria, Staphylococcus positive coagulase,
through the determination of the Most Probable Number (MPN) of total and fecal
coliforms, and also through the research on Salmonella spp. in 30 samples of milk
commercialized in Piracicaba-SP. Based on DIPOA legislation (Brazil, 2002), the results
showed that 44.4% of the type-A milk samples did not meet the microbiological
standard for mesophillic aerobe for total and fecal coliforms, 66.7% and 55.6% of the
same milk samples, respectively, were not in accordance with the present legislation. For
xv
the type-B milk, no sample failed to meet the microbiological standard in relation to
mesophillic aerobes. However, for total and fecal coliforms, 33.3% of the samples were
in disagreement with the present legislation. Type-C milk was the one presenting the
best result. All samples were in accordance with the microbiological analysis performed
in this work. The raw milk examined showed high values for all microbiological
analyses. No infected samples with Salmonella spp. were found in the analyzed milk
samples. The greatest value found for Staphylococcus positive coagulase was 1.1 x 102
UFC/mL, thus, far from the infective dose, although somewhat concearning since milk is
considered na excellent environment for the infestation of bacteria. After the
pasteurization (62.8C/30) performed in the Food Microbiology Laboratory, of the
Agroindustry, Foods and Nutrition Department, ESALQ/USP, all samples that analyzed
again, based on the microbiological parameters mentioned above, met the national
legislation in force (Brazil, 2002). The results found in the research may be an indication
of probable failures regarding time/temperature during the industrial pasteurization;
infected raw-material; defecient sanitation of product lines or post-pasteurization
contamination.
1 INTRODUO
O leite um alimento que possui um perfeito balano de nutrientes,
fornecendo ao homem macro e micronutrientes indispensveis ao crescimento,
desenvolvimento e manuteno da sade. Como fonte de protenas, lipdeos,
carboidratos, minerais e vitaminas, torna-se um dos alimentos mais vulnerveis a
alteraes fsico-qumicas e deteriorao por microrganismos. Estes contaminantes
podem causar modificaes fsico-qumicas e organolpticas, que limitam a durabilidade
do leite e seus derivados, alm de problemas econmicos e de sade pblica (Freitas et
al., 2002; Lopez & Stamford, 1997; Souza & Cerqueira, 1996).
O Brasil apresenta grande potencial no consumo e na produo de lcteos.
Apresenta uma das maiores taxas de crescimento na produo e vem participando do
mercado exterior de forma incipiente. Apresenta tambm rea disponvel e uma
diversidade de sistemas de produo viveis. Alm disso, devem-se considerar as boas
relaes diplomticas com os principais mercados importadores, como os do Oriente
Mdio e Norte da frica, possuindo uma cultura exportadora de agronegcio mundial
(FNP, 2004).
No Brasil, apesar do desenvolvimento tecnolgico atingido em certos
laticnios, persistem ainda em nvel de produo de leite, graves problemas que
depreciam a matria-prima, que impedem o seu beneficiamento para consumo in
natura ou tornam o produto beneficiado imprprio para o consumo humano, mesmo
nas regies onde a pecuria leiteira tradicional (Fonseca, 1998; Freitas et al., 2002;
Nader Filho et al., 1997).
1.1 Objetivos
O presente trabalho teve como objetivos:
Avaliar as condies microbiolgicas e de pasteurizao em amostras de
leite comercializadas no municpio de Piracicaba-SP;
Avaliar o mtodo SimPlate em comparao com o mtodo convencional
(NMP - tubos mltiplos) para enumerao de bactrias do grupo coliforme em amostras
de leite pasteurizado tipos A, B, C e leite cru;
Avaliar a eficcia da pasteurizao realizada no Laboratrio de
Microbiologia de Alimentos do Departamento de Agroindstria, Alimentos e Nutrio
da ESALQ/USP.
.
2 REVISO DE LITERATURA
humano. Esse fator inviabiliza a rpida identificao e imediata correo das provveis
falhas no processo de beneficiamento. At mesmo nas grandes usinas de beneficiamento,
subordinadas fiscalizao diria e permanente do Servio de Inspeo Federal, podem
surgir problemas relativos qualidade do leite pasteurizado (Nader Filho et al., 1997).
