QUMIC

CA BIOLG
GICA. Ao 2013

Trabajo Prctico N 1: PUR

RIFICACIO
ON DE LA
A ENZIMA LISOZIMA
A DE CLA
ARA DE
HUEVO
O
E trabajo prrctico consiiste en 4 sesiiones (das 1-4) donde se
El
s purificar la enzima liisozima a
partir dee clara de hu
uevo y se evvaluar la puureza y el renndimiento alcanzados. Adems,
A
se estudiar
la depenndencia de laa actividad y la estabiliddad de la lisoozima en funncin del pH.

RMACIN GENERAL
L:
INFOR
L lisozima es una enziima abundannte en las lgrimas y la saliva en doonde acta como
La
c
una
barrera frente a las infecciones.. La deficienncia en lisoziima, debida a mutacionees en el gen LYZ , ha
sido asoociada a un aumento enn la propensiin a las inffecciones. Addems, se coomercializann algunos
producttos con lisozzima para laa higiene buccal que tieneen eficacia como
c
antimicrobianos orales.
o
La
medida de la activ
vidad de estta enzima en
e sangre y orina contrribuye al diiagnstico de
d ciertas
enfermeedades.
L lisozima tambin es muy
La
m abundaante en la claara del huevo, de donde se extrae paara su uso
industriial, en particu
ular para el control
c
de laas bacterias lcticas
l
en loos vinos y quuesos.
E nombre de lisozima o muramiddasa (EC 3.22.1.17) incluuye a un grrupo de enzzimas que
El
catalizaan la hidrliisis de enlacces glicosdicos (1 4) de los polisacridos
p
s de la pareed celular
bacteriaana (peptido
oglicano) cuuyo disacriido constituttivo es N-aacetilglucosaamina(NAG))-N-acetil
murmiico (NAM, Figura
F
1).

F
Figura
1

Son protenas globulares constituidas por una sola cadena polipeptdica (129 residuos
aminocidicos para la lisozima de Gallus gallus) y de peso molecular comprendido en el rango de
14 a 30 kDa. Estas protenas contienen puentes disulfuro que contribuyen a su elevada estabilidad.
La lisozima fue la primera protena secuenciada, la primera enzima de la que se dispuso de un
modelo tridimensional (usando cristalografa de rayos x) y la primera para la que se propuso un
mecanismo de accin detallado.

MATERIAL PROVISTO POR EL ALUMNO:

Guardapolvo.
Guantes.
Lavandina (1 litro por comisin).
Papel absorbente (por grupo).
Marcador indeleble.
2 Huevos (por comisin).
2 Tubos cnicos de plstico con tapa a rosca de 15 ml tipo Falcon (por grupo).
Cronmetro.

ATENCIN:
Una vez finalizada cada sesin cada grupo deber dejar su lugar de trabajo ordenado y los tubos de
vidrio utilizados lavados y desrotulados.

Da 1: TCNICA DE PIPETEO Y CURVA DE CALIBRACIN DEL MTODO DE

BRADFORD
Objetivos: Comprender la correcta manipulacin de las micropipetas y realizar una curva de
calibracin del mtodo de Bradford para su posterior utilizacin en el dosaje de protenas.
A- Manipulacin de las micropipetas
Las micropipetas son dispositivos que se utilizan para medir o transvasar pequeos
volmenes de lquido de un recipiente a otro con gran exactitud. Todas las micropipetas de pistn
disponen de puntas desechables para minimizar los riesgos de contaminacin. Para facilitar el uso
del tipo de punta adecuado los fabricantes han adoptado un cdigo de color segn el volumen a
dispensar (Figura 2).
2200l

Hasta10l

1001000l

Figura 2

Instrucciones para el manejo de una micropipeta (Figura 3):

0. Ajustar el volumen girando la rueda hasta que en la escala aparezca el volumen deseado y
colocar una punta de plstico (adecuada) en la punta de la pipeta haciendo una leve presin para
lograr un buen ajuste.
1. Oprimir pistn con el dedo pulgar, hasta el primer tope y sin soltarlo introducir
verticalmente la pipeta, hasta que la punta se sumerja de 2 a 5 mm dentro del lquido.
2. Liberar lentamente la presin sobre el pistn. Despus de 23 segundos retirar, siempre
verticalmente, la pipeta del lquido deslizando la punta contra la pared del recipiente.
3, 4 y 5. Apoyando la punta contra la pared del recipiente donde se quiere colocar el lquido,
presionar lentamente el pistn hasta el primer tope. Despus de un segundo, y sin soltar el pistn,
terminar de vaciar la pipeta presionando hasta el segundo tope.

6. Retirar la pipeta deslizando la punta contra la pared del recipiente y descartar la punta de
plstico.

Figura 3

PARA NO DAAR EL SISTEMA INTERNO DE PISTONES QUE POSEE LA MICROPIPETA:

-

El lquido nunca debe entrar en contacto con el cono de la micropipeta.

