Tres mtodos de extraccin para la determinacin de los lpidos en la

harina de pescado: evaluacin de un mtodo de hexano / isopropanol

como una alternativa a los mtodos basados en cloroformo
Helga Gunnlaugsdttir y Robert G Ackman
Resumen: therre diferentes mtodos de extraccin se copared para la
determinacin de lpidos tanto en la harina de pescado de Brown
oxidado y-stabilsed antioxidante. Los tres mtodos que se investigan son
los de Smith Ambrose - Knbl usando choloform / metano / agua, Bligh y
Dyer tambin utilizando cloroformo / metanol / agua, pero monofsica. Y
hara y radin utilizando hexano / isopropanol. El contenido de grasa,
determinado por gravimetra, fue significativamente menor (P <0,05)
cuando se utiliz hexano) isopropanol para su extraccin, tanto oxidado
y harina de pescado-antioxidante estabilizado, broncearse cuando se
utiliz cither de los sistemas de cloroformo. Determinacin de clases de
lpidos en los extractos de lpidos utilizando cromatografa en capa fina
de gel de slice sobre silica gel-SIII. Con la deteccin de ionizacin de
llama por latroscan, sugiri que la recuperacin ms bajos de lpidos por
el mtodo de hexano / isopropanol puede ser debido a una LC55 de
extraccin Efectiva de las clases de lpidos ms polares, incluidos los
productos de oxidacin, presentes en Brown harina de pescado.
INTRODUCCIN
La harina de pescado se utiliza principalmente como una fuente de
protena y energa para los animales domsticos. El valor energtico de
la harina de pescado proviene exclusivamente de su contenido de
protenas y lpidos (Barlow y Windsor, 1983). Los lpidos en la harina de
pescado son especialmente importantes, como fuentes nutricionales de
cido graso altamente insaturado n-3 y tambin como un ndice de su
valor energtico (Opstvedt et al 1970: Opsteved 1973, 1974).
Numerosos mtodos han sido utilizados para la determinacin de este
contenido de lpidos en la harina de pescado, pero todava no hay un
acuerdo general sobre la mejor (Gunstone y Wijesundera 1978): de
Koning et al 1985; de Koning y Mol 1989). La mayora de los mtodos
son cither insatisfactorio en trminos de recuperacin o no aptos para el
uso rpido y seguro.
* Presentado en parte en la reunin anual de la sction canadiense de la
American Oil Chemists Society, de Winnipeg. ** A quien la
correspondencia debe ser addresed.
Los mtodos que utilizan ter dietlico se utilizan comnmente en el
pasado (Stansby una Clegg 1955; Wiechers et al 1964; Lee et al 1966).

La Asociacin Internacional de Harina de Pescado Manufacturas (Hoval

House, Potters Bar, Hertford-shire, Reino Unido). Tan recientemente
como en 1980, en su Techincal Boletn N 13. Extraccin con ter
dietlico Recomendado para 6 h.
Estos mtodos son ahora reconocidos como no aptos para para la
determinacin de lpidos totales como nota todos los lpidos se considera
que son igualmente bien extrajo con ter dietlico (Gunstone y
Wijesundera 1978). La acetona es apta no extraet fosfolpidos (Christie,
1982). Incluso en las 16 h propuestos por este mtodo (AOAC 1984),
base Mehtods don extraccin con cloroformo / metanol / agua se han
recomendado para el anlisis de los lpidos totales en tanto oxidado y la
harina de pescado no oxidado (Ambrose y Knbl 1966: Ederzecl y Ritskes
et col 1985). Sin embargo, ahora no son deseables como cloroformo es
sospechoso de ser un careinegen (Radin 1981; Nelson 1991). Una razn
para esta multitud de mtodos es, probablemente, se ha encontrado que
la oxidacin se produce de secado duraing para causar una disminucin
en los lpidos extrables de harina de pescado (Williams 1959: de Koning
y Mol 1989). Esto podra ser provocada por la interaccin de los
productos de oxidacin con la protena (Pokorny et al 1983).
Investigadores lpidos HACE mtodos alternativos buscados para los
tejidos animales. Mtodos alternativos de baja toxicidad para los tejidos
animales. Disolventes de baja toxicidad, tales como hexano / isopropanol
se han recomendado (Hara y Radin 1978: Radin 1981). Este estudio se
llev a cabo para comparar tres mtodos de extraccin fifferent y para
evaluar si el mtodo utilizando hexano / isopropanol. No previusly
examinado para la determinacin de los lpidos en la harina de pescado.
Coul ser utilizados para la extraccin de este material. Tanto
estabilizados y no estabilizados comidas lacha se ensayaron despus de
su almacenamiento en diferentes formatos y estilos de ms de 60 das.
Las cantidades de diferentes Clases de componentes lipdicos extrated
por estos tres mtodos de una comida estabilizado se expone al aire se
han comparado mediante el uso de cromatografa en capa fina de gel de
slice con deteccin de ionizacin de llama (Iatroscan TLC-FID).
EXPERIMENTAL
Materiales
Meeal peces sbalo, de la Zapata Haynie Corporation, Reedville. VA.
EE.UU.. Se obtuvo durante las etapas finales de un solo ciclo de
produccin y se divide en dos partes: uno fue tratado inmediatamente
con 750 mg kg-1 etoxiquina (1,2-dihidro-6-etoxi-2.2.4-trimetilquinolina)
(WE): el otro era no tratado con antioxidante (AY). Las alcuotas de
ambas muestras se envasaron en 300 x 500 mm de barrera Bolsas

