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PESQUISA

PROTEOMA
Ilustraes cedidas pelas autoras

Avanos Recentes em Tcnicas de Eletroforese Bidimensional e Espectrometria de Massa

Luciana Di Ciero
Doutora, Pesquisadora, Esalq USP
ldctleme@terra.com.br

Cludia de Mattos Bellato, Ph.D


Pesquisadora, CENA USP
bellato@cena.usp.br

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roteoma indica as PROTEnas


expressas em um genOMA
ou tecido. Enquanto o genoma representa a soma de todos os genes de um indivduo, o proteoma no uma caracterstica fixa de
um organismo. O proteoma altera com
o estado de desenvolvimento, do tecido ou mesmo sob as condies nas
quais o indivduo se encontra. Portanto, h muito mais protenas no proteoma do que genes no genoma, especialmente para eucaritos. Isto porque h
vrias maneiras do gene expresso, o
RNA total, sofrer reduo (splicing)
para construir o RNA maduro. Este
ento vai servir de molde para a traduo de uma protena, a qual sofre
modificao ps-traduo.
Investigar diretamente os produtos
dos genes uma forma de estudar
doenas e qualquer problema biolgico complexo. Por exemplo, para entender molecularmente como uma
clula funciona em um indivduo doente e em um sadio preciso ter
conhecimento das protenas e de outros componentes celulares que esto
presentes, como eles interagem e o
resultado de suas interaes.
Portanto, anlise ao nvel de protena necessria, pois o estudo dos
genes atravs do sequenciamento dos
genes, ou seja, o estudo genmica, no
pode adequadamente prever a estrutura dinmica das protenas, uma vez
que ao nvel das protenas que muitos dos processos de uma clula ocorrem, onde processos de doenas inicialmente acontecem e aonde muitas
das drogas medicinais atuam. Sendo
assim, protemica o mtodo direto

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para identificar, quantificar e estudar as


modificaes ps-traducionais das protenas em uma clula, tecido ou mesmo oragnismos.
O termo protemica foi introduzido em 1995 para descrever todas as
protenas que so expressas em um
genoma (Anderson et al., 1996; Wilkins et al., 1996). Definir todos os
aspectos da protemica difcil, pois
atualmente este termo mais um
conceito do que uma cincia bem
definida.
Protemica pode ser vista como
uma metodologia de seleo da biologia molecular, a qual tem como objetivo documentar a distribuio geral de
protenas da clula, identificar e caracterizar protenas individuais de interesse e principalmente elucidar as suas
associaes e funes. Sendo assim,
protemica fundamenta-se em princpios bioqumicos, biofsicos e de bioinformtica para quantificar e identificar
as protenas expressas, pois elas se
alteram conforme o desenvolvimento
de um organismo assim como em
resposta aos fatores do ambiente (Anderson & Anderson, 1996; Celis et al.,
1996; Wilkins et al., 1996; Wilkins et
al., 1997).
H uma forte e sinergstica correlao entre os estudos protemicos e
genmicos uma vez que ambas reas
de estudo investigam a organizao
celular ao nvel complementar, protenas e genes, e cada rea fornece
informao que aumenta a eficincia
da outra. Por exemplo, protemica
conecta as descobertas da genmica
com o desenvolvimento das drogas
que as companhias farmacuticas in-

tecido a estresses externos. Atravs da


protemica pode-se fazer uma comparao do perfil protico de uma
clula cancerosa com o de uma clula
sadia, ou de uma clula cancerosa cujo
portador est sob tratamento mdico.
Vrias pesquisas j foram ou esto
sendo conduzidas no mundo na rea
da sade como o proteoma do fgado,
rim, e para diferentes organismos, como
Mycobacterium tuberculosis (agente
causal da tuberculose), Plasmodium
falciparum (agente causal da malria),
Helycobacter pylori (agente causal da
lcera e gastrite). Na rea agronmica,
h estudos protemicos de milho, arroz, trigo, cana-de-acar, eucalipto
entre outras, e de organismos que
causam imapcto econmico, como
aquele que fixa nitrognio atmosfrico
para as leguminosas, Rhizobium spp.,
ou que causam doenas em em feijoerio e citros como Xanthomonas spp.
Aqui no Brasil, pesquisas protemicas
esto sendo realizadas com sucesso.
No Estado de So Paulo, graas ao
apoio da Fundao de Amparo a Pesquisa (FAPESP), estudos protemicos
esto sendo conduzidos para entender
o processo da interao entre a bactria patognica, Xylella fastidiosa, de
citros variedade laranja doce.
Tcnica aplicada ao
Estudo Protemica
A eletroforese de duas dimenses
em gel de poliacrilamida (2DE) em
conjunto com a espectrometria de
massa so as duas tecnologias mais
usadas atualmente para anlise de proteoma. A primeira aplicada para
separao, deteco e quantificao
das protenas e a espectrometria de
massa para identificao das protenas
graas aos grandes avanos da bioinformtica.