Nunca posicione la micropipeta cargada con la punta hacia arriba.

Nunca coloque la micropipeta en forma horizontal si la punta tiene lquido.

Nunca ajuste el volumen fuera del rango de la micropipeta.

Profundidad de inmersin de la punta

La profundidad de inmersin de la punta es especialmente importante en el uso de
volmenes pequeos (Figura 4). Si la punta se sumerge demasiado, se aspirar ms lquido debido
al aumento de la presin. Si por el contrario, la punta no se sumerge lo suficiente, se puede cargar
aire con las consiguientes burbujas y volumen inadecuado. Sumergir la punta a una profundidad
adecuada puede mejorar la precisin hasta un 5%.
4

Figura 4
Uniformidad al pipetear
Es fundamental mantener un ritmo, velocidad y tcnica adecuada al mover el mbolo. Una
aspiracin demasiado rpida e incontrolada puede llevar a la formacin de aerosoles, salpicaduras y
posible contaminacin del eje y del pistn, pudindose producir incluso prdida de volumen de la
muestra. Una velocidad de pipeteo uniforme puede mejorar la precisin tambin hasta un 5%.
ngulo de inmersin vertical
Se ha de procurar mantener el ngulo de inmersin de la pipeta lo ms cercano a la vertical
posible. De otra forma, la columna vertical de lquido ser ms pequea y se aspirar demasiada
muestra. Por el contrario, al dispensar el lquido, la punta se ha de mantener en un ligero ngulo
frente a la pared del vaso para asegurar un correcto vaciado. Se estima que pipetear de forma
vertical o como mximo dentro de un ngulo menor de 20 de sta, puede mejorar la precisin hasta
en un 2,5%.
Tcnica de dispensacin
Para la mayora de aplicaciones se recomienda dispensar con el extremo de la punta apoyado
contra la pared del recipiente. As se reduce o elimina el hecho de que se quede algo de muestra en
el interior de la punta despus de acabar la dispensacin. Retirar la pipeta deslizando el extremo de
la punta hacia arriba por la pared lateral para liberar cualquier gotcula restante en el orificio de la
punta. Esta tcnica puede mejorar la precisin hasta en un 1%.
Otra tcnica consiste en emitir directamente en la superficie del lquido. Si se dispensa
directamente dentro del lquido tendremos que sacar la pipeta mantenindola en el segundo tope
para evitar una toma de muestra despus de la dispensacin.
5

Enjuague previo de puntas

Se recomienda enjuagar previamente las puntas como mnimo dos veces con el lquido a
pipetear para compensar la pelcula de lquido en el interior de la punta. El enjuague previo tambin
tiene otras ventajas: ayuda a neutralizar los efectos de capilaridad e iguala la temperatura y
humedad del aire del interior de la pipeta con la temperatura y humedad de la muestra. Todo esto
puede suponer una mejora de hasta el 0,2% de la precisin.
Utilizacin de una pipeta adecuada para el volumen que se aspira
Se recomienda trabajar entre el 35% y el 100% del volumen mximo de la pipeta. Seguir
este consejo puede hacernos mejorar los resultados hasta en un 1%. Cometemos mucho mayor error
trabajando por debajo del 10% del volumen mximo de la pipeta que estamos utilizando.

PROCEDIMIENTO A REALIZAR POR LOS ALUMNOS:

1. Reconocimiento del rango de volumen permitido por cada micropipeta.
2. Pipetear los siguientes volmenes de agua utilizando las micropipetas adecuadas: 625, 170,
55, 10 l.

B- Determinacin de la concentracin de protenas

Existen diferentes mtodos para la cuantificacin de protenas. Muchos de estos mtodos se
basan en la propiedad intrnseca de las protenas para absorber luz en el UV o en la capacidad que
tienen de unir determinados colorantes.
Absorcin Ultravioleta de las Protenas.
Todas las protenas son capaces de absorber fuertemente debajo de los 230 nm debido al
enlace peptdico. Sin embargo, a esta longitud de onda tambin absorben otros compuestos que
pueden interferir en la utilizacin de esta medida en la determinacin de la concentracin de
protena (por ejemplo, altas concentraciones de ciertos buffers). Ninguno de los 20 aminocidos
hallados en las protenas absorbe luz en la regin visible del espectro electromagntico; sin
embargo, tres de ellos (tirosina, triptofano y fenilalanina) absorben significativamente en la regin
del UV cercano. Dado que la mayora de las protenas poseen residuos de aminocidos aromticos,

las medidas de absorcin a 280 nm constituyen un mtodo rpido para la determinacin del
contenido de protena de una solucin.
Mtodo de Bradford.
Este mtodo constituye una forma rpida y confiable para la determinacin de protenas. Se
basa en la cuantificacin de la unin del colorante Azul Brillante de Coomassie a una protena
desconocida y la comparacin de esta unin con la de diferentes cantidades de una protena
standard. El complejo colorante - protena presenta un mximo de absorcin a 595 nm. Este mtodo
es ms sensible, simple y rpido que el Mtodo de Gornall.
En este trabajo prctico se realizar la curva de calibracin del mtodo de Bradford para
posteriormente (Da 3) cuantificar la concentracin de protenas en las distintas fracciones de la
purificacin de la lisozima.