(Divisin Cryovac. WR Grace and Co. Mississauga. Ontario. Canad) bajo

O2-aire o N2 usando un sellador al vaco. Las muestras se almacenaron
a temperature ambiente durante 60 das. El aire de O2 fueron
sustituidos cada 2 semanas. Las muestras de control envasados en
atmsfera de N2 se tamizaron a travs de un 9 mallas por pulgada
(abertura de malla de 2 mm) se har inmediatamente antes de la
extraccin. El producto tamizado se mezcl de nuevo a fondo para
garantizar un muestreo representativo de las rplicas de los tres anlisis
comparativos.
determinacin de lpidos
Tres mtodos diferentes fueron utilizados para la extraccin de lpidos:
Smith-Ambrosio-Knbl (SAK) utilizando CHCI3/metanol/wter en una
extraccin monofsica (Biligh y Dyer 1959). Hara y Radin (HR) utilizando
hexano / isopropanol (Hara y Radin 1978). El mtodo de HR se modific
ligeramente para el propsito de la extraccin de la harina de pescado.
Es decir, se aadi agua a la harina de pescado y la mezcla se sonic
lado a otro 15 min antes de la extraccin. En todos los tres mtodos que
el material de lpido extrado se liber de disolvente a 30 - 40 C bajo
vaco usando un evaporador rotatorio.
Cada extraccin se llev a cabo por triplicado y la coparison mltiple de
Tukey de medios Teste se utiliz para determinar si los medios simples
fueron significativamente diferentes al nivel del 5%. Todos los anlisis
estadsticos se realizaron utilizando el programa de ordenador Systat 4.0
(Wilkinson 1988).
TLC-FID
Los extractos de lpidos fueron examinados para clases de lpidos por
cromatografa en gel de slice (silica gel-SIII), seguido de cuantificacin
en una Iatroscan TH-10 MKIII (Iatron Laboratories Inc. de Tokio Japn:..
Distribuidor mundial Newman-Howells Associates Ltd. Pehybont Uchaf
Llanwrtyd Wells . Powys Reino Unido.) equipado con un detector de
ionizacin de llama. El Iatroscan fue equipado con un interruptor de
botn pulsador para interrumpir la exploracin en cualquier momento
cuando sea necesario (Parrish y Achman 1985): esto era especialmente
til para la exploracin parcial y reconstruccin. El Iatroscan se hizo
funcionar con una velocidad de flujo de hidrgeno de 110 ml min-1. . El
flujo de aire de 2000 ml min-1 y velocidad de exploracin 2 El Iatroscan
estaba conectado a un integrador de computacin Spectra-Physics SP
4270 para la grabacin de los cromatogramas y con el fin de
proporcionar la integracin digital de los picos:. La atenuacin utilizado
fue 16 Los silica gel eran limpiado antes de su uso por inmersin en
cido concentrado / agua ntrico (35:65 v) durante la noche y despus se