Figura 1. Esquema de procedimento de eletroforese bidimensional (A)


Preparao de amostra: rompimento celular seguido de extrao e
solubilizao de protenas das clulas (ou tecidos) (B) Separao na primeira dimenso por IEF, onde as protenas so separadas pelo seu ponto isoeltrico. (C) Separao na segunda dimenso SDS-PAGE, que separa protenas pela massa molecular aparente. (D) colorao das protenas
separadas, resultando num mapa de pontos (spots). Digitalizao da
imagem e anlise densitomtrica por programas de computador
vestigam. Sendo assim, protenas de
uma forma geral controlam a vida e a
sade, ou seja, preciso entender as
protenas e como elas operam celularmente para assim entender como regular os mecanismos da doena para

Eletroforese
Bidimensional (2DE)

um posterior tratamento.
A Protemica pode ser aplicada em
diversas reas de interesse como por
exemplo na investigao de marcadores moleculares em determinadas doenas indicando a resposta da clula ou

A tcnica de eletroforese bidimensional foi introduzida na dcada de 70.


Entretanto foi nos ltimos 10 anos que
ocorreram os grandes avanos nos
mtodos que possibilitaram identificar
protenas separadas atravs de 2DE de
forma sensvel, rpida e conclusiva.
Desde a introduo da tcnica de

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Figura 2. Perfil da protena total (150 ug) de Xylella fastidiosa, bactria patognica de citros var. laranja doce. IEF ocorreu entre pH3-10 e a
2DE em gel gradiente (9-18%) de poliacrilamida. Gel corado com nitrato de prata. Projeto financiado pela FAPESP

Figura 3. Esquema de Peptide mass


fingerpriting (PMF) Os spots so
recortados do gel 2DE e submetidos a
digesto enzmtica, geralmente usando-se tripsina. Os peptdeos resultantes so incorporados a uma matriz e
identificados por espectrometria de
massa (MALDI-TOF). A massa dos
peptdios so comparadas a um banco
de dados para identificar sequncias
de amoncidos, cujas massas previstas
batem com a massa dos peptdios obtidos
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2DE, diversas modificaes foram feitas, principalmente na primeira dimenso. Utilizava-se os anflitos para estabelecer o gradiente de pH para a
separao das protenas pelo ponto
isoeltrico. Entretanto, o uso de anflitos com esta finalidade tem diversos
problemas incluindo a incapacidade
de correr grandes quantidades de protenas necessrias para a micro seqncia, pouca estabilidade do gradiente de pH durante a eletroforese e
freqente falta de reprodutibilidade
dos gis entre os laboratrios. O uso
dos gradientes de pH imobilizados
(IPG) para a separao por cargas na
2DE solucionou muitos dos problemas. Encontra-se no mercado fitas de
gis IPG desidratadas (Amersham Biosciences) feitas de uma matriz de
poliacrilamida, a qual modificada
covalentemente com grupos cidos e
bsicos que formam o gradiente de pH
imobilizado em toda a extenso do gel.
H diversas faixas de pH, desde ampla
(3-10), como faixas estreitas, como
por exemplo de 4,5-5,5 ou 7,0-11,0.
Esta flexibilidade na escolha das faixas
de pH a serem utilizadas de grande
utilidade para separar eficientemente
o maior nmero de protenas possvel.
A 2DE combina duas tcnicas de
separao: a primeira separao (primeira dimenso) a focalizao isoeltrica (IEF), e a segunda dimenso
(2DE) a eletroforese em gel de
poliacrilamida, chamada de SDS-PAGE.
No IEF as protenas so separadas,
atravs de uma alta tenso, em um
gradiente de pH imobilizado em um
gel de acrilamida at alcanarem a
posio estacionria onde a carga total
zero. O pH no qual a protena tem
carga lquida zero chamado de ponto
isoeltrico (pI). Na 2DE, as protenas
so separadas pelo peso molecular,
atravs de uma tenso, tambm em
gel de poliacrilamida contendo ou no
o detergente sulfato dodecil de sdio
(SDS-PAGE). A mobilidade eletrofortica se d de acordo com o tamanho da
protena sendo restringida pelo tamanho do poro da matriz de poliacrilamida, de uma forma que as protenas
migram em uma velocidade proporcional ao seu tamanho. A matriz de
poliacrilamida usada pode ser homo-