Vale notar que o comrcio informal de leite uma grande ameaa sade
pblica. Segundo a Organizao Mundial de Sade (OMS), dezesseis doenas
bacterianas e sete virticas so veiculadas pelo produto comercializado nessas
condies, dentre elas, a tuberculose e gastroenterites, conseqentes da baixa qualidade
do leite (Agnese, 2002).
presena de infeces do bere causada por certas espcies deste grupo e tambm avaliar
a eficincia da pasteurizao, j que o grupo de microrganismos coliformes totais e
fecais considerado indicador das condies higinicas da produo e beneficiamento
do leite pasteurizado.
A utilizao do grupo coliforme como indicador das condies higinicosanitrias em alimentos, prtica estabelecida h muitos anos. Dos agentes bacterianos,
os coliformes so internacionalmente considerados microrganismos indicadores da
segurana microbiolgica de alimentos (Bonassi, 1984; Frazier & Westhoff, 1993;
Nascimento et al., 1991; Rogick, 1987; Vanderzant & Splittstoesser, 1992).
10
fsico-qumicas
das
enterotoxinas
estafiloccicas
apresentam
similaridades entre si, que podem assim ser resumidas: constituem protenas simples de
peso molecular situado entre 26.000 a 29.000 D e estruturadas em uma nica cadeia
polipeptdica rica em lisina, tirosina e cidos asprtico e glutmico. No estado ativo, as
enterotoxinas resistem ao de enzimas proteolticas como pepsina, tripsina,
quimiotripsina, papana e renina.
11
12
13
2.3.5 Salmonella
O gnero Salmonella, descrito por Lignires em 1900, em homenagem ao
bacteriologista americano D.E. Salmon que, juntamente com Theobald Smith em 1894
isolaram a Salmonella choleraesuis, pertence famlia Enterobacteriaceae (Le Minor,
1984).
As salmonelas tm a forma de bastonetes curtos, medindo de 0,7 - 1,5 x 2,0 5,0 micra. So bactrias Gram-negativas; no esporuladas; mveis por meio de flagelos
peritrquios (exceto S. gallinarum e S. pullorum); anaerbias facultativas, mas que
podem crescer em meio comum na presena de oxignio livre; produzem catalase;
utilizam o citrato como fonte de carbono (exceto S. typhi e S. paratyphi A); reduzem o
nitrato a nitrito; produzem cido e gs a partir da glicose; geralmente produzem sulfeto
de hidrognio em Agar Trplice Acar-Ferro; fermentam o dulcitol, porm no
14
15
16
registrado como positivo para coliformes. As cavidades que fluorescem azul quando
expostas a comprimento de onda ultravioleta (365nm) so registradas como positivas
para E. coli. O nmero de cavidades positivas convertido em Nmero Mais Provvel
(NMP) de coliformes ou E. coli (Townsend et al., 1998).
17
18
Salmonella,
Campylobacter,
Staphylococcus,
Brucella,
Yersinia,
Shigella,
19
para leite beneficiado em entrepostos, usinas (tipo C) e em granjas leiteiras (tipo A) foi
maior (p>0,05) do que a do leite submetido pasteurizao lenta (LTLT) em banhomaria (integral/fazenda) (Souza & Cerqueira, 1996).
Segundo Furtado (1988) e Sbampato (1998), o leite pasteurizado pelo sistema
ejetor de vapor apresentou teores mais elevados de cidos graxos livres, os glbulos de
gordura apresentaram-se menos aglomerados, o soro apresentou menor perda de
gordura, alm do maior rendimento de fabricao L de leite/ Kg de queijo, quando
comparado com a pasteurizao pelo sistema HTST.
20
Tanque de
estocagem
PCC 2
Padronizao e
Homogeneizao
Pasteurizao
x PCC 1
e Refrigerao
Tanque de
estocagem
+
PCC 2
PCC 2
Envase
Cmara
+
frigorfica
Expedio
21
Leite Tipo A
Produzido em granja leiteira, com rebanho acompanhado por veterinrio do
Servio de Inspeo. Deve ser pasteurizado e resfriado imediatamente aps a ordenha,
que obrigatoriamente mecnica. Imediatamente aps a pasteurizao o produto assim
processado deve apresentar teste qualitativo negativo para fosfatase alcalina e teste
positivo para peroxidase. O leite deve ser resfriado e transportado temperatura de 4C.
