HIDRLISIS ENZIMTICA DE CARBOHIDRATOS

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INTRODUCCIN

Los carbohidratos que se ingieren en la dieta son mayoritariamente polisacridos; y en

menor proporcin monosacridos o disacridos. Los polmeros se encuentran presentes en
diferentes alimentos como en cereales, las legumbres y los tubrculos; mientras que los
segundos se encuentran en la leche, las frutas y el azcar.
Las primeras enzimas que participan en la degradacin de los polisacridos son las ptialinas
o -amilasas salivales y las -amilasas pancreticas1.
Si bien la secrecin de cada glndula salival tiene caractersticas diferentes, en la cavidad
bucal, las secreciones se mezclan y constituyen lo que se denomina saliva mixta o total.
Esta saliva bucal es viscosa, contiene, prcticamente, un 99% de agua y su pH se encuentra
entre 6,8 y 7,2, que es el pH ptimo para que pueda actuar la amilasa salival o ptialina 2.
Recientemente, se ha detectado en la saliva humana un analgsico natural que es varias
veces ms potente que la morfina. Esta sustancia inhibidora del dolor ha recibido la
deformacin de opiomorfina, ya que acta como sobre las mismas vas que la morfina y
otros analgsicos opiceos2.
Se estima que el volumen de saliva que producen las glndulas salivales humanas puede
llegar a 1,5 litros por da, pero se calcula que solo se llega a 600-800 mL diarios. La
cantidad de saliva secretada nuestra un ritmo circadiano, ya que vara en los diferentes
momentos del da, disminuyendo considerablemente durante las horas de sueo2.
En esta prctica los objetivos son:
-

Demostrar la actividad de hidrlisis enzimtica de la amilasa salival

Ver cmo influyen los cambios de pH a la actividad de amilasa.

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MARCO TERICO
La digestin de los carbohidratos se inicia en la boca con la accin de la enzima -amilasa,
que se secreta en la saliva. Esta enzima es capaz de actuar sobre los enlaces 14 de los
polmeros de glucgeno y almidn. Debido a que el alimento no permanece por mucho
tiempo en la boca, la proporcin de enlaces que logra romper no es muy alta. La enzima
salival, junto al bolo alimenticio, llega al estomago, donde es rpidamente desnaturalizada
por el pH tan acido (alrededor de 2) que se mantienen en ese rgano3.
Los carbohidratos continan el trnsito hacia el intestino delgado sin sufrir mayores
modificaciones. Al salir el alimento del estomago, se detiene en la pared duodenal y esto
estimula la secrecin de dos hormonas a la sangre: la colecistoquinina y la secretina. La
colecistiquinina llega hasta el pncreas exocrino y provoca la liberacin de un lquido rico
en enzimas. Dentro de estas enzimas se encuentran la -amilasa pancretica, el cual, al
igual que su isoforma salival, acta sobre los enlaces 14 de los polisacridos2.
La secretina, por su parte, trabaja tambin en el pncreas donde estimula la liberacin de
un lquido rico en bicarbonato. Este bicarbonato es el responsable de la alcalinizacin del
medio intestinal, que permite la accin de las enzimas a valores de pH cercanos a su pH
ptimo3, 4.

Amilasa salival
Las glndulas salivales liberan una secrecin ligeramente alcalina que adems de agua y
sales inorgnicas contiene glucoproteinas (mucina) como material lubricante, anticuerpos y

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enzimas. La -amilasa acta sobre los polisacridos y una lipasa que hidroliza una pequea
parte de las grasas neutras.
Es probable que la -amilasa y la lisozima, una enzima que degrada la mureina, tengan la
funcin de controlar la flora bacteriana de la boca ms que la de contribuir a la digestin4.
Como se mencion, la amilasa salival, tambin llamada ptialina, acta hidrolizando los
enlaces glucosa-14-glucosa y por lo tanto, degrada almidn y el glucgeno. La ptialina
requiere cloruro como cofactor inorgnico para la catlisis ocurra de manera ptima5.

