obtencin y multiplicacin de plantas de fresa libres de virus

CONTENIDO

INTRODUCCIN

ETAPA I. SANEAMIENTO DE PLANTAS

POR TCNICAS DE CULTIVO in vitro

ETAPA II. EVALUACIN SANITARIA

ETAPA III. EXPOSICIN DE PLANTAS A

LUZ ARTIFICIAL PARA ESTIMULAR LA
PRODUCCION DE ESTOLONES

ETAPA IV. MULTIPLICACIN DE PLANTAS

BAJO CUBIERTA

ESTABLECIMIENTO DE VIVERO

ANEXO 1.
Composicin de sales inorgnicas del
medio MS

14

ANEXO 2.
Composicin de medios de cultivo

14

ANEXO 3.
Esquema para la obtencin de plantas de
fresa libres de virus por cultivo in vitro de
meristemos

15

ANEXO 4.
Esquema para la produccin de planta
madre de fresa libre de virus

16

obtencin y multiplicacin de plantas de fresa libres de virus

OBTENCION Y MULTIPLICACION DE PLANTAS

DE FRESA LIBRES DE VIRUS
Patricia Eugenia Lpez Gonzlez 1
Kunio Inoue 2

INTRODUCCION
En Morelos, la fresa es un cultivo alternativo de nueva
introduccin y su produccin comercial depende de la
importacin de la planta madre. Estas plantas no tienen garanta
de sanidad y la presencia de patgenos, entre ellos los llamados
virus, afectan negativamente el rendimiento; por otra parte,
su multiplicacin por ms de un ciclo bajo condiciones
naturales se dificulta, y la planta pierde calidad.
Mediante la aplicacin de tcnicas de cultivo in vitro, evaluacin
sanitaria y mtodos adecuados para estimular la produccin
de estolones, se puede producir planta madre nacional de
alta calidad fitosanitaria para el establecimiento de viveros
comerciales.
El siguiente esquema para la obtencin y multiplicacin de
plantas de fresa libres de virus consta de cuatro etapas y se
aplic a las variedades Camarroza y Chandler, que son las
ms importantes en la entidad.
I. Saneamiento de plantas por tcnicas de cultivo in vitro.
II. Evaluacin sanitaria.

1 Investigador Titular del Programa de Biotecnologa. SAGARPA, INIFAP,

CIRCE.
2 Experto de largo plazo. INIFAP, JICA, CIRCE.

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III. Exposicin de plantas a luz artificial para estimular la

produccin de estolones.
IV. Multiplicacin de plantas bajo cubierta.
Las plantas producidas por este mtodo son apropiadas para
ser utilizadas como planta madre para el establecimiento de
los viveros comerciales.
ETAPA I. SANEAMIENTO DE PLANTAS POR TECNICAS DE
CULTIVO in vitro.

Aislamiento y cultivo de meristemos

a) Desinfectar superficialmente los estolones
sumergindolos en una solucin de alcohol al 70% durante
5 segundos y de cloro comercial al 10% por 10 minutos.
Enjuagar tres veces con agua destilada esterilizada.
b) Aislar los meristemos de 0.2-0.5 mm en un ambiente
asptico, con el auxilio de una campana de flujo laminar,
instrumental de diseccin y un microscopio estereoscpico.
Se debe prevenir la desecacin y evitar daos fsicos al
meristemo.
c) Sembrar los meristemos en un medio de cultivo slido
complementado con vitaminas, aminocidos, una fuente
de carbohidratos y reguladores del crecimiento (Anexo 2).
d) Incubar a una temperatura de 26 2 C; humedad relativa
> 50%; fotoperiodo 16/8 hr luz/oscuridad (mantener las
mismas condiciones fsicas controladas en cada una de
las etapas del cultivo in vitro ).
e) Al cabo de 70 a 90 das de incubacin, se observa una
masa de yemas axilares.

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Micropropagacin
a) Aislar los brotes axilares desarrollados a partir de los
meristemos, y subcultivarlos individualmente en el mismo
medio fresco cada 4-6 semanas . Se sugiere no realizar
ms de 4 propagaciones in vitro.
b) Seleccionar los brotes ms grandes para el
enraizamiento y los ms pequeos para continuar la
multiplicacin.

