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M O L E C U L A R

Aprendemos a ler, abrimos

um livro e comeamos
a folhe-lo. Mas sabemos
apenas algumas poucas
palavras e, para ler
e entender totalmente
a obra, precisamos obter
um vocabulrio mais rico
e saber ainda o significado
das palavras em conjunto
na formao de frases,
pargrafos e captulos.
Essa analogia revela
o quadro atual
do conhecimento cientfico
sobre a biologia
e o desenvolvimento
dos organismos.
O seqenciamento
da molcula de DNA
de um organismo nos revela
o que est escrito
no livro da vida dele.
No entanto, a informao
contida no DNA precisa
ser traduzida em protenas,
as palavras do livro,
para que seu contedo
seja utilizado. O papel
da pesquisa do proteoma
o conjunto das protenas
passa a ser, portanto,
o de nos ensinar
o vocabulrio
e a compreenso geral
do texto.

Adriano Monteiro
de Castro Pimenta
Ncleo de Biomolculas
e Laboratrio de Venenos
e Toxinas Animais,
Departamento de Bioqumica
e Imunologia
(Instituto de Cincias Biolgicas),
Universidade Federal de Minas Gerais
16
16
16 CCCIIINNNCCCIIIAAA HHHOOOJJJEEE vvvooolll... 333222 nnn 11192
92
91

A caracterizao dos genomas de organismos foi uma das principais

foras motrizes da cincia dos recentes anos 90.
Grandes iniciativas como o Projeto Genoma Humano, de mbito mundial, ou a Rede Onsa, consrcio
brasileiro de cientistas que seqenciou o genoma
da bactria Xylella fastidiosa possibilitaram esforos conjuntos (reunindo grande nmero de pesquisadores) sem precedentes
na histria da cincia.
A inovao e consolidao das tcnicas de anlise genmica fizeram com que a biologia molecular
ganhasse cada vez mais espao
tambm fora da rea acadmica, causando, de forma significativa e positiva, impacto para a vida cotidiana do cidado comum.
Nos ltimos anos, temas relacionados s capacidades de an-

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lise e de transformao de seres vivos,

embutidas nas tcnicas de biologia molecular, vieram tona e a sociedade viu-se
envolvida em discusses sobre testes de paternidade, alimentos transgnicos, terapia gnica
e, principalmente, a seqncia genmica humana e a clonagem de seres vivos.
Muitos consideram o conhecimento sobre os genes apenas um primeiro passo, sendo necessria
ainda uma compreenso mais aprofundada dos processos que ocorrem aps o armazenamento, a duplicao e a traduo do material gentico. A chamada
era ps-genmica comeou com a constatao de
que os dados trazidos pelo seqenciamento das molculas de DNA, embora relevantes, so limitados,
sendo imprescindvel investigar tanto os processos
de transcrio das informaes contidas no genoma
quanto os seus produtos, as protenas.
Como se sabe, os genes so compostos por quatro
diferentes nucleotdeos, dispostos em uma seqncia

a b r i l d e 2 0 0 3 C I N C I A H O J E 17

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600

Proteome

Proteomic

Proteomics

500
Nmero de citaes

FONTE: MEDLINE (WWW.NCBI.NLM.NIH.GOV/ENTREZ/QUERY.FCGI)

especfica. Uma seqncia de trs nucleotdeos forma um cdon. Cada cdon o cdigo para um aminocido, e vrios aminocidos ligados em seqncia formam uma protena. Por isso se diz que o DNA
um cdigo gentico: as informaes contidas nesse cdigo so usadas para expressar, ou seja, produzir
as protenas, as executoras das ordens do gene.
Contrariando as expectativas iniciais, o nmero
total de genes no genoma humano de menos de 40
mil. Aparentemente, esse nmero apenas o dobro
dos genomas de animais inferiores, como vermes
ou moscas. Entretanto, h diferenas importantes entre esses genomas. Os genes humanos esto espalhados em regies maiores de DNA genmico e so
usados para construir mais alternativas de transcrio, como chamada a etapa inicial da produo de
protenas. Essas alternativas resultam, no homem, em
talvez cinco vezes mais protenas primrias (protenas recm-produzidas e sem nenhum tipo de modificao qumica) que nos outros animais citados. O
conhecimento dos proteomas, portanto, fornecer
oportunidades sem precedentes para estudos das funes dos genes.
O termo proteoma apareceu em meados dos anos
90 e designa o conjunto de protenas expressas por
um determinado genoma. O tema foi prontamente
absorvido pela comunidade acadmica como uma
das vertentes da era ps-genmica. A utilizao dos
termos relacionados ao tema cresceu rapidamente
no Medline, principal banco de dados em pesquisas
biomdicas, desde sua criao at o final de 2002
(figura 1).
Enquanto o genoma de um organismo permanece relativamente estvel ao longo da sua vida, o proteoma extremamente dinmico e varivel. Todas
as clulas de um organismo, exceto as reprodutivas
(os gametas), tm rigorosamente o mesmo genoma,
mas apresentam formas, funes e caractersticas
totalmente diferentes. Ento, o que faz uma clula
pancretica pertencer ao pncreas e secretar insulina, e no ser responsvel pela transmisso de impulsos nervosos no crebro, por exemplo? O que tor-