lav a fondo con agua destilada y acetona. Los silica gel fueron preescanear dos veces antes de su uso para la limpieza y activacin:
despus de detectar y antes de cada desarrollo los silica gel se
acondicionaron en una cmara de humedad constante durante 5-10
minutos sobre una solucin staturated de NaCl y luego trasladados de
inmediato a la cubeta de desarrollo.
Solucin madre se prepararon para cada extracto lipdico pesando con
precisin unos 150 mg de lpido en un matraz volumtrico de 5 ml. La
adicin de cloroformo. Y almacenar a - 20 C hasta su anlisis.
Drummond pipetas desechables Microcap (Acadian Instruments Ltd.
Etobicoke. Ontario. Canad) se utilizaron para aplicar las soluciones a los
silica gel (normalmente de 1 l, o la acumulacin de aplicaciones de 1 l).
Calibracin de silica gel
Una solucin madre de un estndar compuesto de ocho componentes,
que representa a las principales clases de lpidos que se encuentran en
la harina de pescado (vase ms adelante), se realiz en cloroformo y se
almacen bajo nitrgeno a - 20 C. Todos los estndares utilizados se
obtuvieron del Laboratorio de Investigacin Serdary (Londres. Ontario.
Canad). Se hicieron varias diluciones diferentes de la solucin madre y
las normas utilizadas variaron en la concentracin de 0-1 a 20 mg l-1
antes de hacer el estndar de material compuesto. Cada componente se
ejecuta por separado a travs de todo el procedimiento de desarrollo
para determinar la pureza. Las curvas de calibracin fueron compilados
a lo largo de todo el perodo de anlisis sencillos. Con cada lote de 10
silica gel. Una varilla. Elegido al azar. Fue utilizado para los estndares
en cada da de anlisis. La carga total aplicada a las silica gel vari de 01 a 20-0 g.
desarrollo Chromarod
Tres sistemas de disolventes diferentes se usaron para obtener tres
cromatogramas por Chromarod. El primer desarrollo se llev a cabo
durante 55 min en Cid hexano / cloroformo / isopropanol / formica
(80:14:10-1 V). Los silica gel se secaron a 110 C durante 3 minutos y
parcialmente digitalizado a un punto ms all del pico de diglicridos
(DG) para revelar los lpidos neutros. Los silica gel fueron luego
desarrolladas dos veces durante 10 min en acetona (100%). Se sec a
110 durante 3 min y despus explorado parcialmente hasta el punto
ms bajo beyon el lpido apolar-acetona mvil (AMPL) pico. Por ltimo,
los silica gel se desarrollaron dos veces durante 20 minutos en
cloroformo / metanol / cido frmico / agua (25:15:2:1 v). Se sec a 110
C durante 5-7 min. Y completamente explorada para revelar
fosfolpidos y materiales menos mviles.