Figura 4. Ilustrao Esquemtica de DIGE ( adaptado de Patton, 2002)


Duas amostras diferentes so derivatizadas em dois fluorforos diferentes,
combinadas e submetidas a 2DE. AS protenas so detectadas em um
scanner duplo a laser com filtros de excitao diferentes para gerar duas
imagens separadas. As imagens so, ento sobrepostas com a ajuda de um
programa de computador, os sinais so normalizados e os spots so
quantificados. As diferenas na expresso das protenas so identificadas
pela avaliao de uma imagem pseudo-colorida e os dados so comparados
gnea ou em gradiente. J os parmetros eltricos usados na corrida dependem do tipo e da quantidade de amostra aplicada, influenciando na qualidade da focalizao. Estes parmetros
devem ser cuidadosamente monitorados e controlados. Em aparelhos do
tipo IPGphor (Amersham Biosciences),
geralmente utiliza-se uma corrente de
50 uA por strip e uma voltagem que
vai de 100 a 8000 (80kVh-150kVh).
Para aplicar a tcnica de 2DE (Figura 1), as amostras biolgicas so, de
uma maneira geral, tratadas da seguinte forma. Primeiramente, as clulas so
rompidas atravs de mtodos qumicos (detergentes, solventes, etc) ou
fsicos (homogeneizadores, monhos,
french press). Seguido da ruptura
celular, as protenas so solubilizadas e

desnaturadas em uma soluo contendo detergentes no inicos ou zwiterinicos, caotropes (uria, tiouria), e
pequenas quantidades de agentes redutores, como o ditiotreitol (DTT).
Uma soluo comum a composta de
uria (8 M), CHAPS (4%), DTT (70mM),
anflito (0,5 a 2%) e azul de bromofenol (0,005%). A concentrao do anflito deve ser determinada para cada
amostra empiricamente.
A solubilizao das protenas uma
etapa fundamental para o sucesso da
eletroforese bidimensional. Estas solues devem ser otimizadas baseada
nas amostras utilizadas no experimento. Sabe-se que protenas de membrana so de difcil visualizao em gel
devido, principalmente a dificuldade
de solubiliz-las, j que o uso do SDS

limitante para a 2DE. Recentemente


foram disponibilizados diversos detergentes zwiterinicos que melhoraram muito o desempenho das solues de solubilizao para protenas
hidrofbicas (Chevallet et al., 1998).
Estes detergentes so sulfobetanas
com cauda de cadeia geralmente com
8 a 16 carbonos. A Calbiochem comercializa estes detergentes com os
nomes comerciais de SB 3-10, SB 312, ASB 14, ASB 16. Fizemos um
estudo comparativo da eficincia de
4 detergentes na solubilizao de
protenas de membrana de Xyllela
fastidiosa(projeto Proteoma de Membrana de Xyllela fastidiosa financiado
pela FAPESP), e mostramos que o
ASB 14 mais eficiente quando comparado com o SB 3-10, seguido do
CHAPS e Triton X-100 (Di Ciero et al.,
resultados recentes).
Aps serem submetidas a 2DE, as
protenas so visualizadas atravs de
mtodos de deteco especficos para
cada objetivo, como por exemplo
deteco de protenas totais, modificaes ps-traducionais, etc. A maioria desses mtodos se baseia em
colorao de protenas com corantes
ou reagentes fluorescentes, ou deteco de protenas marcadas radioativamente por fluorografia ou autoradiografia.
Dentre os diversos mtodos para
colorao de protenas, os mais usados so colorao por Azul de Coomassie (Coomassie Blue) e colorao
por prata, devido ao custo, facilidade
de uso e compatibilidade com mtodos de caracterizao microqumica,
tais como sequncia automtica de
aminocidos e espectrometria de massa. Coomassie Blue detecta protenas
com concentrao superior a 100 ng,
enquanto a prata mais sensvel que o
Coomassie, podendo detectar protenas em concentraes de at 1 ng.
Os mtodos de marcao radioativa baseia-se na incorporao de 3H,
14
C, 35S, 32P, 33P ou 125I s protenas.
Aps a eletroforese a deteco do sinal
pode ser feita usando-se filme para
autoradiografia ou fluorografia direta.
Esses mtodos so aplicados em proteoma juntamente com a colorao
por Azul de Coomassie ou nitrato de
prata para anlise simultnea do nveis