400

300

200

na uma clula do msculo afilada e com propriedades contrteis e no arredondada e cheia de gordura?
No temos ainda respostas para vrias dessas perguntas, mas sabemos que o conjunto de protenas
expresso em cada uma dessas clulas (o seu proteoma) extremamente diferente. A anlise protemica permite saber se e quando um produto gentico
est sendo expresso, a concentrao relativa desse
produto e, por fim, as modificaes que podem ocorrer nessas protenas aps a sua traduo. Tais informaes no podem ser previstas com preciso a
partir das seqncias dos cidos nuclicos.
A anlise protemica vai muito alm da simples
listagem de protenas e pode fornecer indcios substanciais quanto organizao e dinmica dos processos metablicos, regulatrios e de sinalizao
atravs dos quais a clula se desenvolve. Mais ainda,
a anlise protemica pode mostrar como esses processos se tornam disfuncionais nos estados patolgicos e como podem ser manipulados, mediante, por exemplo, a administrao de medicamentos ou a terapia gnica.
Portanto, uma das grandes inovaes prometidas
pelo conhecimento dos proteomas, alm do
mapeamento de intrincados caminhos metablicos celulares, a possibilidade de identificar novos alvos farmacolgicos, novas molculas bioativas e marcadores biolgicos que podem ser usados
para diagnsticos clnicos.

Como feita a anlise

protemica?
A anlise protemica baseia-se em duas plataformas
metodolgicas complementares.
Uma vez determinado o complexo multiprotico
a ser estudado, a primeira plataforma realiza uma
separao prvia dos componentes a serem analisados na segunda plataforma. A passagem da amostra
pela primeira plataforma tem dois objetivos bem
estabelecidos. O primeiro aumentar, atravs de
uma separao de molculas, o poder resolutivo da
futura anlise dos componentes da amostra. O segundo fornecer uma figura esttica (uma fotografia)
dos compostos separados, que permite uma comparao no s qualitativa, mas tambm quantitativa
entre duas ou mais amostras fotografadas. As fotografias retratam o proteoma estudado em determinadas condies fisiolgicas ou patolgicas.

100
0
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1998

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2001

Figura 1. Evoluo do uso dos termos relacionados ao

estudo de proteomas nas publicaes cientficas
integrantes do banco de dados Medline

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A comparao qualitativa pode mostrar apenas

se uma protena est presente ou no na amostra
estudada, enquanto a anlise quantitativa revela as
concentraes relativas de determinada protena
nas diferentes condies analisadas. Tcnicas como a eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida ou a cromatografia lquida multidimensional, capazes de separar diferentes fraes da amostra segundo suas propriedades fsico-qumicas, so
usadas como primeiras plataformas.
A segunda plataforma realiza a anlise e caracterizao estrutural das molculas separadas na primeira. A sensibilidade, preciso e poder resolutivo
fazem dos aparelhos de espectrometria de massa a
plataforma ideal para a anlise estrutural e identificao das protenas presentes na amostra estudada
(ver Preciso e sensibilidade). Alm dessas vantagens, tais equipamentos so a galinha dos ovos de
ouro das grandes indstrias farmacuticas e biotecnolgicas, por sua fcil automatizao e pela rapidez