Clases y normas de lpidos

Calibracin del sistema Chromarod-Iatroscan se efectu durante los
picos autnticos, complementados por desconocidos por el material de
la movilidad cromatogrfica similar. Las clases y normas de lpidos
fueron los siguientes: triglicridos (TG). Triapalmitin; cidos grasos libres
(FFA), cido esterico: esterol libre (CHO), colesterol: diglicridos (DG).
1.2-dipalmitina: lpidos polares acetona mvil (AMPL). Monopalmitina:
material no identificado (UIM). L-3-fosfatidiletanolamina (dipalmytil):
fosfatidilcolina (PC). L-3-fosfatidilcolina (dipalmitil): lpido polar oxidado
(OXPL), lisofosfatidilcolina (palmitilo): y material polar (PM),
lisofosfatidilcolina (palmitilo). AMPL es un trmino introducen por Parrish
(1987) como la designacin de un pico en particular, a menudo bien
definido, Frist observado en muestras de lpidos plancton del ocano.
Resultados y discusin
Las cantidades de lpidos y extracte determinada gravimtricamente
tanto oxidado y unosidised comida lacha por los tres procedimientos de
extraccin diferentes bajo investigacin, se registran en la Tabla 1.
Cuando se compararon las recuperaciones Lipit de los tres
procedimientos de extraccin diferentes. El lpido recuperado result ser
significanty menor (P <0,05) para todo sencillo cuando se utiliz el
mtodo de Recursos Humanos para la extraccin de lpidos broncearse
cuando se utilizaron los mtodos SAK y BD. El mtodo de HR utiliza
hexano / isopropanol como el sistema de disolvente de extraccin. Los
mtodos que utilizan slo hexano como previosly han demostrado los
disolventes de extraccin para dar recuperaciones de lpidos ms bajos
se broncean el mtodo BD basada en cloroformo (de Koning et al 1985:
de Koning y Mol 19889). El mtodo Sak dio la ms alta lipidrecovery para
todas las muestras objeto de la investigacin (tabla I). Las diferencias
entre el contenido de lpidos se determina por gravimetra SAK un
mtodos BD de este estudio fue pequeo. Y significativa (P <0,05) slo
en dos casos. La principal diferencia entre los dos mtodos es que el
mtodo de BD se lleva a cabo usando CHCl3/metanol/water que. En las
proporciones 1:2:0-8 v resultados en una extraccin monofsica. Por otro
lado el mtodo SAK utiliza CHCl3/metanol/water en las proporciones 15:1:0-4 V que se traduce en la extraccin bifsica. Una diferencia
adicional es que el material extractd se mezcla de nuevo en CHCl3 en el
mtodo de SAK. En el procedimiento de BD, como se usa, el mezclador
Waring se enjuag con CHCl3 (50 ml) y este disolvente se pas a travs
de la torta de filtro. Qu estaba firmemente presionado seco. En
general. El mtodo de SAK requiere un mayor volumen de CHCl3 para
cada unidad de harina de pescado extrado en comparacin con el
mtodo de BD. De hecho, el requisito de solvente orgnico total por

unidad era dos veces mayor que cualquiera de los dos mtodos de la AR
o BD. Se considera que el procedimiento de BD se recuperar
prcticamente la misma cantidad de lpidos como el procedimiento de
SAK (Tabla 1) y se utiliza apreciablemente menos cloroformo.
Acccordingly, los autores
TABLA
Cantidad de lpido extrado (g Kg-1 comida) por tres procedimientos
diferentes. Smith-Ambrosio-Knoble (SAK). Bligh y Dyer (BD) y Hara y
Radin (HR), de la harina de lacha etoxiquina tratada y no tratada se
almacena bajo N2-aire y O2 durante 60 das

Medios dentro de una fila con diferentes superndices son

significativamente diferentes (P <0,05). Para cada mtodo, los datos son
la media = desviacin estndar de tres determinaciones.

Fig.

1.

Separacin de clases de lpidos en no estabilizado (AY) comida lacha

almacenado bajo O2 durante 60 dyas. Cada varilla se escane dos veces
PARCIALMENTE y una vez completamente. Resultando en tres
cromatogramas por sencilla apllication. El desarrollo es de rihgt a
izquierda. Escaneado desde izquierda a derecha. La atenuacin es la
misma para todos los cromatgrafos. Abreviaturas clase de lpidos se
explican en el texto. (a) lpido extrado utilizando el mtodo de SmithAmbrosio-Knoble. Y (b) de lpidos extrado utilizando el Hara y el mtodo
de Radin.
Coincido con De Koning et al (1985) y de Koning y Mol (1989) que la
extraccin de lpidos de lis mea pescado mejor llevada a cabo por el
procedimiento de Bligh y Dyer (1959). Esta es tambin la conclusin de
los investigadores que utilizan alimentos (Daugherty y Lento 1983) y
otros materiales cuando los procedimientos son estrictamente
estandarizados (Randall et al 1991).
Con el fin de tratar de explicar la recuperacin de lpidos inferior del
dexane (sistema de isopropanol (mtodo de HR). TLC FID se utiliz para
comparar los tipos y las cantidades de los componentes lpidos extrados
por los diferentes mtodos de extraccin. Para aclarar las diferencias
cualitativas entre los extractos lipdicos obtenidos utilizando los Methos
a base de cloroformo y el mtodo de hexano / isopropanol.
cromatogramas de lpidos obtenidos a partir de un ay de menhaden
sencilla harina extrada por la SAK y los mtodos de recursos humanos
se comparan en la figura. 1. los cromatogramas obtenidos para las dos
primeras exploraciones parciales. Donde el nom lpidos polares se
separan en la exploracin Frist y los AMPLs reconstruidas en la segunda