MATERIALES:
-Solucin de Azul brillante de Coomassie: 70 mg de Azul Brillante de Coomassie G-250 + 50 ml
de etanol al 95% + 100 ml de cido fosfrico al 85%. Llevar a 1 litro con H2O. Filtrar con papel
Whatman N 1. Conservar a 4C.

PROCEDIMIENTO A REALIZAR POR LOS ALUMNOS:

Agregar distintos volmenes del testigo, completando a 0,7 ml con H2O, mezclar y adicionar
0,7 ml de Azul Brillante de Coomassie. Respetar el orden del agregado de los reactivos.
MEZCLAR y leer absorbancia a 595 nm en un lapso de tiempo de entre 2 minutos y 1 hora.
Trabajar en tubos eppendorfs y realizar el experimento por duplicado.
Testigo: BSA 0,1 g/l
Sensibilidad: 1 - 12 g de protena en el volumen final de la determinacin.
Curva de calibracin sugerida: 1, 2, 4, 6, 8, 10 y 12 g del testigo.
NOTA: El alumno deber concurrir a la siguiente clase de laboratorio con la curva de calibracin
en Abs vs g protena para que el docente la evalue. No es necesario que est con formato de
informe.
7

Da 2: PURIFICACIN DE LA LISOZIMA
Objetivos: Purificar la enzima lisozima a partir de la clara del huevo mediante cromatografa de
intercambio catinico utilizando Carboximetilcelulosa.

A- Purificacin de la lisozima
Cromatografa de intercambio inico.
La cromatografa de intercambio inico se fundamenta en las propiedades cido-base de las
protenas. Una protena, a pH menor de su pI (punto isoelctrico), tendr carga positiva y a pH
mayor de su pI presentar carga negativa. Por lo que, en el primer caso, se unir a una resina con
carga negativa (por ejemplo, Carboximetil-celulosa, CM-celulosa, Figura 5) y en el segundo a una
resina con carga positiva (por ejemplo, Dietilaminoetil-celulosa, DEAE-celulosa, Figura 5).

Celulosa o
Agarosa

Celulosa o
Agarosa

Grupo Carboximetilo (CM)

Forma desprotonada

Grupo Dietilaminoetilo
(DEAE) Forma protonada

Figura 5

Una vez unida la protena a la resina, esta se puede eluir de dos formas: variando el pH del
medio hasta alcanzar y/o sobrepasar el pI o bien mediante un gradiente inico.
Dado que el pI de la lisozima es de 11, dos unidades de pH superior al del resto de las
protenas de la clara del huevo, a un pH de 10 la lisozima es prcticamente la nica protena con
carga positiva neta. Ello permite separar esta enzima del resto de protenas de la clara mediante la
utilizacin de resinas intercambiadoras de cationes.

En este trabajo prctico utilizaremos la CM-celulosa a pH 10 (cargada negativamente debido

a la presencia de restos carboxilo ionizados a ese pH, resina intercambiadora de cationes) para la
purificacin de la lisozima a partir de clara de huevo. A este pH la enzima quedar unida a la
columna mediante una interaccin electroesttica y el resto de las protenas de la clara no sern
retenidas. Posteriormente, puede disociarse la lisozima de la resina mediante un lavado con un
buffer de alta fuerza inica.

MATERIALES:
- Buffer A: glicina/NaOH 100 mM, pH 10
- Buffer B: glicina/NaOH 100 mM, pH 10, conteniendo 100 mM NaCl
- Buffer C: glicina/NaOH 100 mM, pH 10, conteniendo 300 mM NaCl
- Carboximetil-Celulosa (CM): Suspensin de resina previamente activada
Activacin de la CM: Inicialmente el polvo comercial de carboximetilcelulosa se hidrata
toda la noche en agua destilada. Luego la resina se lava con HCl 0.5 M (5 minutos), 2 veces con
H2O (o hasta pH neutro), NaOH 0.5 M (5 minutos) y finalmente dos veces con H2O (o hasta pH
neutro). Por ltimo se hace una suspensin 1/1 (vol/vol) en buffer A. Las centrifugaciones son de 5
minutos a mxima velocidad, salvo luego del tratamiento con NaOH que es de 20 minutos.
- Extracto Crudo: 50 ml de una dilucin 1/5 (vol/vol) en buffer A de la clara procedente de un
huevo. Se reparten 10 ml a cada grupo.
PROCEDIMIENTO A REALIZAR POR LOS ALUMNOS:
1. Centrifugar a 2000 rpm durante 5 min suficiente cantidad suspensin de CM-celulosa
previamente activada y equilibrada para obtener de 2 a 4 ml de resina. Descartar el sobrenadante.
ATENCION: en este y en los siguientes pasos el pipeteo debe realizarse con sumo cuidado
para evitar la resuspensin de la resina.
2. Separar una alcuota de 1 ml (EC). Sobre la resina de CM-celulosa agregar los 9 ml
restantes de Extracto crudo. Agitar suavemente durante 15 min, para que la lisozima se
adsorba a la resina.
4. Al finalizar la incubacin, centrifugar la muestra a 2000 rpm durante 5 min. Luego, medir el
volumen del sobrenadante, guardar una alcuota de 1 ml del mismo en un eppendorf en hielo (Flow
through o fraccin no retenida de la siembra, FT) y descartar el resto.
9