Fig. 1.

Aspecto de los brotes axilares de fresa durante la

micropropagacin.

Enraizamiento
Aislar los brotes y transferirlos a un medio nutritivo sin
reguladores del crecimiento (Anexo 2). El desarrollo de
races se presenta despus de los 30 das de incubacin.

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Aclimatacin
a) Seleccionar plantas obtenidas in vitro mayores de 4
cm y con races vigorosas. Lavar las races con agua
corriente hasta eliminar completamente los residuos de agar.
b) Utilizar un sustrato esterilizado preparado con peatmoss
+vermiculita en proporcin 1:1. Se sugiere utilizar charolas
para almcigo de 50 cavidades . Fertilizar las plantas cada
tercer da con una solucin de la frmula 6-6-19 NPK
(1g/l).
c) Las plantas deben cubrirse con bolsas de plstico
transparente para conservar alta humedad relativa; esta
cubierta se retira gradualmente hasta su eliminacin total.
d) La aclimatacin de las plantas requiere aproximadamente
de 20 das y se sugiere realizarla entre los meses de
diciembre y enero.

Fig 2. Vitroplantas en aclimatacin

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e) Para estimular la produccin de estolones estas plantas

deben ser expuestas a luz artificial 1 hr a la media noche
en todo el proceso se aclimatacin. Consultar la seccin
Etapa III: Trasplante a maceta (c-f) y Tratamiento con luz
artificial.
ETAPA II. EVALUACION SANITARIA
Se realiza mediante un injerto de hoja sobre plantas indicadoras
de especies silvestres de fresa, y se aplica para comprobar
la ausencia de virus en las plantas obtenidas en el laboratorio.
Comprende los siguientes pasos:
a) Tomar hojas maduras de plantas indicadoras de
Fragaria vesca ( clones: EMC y UC-5) as como de las
plantas prueba obtenidas por cultivo in vitro.
b) Retirar el foliolo central de la planta prueba y prepararla
en forma de cua. Mantener esa porcin en agua para evitar
la deshidratacin.
c) Eliminar el foliolo central de la planta indicadora y realizar
una incisin a lo largo y por el centro del peciolo, de longitud
similar a la de la cua del foliolo preparado anteriormente.
d) Insertar el foliolo de la planta que se probar, en el corte
del peciolo de la planta indicadora. Atar con banda de
polietileno.
e) Cubrir el injerto as preparado, con una bolsa de plstico
transparente la cual se retirar gradualmente. Al cabo de
2 a 5 semanas observar si hay sntomas en las nuevas
hojas desarrolladas. La ausencia de sntomas seala la
sanidad de los materiales evaluados.
f) Eliminar plantas con sntomas de mosaicos, moteado,
deformaciones de hojas y tallos, amarillamiento,
achaparramiento, anillos clorticos o necrticos.

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g) Las plantas libres de virus se micropropagarn

a
partir de los cultivos rplica que permanecieron in vitro.

(Foto: K. Ohkoshi)

Fig. 3. Injerto de hoja sobre planta indicadora de fresa. Se

muestran sntomas de virosis como mosaicos y amarillamiento en el clon EMC de F. vesca.

ETAPA III. EXPOSICION DE PLANTAS A LUZ ARTIFICIAL

PARA ESTIMULAR LA PRODUCCION DE ESTOLONES

Obtencin de planta madre para el primer ao

De las plantas libres de virus se puede emplear la primera
o segunda generacin obtenida fuera del laboratorio.

Trasplante a maceta
a) Se recomienda utilizar plantas cosechadas en el mes
de octubre.

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b) Podar las hojas ms grandes de la plantas y proteger

las races de la deshidratacin antes del trasplante.
c) Trasplantar en macetas de 10 cm de dimetro con suelo
agrcola esterilizado, cuidando que las races no queden
dobladas.
d) Evitar que el cogollo de la planta quede bajo el nivel del
suelo.
e) Fertilizar a los 30 das del trasplante, aplicando 3 gr de
triple 17, mateado en cada planta. El fertilizante debe taparse
y se evitar dejarlo en contacto con la planta. Repetir la
aplicacin cada mes hasta el trasplante a piso (Cuadro 1).
f) Colocar las macetas bajo cubierta de malla contra
insectos, y evitar su contacto directo con el piso.