exploracin Demostrar que las mismas principales componenets de

lpidos estn presentes en ambos de los extractos de lpidos la tercera
exploracin muestra la separacin de clases de lpidos polares:.. tanto
en lpidos extrae pico .. identificado como se observaron UIM PC y PM sin
embargo, un pico designado como OXPL slo se observ en el extracto
lipdico obtenido utilizando los mtodos SAK y BD: no se observ en el
extracto lipdico de recursos humanos. Esto podra sugerir que OXPL no
se extrae de la muestra de harina de pescado oxidado o que estuvo
presente en una cantidad tan pequea que no se detect como un pico
separado y por lo tanto se solapa con el pico de PM.

Fig. 2. Las
de clases

cantidades
de
lpidos
recuperados,
tres

utilizando

procedimientos

de

extraccin

diferentes.

Desde

antioxidante

estabilizado (WE) comida lacha almacena bajo aire. Los puntos de datos
son la media SD de tres extractos de lpidos. (a) las clases no polares
de lpidos (cidos grasos libres FFA) y (b) clases de lpidos polares
(lpidos polares AMPL-acetona-mvil. materiales-UIM unidentifled. PCfosfatidilcolina. material de PM-polar).
Las cantidades de clases de lpidos extrados de una comida lacha
oxidado se ilustran en la figura. 2. Todos los tres procedimientos
extrajeron aproximadamente la misma cantidad de los principales clases
de lpidos no polares. Es decir TG. FFA y CHO. casi seguro (Walton et al
1989)> 95% colesterol (Fig 2 (a)). Sin embargo. El mtodo Exane /
isopropanol tenda a extraer menos del lpido polar Clases AMPL. UIM, PC
y PM Tan los mtodos basados en cloroformo. Esta tendencia es
particularmente evidente en el caso de las clases de lpidos ms polares
incluyendo UIM. PC un PM (figura 2 (b)). Se obtuvieron resultados
similares para la harina de pescado no oxidado (Gunnlaugsdttir, 1992).
La TLC - determinacin de FID de los extractos de lpidos obtenidos
utilizando los tres procedimientos exrraction diferentes sugiere que la
recuperacin de lpidos inferior del mtodo de hexano / isopropanol
puede ser debido a una extraccin menos eficiente de las clases de
lpidos polares presentes en las harinas de pescado tanto oxidadas y no
oxidadas.
Por lo tanto el menor rendimiento del mtodo de extraccin basado en
hexano se podra explicar por las diferentes solubilidades de comonents
de lpidos en disolventes polares y no polares. Como se cree que los
lpidos polares para ser slo ligeramente solubles en disolventes
hidrocarbonados tales como hexano (Christie 1982: Nelson 1991).
Extraccin de lpidos de peces o cualquier otro tejido muscular requiere
ambos disolventes polares y no polares (Christie 19829. El disolvente
polar usado en el procedimiento de HR es isopropanol. Considerando
que el metanol es el disolvente polar usado en ambos los
procedimientos de BD y SAK. De estos dos disolventes polares.
isopropanol es menos metanol Tan polar (Zief y Kiser 1990), aunque
puede tener vitues en otras circunstancias (Peuchant et al 1989). Ambos
de estos factores. Esa es la solubilidad porcin de componentes lpidos
polares en disolventes de hidrocarburos. y la polaridad inferior de
isopropanol en comparacin con metanol. Podra. En parte. Explicar la
extraccin menos eficiente de clases de lpidos polares y en
consecuencia la recuperacin de lpidos inferior del mtodo de hexano /
isopropanol. En el pasado, la evaluacin de los tipos de clases de lpidos
extrados de . harina de pescado ha sido incompleta (. de Koning et al
1985 1986) Sahasrabudhe y Sallbone (1983) compararon la cantidad de
lpidos neutros y PLAR extrados de magra, media y alta -. carne molida
de grasa utilizando siete mtodos de extraccin diferentes. Utilizaron