Preciso e

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de anlise. Decidida a metodologia a ser empregada,

a anlise de uma amostra no espectrmetro de massa
pode ser realizada em apenas alguns minutos.
O objetivo dessas anlises fornecer uma lista de
massas moleculares (mass fingerprinting ou peptide
mapping), usada para identificar sem ambigidades a amostra ou os componentes dessa amostra.
Embora haja uma superposio entre os termos, o
conceito de mass fingerprinting cuja traduo seria impresso digital de massas, dando a idia de
uma listagem nica de massas moleculares usado principalmente para relacionar os componentes
proticos de um dado proteoma. J o termo peptide
mapping (mapeamento peptdico) usado preferencialmente para descrever o padro de clivagem (corte) por enzimas, ou fragmentao, de uma molcula
protica. Em ambos os casos, o objetivo listar as
massas dos componentes do proteoma ou dos fragmentos (peptdeos) de uma protena. Essa impres

so digital nica para cada amostra analisada.

sensibilidade

Desde seu surgimento, na primeira metade do sculo passado, a espectrometria de massa uma pea importante na pesquisa em qumica de compostos orgnicos e inorgnicos. Apenas na ltima dcada, no entanto, tornou-se uma tcnica analtica molecular valiosa em pesquisas biolgicas, fornecendo de maneira rpida, precisa e sensvel a massa de biomolculas como protenas, acares, cidos nuclicos, lipdios e outros compostos orgnicos. Essa tcnica mede a massa molecular (em
dltons) a partir da razo entre a massa e a carga de molculas ionizadas. A necessidade de ionizar as molculas para obter
um espectro de massa era um grande obstculo no caso de molculas biolgicas. Nos mtodos iniciais de ionizao, as molculas
a serem analisadas tinham que estar em fase gasosa, sob alto vcuo e a altas temperaturas, condies incompatveis com
a maioria das molculas biolgicas.
Esse problema foi resolvido com a primeira grande inovao na espectrometria de massa: o surgimento da ionizao branda, no fim dos anos 80. Na ionizao do tipo ES (electrospray ionization), a amostra, solubilizada, passada por um tubo capilar
submetido a alta voltagem. Na sada do tubo forma-se uma nebulizao, e as molculas aprisionadas nas gotculas suspensas em vcuo so, ento, ionizadas. Na ionizao do tipo Maldi (matrix-assisted laser desorption ionization), a amostra
misturada a uma matriz inorgnica solubilizada em um solvente bifsico. A mistura aplicada em uma placa de metal e, quando se promove a evaporao do solvente, as molculas da amostra cristalizam-se junto com a matriz. Esses cristais so ento bombardeados por um feixe de raio laser para a ionizao das molculas. Essas tcnicas de ionizao so as mais utilizadas hoje para ilustrar sua importncia para a cincia, dois dos ganhadores do Nobel de qumica de 2002, o norte-americano John B. Fenn e o japons Koichi Tanaka, foram escolhidos pelo desenvolvimento de mtodos de ionizao branda para anlise por espectrometria de massas de macromolculas biolgicas.
Uma segunda inovao relevante foi a conjugao de analisadores de massa em tandem, ou seja, em seqncia. A espectrometria de massa em tandem aumentou muito o poder de resoluo e a sensibilidade do mtodo, tornando-se obrigatria nas anlises estruturais de molculas biolgicas. Ela torna possvel selecionar uma s molcula ionizada e fragment-la
pela coliso com um gs inerte (em geral argnio ou mesmo ar). A anlise das massas dos fragmentos obtidos fornece informaes sobre a estrutura da molcula original, permitindo determinar, por exemplo, a seqncia de aminocidos de um
peptdeo ou uma alterao qumica especfica em algum resduo de aminocido, por exemplo. Portanto, o grande e recente
impulso no estudo dos proteomas a idia de decifrar o conjunto de protenas de um genoma relativamente antiga
deu-se a partir do desenvolvimento de tcnicas de espectrometria de massa direcionadas para a anlise de molculas
biolgicas.

abril de 2003 CINCIA HOJE 19

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Bactria
desconhecida

Bactria
espcie 1

Bactria
espcie 2

Bactria
espcie 3

Mass fingerprinting dos extratos das bactrias

Bactria desconhecida pertence espcie 3

So, portanto, duas situaes distintas. A primeira envolve apenas a deteco da impresso digital
das massas moleculares dos componentes de determinado extrato biolgico. Nesse caso, a idia realizar uma classificao de diferentes extratos pela
comparao das massas moleculares de seus componentes. Esse processo extremamente til, por exemplo, para identificar e classificar tipos de clulas
cancerosas, diferentes microrganismos ou venenos
de variadas espcies de serpentes (figura 2).
Na segunda situao, a protena isolada na pri-