Amilasa

pancretica
La

salival: sin embargo, en

accin
de
la
pancretica
es
dado que el almidn
permanecen
por
duodeno (para su
boca5, 6.

accin de la
-amilasa pancretica es casi idntica a la de la -amilasa
el organismo, la
amilasa
ms
importante,
y el glucgeno
ms tiempo en el
digestin) que en la

La amilasa pancretica puede degradar completamente la amilosa del almidn hasta

maltosa, pero solamente de manera parcial el glucgeno y la amilopectina. El producto de
esta digestin parcial de la amilopectina y el glucgeno da origen a maltosas, malotriosas,
isomaltosas y lo que se conoce como dextrina limite, que es el producto del ataque mximo
que pueden realizar las amilasas sobre el glucgeno. El resultado es un mleo muy
ramificado de glucosas, debido a la presencia de numerosos enlaces 16-glucosidasa7.
La degradacin posterior de la dextrina limite y la isomaltasa requiere otra enzima,
sintetizada por las glndulas del duodeno, que se llama isomaltasa o 16-glucosidasa,
que quita la glucosa en posicin 16 y, al hacerlo, deja expuesta la siguiente glucosa, que
se encuentra en posicin 14, sobre la cual puede actuar la amilasa pancretica sin
ninguna restriccin7, 8.

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E la dieta, es normal encontrar disacridos; estos compuestos deben ser digeridos con el fin
de absorber los monosacridos que los componen. Existen, para tal efecto, algunas
disacaridasas que se encuentran en las clulas epiteliales del intestino delgado6.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
La amilasa salival fue obtenida a partir de 4 ml
de saliva, que se diluyo 1 en 50, la cual fue la
solucin de enzima.
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ENSAYO 1: Actividad de la hidrolisis de almidn
Componente
Sol. Almidn 1%
Buffer fosfato pH 6.6
Sol. Salina (NaCl 1%)
Agua Destilada

1(ml)

2(ml)

3(ml)

4(ml)

5(ml)

6(ml)

2.2

2.2

2.2

2.2

2.0

0.8

0.6

0.4

0.2

2.4

0.4

Los tubos del 1 al 5 fueron colocados en un bao de agua a 37C durante 5 min y el tubo 6
fue mantenido como control a temperatura ambiente. Luego a cada uno de los tubos se
agrego la solucin de enzima:
Enzima(ml)

0.2

0.4

0.6

0.8

0.8

0.8

Los tubos del 1 al 5 fueron colocados en bao mara de agua a 37C por 30 min y el tubo 6
fue mantenida temperatura ambiente.
ENSAYO 2: Efecto de la concentracin de sustrato y del tiempo de incubacin sobre
la actividad de la amilasa salival
Componente
Sol. Salina (NaCl 1%)
Buffer fosfato pH 6.6
Sol. Almidn 1%
Sol. Enzima
Agua destilada

1 (ml)
0.5

2 (ml)
0.5

3 (ml)
0.5

4 (ml)
0.5

5 (ml)
0.5

3.2

2.8

2.2

1.8

1.3

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.1

0.5

1.1

1.5

Cada uno de los tubos fue llevado a bao a mara 37 C por 15 min.
ENSAYO 3: Efecto del pH sobre la actividad de la amilasa salival
Componentes
1 (ml)
Sol. Almidn 1%
Sol. Salina
2.0
Buffer pH 6
2
Buffer Ph 4
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Buffer pH 10

2 (ml)
5

3(ml)
5

2
2

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Cada uno de los tubos fue llevado a bao mara 37C por 5 minutos y se agrego 1 ml de la
solucin de enzima a cada uno de los tubos. Luego fueron llevados a bao mara 37C
durante 20 minutos.