O leite A pode ser dividido em:
- Leite Pasteurizado tipo A Integral;
- Leite Pasteurizado tipo A Padronizado;
- Leite Pasteurizado tipo A Semidesnatado;
- Leite Pasteurizado tipo A Desnatado;
Leite Tipo B
Produzido em estbulo leiteiro, com rebanho acompanhado por veterinrio do
Servio de Inspeo. Aps a ordenha pode ser resfriado e transportado para ser
pasteurizado em usinas de beneficiamento ou entreposto-usina, num perodo de 3 horas
aps a ordenha. Este prazo pode ser prolongado por mais 2 horas, desde que o leite tenha
sido resfriado temperatura de 70C. Imediatamente aps a pasteurizao, o produto
assim processado deve apresentar teste qualitativo negativo para fosfatase alcalina e
teste positivo para peroxidase.
O leite B pode ser dividido em:
- Leite cru Refrigerado tipo B;
- Leite Pasteurizado tipo B Integral;
22
Leite tipo C
O leite cru tipo C transportado em vasilhame adequado e individual de
capacidade at 50 litros e entregue em estabelecimento industrial adequado at as 10:00
h do dia de sua obteno, em temperatura ambiente. Aps ser entregue em posto de
refrigerao de leite ou estabelecimento industrial adequado, mantido em temperatura
igual ou inferior a 4C. Este leite, aps sofrer refrigerao em posto de refrigerao,
permanece estocado no perodo mximo de 24 h, sendo remetido em seguida ao
estabelecimento beneficiador. Em um perodo mximo de 12 h, o leite transportado
para outra indstria, visando processamento final, onde deve apresentar, no momento do
seu recebimento, temperatura igual ou inferior a 7C. Imediatamente aps a
pasteurizao, o produto assim processado deve apresentar teste negativo para fosfatase
alcalina e teste positivo para peroxidase.
O leite tipo C dividido em:
- Leite cru tipo C;
- Leite cru Refrigerado tipo C;
- Leite Pasteurizado tipo C Integral;
- Leite Pasteurizado tipo C Padronizado;
- Leite Pasteurizado tipo C Semidesnatado;
- Leite Pasteurizado tipo C Desnatado.
3 MATERIAL E MTODOS
3.1 Amostragem
As amostras de leite pasteurizado dos tipos A, B e C, foram obtidas em
diferentes pontos de venda no municpio de Piracicaba-SP. As coletas foram efetuadas
em estabelecimentos comerciais de pequeno, mdio e grande portes, em diferentes
bairros com alternncia a cada amostra. Foram coletadas 3 amostras para cada uma das 3
marcas de leite para cada tipo do produto. Essas amostras sofreram uma nova
pasteurizao no Laboratrio de Microbiologia de Alimentos do Departamento de
Agroindstria, Alimentos e Nutrio da ESALQ-USP, para se verificar a eficincia deste
tratamento trmico, quando comparado a pasteurizao industrial aplicada s amostras
coletadas.
Tambm foi avaliada a qualidade microbiolgica do leite cru, valendo
ressaltar que nos locais de coleta das amostras de leite pasteurizado, no
comercializado o produto cru.
3.2 Metodologia
As amostras foram analisadas de acordo com a metodologia padro descrita
por: Vanderzant & Splittstoesser, 1992 e Association of Official Analytical Chemists
(AOAC, 2000).
24
25
50 mL
10 mL
450 mL H2O
peptonada
(10-1)
10 mL
10 mL
10 mL
90 mL
90 mL
90 mL
H2O pept. H2O pept. H2O pept.
(10-2)
(10-3)
(10-4)
90 mL
H2O pept.
(10-5)
26
10-1
10-2
1 mL 1 mL
10-3
10-4
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
10-5
1 mL 1 mL
Estufa
35C / 48h
Estufa
50C / 48h
PCA
Incubadora
7C / 10 dias
27
10-1
10-2
10-3
Estufa
35C / 24-48h
positivo
EC
confirmativo
(C. fecais)
positivo
positivo
Banho-maria
45C / 24h
28
3.6 Numero Mais Provvel de coliformes totais e E. coli pelo sistema SimPlate
As placas foram inoculadas usando diluies 100 e 10-1. Foi inoculado 1mL
das diluies no centro da placa e adicionados 9mL de meio de cultura especfico para
coliformes totais e E. coli. As placas foram homogeneizadas e o excesso de meio de
cultura descartado; a seguir foram invertidas e incubadas a 35C por 24 horas. Aps o
perodo de incubao, as cavidades das placas que apresentavam colorao de laranja
prpura eram contadas para a estimativa do NMP de coliformes totais. A seguir, as
placas eram expostas luz UV(365nm) e as cavidades que apresentavam fluorescncia
eram contadas para a estimativa do NMP de E. coli (Figura 7). O nmero de cavidades
positivas presentes no SimPlate foi transformado em NMP de coliformes totais e
E.coli/mL de leite, atravs de consulta Tabela prpria do mtodo.