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Figura 5. Ilustrao Esquemtica de Proteoma Mltiplo (MP) (Adaptado


de Patton, 2002) Duas amostras diferentes so submetidas a 2DE. Os
gs so corados por um atributo funcional particular, tal como glicosilao,
e digitalizados. Os gis so ento corados para protenas totais usando o
corante SYPRO Ruby e digitalizados novamente. As duas imagens so
ento sobrepostas com a ajuda de um progarama de computador, e os
spots so quantificados. As difertenas na glicosilao e expresso de protenas totais so identificadas pela anlise de imagens pseudo-coloridas e
comparao de dados. O registro do perfil de protena total com padres
de glicosilao so feitos pela sobreposio das imagens
de expresso da protena total juntamente com a taxa de sntese de protena, bem como fornecer regies marcadas para a localizao de protenas
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de baixa abundncia em 2DE. Embora


os mtodos de deteco por marcao
radioativa sejam bastante sensveis e
quantitativos por uma maior faixa de

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abundncia, eles tendem a ser mais


caros e perigosos de manipulao, e
limitados a amostras que podem ser
marcadosradioativamente(geralmente por marcao metablica).
Mtodos de colorao reversa tm
sido usados com menor freqncia
para a visualizao de protenas em
2DE, os quais empregam cloreto de
potssio, cloretos de cobre, cloreto
de zinco, acetato de cobalto cloreto
de nquel ou cloreto de zinco imidazol. Dentre elas, as mais usadas em
proteoma so cloreto de potssio,
cloreto de cobre e cloreto de zinco. O
cloreto de cobre um pouco mais
sensvel que o Azul de Coomassie,
entretanto o cloreto de potssio
menos sensvel. O mtodo que emprega o cloreto de zinco imidazol o
mais sensvel entre eles e pode ser
avaliados por densitometria, embora
a faixa linear dinmica est restrita a
10-100 ng. Os gis corados com
zinco-imidazol podem ser eletrotransferidos (electroblotted) ou eletroeludos (electroeluted) pela adio
de um agente quelante ao tampo
de transferncia. Outra vantagem
deste mtodo que ele compatvel com mtodos de microsequncia
baseados em Edman e a digesto
trptica in gel para a identificao dos
peptdeos por espectrometria de
massa MALDI-TOF (matrix-assisted
laser desorption ionization time-offlight).
A deteco de protenas por fluorescncia em eletroforese em gel
muito usada em laboratrios que pesquisam proteoma em larga escala. A
faixa de deteco linear dinmica
normalmente superior aos mtodos de colorao. Os corantes disponveis no mercado so o Vermelho
do Nilo (Nile Red), SYPRO Vermelho, SYPRO Laranja e SYPRO Tangerina. Os corantes SYPRO so fceis
de serem aplicados, atravs de somente uma etapa de colorao de 30
a 60 minutos sem a necessidade de
descolorao. Estes corantes detectam pequenas quantidades de protena 4-8 ng e h metodologia para
quantificao por anlise de imagem.
Para anlise de modificaes pstraducionais so usados mtodos de
deteco especficos para glicoprotenas (autoradiografias com a incor-