5. Aadir a la resina (precipitado) 10 ml de buffer A. Agitar suavemente y centrifugar de

nuevo. Medir el volumen del sobrenadante y guardar una alcuota de 1 ml del mismo en un
eppendorf en hielo (Lavado 1, L1) y descartar el resto.
6. Repetir el paso anterior con 10 ml buffer B (Lavado 2, L2).
7. Resuspender la CM-celulosa con 5 ml de buffer C e incubar, agitando suavemente, durante
10 minutos. Centrifugar y recoger TODO el eludo en un tubo falcon de 15 ml (Elucin, E).
NOTA: Medir el volumen de cada una de las fracciones obtenidas y guardarlas, debidamente
rotuladas (comisin y grupo), a -20C. Las mismas sern utilizadas para determinar la
concentracin proteica (Da 3) y para medir su actividad enzimtica (Da 4).
B- Preparacin de las muestras para SDS-PAGE

MATERIALES:
- Solucin de siembra para muestras de protenas 5X: Tris-HCl 20 mM pH 6.8, glicerol 5% v/v,
SDS 2% p/v, -ME 0,1% v/v y azul de bromofenol 0,1 mg/mL.

PROCEDIMIENTO A REALIZAR POR LOS ALUMNOS:

1. Mezclar en eppendorfs 2.5 l de solucin de siembra para protenas con 10 l de cada una
de las fracciones: EC, FT, L1 y L2 obtenidas durante la purificacin. Para el caso del eludo (E)
mezclar 2,5 l de la solucin de siembra, 5l de H2O y 5 l del eludo.
2. Hervir 5 minutos.
3. Guardar a -20C hasta su anlisis por SDS-PAGE.

10

Da 3: ANLISIS POR SDS-PAGE DE LA PURIFICACIN DE LA LISOZIMA Y

CUANTIFICACIN PROTEICA.
Objetivos: Utilizar la tcnica de la electroforesis en gel para analizar la purificacin de la lisozima,
en cuanto a la composicin proteica de las distintas fracciones y el grado de pureza alcanzado de la
lisozima. Cuantificar la concentracin de protenas en cada una de las fracciones.

A- Separacin de protenas en geles de poliacrilamida

Electroforesis
La electroforesis es una de las tcnicas analticas ms importantes dentro de la Bioqumica y
consiste en la migracin de molculas biolgicas (ADN, protenas, vitaminas, etc.) en un campo
elctrico. La movilidad depender de la carga que presentan al pH de trabajo. La electroforesis en
gel es el mtodo ms conveniente para realizar separaciones de macromolculas (ADN y Protenas),
en el cual un entramado tridimensional impide o reduce la movilidad de las molculas, participando
as en el proceso de separacin. Los soportes pueden ser ms o menos restrictivos segn el tamao
del poro. Entre los ms restrictivos estn los geles de acrilamida-bisacrilamida, y entre los menos
restrictivos est la agarosa. En la electroforesis, el gel retarda en mayor medida a las molculas
mayores respecto a las de menor tamao. De esta manera, la movilidad de una molcula en una
electroforesis depender de su tamao (su capacidad de atravesar el tamizado molecular) as como
tambin de la carga neta que posea.
En este trabajo prctico, realizaremos una electroforesis en condiciones desnaturalizantes en
presencia de SDS (Dodecilsulfato sdico, Figura 6). En este tipo de electroforesis, la separacin de
las protenas se ver condicionada slo por su tamao y no por su carga. Esto se debe a que este
detergente se une a las protenas desnaturalizndolas y confirindoles carga negativa en forma
proporcional a su tamao y que enmascara la carga intrnseca de cada protena. De esta manera,
todas las protenas tratadas con SDS presentan la misma relacin carga/masa, por eso, la separacin
ser debida slo a la diferente retencin por el soporte, es decir depende nicamente de la masa
molecular de la protena (Figura 7).

11

Parte hidrofbica
Parte hidroflica
Confiere la carga negativa

Dodecilsulfato

sdico (SDS)
Figura 6

Mezcla de
macromolculas

Electroforesis

Gel poroso

Figura 7
Para llevar a cabo la electroforesis se necesita:
A) una fuente de tensin que proporciona el campo elctrico, mediante dos electrodos,
positivo (nodo) y negativo (ctodo), entre los que se establece la diferencia de potencial (Figura 8).
B) una cuba o recipiente, en cuyos extremos se sitan los electrodos (Figura 8).