2 0 C I N C I A H O J E v o l . 3 2 n 1 92

Figura 2. Identificao de clulas bacterianas por mass

fingerprinting: a anlise do extrato de uma bactria
desconhecida determina sua impresso digital de
massa, o que permite identific-la corretamente, por
comparao com a mass fingerprinting de bactrias
conhecidas tipo de anlise usada, por exemplo, para
identificar bactrias causadoras de infeces
meira plataforma (por eletroforese bidimensional ou
cromatografia lquida) clivada por enzimas para a
obteno do mapeamento peptdico. A protena
intacta clivada pela enzima em vrios pontos especficos, que dependem da seqncia dos aminocidos e da prpria enzima usada, resultando em
vrios fragmentos menores de massas moleculares
diferentes. O padro de clivagem fornecido pelas
diversas massas moleculares dos fragmentos da protena ento comparado com um padro obtido in
silico, ou seja, um padro terico de clivagem de uma
seqncia protica extrada de um banco de dados
de seqncias genmicas ou proticas. A comparao das massas moleculares obtidas com as do banco
de dados permite identificar as protenas (figura 3).
Nesse segundo caso, possvel ainda verificar
modificaes ps-traducionais, ou seja, alteraes
qumicas ocorridas aps a produo da protena e
determinantes para sua funo.
Em ambas as situaes acima, possvel determinar a expresso de protenas e suas quantidades
relativas em extratos biolgicos. A quantificao

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relativa dos componentes extremamente importante para verificar se houve aumento ou reduo
da quantidade de protena produzida. Essa regulao
da expresso gnica, resultando em maior ou menor
quantidade de protena, pode estar relacionada ao
aparecimento ou desenvolvimento de uma doena
(como um tipo de cncer) e medir o processo pode
ajudar no diagnstico ou no tratamento da mesma.
Esses tipos de anlises protemicas, no entanto,
apresentam duas limitaes importantes. A primeira diz respeito ao fato de que, se uma protena
identificada por comparao com padres obtidos
de protenas j analisadas, a identificao de uma
protena nova, cuja seqncia de aminocidos ainda no conhecida, pode ser um srio problema.
A segunda limitao que identificar a seqncia de aminocidos das protenas apenas a ponta
do iceberg. Mesmo sabendo-se que protena , no
se pode saber sobre sua atividade, a menos que sua
funo j tenha sido determinada, ou que a protena pertena a uma famlia com funes j conhecidas. Em ltima anlise, uma nova protena precisar ser purificada, ter sua estrutura e arranjos
espaciais determinados e sua funo testada experimentalmente in vitro ou in vivo.
Muitas vezes, a quantidade de protena pequena
demais e preciso recorrer sntese artificial ou
expresso da mesma por meio da engenharia gentica de vrus ou bactrias. Tais mecanismos, porm,

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no so garantidos e as protenas assim produzidas

podem no ter os efeitos biolgicos esperados. Todo
esse processo pode levar anos de estudo. Nesse aspecto, o estudo dos genomas apresenta uma enorme
vantagem, pois as molculas de DNA e RNA tm
estrutura relativamente simples e podem ser copiadas pela tcnica da reao em cadeia da polimerase
(conhecida como PCR, do ingls polimerase chain
reaction).

Por que estudar

o proteoma?
O estudo do proteoma importante porque pode levar a trs vertentes bsicas com implicaes diretas em vrios campos da biologia e da


biotecnologia.
Figura 3. Identificao de protenas por peptide mapping.
As protenas de um complexo multiprotico so separadas
por cromatografia lquida ou eletroforese e em seguida
uma protena isolada (um ponto do gel) clivada (cortada)
por enzimas. Os fragmentos obtidos (peptdeos)
so analisados no espectrmetro de massa,
obtendo-se uma lista das massas moleculares dos
mesmos, que permite a identificao da protena original
por comparao com a lista terica existente
em um banco de dados de seqncias proticas