Ensayo 1
Control
por la
reacccion
de lugol y
Benedict

Ensayo 2

Ensayo 3

Control por la reaccin de lugol

De cada uno de los tubos fueron tomados 0.5 ml de muestra y se agrego 0.5 ml de lugol. Se
mezclo bien y fueron dejados en reposo durante 5 minutos. Se observo los resultados.
Control por la reaccin de Benedict
De cada uno de los tubos se tomo 0.5 ml y se agrego 2.5 ml del reactivo de Benedict, se
mezclo bien y fueron sometidos a la accin del calor en bao de agua hirviendo durante 3
minutos, luego fueron enfriados a T ambiente y se observo los resultados.
RESULTADOS

Ensayo 1: Demostracin de la actividad de la hidrlisis del almidn

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Tubos
Intensidad
de reaccin

1
+
0

2
++
0

3
++
0

4
++
0

5
+
0

6
+++
0

Benedict
Lugol

a) Con reactivo de BENEDIC

Precipitado
rojo ladrillo
en todo los
tubos

b) Con reactivo de LUGOL

No hay
reaccin, solo
variacin de
la intensidad
del color

Ensayo 2:
Efecto de la concentracin de sustrato y del tiempo de incubacin sobre la actividad de la
amilasa salival.
Tubos
1
2
Intensidad
+++ y Bioqumica
++
Facultad
de Farmacia
++
de Reaccin ++

3
4
++
Pgina
7 +
+
+

5
+
0

Benedict
Lugol

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a) Con reactivo de BENEDIC
5

Se observa
disminucin
de la
tonalidad
azul

Ligera
coloraci
n
anaranja

b) Con reactivo de LUGOL

Intensidad
de
coloracin
azul de
mayor a
Reacci
n
negativ

Ensayo 3: Efecto del pH sobre la actividad de la amilasa salival

Tubos
Intensidad de
reaccin

1
+++
0

2
0
+++

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3
0
+++

Benedict
Lugol

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a) Con reactivo de BENEDIC

3
No hay
reaccin

Reaccin
positiva
(color
ligerament
e

b) Con reactivo de LUGOL

3
Reacci
n
positiva
(azul
intenso

No hay
reaccin

DISCUSIONES
La alimentacin humana normal solo contiene tres fuentes importantes de hidratos de
carbono: la sacarosa, que es el disacrido conocido popularmente como azcar de caa; la
lactosa, el disacrido de la leche, y los almidones, grandes polisacridos presentes en casi
todos los alimentos de origen no animal, especialmente en las patatas y en los distintos

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tipos de cereales.9 Donde la amilasa salival, secretada por la glndula partida cataliza la
hidrlisis los enlaces -1,4 glucosidicos de la regin central de la cadena de amilosa y
amilopectina del almidn, exceptuando las molculas cercanas a la ramificacin,
obteniendo como resultado