Figura 8
C) el buffer: durante la electroforesis se produce electrolisis del agua, generndose protones
en la proximidad del nodo e iones hidroxilos en la proximidad del ctodo; el buffer evitar que el

12

entorno andico se acidifique y el catdico se haga ms bsico a lo largo de la corrida

electrofortica.
D) un gel: el polmero utilizado para la formacin del gel es la acrilamida y la bisacrilamida, los cuales se polimerizan mediante la adicin de catalizadores (persulfato de amonio,
TEMED, Figura 9).

Acrilamida

Bis-acrilamida

Radical sulfato inicia la polimerizacin

Figura 9

La preparacin de los geles de poliacrilamida se llevar a cabo segn el mtodo descrito por
Laemmli:

Gel de separacin: poliacrilamida 15% (vol. final para 2 geles 10 ml)

- Acrilamida (30%)- Bis-acrilamida (0.8%): 5 ml
- Tris 1,5M pH8.8: 2,5 ml
- H20: 2,3 ml
- SDS: 10% 0,1 ml
- TEMED: 10 l
- Persulfato de amonio 10%: 100 l
13

Verter, cuidadosamente, la mezcla entre los cristales.

Cubrir, cuidadosamente con alcohol 96% (utilizar una pipeta Pasteur) para delimitar el frente.
Esperar a que el gel polimerice.
Una vez gelificado retirar el agua.

Gel concentrador: poliacrilamida 6% (vol. final para 2 geles 6 ml)

- Acrilamida (30%)- Bis-acrilamida (0,8%): 1,2 ml
- Tris 1,0M pH 6,8: 1,5 ml
- H20: 3,2 ml
- SDS 10%: 60 l
- TEMED: 6 l
- Persulfato de amonio 10%: 60 l
Verter, cuidadosamente, la mezcla entre los cristales.
Colocar el peine y esperar a que polimerice.
Retirar el peine.
ATENCIN: La acrilamida y el TEMED son agentes extremadamente txicos que pueden ser
absorbidos por la piel. Al manipular estas soluciones usar siempre guantes y tener cuidado con el
material contaminado.

PROCEDIMIENTO A REALIZAR POR LOS ALUMNOS:

1. Sembrar segn se detalla a continuacin. El marcador de peso Molecular est compuesto
por una mezcla de BSA (66 KDa), ovoalbmina (45 KDa), Inhibidor de tripsina (20,1 KDa) y alfalactoalbmina (14,2 KDa).

14

Gel 1: Calles

Gel 2: Calles

1: 15 l Marcador de Peso Molecular

2: 12,5 l EC Grupo 1 o 2
3: 12,5 l FT Grupo1
4: 12,5 l L1 Grupo1
5: 12,5 l L2 Grupo1
6: 12,5 l E Grupo1
7: 12,5 l FT Grupo2
8: 12,5 l L1 Grupo2
9: 12,5 l L2 Grupo2
10: 12,5 l E Grupo2

1: 15 l Marcador de Peso Molecular

2: 3 l EC Grupo 3 o 4
3: 3 l FT Grupo3
4: 12,5 l L1 Grupo3
5: 12,5 l L2 Grupo3
6: 12,5 l E Grupo3
7: 3 l FT Grupo4
8: 12,5 l L1 Grupo4
9: 12,5 l L2 Grupo4
10: 12,5 l E Grupo4

2. Correr la electroforesis en buffer Tris-HCl 0,025 M, pH 8,8, glicina 0,192 M y SDS 0,1%, a
intensidad de corriente constante de 30 mA hasta que el azul de bromofenol est, aproximadamente,
a 0,5 cm del extremo inferior del gel.
3. Desmontar el gel y teirlo con metanol/actico/H20 (5/1/5) con azul de Coomassie (1 g/l).

B- Cuantificacin de protenas por mtodo de Bradford

MATERIALES:
-Solucin de Azul brillante de Coomassie: 70 mg de Azul Brillante de Coomassie G-250 + 50 ml
de etanol al 95% + 100 ml de cido fosfrico al 85%. Llevar a 1 litro con H2O. Filtrar con papel
Whatman N 1. Conservar a 4C.

PROCEDIMIENTO A REALIZAR POR LOS ALUMNOS:

Cada grupo deber determinar la cantidad de protenas presente en cada una de las
fracciones de la purificacin utilizando la siguiente tabla y la curva de calibracin realizada el Da1.
Trabajar en tubos eppendorfs y realizar el experimento por duplicado.
Fraccin
Blanco
EC (dil 1/50)
FT (dil1/50)
L1
L2
E

Volumen
(l)
0
20
20
5
20
20

Volumen de H2O
(l) csp. 700 l
700
680
680
695
680
680

Volumen de
Bradford (l)
700
700
700
700
700
700

Abs1

Abs2

15

Respetar el orden de los agregados.