Figura 6. Estrutura do reagente ICAT, composto de trs elementos: um


grupamento reativo tiis, que se liga resduos de cistenas reduzidas; um
espaador que pode conter deutrios (reagente pesado, com os deutrios
nas posies indicadas por X) ou no (reagente leve, com hidrognios nas
posies indicadas por X); e um grupamento de biotina utilizado para o
isolamento seletivo dos peptdios contendo cistena (marcados com ICAT)

porao de 3H e 14C; fluorescncia,


mtodo de Schiff, Azul de Alcian, etc.),
fosforilao (autoradiografias com a incorporao de 32P ou 33P na cultura de
clulas ou aps dentro de fraes subcelulares por protenas cinases, deteco in gel por hidrlise alcalina de
sters de fosfato de serina ou treonina
preciptando-se o fosfato liberado com
clcio formando um complexo de fosfomolibdato e ento visualizando-se
com um corante, tal como Verde de

Metil), protelise (ensaios zimogrficos, corantes fluorescentes BODIPY),


nitrosilao (mtodo de Biotina), metilao (fluorografia), ribolizao (anticorpos especficos anti-ADP ribose).
Aps a colorao do gel, observa-se
um perfil bidimensional de pontos
(spots), sendo que em cada ponto h
mltiplas cpias de uma protena. A
imagem deste perfil posteriormente
documentada atravs de programas
de computador apropriados (Figura

2), como o Melanie desenvolvido


pela Genebio (Genebra, Suia), Image Master (Amersham BioSciences)
e outros.
Estes programas apresentam vrias funes, entre elas a de permitir
uma anlise da abundncia da protena em cada spot atravs do volume,
intensidade e rea. Diversos gis representando diferentes proteomas
podem ser comparados com o objetivo de detectar protenas diferencialmente expressas .
Apesar da tcnica de 2DE ter o
potencial de separar milhares de protenas e ser a tcnica mais utilizada
para anlise de proteomas, ela apresenta algumas limitaes para protenas muito cidas (pH menor que
3,5) or bsicas (pH maior que 9)
protenas de baixa abundncia e paras protenas hidrofbicas, geralmente presentes nas membranes celulares. Porm, esta tcnica est sendo
cada vez mais aperfeioada e logo
limitaes como estas deixaro de
existir. No geral, a 2DE um mtodo
de separao eficiente, porque todas
as protenas numa amostra so separadas simultaneamente, fornecendo
informaes teis sobre pI, massa
molecular, expresso e abundncia
relativa e modificaes ps-traducionais pela alterao da mobilidade
eletrofortica.
Identificao das Protenas

Figura 7. Esquema do procedimento de ICAT - Os resduos de cistena


reduzida das protenas em amostras a serem comparadas so rotulados
separadamente. Em uma das amostras usada a forma isotopicamente
pesada e na outra amostra a forma leve do reagente ICAT. As duas amostras so combinadas e digeridas com tripsina. Os peptdios marcados, que
contm cistena so isolados por cromatografia de afinidade e, posteriormente analisados por espectrometria de massa para a determinao da
identidade da protena que deu origem ao peptdio e a abundncia relativa de cada protena nas amostras sendo comparadas

H vrias tcnicas para identificar


uma protena, como por exemplo, o
sequenciamento da protena atravs
da degradao por Edman, sequenciamento qumico, processo imunolgico, espectrometria de massa entre
outros. Uma das tcnicas mais utilizadas para a identificao das protenas
a anlise do fingerprinting da
massa precisa de um nmero de
peptdios derivados da mesma protena (Figura 3). Para tal, as protenas
de interesse so recortadas do gel,
so fragmentadas (obteno dos pepitdeos), geralmente por digesto
trptica, e os fragmentos so analisadas no espectrmetro de massa MALDI-TOF auxiliados por programas de
informtica desenvolvidos por vrios
grupos (Pappin, 1997; Mann et al.,
1993; Henzel, 1993; Yates et al.,

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1993; James et al., 1993).