una columna de cido de slice para separarse las clases de lpidos en un

lpido simple purificada. Dos de los siete mtodos de extraccin
investigados fueron los BD y los mtodos de extraccin de recursos
humanos. El mtodo Hr fue encontrado para extraer una pequea
cantidad de los lpidos polares en media y alta de carne molida de grasa
curtir el mtodo BD. Los resultados para la harina de pescado en este
estudio son, por tanto, de acuerdo con los resultados de Sahasrabudhe y
Smallbone (1983) para la carne. Componentes menores pueden, por
supuesto, nota ll responden de la misma manera los materiales de
glicerol como acilados (Randall et al 1991: Cabrini et al 1991).
El ocasional recuperacin ligeramente menor de lpidos por el sistema
disolvente BD (tabla 1) tambin puede deberse en parte a una menor
recuperacin de material plar (fig 2). Desde recuperaciones de los otros
seis clases de lpidos parecieron ser similares a los de las extracciones
SAK. Dado que la respectiva lpidos recuperaciones de cada sistema
disolvente. Aplicado a las NOSOTROS Y ay comidas almacenadas en
diferentes ambientes. No mostraron diferencias sistemticas ms all de
la funcin que se espera de aire (y O2) y el beneficio de Etoxiquina.
Parece que la mayor parte de los productos de oxidacin de lpidos y sus
interacciones con los aminocidos tienen lugar en la etapa de secado de
la produccin de harina de pescado o poco despus. Esto tambin es
sugerido por las recientes investigaciones de la harina de pescado por
Saito y Udagawa (1992) el empleo de la resonancia magntica nuclear.
Puede ser significativo que la comida Temperatura ms baja (es decir,
comida seca a la temperatura ms baja de los 90 C en lugar de la
convencional de 100 C) permite un mejor crecimiento en la acuicultura
del salmn (Pike et al 1990). AGL recuperados fueron componentes
menores (Fig. 1). Esta clase de lpidos puede ser especialmente
propensos a la oxidacin y la interaccin con aminocidos (de Koning et
al 1986) y hay indicaciones de que hay un efecto de Temperatura que
afectan especialmente a AGL (Koizumi et al 1986).
Se recibieron las muestras de harina de pescado comercial
aproximadamente Me semanas despus de la fabricacin y el
antioxidante se haban aadido a la muestra adecuada (WE)
inmediatamente despus de la etapa de enfriamiento post-secado de la
fabricacin. El almacenamiento y la distribucin de lis mea peces a
menudo una cuestin de meses y los autores consideran que sus
respectivos anayses se llevaron a cabo en el pescado meeal realista
imitando muestras comerciales. Los procesos de oxidacin se modifican
en cuanto al tiempo de iniciacin por los antioxidantes. Pero con el
tiempo incluso comidas procetected pueden ser tan susceptibles a la
misma oxidacin total como las comidas sin proteccin. Contabilizacin
de las similitudes en la recuperacin de los lpidos de la Tabla 1 para los

mtodos SAK y BD aplicadas a los aparatos de aire y almacenadas-O2

muestras comparadas con la muestra almacenada-N2.
CONCLUSIONES
Hexano / isopropanol extrae una (P <0,05) menor cantidad significativa
de lpidos de tanto oxidado y mtodos basados en cloroformo tan
comida lacha sin oxidar. TLC-FID determiantion de los extractos de
lpidos sugiere que la recuperacin de lpidos inferior con hexano /
isporpanol puede ser debido a la extraccin menos eficiente de clases
IPID polares. Por lo tanto. Hexano / isopropanol no puede ser
recomendado como una alternativa viable a los mtodos basados en
cloroformo para la determinacin de lpidos en Brown harina de pescado.
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo fue apoyado en parte por la Asociacin Internacional de
Fabricantes de Harina de pescado (ahora el Internacional de Harina y
Aceite de la Asociacin de Fabricantes, St Albans. Herts AL3 4PE. Reino
Unido), y en parte por las Ciencias Naturales e Ingeniera de
Investigacin de Canad. La cooperacin, Reedville. VA. EE.UU., se
agradece.