Considerar que los valores de absorbancia medidos deben caer dentro del rango de
determinado en la curva de calibracin. De lo contrario, deben realizarse nuevas medidas
utilizando cantidades mayores o menores de las fracciones correspondientes.

C- Cuantificacin de protenas por Absorbancia a 280 nm

La concentracin proteica en la fraccin E tambin ser determinada por absorbancia a
280 nm utilizando el coeficiente de extincin terico de la lisozima:
Coeficiente de extincin (280nm): 38,940 cm-1 mM-1

PROCEDIMIENTO A REALIZAR POR LOS ALUMNOS:

Colocar 700 l de la fraccin E en una cubeta especial para UV y medir absorbancia a
280 nm.

16

Da 4: DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA DE LA LISOZIMA

Objetivos: Determinar la actividad de la lisozima en las diferentes fracciones de purificacin y su
dependencia con el pH del medio.

Medida de la actividad enzimtica

Exceptuando unas pocas protenas que pueden ser detectadas por medidas espectroscpicas
directas, la presencia de una enzima es determinada por la medida de la reaccin que cataliza,
pudindose estimar la cantidad de enzima por la velocidad de la reaccin. Adems, la
caracterizacin de una enzima implica la determinacin de su actividad en diferentes condiciones.
Por esto, la medida de actividad enzimtica es de importancia para la investigacin y anlisis de
protenas. La figura 10 muestra una curva tpica de formacin de un producto (P) en funcin del
tiempo para una reaccin catalizada enzimticamente. Se observa que la velocidad disminuye con el
tiempo, hecho que puede deberse a las siguientes causas:
-

El transcurso de la reaccin produce una disminucin significativa de la concentracin de

sustrato (S)

La reaccin inversa puede comenzar a cursar y hacerse relativamente importante al aumentar

la concentracin de P

Algunos de los productos pueden inhibir a la enzima.

8
P

6
4
2
0

4
6
Tiempo

10

Figura 10
La medida adecuada de la actividad de una enzima requiere que se determine la velocidad
inicial, esto es, obtener la tangente al origen del grfico mostrado en la figura 10. De esta manera,
las diferentes causas que producen la disminucin de la actividad con el tiempo son eliminadas.
17

La figura 11 ejemplifica medidas experimentales de la formacin de P en funcin del tiempo

(como en la figura 10), determinadas a tres concentraciones diferentes de S. Puede observarse que
la velocidad (v) que se obtendra en cada caso dependera del intervalo de tiempo que se tomara
para medirla.

Figura 11
En este ejemplo, si medimos v para cuando S=S3, obtendramos el mismo valor,
independientemente del intervalo de tiempo elegido. En cambio para S=S2, la v obtenida sera
distinta segn el intervalo escogido. Para estos dos casos, la v podra calcularse adecuadamente
eligiendo el intervalo 0-1, donde la formacin de P es funcin lineal con el tiempo. Para el ejemplo
de la figura 11, cuando S=S1, la determinacin de v usando el intervalo 0-1 no es enteramente
confiable ya que se necesitan ms puntos experimentales que verifiquen la condicin de linealidad
en la estimacin de v realizada.
Adems de considerar la variacin de la velocidad con el tiempo, hay que tener en cuenta
que la actividad de una enzima es afectada por otros factores como la temperatura, la fuerza inica,
el pH, la concentracin de S, la cantidad de enzima en el medio de medida. Todos estos factores
deben ser convenientemente conocidos y fijados al realizar medidas de actividad enzimtica.
La medida de la actividad de una enzima requiere determinar el consumo de S o la aparicin
de un P de la reaccin en funcin del tiempo. La determinacin cuantitativa de S o de P puede
hacerse por diferentes mtodos analticos segn el caso: espectrofotomtricos (los ms comunes),
volumtricos, potenciomtricos, radioqumicos, espectrofluoromtricos.

18

Independientemente del mtodo utilizado, puede suceder que para, por ejemplo, una
reaccin enzimtica: Sa + Sb P + Q, pueda medirse Q en presencia de los otros componentes de la
mezcla de reaccin. En este caso, la reaccin enzimtica podra seguirse continuamente en funcin
del tiempo. En consecuencia, podran obtenerse numerosos puntos experimentales (o trazos
continuos si disponemos de un registrador automtico) de la produccin de Q en funcin del
tiempo, a partir de un nico medio de reaccin. Esto es lo que se denomina mtodo continuo de
medida de la actividad enzimtica.
Los ejemplos tpicos de mtodos continuos empleados para medir actividad los constituyen
las deshidrogenasas que usan NAD(P)/NAD(P)H como coenzima. Estos mtodos se basan en que la
forma reducida de la coenzima (NAD(P)H), pero no la forma oxidada (NAD(P)), absorbe a 340nm.
As, la actividad de la Glutamato deshidrogenasa (GluDH):
NH4+ + 2-oxoglutarato + NADH + H+ Glutamato + NAD+
podra seguirse por un mtodo continuo midiendo la disminucin de absorbancia a 340 nm, con lo
que se obtendra la curva mostrada en la figura 12.