29
30
50 mL
10 mL
450 mL H2O
peptonada
0,4 mL
0,3 mL
0,3 mL 0,1 mL
90 mL
H2O pept.
(10-1)
(10-2)
0,1 mL
0,1 mL
Estufa
BPA
35C / 24-48h
Teste de
coagulase
Colorao
de Gram
31
32
Pr
enriquecimento
25 mL
Estufa
35C / 24h
225 mL
0,1 mL
caldo
lactosado
Observao
imunobanda
Estufa
1-2 Test
35C / 14-30h
4 RESULTADOS E DISCUSSO
34
Contagem Total de
Mesfilos
(UFC/mL)
Coliformes Fecais
(NMP/mL)
Salmonella (25mL)
A
Antes da Aps Past
Past
1,0x104
5,0x102
Leite
B
Antes da Aps Past
Past
5,0x105
4,0x104
Demais Tipos
Antes da Aps Past
Past
_
1,5x105
Ausncia em 1mL
Ausncia
Ausncia
Ausncia
A
1,0 x 103
Leite
B
8,0 x 104
C
3,0 x 105
<1
Ausncia
Ausncia
Ausncia
Ausncia
Leite Pasteurizado
1-4
Ausncia
35
Amostras
AI1
AI2
AI3
A II 4
A II 5
A II 6
A III 7
A III 8
A III 9
mdia
BI1
BI2
BI3
B II 4
B II 5
B II 6
B III 7
B III 8
B III 9
mdia
CI1
CI2
CI3
C II 4
C II 5
C II 6
C III 7
C III 8
C III 9
mdia
Cru 1
Cru 2
Cru 3
mdia
Mesfilos
3
2,2 x 10
2,9 x 103
1,6 x 106
1,9 x 103
1,0 x 103
2,6 x 102
3,6 x 102
1,7 x 102
1,7 x 102
1,8 x 105
1,1 x 104
8,7 x 103
1,6 x 104
7,2 x 102
95 x 102
9,1 x 102
1,4 x 103
1,4 x 103
1,3 x 103
4,7 x 103
3,0 x 103
6,0 x 103
8,7 x 103
2,5 x 104
1,3 x 104
2,0 x 104
4,0 x 102
6,4 x 102
7,6 x 102
8,6 x 103
5,8 x 107
9,1 x 107
2,5 x 106
5,1 x 107
2,3 x 10
8,0 x 102
1,8 x 103
1,9 x 102
1,0 x 102
7,0 x 101
3,5 x 101
6,1 x 101
2,4 x 101
3,7 x 102
4,5 x 103
4,3 x 103
1,5 x 103
1,3 x 102
7,5 x 101
1,0 x 102
4,5 x 101
6,5 x 101
2,5 x 101
1,2 x 103
8,3 x 102
4,0 x 102
6,1 x 102
2,5 x 103
1,8 x 103
3,0 x 103
3,5 x 101
1,0 x 101
1,5 x 101
1,0 x 103
7,1 x 102
8,0 x 102
3,3 x 103
1,6 x 103
(UFC/mL)
1,0 x 101
0
1,6 x 102
2,5 x 101
1,0 x 101
3,6 x 101
0
1,0 x 101
0
1,1 x 102
1,5 x 101
0
0
5
1,0 x 101
1,5 x 101
1,2 x 101
1,5 x 101
1,0 x 101
9,1
0
1,5 x 101
1,0 x 101
4,5 x 101
1,0 x 101
2,0 x 101
1,3 x 102
5,5 x 101
6,5 x 101
3,9 x 101
1,5 x 101
5
4,0 x 101
2,0 x 101
Termof
Past.
Psicrotrficos
Psicrot
Past.