Tratamiento con luz artificial

a) Mantener las plantas en iluminacin 1 hr a la media noche
a partir del mes de noviembre, hasta la fecha de trasplante
a piso (Cuadro 1).
b) Se sugiere utilizar un foco de 60 w para una superficie
de 4 m en la que se colocan 304 macetas. Ubicar los
focos 1.5 m arriba de las macetas.
c) La aparicin de estolones se presenta despus de los
40 das de iniciar la exposicin con luz artificial. Cortar los
botones florales.
d) Las plantas tratadas pueden utilizarse para la produccin
de planta madre para el segundo ao o como planta madre
para el vivero comercial.

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Fig. 4. Desarrollo de estolones en plantas expuestas al tratamiento de luz artificial

ETAPA IV. MULTIPLICACION DE PLANTAS BAJO

CUBIERTA
Todas las multiplicaciones de las plantas libres de virus fuera
del laboratorio y antes de establecer los viveros comerciales,
deben realizarse bajo cubierta de malla contra insectos y con
un estricto control de plagas y enfermedades.

Produccin de planta madre para el segundo ao

a) Plantas tratadas con luz artificial se trasplantan a
camas con suelo previamente desinfectado.
b) En cuanto a la preparacin de suelo, poca de trasplante,
densidad, fertilizacin, plagas y enfermedades se
describen en la seccin de establecimiento de vivero.
c) Cada planta tratada con luz artificial produce de 90-150
plantas hijas.
10

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d) Las plantas se cosechan en octubre y antes del

establecimiento del vivero, los materiales se someten
nuevamente al tratamiento con luz artificial para estimular
la produccin de estolones.

Fig 5. Produccin de planta madre bajo cubierta de malla contra

insectos

ESTABLECIMIENTO DE VIVERO

Obtencin de la planta madre

Los viveros deben utilizar plantas que no estn separadas
ms de tres generaciones de una planta libre de virus
obtenida en el laboratorio.

Seleccin del terreno

a) Utilizar terrenos sin problemas de salinidad y drenaje.

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b) Evitar establecer el vivero en donde se haya cultivado

fresa, papa, jitomate, pepino, meln y ornamentales durante
los tres aos anteriores.
c) El vivero debe estar alejado de la plantacin comercial
para reducir la presencia de plagas y enfermedades.

Preparacin del terreno

a) El suelo debe prepararse mediante un barbecho a 30
cm de profundidad, una cruza y varios pasos de rastra, hasta
dejar el suelo mullido, a continuacin se debe nivelar.
b) Preparar camas de 1.10 m de separacin y de 15 a 20
cm de altura.
Cuadro 1. Epoca del trasplante

Variedad
Chandler

Localidad
Zacatepec

msnm
900

Epoca de trasplante
15 feb-30 marzo

Camaroza

15-30 marzo

Chandler

Oacalco

1 300

20-30 marzo

Tepoztln

1 700

Forma de trasplante
a) A las plantas tratadas con luz artificial se les retiran
las macetas, y sin eliminar el suelo que cubre las races
se trasplantan cuidando que el cuello de la raz quede al
nivel del suelo.
b) Los estolones que estn presentes deben mantenerse
en contacto con el suelo para su enraizamiento.

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Densidad de plantas por hectrea

Trasplantar a una hilera y con una distancia entre planta de
1 m , lo que dar un total de 9 090 plantas /ha. (Fig. 6)

Fig. 6

Trasplante a 1 hilera en camas de 1.10 m de separacin

Fertilizacin y control de maleza

a) Se recomienda la frmula de N-P-K 120 -60-60 la cual
se obtiene con 585 kg de sulfato de amonio, 308 kg de
superfosfato de calcio simple y 120 kg de sulfato de potasio.
b) Realizar dos aplicaciones: la primera a los 30 das del
trasplante aplicando la mitad de nitrgeno y todo el fsforo
y potasio; la segunda a los 60 das de la primera aplicacin,
con el resto del nitrgeno.
c) Aplicar el fertilizante mateado a cada planta madre,
tapndolo, y evitando que quede en contacto directo con la
planta.
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d) Mantener el vivero libre de malas hierbas mediante

deshierbes continuos.