Figura 12
En ciertos casos, aunque no haya una propiedad analtica diferencial de un S o de un P que
permita su dosaje continuo, an puede medirse la actividad de una enzima por un mtodo continuo
si se acopla otra reaccin enzimtica a la de la enzima en cuestin. Por ejemplo, la actividad de la
enzima Ureasa puede medirse en forma continua por un mtodo que utilice a la Glutamato
Deshidrogenasa como enzima acoplada de forma que se cuantifique el Amonio producido por
accin de la Ureasa:
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(CO(NH2)2 + 2 H2O 2 NH4 + + CO2) (Ureasa)

NH4+ + 2-oxoglutarato + NADH + H+ Glutamato + NAD+ (GluDH)
Si las cantidades de GluDH y de NADH agregadas al medio de reaccin son lo
suficientemente elevadas, la disminucin de la absorbancia a 340 nm va a ser equivalente a la
velocidad de produccin de NH4+ por parte de la Ureasa.
En otros casos, la medida de la actividad de una enzima no puede hacerse determinando
continuamente un dado S o P en presencia de los dems componentes del medio de medida y es
necesario separar el compuesto a cuantificar, para lo cual se requiere detener la reaccin enzimtica.
En estos casos se utilizan mtodos discontinuos, en los que la medida de S o de P requiere partir de
un medio de reaccin diferente. Por ejemplo, la actividad de la ADPglucosa pirofosforilasa
(ADPGlc + PPi Glc1P + ATP) puede medirse usando PPi marcado con [32P] y midiendo la
formacin de ATP radioactivo. Si no se separa el ATP formado del PPi que no reaccion no se
observa cambio de la radioactividad en el medio de reaccin. Para determinar cunta radioactividad
est en forma de ATP es necesario detener la reaccin enzimtica y separar el ATP del PPi. De esta
forma, para tener una curva de ATP formado en funcin del tiempo, es necesario preparar tantos
tubos de reaccin como puntos experimentales se deseen, en cada uno de los cuales se cortar la
reaccin en el tiempo adecuado.
Un mtodo discontinuo puede comprender tambin aquel en el que el dosaje de un S o P no
implique su separacin del medio de reaccin, sino su reaccin qumica en condiciones que afectan
la actividad de la enzima. Por ejemplo, la actividad de la Fosfoglucosa isomerasa (Glc6P
Fructosa6P) podra medirse cuantificando Fru6P por el mtodo de Roe. Pero las condiciones del
mtodo de determinacin hacen que necesariamente se detenga la reaccin enzimtica con cada
medida de Fru6P. Se requiere nuevamente de un medio de medida de actividad por punto
experimental de cantidad de Fru6P producida.
Ntese que, en general, el uso de un mtodo continuo brinda con mayor facilidad un nmero
elevado de medidas de variacin de S o P en funcin del tempo (inclusive puede tenerse un trazo
continuo) que un mtodo discontinuo. Por esto, y teniendo en cuenta lo antes mencionado sobre la
variacin de v en funcin del tiempo, al usar un mtodo discontinuo para medir actividad
enzimtica hay que ser particularmente cuidadoso para estar seguro de medir velocidades iniciales.
En este trabajo prctico se utilizar un mtodo continuo para la medida de actividad de la
enzima lisozima.
20

Medida de la actividad lisozima

La medida de la actividad lisozima se realiza utilizando una suspensin del microorganismo
Bacillus subtilis en concentracin suficientemente elevada para atenuar, por dispersin, la
transmisin de luz monocromtica a travs de la cubeta de un espectrofotmetro. Al incubar esta
suspensin con lisozima, la pared celular de las bacterias se hidroliza, y en un medio hipotnico
produce la lisis de las mismas, lo que reduce la dispersin de la luz, que se manifiesta en una
reduccin en la absorbancia a una longitud de onda fija de 600 nm. La actividad enzimtica es
proporcional a la disminucin de la absorbancia a 600 nm. Por definicin, en condiciones
estndar (25C, pH 6,2 y 0,1 M fosfato), se considera que 1 unidad de actividad enzimtica de
lisozima (U) produce una disminucin en la absorbancia de 0,001 en 1 minuto.

MATERIALES:
- Buffer citrato-fosfato 100 mM, pH 4
- Buffer citrato-fosfato 100 mM, pH 5
- Buffer fosfato sdico 100 mM, pH 6,2
- Buffer fosfato sdico 100 mM pH 7
- Buffer fosfato sdico 100 mM pH 8
- Suspensin de la bacteria Bacillus subtilis. Las bacterias se crecen ON en medio Luria Bertani a
37C, se centrifuga el cultivo y se resuspende en buffer fosfato sdico pH 6,2 a una DO de 2 a
600 nm.