0
0
8,5 x 102
1,3 x 101
5
1,9 x 101
0
0
0
2,2 x 101
0
0
0
0
5
1,0 x 101
0
0
0
1,7
0
0
0
2,5 x 101
0
1,0 x 101
7,0 x 101
3,0 x 101
3,5 x 101
1,9 x 101
1,0 x 101
5
3,0 x 101
1,5 x 101
1,9 x 102
1,6 x 102
8,3 x 102
2,7 x 102
1,2 x 102
2,4 x 102
2,0 x 102
1,3 x 102
1,9 x 101
2,3 x 102
1,6 x 102
5,5 x 101
7,4 x 102
3,5 x 101
6,0 x101
1,2 x 102
3,5 x 101
1,2 x 101
6,0 x 101
1,4 x 102
2,1 x 103
4,5 x 103
1,1 x 103
7,5 x 102
5,5 x 103
8,0 x 102
1,1 x 102
7,0 x 101
4,5 x 101
1,6 x 103
1,1 x 102
6,5 x 103
8,5 x 103
5,0 x 103
1,1 x 101
6,0 x 101
2,6 x 101
0
0
0
1,5 x 101
0
0
1,2 x 101
0
0
0
0
0
0
0
5
0
0,5
1,6 x 102
1,0 x 102
1,3 x 102
6,5 x 101
9,0 x 101
4,5 x 101
1,0 x 101
5
3
6,8 x 101
0
0
5
1,7
36
10
Log x+2
0
mesfilos
mesfilos past
termfilos
termfilos past
psicrotrficos
psicrotrficos past
Aerbios
A
Cru
37
relao a que estava em vigncia em 1980. Esta amostra no seria aprovada como foi
pela legislao em vigor.
Aps a nova pasteurizao no laboratrio das amostras de leite tipos A, B e C,
somente uma amostra (11,1%) de leite tipo A apresentou valor acima do permitido pela
legislao, j que esta se encontrava muito contaminada quando foi obtida no comrcio
(1,6 x 106UFC/mL).
As 3 amostras de leite cru analisadas apresentaram contagens de mesfilos
entre 2,5 x 106 e 9,1 x 107UFC/mL. Pelos valores citados na Tabela 1, tais amostras no
estariam satisfazendo as exigncias para contagem de mesfilos em leite tipos A e B,
antes da pasteurizao. No entanto, aps a pasteurizao (62,8C/30) no laboratrio, 2
(66,7%) atenderiam aos padres DIPOA (Brasil, 2002) para leite pasteurizado tipo A e 1
(33,3%) atenderia aos padres do mesmo rgo para leite pasteurizado tipo B. Se a
comparao fosse feita com os padres RIISPOA (Brasil, 1980), as 3 amostras de leite
cru, aps a pasteurizao no laboratrio, atenderiam as especificaes para leite
pasteurizado tipo B.
No trabalho de Tavares (1996) os valores encontrados em 24 amostras de leite
pasteurizado tipo A analisadas variaram de 8,5 x 101 a 3,7 x 105UFC de mesfilos/mL.
Em 36 amostras de leite pasteurizado tipo B os valores variaram de 1,8 x 104 a 5,2 x
106UFC de mesfilos/mL e em 48 amostras de leite pasteurizado tipo C os valores
tiveram variao de 5,2 x 103 a 1,6 x 107UFC de mesfilos/mL.
Nader Filho et al. (1997) observaram que de 28 amostras de leite pasteurizado
tipo A integral analisadas, 3 (10,7%) tiveram valores de mesfilos acima dos permitidos
pela legislao.
Na presente pesquisa, os percentuais de amostras em desacordo com os
padres estabelecidos para a contagem de mesfilos em leite pasteurizado tipo A,
superaram os valores encontrados por Santos et al. (1999).
Os valores das contagens de mesfilos, realizadas por Freitas et al. (2002),
foram de 1,0 x 101 a 2,3 x 107UFC/mL em 13 amostras de leite pasteurizado tipo A
integral, 1,0 x 101 a 2,5 x 107UFC/mL em 13 amostras de leite pasteurizado desnatado,
1,0 x 101 a incontveis em 31 amostras de leite pasteurizado tipo C, 9,2 x 105 a
38
39
40
encontradas quando as contagens desses microrganismos no leite estavam entre 2,0 x 106
a 2,0 x 108UFC/mL. Pode se inferir que todas as amostras de leite analisadas neste
trabalho no deveriam ter alteraes organolpticas devido a microrganismos
psicrotrficos, pois as contagens estiveram muito abaixo das mencionadas no trabalho
citado.
Na pesquisa de Tavares (1996) os valores encontrados em 24 amostras de leite
pasteurizado tipo A variaram de 1,1 x 102 a 5,9 x 103UFC de psicrotrficos/mL. Em 36
amostras de leite pasteurizado tipo B os valores variaram de 1,2 x 102 a 4,6 x 104UFC de
psicrotrficos/mL e em 48 amostras de leite pasteurizado tipo C os valores tiveram
variao de 1,2 x 102 a 3,4 x 105UFC de psicrotrficos/mL. Tais contagens, de uma
forma geral, estiveram bem acima das encontradas na presente pesquisa.