maltosa, glucosa y dextrinas que poseen enlaces -1,6 de la

amilopectina.10
Durante la prctica realizamos un anlisis cualitativo de la actividad enzimtica de la amilasa salival en relacin con algunos factores que van a modificar el curso normal de la
reaccin en condiciones normales del organismo.
En una reaccin normal, la [E] puede estar presente en concentraciones de orden
nanomolar, mientras que la [S] puede ser 5 o 6 rdenes de magnitud mayor. Por lo tanto, en
el primer ensayo a medida que aumentemos la [E], habr una mayor cantidad de enzima
que catalice la reaccin del sustrato, aumentando as la velocidad de reaccin y por ende el
producto obtenido ser mayor.11 En la reaccin con lugol, varia en intensidad de colores
donde el tubo 1 con menor concentracin de enzima presento menos hidrlisis que en el
tubo 4, con mayor concentracin de enzima. 12 Tambin se pudo observar que en el tubo 5
no presento reaccin debido a q no estaba su activador ion Cl- en la solucin salina.14 Y en la
reaccin de Benedict para azucares(glucosa) con grupos de reductores libres existe una
correlacin consecutiva de formacin de producto en forma de precipitado de Cu 2O3 (rojo
ladrillo) en funcin de la concentracin de enzima.13
En el segundo ensayo la [E] estuvo presente en concentraciones constantes, mientras que la
[S] presento una mayor magnitud. Por lo tanto, a medida que aumentemos la [S], habr una
mayor cantidad de producto que se catalice en la reaccin. Hasta que la enzima llegue a
saturarse, llegando a una velocidad mxima que ya no genere mayor formacin de
producto.11 As en la reaccin con lugol est en funcin de la concentracin de sustrato
donde en el tubo 5 hay una mayor hidrlisis del almidn en unidades de glucosa que en el
tubo 1, cuya escala va de rojo(amilopectinas) a azul intenso(amilosas).12 Y en la reaccin de
Benedict para azucares(glucosa) con grupos de reductores libres existe una correlacin
consecutiva, donde el tubo 1 empieza a decolorarse hasta el tubo 5 donde se aprecia el
precipitado de Cu2O3 (rojo ladrillo), lo que indica que en los primeros tubos estaban
saturados de exceso de sustrato.13
En el tercer ensayo se evalu el efecto del pH optimo en el que su actividad es mxima,
pero a valores superiores o inferiores disminuye la actividad de la enzima.11 Por lo tanto se
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trabajo con pH diferentes (4,6.6 y 10) teniendo como rango de pH terico estable entre 5.58 14; evalundose con el reactivo de lugol, se tiene que a pH 6.6 presenta una coloracin
rojiza, evidencia de que se hidrolizo la amilosa (azul), quedando las amilopectinas(rojo). 12
Y en la reaccin de Benedict para azucares(glucosa) con grupos de reductores libres se
evidencio precipitacin rojo ladrillo abundante confirmando el pH 6.6 adecuado para la
actividad de la enzima.13
Adems la reaccin con el lugol, el almidn tomo una coloracin azul intenso, debido a que
el yodo es capaza de formar complejos tanto con amilosa como con amilopectina. En el
caso de la amilosa, los largos segmentos helicoidales permiten la formacin de largas
cadenas de poli (I3-) que dan lugar al color azul intenso caracterstico. La amilopectina se
colorea de color rojo purpurea con el yodo debido a que sus ramas son demasiado cortas
para la formacin de largas cadenas de poli (I3-).12
Finalmente se tiene la reaccin de Benedict, la cual es especfica para azucares con grupos
reductores libres(C=O), tomando en cuenta que todos los monosacridos (glucosa) poseen
un grupo reductor libre, este reduce al Cu +2 en medio alcalino a Cu+1 para luego oxidar y
precipitar en forma de Cu2O3, lo que proporciona la coloracin positiva (rojo ladrillo) de la
reaccin.13

CONCUSIONES
En el primer ensayo se demostr de la actividad de la amilasa salival se tuvo como
controles al reactivo de lugol, donde se aprecia variaciones en intensidad de colores
donde el tubo 1 con menor concentracin de enzima presento menos hidrlisis que
en el tubo 4, con mayor concentracin de enzima. Tambin se puso observar que en
el tubo 5 no presento reaccin ya que no tena solucin salina y el control por la
reaccin de Benedict donde la precipitacin de Cu2O3 (rojo ladrillo) va en forma
creciente con excepcin del tubo 5 debido a que no presenta solucin salina.
En el segundo ensayo se demostr el efecto de la concentracin de sustrato y tiempo
de la enzima amilasa salival presenta el control por la reaccin de lugol, donde el
tubo 5 con menor concentracin de sustrato dio una coloracin rojiza y el de mayor
concentracin de sustrato dio un color azul oscuro, adems para el control por la

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reaccin de Benedict la precipitacin que al inicio es inapreciable va en forma
creciente hasta que llega al tubo 5 con mayor precipitado rojo ladrillo de Cu2O3.
En el tercer ensayo se demostr el efecto del pH sobre la actividad de la enzima
amilasa salival mediante sus controles con lugol, dio color rojizo para el tubo con
pH 6.6 y los dems de color azul intenso; adems mediante el control por la
reaccin de Benedict se confirmo el valor de pH optimo de 6.6 mediante su
formacin de precipitado de Cu2O3 (rojo ladrillo).

CUESTIONARIO

1. Cul es el fundamento de la reaccin de lugol?

Este mtodo se usa para identificar polisacridos. El almidn en contacto con unas gotas de
Reactivo de Lugol (disolucin de yodo y yoduro potsico) toma un color azul-violeta
caracterstico.
Fundamento: Esta caracterstica es especfica del almidn, debido a su estructura, y se
debe a la adsorcin del Iodo por las cadenas helicoidales, especialmente de la amilosa.
Por tanto no es una reaccin qumica, sino una interaccin fsica reversible por mtodos
fsicos que modifica las propiedades fsicas de esta molcula, apareciendo la coloracin
azul violeta.
Esto se puede comprobar fcilmente, pues al calentar la mezcla, el color azul desaparece, y
al enfriarla vuelve a aparecer.