ATENCIN: Tener precaucin a lo largo de todo el trabajo prctico en la manipulacin de las

clulas bacterianas. A pesar de que se trate de una cepa no patognica se considera residuo
peligroso por tratarse de material biolgico. El descarte del material slido (por ejemplo tips,
guantes, etc) debe realizarse en bolsas rojas, mientras que las soluciones deben tratarse con
lavandina en una concentracin final del 10% V/V.

21

A- Medida de la actividad de las distintas fracciones de la purificacin

PROCEDIMIENTO A REALIZAR POR LOS ALUMNOS:
1. En una cubeta, aadir la suspensin bacteriana, el buffer fosfato sdico 100 mM pH 6,2 y
por ltimo, la fraccin que corresponde siguiendo el siguiente esquema:
Volumen de suspensin Volumen
de
buffer
Volumen de cada
Fraccin
de bacterias (l)
fosfato pH 6,2 (l)
fraccin (l)
100
1310
EC
90
100
1100
FT
300
100
1100
L1
300
100
1100
L2
300
100
1310
E
90
2. Medir en forma continua el descenso de la absorbancia a 600 nm registrando los valores de
absorbancia cada 20 segundos por un perodo de 4 minutos. Calcular la variacin de absorbancia
por minuto (A/min) y la actividad en U/mg.

B- Medida de la actividad en funcin del pH

PROCEDIMIENTO A REALIZAR POR LOS ALUMNOS:
1. En una cubeta, aadir 100 l de la suspensin bacteriana, 1310 l del buffer que corresponda
en cada caso y por ltimo, 90 l de la fraccin E. Se deben realizar las medidas a pH 4, pH 5, pH
6,2, pH 7 y pH 8.
2. Medir en forma continua el descenso de la absorbancia a 600 nm registrando los valores de
absorbancia cada 20 segundos por un perodo de 4 minutos. Calcular la variacin de absorbancia
por minuto (A/min) y la actividad en U/mg.

C- Estabilidad en funcin del pH

PROCEDIMIENTO A REALIZAR POR LOS ALUMNOS:
1. Incubar en un eppendorf 90 l de la fraccin E con 210 l del buffer que corresponda en
cada caso por 20 minutos. Se deben realizar las incubaciones a pH 4, pH 5, pH 6,2, pH 7 y pH 8.
2. Luego de los 20 minutos, aadir en una cubeta 100 l de la suspensin bacteriana, 1100 l el
buffer fosfato sdico 100 mM pH 6,2 y por ltimo, agregar el contenido del eppendorf.

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3. Medir en forma continua el descenso de la absorbancia a 600 nm registrando los valores de

absorbancia cada 20 segundos por un perodo de 4 minutos. Calcular la variacin de absorbancia
por minuto (A/min) y la actividad en U/mg.

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INFORME DE LABORATORIO:

INTEGRANTES DEL GRUPO

COMISIN
OBJETIVOS GENERALES
RESULTADOS
I- Purificacin de la lisozima
I.a- SDS-PAGE (foto/ esquema y descripcin)
I.b- Cuantificacin de protenas (curva de calibracin y el ejemplo del clculo de la concentracin
de al menos una de las fracciones)
I.c- Medidas de actividad de cada fraccin (al menos el ejemplo del clculo de la Aesp en 1 de las
fracciones)
I.d- Complete la siguiente tabla:
Fraccin

Vol
(ml)
10

[Prot]
(mg/ml)

ProtT
(mg)

A
(U/ml)

AT
(U)

Aesp
(U/mg)

EC
FT
L1
L2
E
A partir de esos datos construya la tabla de purificacin.
II- Estabilidad y actividad de la lisozima vs pH (grficas de U/mg vs pH de medida o pH de
preincubacin)
DISCUSIN
- Mtodo de cuantificacin de protenas:
a- La medida de absorbancia a 280 nm: Es un mtodo confiable para la determinacin de
la concentracin de protenas? Se puede aplicar a cualquier protena? Qu se usa
como patrn para la construccin de las curvas de calibracin?
b- Calcular la concentracin de protenas totales en la clara de huevo y comparar con la
bibliografa.

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Mtodo de medida de actividad:

a- Continuo vs Discontinuo. Discutir porque el mtodo que usamos es continuo a pesar
de que los datos se midan en forma discontinua.

Purificacin:
a- Comparar la tabla del tem I.d con el gel. Discutir sobre la eficiencia del proceso de
purificacin.
b- Completar la siguiente tabla y comparar con lo observado en el gel:

Abundancia en clara de
huevo (%)

Protena

Peso
Molecular
(kDa)

Funcin/Caractersticas
pI

Ovoalbmina
Ovotransferrina
Lisozima
Ovomucina
Ovomucoide
Avidina

- Actividad y estabilidad en funcin del pH

a- Determinar e informar rango de estabilidad y pH pimo

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