Os psicrotrficos termodricos constituem um importante grupo de
microrganismos que, alm de multiplicarem-se bem a temperatura de refrigerao,
podem sobreviver temperatura de pasteurizao. Estes so classificados como Grampositivos formadores ou no de esporos, pertencentes principalmente ao gnero Bacillus
(Muir, 1996; Santos ,1999; Sorhaung & Stepaniak, 1997).
Normalmente, as enzimas proteolticas (termoestveis) produzidas por
psicrotrficos promovem quebra de protenas, provocando alteraes fsicas e
organolpticas que comprometem o consumo e a produo de derivados do leite
(Santos,1999; Shah,1994).
41
tipos
de
bactrias
que
possam
causar
alteraes
organolpticas
42
Tabela 5. Nmero Mais Provvel (NMP) de coliformes totais pelo mtodo convencional
(tubos mltiplos) e Simplate, obtido em amostras de diferentes tipos de leite
coletados no comrcio de Piracicaba antes e aps pasteurizao em laboratrio
Amostras Tubos Mltiplos
(NMP/mL)
AI1
<2
AI2
2
AI3
2,1 x 101
A II 4
6
A II 5
4
A II 6
2
A III 7
4
A III 8
<2
A III 9
<2
mdia
4,3
BI1
2,1 x 101
BI2
7
BI3
7,9 x 101
B II 4
<2
B II 5
<2
B II 6
<2
B III 7
<2
B III 8
2
B III 9
<2
mdia
1,2 x 101
CI1
<2
CI2
<2
CI3
<2
C II 4
2
C II 5
<2
C II 6
<2
C III 7
<2
C III 8
<2
C III 9
<2
Mdia
0,2
Cru 1
1,1 x 102
Cru 2
4,9 x 101
Cru 3
1,6 x 103
mdia
5,9 x 102
Tubos Mltiplos
Past. (NMP/mL)
<2
<2
2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
0,2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
0
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
0
<2
<2
<2
0
SimPlate
(NMP/mL)
<2
6
7,3 x 101
8
4
2
4
<2
<2
1,1 x 101
3,2 x 101
1,2 x 101
9,6 x 101
<2
<2
<2
<2
2
<2
1,6 x 101
<2
<2
<2
2
<2
<2
<2
<2
<2
0,2
2,6 x 101
2,2 x 101
7,4 x 102
2,6 x 102
SimPlate
Past.(NMP/mL)
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
0
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
0
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
0
<2
<2
<2
0
43
3
2,5
Log x+2
2
1,5
1
0,5
0
tubos mltiplos
simplate
simplate past
Mtodos
A
CRU
44
45
46
47
Tubos
Mltiplos
(NMP/mL)
Tubos Mltiplos
Past. (NMP/mL)
SimPlate
(NMP/mL)
SimPlate
Past.(NMP/mL)
AI1
AI2
AI3
A II 4
A II 5
A II 6
A III 7
A III 8
A III 9
mdia
BI1
BI2
BI3
B II 4
B II 5
B II 6
B III 7
B III 8
B III 9
mdia
CI1
CI2
CI3
C II 4
C II 5
C II 6
C III 7
C III 8
C III 9
mdia
Cru 1
Cru 2
Cru 3
mdia
<2
2
2,8 x 101
4
4
4
<2
<2
<2
4,7
1,4 x 101
6
2,4 x 101
<2
<2
<2
<2
<2
<2
4,9
<2
<2
<2
2
<2
<2
<2
<2
<2
0,2
4,6 x 101
2,2 x 101
9,2 x 102
3,3 x 102
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
0
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
0
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
0
<2
<2
<2
0
<2
<2
2,1 x 101
2
2
2
<2
<2
<2
3
1,0 x 101
4
1,7 x 101
<2
<2
<2
<2
<2
<2
3,4
<2
<2
<2
2
<2
<2
<2
<2
<2
0,2
1,2 x 101
8
3,7 x 102
1,3x 102
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
0
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
0
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
0
<2
<2
<2
0
48
3,5
3
Log x+2
2,5
2
1,5
1
0,5
0
tubos mltiplos
simplate
simplate past
Mtodos
A
CRU
Figura 13 Mdias do NMP de coliformes fecais (45C) obtidas pela tcnica dos tubos
mltiplos e de E. coli pelo mtodo SimPlate, encontradas para as amostras
de leite tipos A, B, C e leite cru analisadas antes da pasteurizao no
laboratrio e aps a mesma
49
50
51
52
53
claro que os coliformes fecais estimados pela tcnica dos tubos mltiplos se referiam
quase que exclusivamente a E. coli, que a bactria coliforme fecal detectada pela
tcnica do SimPlate.