Uma vez conhecida a sequncia
desta protena, a sua identificao
geralmente feita por correlao de
dados depositados em bancos acessveis via internet, como o da Swiss-Prot
(Suia).
Tcnicas e Opes para Anlise
de Proteoma Diferencial
O proteoma diferencial compara
diferentes perfis de protenas entre
situaes de interesse. O objetivo central do proteoma diferencial melhorar o contedo de informaes do
estudo de proteoma atravs de anlises mltiplas. As trs principais tcnicas usadas atualmente para anlise de
proteoma diferencial so eletroforese
diferencial em gel (DIGE), Multplex
Proteome (MP) e rotulao de protenas com reagentes ICAT (isotopecoded affinity tagging).
A tcnica DIGE (Figura 4) usa sters de succinil de corantes de cianina,
CY2, CY3 e CY5, que podem ser
empregados para rotulao fluorescente para trs populaes complexas
de protenas antes de mistur-las e
resolv-las simultaneamente na mesma 2DE. Recentemente, foi desenvolvido outro procedimento similar usando corante Alexa Fluor.
O Multplex Proteome (MP) baseia-se na determinao paralela dos
nveis de expresso de protenas bem
como em certos atributos funcionais,
tais como nveis de glicosilao, capacidade de ligao com drogas ou metabolizao de drogas (Figura 5). Esta
tecnologia utiliza o mesmo fluorforo
para medir protenas atravs de todos
os gis no banco de dados, e emprega
fluorforos adicionais com diferentes
excitaes e/ou emisso mxima para
acentuar atributos funcionais especficos da espcie. A vantagem desta
tcnica sobre a DIGE que ela d uma
faixa muito mais larga de informaes.
A tcnica de ICAT permite identificao sistemtica das protenas numa
mistura complexa e quantificao precisa das diferenas em abundncia de
cada protena presente em duas ou
mais amostras proticas. O reagente
ICAT formado por trs componentes funcionais: um grupamento reativo
164

tiis, que seletivo para os grupamentos sulfidrilas das cadeias laterais


de cistenas reduzidas, um grupo de
etileno glicol que pode conter tomos
de deutrio (isotopicamente pesado)
ou no (isotopicamente normal) e que
possibilita realizar quantificao precisa por MS, e um grupamento de biotina
que a etiqueta de afinidade utilizado como base para o isolamento seletivo dos peptdios contendo cistena
(marcados com ICAT) de uma mistura
complexa de peptdios, atravs de
cromatografia de afinidade em coluna
de avidina (Figura 6).
Os resduos de cistena reduzida
das protenas nas duas amostras a serem comparadas so rotulados separadamente durante o experimento. Em
uma das amostras usada a forma
isotopicamente pesada e na outra
amostra a forma leve do reagente
ICAT. As duas amostras so combinadas e digeridas com tripsina. Os peptdios marcados, que contm cistena
so isolados por cromatografia de afinidade e analisados por espectrometria
de massa, determinando assim a identidade da protena que deu origem ao
peptdio e a abundncia relativa de
cada protena nas amostras sendo comparadas (Figura 7) (Gygi et al., 1999).
Concluses
A Protemica veio para revolucionar os estudos de Genoma, uma vez
que utiliza-se de suas ferramentas para
identificar as protenas expressas em
situaes especficas em um dado
momento naquele ambiente. A Protemica dinmica e permite fazer estudos comparativos. Os mtodos para
anlise global da abundncia de protenas, modificaes ps-traducionais e
as mudanas nesses dois parmetros
como a funo de um estado biolgico
da clula ou tecido se desenvolveram
utilizando-se das tcnicas de eletroforese, cromatografia e espectrometria
de massa como componentes-chave
para o estabelecimento de plataformas de estudo. As inovaes tecnolgicas na deteco, anlise e quantificao de protenas acelerou rapidamente o desenvolvimento da Protemica
nos ltimos 4 anos. Isso, sem dvida,
ocorreu devido ao foco que institui-

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es privadas e pblicas deram


pesquisa do Genoma ao Proteoma.
No Brasil, a Protemica vem se desenvolvendo desde o incio do Projeto Genoma da Xyllela fastidiosa financiado pela Fundao de Amparo a
Pesquisa do Estado de So Paulo (FAPESP). Diversos grupos inseridos no
Genoma Funcional da FAPESP ainda
continuam trabalhando com tcnicas
protemicas com o objetivo de mapear as protenas funcionais importantes no estabelecimento da doena
do amarelinhoe a sobrevivncia da
bactrianaslaranjeirasvariedadedoce.
Com os resultados obtidos destes estudos espera-se criar estratgias de
controle desta doena, a qual j tem
causado srios danos citricultura
paulista.
Literatura Consultada
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Rouquie D, Fuchs A, Kieffer S,
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