2. Como influye el pH en la actividad de la amilasa salival

Con frecuencia la boca est expuesta a alimentos que tienen un pH mucho ms bajo que el
de la saliva y que son capaces de provocar una disolucin qumica del esmalte (erosin),
bajo estas condiciones, los mecanismos tampn tambin se ponen

en marcha para

normalizar el pH lo antes posible.

Los alimentos se clasifican como cidos o alcalinos de acuerdo al efecto que tienen en el
organismo humano despus de la digestin y no de acuerdo al pH que tienen en s mismos.
Es por esta razn que el sabor que tienen no es un indicador del pH, si no lo que generaran
en nuestro organismo una vez consumidos.

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De acuerdo a estudios se ha demostrado que algunos alimentos producen efecto alcalino o
cido dentro del organismo lo que provoca un aumento o descenso del pH.
La funcin amortiguadora de la saliva se debe principalmente a la presencia del bicarbonato
ya que la influencia del fosfato es menos extensa. La capacidad amortiguadora es la
habilidad de la saliva para contrarrestar los cambios de pH.
Esta propiedad ayuda a proteger a los tejidos bucales contra la accin de los cidos
provenientes de la comida o de la placa dental, por lo tanto, puede reducir el potencial
cariognico del ambiente.
El buffer cido carbnico/bicarbonato ejerce su accin sobre todo cuando aumenta el flujo
salival estimulado. El buffer fosfato, juega un papel fundamental en situaciones de flujo
salival bajo, por encima de un pH de 6 la saliva est sobresaturada de fosfato con respecto a
la hidroxiapatita (HA), cuando el pH se ve disminuido por debajo del pH crtico (5,5), la
HA comienza a disolverse, y los fosfatos liberados tratan de restablecer el equilibrio
perdido, lo que depender en ltimo trmino del contenido de iones de fosfato y calcio del
medio circundante. Algunas protenas como las histatinas o la sialina, as como algunos
productos alcalinos generados por la actividad metablica de las bacterias sobre los
aminocidos, pptidos, protenas y urea tambin son importantes en el control del pH
salival.
Los amortiguadores funcionan convirtiendo una solucin cida o alcalina altamente
ionizada, la cual tiende a alterar el pH, en una solucin ms dbilmente ionizada libreando
(H+) u (OH-).

3. Cual es la funcin de la solucin salina y de la solucin de almidn utilizados en el

ensayo 1?
La funcin de la solucin salina en el ensayo 1 es que otorga iones Cl-, los cuales se
utilizan como activadores de la enzima amilasa salivan. Y la funcin de la solucin de

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almidn es actuar como sustrato de la reaccin con la amilasa salivan y se compruebe como
disminuye el sustrato en funcin de la concentracin de enzima.2

4. Cul es la clasificacin y la nomenclatura de las amilasas empleadas en la

prctica?
En la prctica emple la amilasa salival mas no la pancretica sin embargo se mencionar
tanto la clasificacin y nomenclatura de ambas:
La amilasa salival o amilasa es una enzima clasificada dentro de las hidrolasas y la
nomenclatura que posee es EC 3.2.1.1. 1
La amilasa pancretica es tambin del mismo grupo de hidrolasas, en el mencionado rgano
se encuentra con pesos moleculares de 52000 (Ec 3.2.1.1) y 53000 (EC 3.2.1.1). Esta
nomenclatura esta normada por la comisin IUPAC-IUB para nombrar mltiples formas de
enzimas.2
Referencias:
1. IUBMB

Enzyme

Nomenclature

[en

lnea].

Disponible

en:

http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/2/1/1.html
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including a comparison with human parotid amylase.Biochim Biophys Acta 1973;
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14. Stiefel DJ, Keller PJ. Preparation and some properties of human pancreatic amylase
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