Barancelli (2002) ao realizar anlise estatstica para comparao desses dois
mtodos para coliformes totais, encontrou em 27 amostras analisadas, coeficiente de
correlao 0,95, coeficiente angular 0,93 e coeficiente linear 0,36. Em comparao com
a presente pesquisa, os valores foram semelhantes.
Tabela 7. Resumo das comparaes estatsticas entre os mtodos NMP (tubos mltiplos)
e SimPlate para contagem de coliformes totais e fecais/E. coli nas amostras
de leite tipos A, B, C e cru
Medida
Tubos mltiplos x
Tubos mltiplos x
de performance
SimPlate (Totais)
Coeficiente de correlao
0,9289
0,9711
Coeficiente angular
0,9015
0,8110
Coeficiente linear
0,0761
0,038
Nmero de amostras
30
30
3,5
Simplate
2,8
2,1
1,4
y = 0,9015x + 0,0761
2
R = 0,9289
0,7
0
0
0,7
1,4
2,1
2,8
3,5
Tubos mltiplos
Figura 14 Disperso dos resultados das contagens (NMP) de coliformes totais em leite
tipos A, B, C e cru obtidos pelos mtodos NMP (tubos mltiplos) e
SimPlate
54
3,5
Simplate
2,8
2,1
1,4
y = 0,811x + 0,038
2
R = 0,9711
0,7
0
0
0,7
1,4
2,1
2,8
3,5
Tubos mltiplos
Figura 15 - Disperso dos resultados das contagens (NMP) de coliformes fecais/E. coli
em leite tipos A, B, C e cru obtidos pelos mtodos NMP (tubos mltiplos) e
SimPlate
55
56
57
58
Amostras
analisadas
Padres Bacteriolgicos
Amostras
em
desacordo
Contagem
Padro
4 (44,4%)
Coliformes
Totais
6 (66,7%)
Coliformes
Fecais
5 (55,6%)
Salmonella
0
15 (41,7%)
3 (33,3%)
3 (33,3%)
6 (16,7%)
0 (0%)
59
pois todas as amostras seriam aprovadas no caso de uma inspeo. Normalmente este
tipo de leite pode ser produzido em qualquer tipo de propriedade, com inspeo
peridica do rebanho. A ordenha normalmente manual e o resfriamento do leite no
obrigatrio. Tambm, no h meno de tempo mximo entre ordenha e transporte para
o beneficiamento.
H que se levar em conta que o maior ndice de reprovao das amostras do
leite tipo A, tem como uma das causas a maior exigncia da legislao em relao aos
outros tipos de leite. Porm, vale salientar que o consumidor pagou mais caro
(praticamente o dobro do preo) pelo leite do tipo A. O valor em reais (R$) do leite tipo
A varia nos estabelecimentos comerciais, mas em mdia o preo R$ 1,90/litro. O leite
tipo C custa de R$ 0,80 a R$ 1,00. Pelo fato dos padres microbiolgicos para o leite C
serem menos rigorosos, teoricamente mais fcil de se manter dentro dos padres.
Ainda pode ser discutido que um leite tipo A rejeitado ou fora dos padres no
necessariamente um leite de pior qualidade microbiolgica que um leite tipo C dentro
das normas. Mas de qualquer maneira, as pessoas esto comprando leite A esperando
uma qualidade superior e que no est sendo mantida, se forem observados os resultados
da presente pesquisa.
Ainda, existem especificaes e medidas a serem adotadas para a obteno de
um leite tipo A e que se forem rigorosamente seguidas, o produto ir atender as
exigncias legais. Portanto, no se justifica que um % to elevado de amostras de leite
pasteurizado tipo A no tenha se apresentado em acordo com os padres
microbiolgicos vigentes no pas.
Em relao contagem de bactrias mesfilas aerbias, somente as amostras
do leite tipo A apresentaram valores acima dos tolerados, com 44,4% das amostras em
desacordo com os padres estabelecidos pelo DIPOA (Brasil, 2002) e 55,6% em
desacordo com os padres do RIISPOA (Brasil, 1980). Diferentemente do esperado, as
amostras de leite tipo C analisadas, mostraram-se em vrios parmetros microbiolgicos,
em melhores condies do que amostras de leite tipos A e B (Figuras 16, 17 e 18).