abril de 2003 CINCIA HOJE 21

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Sugestes
para leitura
ANDERSON, N. L.;
MATHESON, A. D. &
STEINER, S.
Proteomics:
applications in
basic and applied
biology, in Current
Opinion in
Biotechnology., v.
11 (4), p. 408,
2000.
JONSSON, A. P. Mass
spectrometry for
protein and
peptide
characterization,
in Cellular and
Molecular Life
Sciences, v. 58, p.
868, 2001.
PIMENTA, A. M. C.;
STOCKLIN, R.;
FAVREAU, P.;
BOUGIS, P. E. &
MARTINEAUCLAIRE, M. F.
Moving pieces in a
proteomic puzzle:
mass
fingerprinting of
toxic fractions from
the venom of
Tityus serrulatus
(Scorpiones,
Buthidae),
in Rapid
Communications
in Mass
Spectrometry, v. 15
(17), p. 1.562, 2001.
POON, T. C. &
JOHNSON, P. J.
Proteome analysis
and its impact on
the discovery of
serological tumor
markers, in Clinica
Chimica Acta, v.
313 (1-2), p. 231,
2001.
BANKS, R. E.; DUNN,
M. J.;
HOCHSTRASSER, D.
F.; SANCHEZ, J. C.;
BLACKSTOCK, W.;
PAPPIN, D. J. &
SELBY, P. J.
Proteomics: new
perspectives, new
biomedical
opportunities, in
The Lancet, v. 356,
p. 1.749, 2000.

Figura 4. Fluxo das informaes genticas em uma clula: medida que a informao gentica repassada,
aumenta a complexidade molecular da clula o sufixo oma tornou-se sinnimo de conjunto de, e quando aplicado a uma palavra significa o estudo estrutural
e dinmico do conjunto de molculas ou processos designados por aquela palavra

Primeiro, a caracterizao protemica a chance

de desvendar os intrincados caminhos metablicos nas diversas etapas celulares, gerando um conhecimento sem precedentes na biologia celular.
Tal conhecimento tornar possvel identificar novos alvos farmacolgicos especficos, relacionados, por exemplo, a determinada etapa de desenvolvimento de uma clula cancerosa.
Segundo, ela viabiliza a identificao de novas
molculas bioativas em extratos biolgicos naturais,
levando ao desenvolvimento de novos medicamentos.
Terceiro, permite a identificao e caracterizao de marcadores biolgicos, ou seja, molculas
endgenas ou exgenas especficas de um determinado estado patolgico. A capacidade de identificar essas molculas extremamente til no diagnstico precoce de doenas e no acompanhamento
da evoluo do tratamento.
Apesar da novidade do tema, vrios grupos de
pesquisa, no mundo inteiro, usam as abordagens
protemicas em seus estudos. Na medicina, por
exemplo, muitas aplicaes j foram descritas.
Inmeros estudos protemicos foram aplicados na
caracterizao do cncer, principalmente, mas tambm de doenas neurolgicas (como o mal de Alzheimer), infecciosas e cardacas, ou na caracterizao de agentes infecciosos, como Bacillus anthracis

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(antraz) e Mycobacterium tuberculosis (tuberculose). Alm disso, estudos protemicos tm sido utilizados na busca de novas molculas bioativas em
venenos de animais peonhentos e extratos naturais
e no desenvolvimento de novas drogas teraputicas.

Outros membros
da famlia oma
Seria ingenuidade imaginar que as respostas fornecidas apenas pelos estudos de genomas e proteomas bastariam para responder s complexas questes sobre a biologia celular, mesmo no caso dos
organismos mais simples.
Um esquema do fluxograma (figura 4) dos componentes de uma clula permite ver uma complexidade qumica e estrutural cada vez maior. Para
cada uma das etapas desse fluxograma esto sendo
desenvolvidas abordagens metodolgicas que visam
desvendar os segredos da clula.
Assim, o genoma estuda a molcula de DNA e a
informao nela armazenada sob a forma de genes.
A transcrio do DNA para o RNA, o primeiro passo
do fluxo da informao gentica, investigada pelo estudo do transcriptoma, que d uma idia da
funcionalidade do genoma daquela clula. As protenas expressas so analisadas e identificadas pelo proteoma, enquanto o metaboloma visa determinar os metablitos, os produtos finais dos diversos processos celulares e que podem englobar,
alm dos nucleotdeos e aminocidos, os acares,
lipdios, esterides e mais uma infinidade de outras molculas importantes para a manuteno da
atividade biolgica.