Riegos
a) Regar el terreno antes y despus del trasplante de tal
manera que el suelo quede bien hmedo.
b) Despus del trasplante los riegos deben ser ligeros y
frecuentes con agua de buena calidad y sin exceso de
sales.

Plagas
Las principales plagas son araa roja, trips, pulgones y
gallina ciega; las tres primeras se controlan utilizando
2 lt/ha de Thiodan 35%; Malation 1000 E 1 lt/ha; para la
tercera, aplicar 12 kg/ha de Furadan 10G.

Enfermedades
Se presentan principalmente antracnosis y mancha o peca
de la hoja; para la primera aplicar Folpan 80 PH 1 a 2 kg/ha;
para la segunda aplicar Direne 50% PH 2-4 kg/ha.

Cosecha
La cosecha se realiza entre el 15 de agosto y el 30 de
septiembre y debe efectuarse en terreno hmedo (Fig. 7).

Clasificacin de la planta
Clasificar las plantas por dimetro de la corona
seleccionando las de ms de 5 cm porque son las de mayor
rendimiento. Las plantas se deben proteger de la
deshidratacin mantenindolas en contacto con el suelo
hmedo y sombreado hasta su trasplante definitivo en el
lote de produccin frutcola (Fig. 8).

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Fig. 7

Cosecha de planta

Fig. 8. Clasificacin de planta por el dimetro de la corona

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Anexo 1. Composicin de sales inorgnicas del medio MS

Compuesto

Concentracin ( mg/litro)

NH4 NO3
KNO3
CaCl.2H2O
KH2PO4
MgSO4.7H2O
MnSO4.4H2O
H3BO3
ZnSO4.4H20
Na2MoO4.2H2O
KI
CoCl.6H2O
CuSO4.5H2O
Na2EDTA
FeSO4.7H2O

1650.00
1900.00
440.00
170.00
370.00
22.30
6.20
8.60
0.25
0.83
0.025
0.025
37.25
27.85

MS= Murashige y Skoog, 1962

Anexo 2. Composicin de medios de cultivo

Constituyentes

Concentracin (mg/litro )
Cultivo de meristemos
y micropropagacin
Enraizamiento

Sales inorgnicas
Inositol
Tiamina-HCl
Piridoxina-HCl
Acido nicotnico
Glicina
Sacarosa
Agar
BAP
AIB
GA3

MS
100.0
0.1
0.5
0.5
2.0
30, 000.0
8, 000.0
0.5
0.1
0.1

MS
100.0
0.1
0.5
0.5
2.0
30, 000.0
8, 000.0
0.0
0.0
0.0

BAP = 6-benzil-aminopurina
AIB = cido 3- indolbutrico
GA3 = cido giberlico

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Laboratorio

Anexo 3. Esquema para la obtencin de plantas de fresa

libres de virus a partir del cultivo in vitro de
meristemos

Saneamiento por
cultivo in vitro
de meristemos

Micropropagacin

Bajo cubierta

Aclimatacin

Evaluacin
sanitaria

Luz
artificial

obtencin y multiplicacin de plantas de fresa libres de virus

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Anexo 4. Esquema para la produccin de planta madre de

fresa libre de virus

Laboratorio
Plantas libres
de virus

Planta madre
segundo ao

Bajo cubierta

Cielo abierto

Vitroplantas
en maceta
con luz artificial
(16 plantas de
laboratorio)

Propagacin
en piso
(16 plantas / 32 m2)

Plantas en maceta
con luz artificial
(1 200 plantas/32m2)

Vivero
(1000 plantas x 100)

Cultivo comercial
de produccin
frutcola
( 100 mil plantas / ha)