Em relao s anlises realizadas para a enumerao do nmero mais provvel
de coliformes totais, 66,7% das amostras de leite pasteurizado tipo A, 33,3% das
60
amostras de leite tipo B e nenhuma das amostras de leite tipo C, estiveram em desacordo
com os padres mencionados pelo Departamento de Inspeo de Produtos de Origem
Animal - DIPOA (Brasil, 2002) (Figuras 16, 17 e 18).
A enumerao de coliformes fecais mostrou que 55,6% das amostras de leite
A, 33,3% das amostras de leite B e nenhuma das amostras de leite C, estavam com
valores acima dos tolerados pelos padres legais vigentes (Figuras 16, 17 e 18).
61
62
63
64
65
66
Tabela 10. Eficcia da pasteurizao (log) realizada no laboratrio, das amostras de leite
tipos A, B, C e cru obtidas no comrcio de Piracicaba
Amostras
AI1
AI2
AI3
A II 4
A II 5
A II 6
A III 7
A III 8
A III 9
mdia
BI1
BI2
BI3
B II 4
B II 5
B II 6
B III 7
B III 8
B III 9
mdia
CI1
CI2
CI3
C II 4
C II 5
C II 6
C III 7
C III 8
C III 9
mdia
Cru 1
Cru 2
Cru 3
mdia
Mesfilos
0,97
0,56
2,95
0,99
0,11
0,56
0,99
0,43
0,82
1,03
0,39
0,30
1,03
0,74
1,09
0,95
1,47
1,32
1,68
0,99
0,56
1,17
1,15
0,99
0,85
0,82
1,03
1,73
1,65
1,11
4,91
5,05
2,88
4,28
Termfilos
0,77
0
0,72
0,25
0,23
0,25
0
0,78
0
0,41
0,93
0
0
0,54
0,23
0,15
0,84
0,93
0,78
0,49
0
0,93
0,78
0,24
0,78
0,26
0,26
0,25
0,26
0,42
0,15
0
0,12
0,09
Psicrotrficos
1,17
0,42
1,47
2,13
1,78
2,00
1,07
1,82
1,02
1,43
1,91
1,45
2,57
1,27
1,49
1,78
1,27
0,84
1,49
1,56
1,11
1,64
0,92
1,05
1,77
1,23
0,97
1,01
0,97
1,19
1,75
3,51
3,08
2,78
67
4,5
Log x+2
3,6
2,7
1,8
0,9
0
mesfilos
termfilos
psicrotrficos
Aerbios
A
Cru
68
5 CONCLUSES
1 O nmero de amostras acima do limite estabelecido pelo DIPOA (Brasil, 2002) para
microrganismos mesfilos do leite tipo A (44,4%), foi maior em relao s amostras
de leite tipos B (0,0%) e C (0,0%).
2 Embora sem padres legais vigentes atualmente, as contagens de psicrotrficos (1,2 x
101 a 8,5 x 103UFC/mL) e de termfilos (<10 a 1,6 x 102UFC/mL), encontradas nas
amostras de leite pasteurizado tipos A, B, C e leite cru analisadas, foram baixas.
3 Utilizando-se a metodologia dos tubos mltiplos, 6 (66,7%) amostras de leite tipo A,
3(33,3%) amostras de leite tipo B e 0 (0,0%) amostras de leite tipo C, apresentaram
NMP de coliformes totais acima dos padres estabelecidos pelo DIPOA (Brasil,
2002). Quando a metodologia SimPlate foi utilizada, os mesmos percentuais de
amostras analisadas foram encontrados como fora dos padres do referido rgo.
4 Utilizando-se a metodologia dos tubos mltiplos, 5 (55,6%) amostras de leite tipo A,
3 (33,3%) amostras de leite tipo B e 0 (0,0%) amostras de leite tipo C, apresentaram
NMP de coliformes fecais acima dos padres estabelecidos pelo DIPOA (Brasil,
2002). Quando a metodologia SimPlate foi utilizada, 4 (44.4%) amostras de leite
tipo A, 3 (33,3%) amostras de leite tipo B e 0 (0,0%) amostras de leite tipo C,
apresentaram NMP de E. coli acima dos mesmos padres para coliformes fecais.
5
70
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
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