SEMINARIO 1

PRUEBAS MICROBIOLOGICAS PARA MANEJO Y

ESTUDIO DE LA INFECCION FUNGICA INVASORA
1.- Espiroquetas:
Bacilos flexuosos en forma de espiral
con movilidad debida a un filamento
axial y semejante a un sacacorchos. Son
Gram-negativos.

Comprende

los

rdenes y familias siguientes1:

Orden Spirochaetales1

ANLISIS
Familia Spirochaetaceae
SEMINARIO
Gnero Treponema: T.
pallidum
CLNICO
Gnero Borrelia: B. recurrentis

Familia Leptospiraceae:
Gnero Leptospira: L. interrogansINTEGRANTES:
ORTIZ LUJAN MARIO
OTOYA LAVADO STHEFANY
PAREDES LLICO LESDY
PAREDES MONZON WALTER
Treponema pallidum
PAREDES PUERTA ALEXANDRA
PELAEZ RAMOS GIANNINA
Es la causante de la sfilis. Se trata de un microorganismo
dePERCY
pequeo tamao que
PEREA ALVA
sistemas
PESANTES
CHAVEZ
GIULIANA
no es observable al microscopio ptico con los
de tincin
normales.
No ha

ESPIROQUETAS

podido ser cultivado en el laboratorio.PROFESOR:

El nico reservorio es el humano1.
Dra.
MIRIAM
GUTIRREZ
RAMOS La
La sfilis es una enfermedad de transmisin
sexual
y de declaracin
obligatoria.

enfermedad pasa por diferentes estados (periodo de incubacin, sfilis primaria,

CICLO:
secundaria y terciaria) y puede atravesar
la barrera placentaria y causar la sfilis

congnita1.

VII

El sntoma caracterstico de la sfilis es la aparicin de una lcera plana no dolorosa,

principalmente en el rea genital, que se conoce con el nombre de chancro de
inoculacin1.
1

SEMINARIO 1
El tratamiento de la sfilis se basa en la inyeccin de altas concentraciones de
penicilina de accin retardada o doxiciclina en el caso de pacientes alrgicos a los lactmicos, y la prevencin del contagio se basa en las medidas de proteccin frente
a las enfermedades de transmisin sexual1.
El patgeno escapa del sistema inmune y es difcil de tratar en pacientes con SIDA.

2.- Micoplasmas:
Carecen de pared celular. Son los menores microorganismos cultivables en medios
sintticos.
Familia Mycoplasmataceae.
Gnero Mycoplasma.
Especies: M. pneumoniae, M. hominis
Gnero Ureaplasma.
Especie: U. urealyticum
MICOPLASMAS

Mycoplasma pneumoniae:
Es el microorganismo causante de la neumona atpica primaria. Los microplasmas no
tienen pared celular de peptidoglicano y, por consiguiente, son insensibles a los lactmicos y son muy pleomrficos Su cultivo en el laboratorio es muy complicado2.

SEMINARIO 1
Hay especies que son parte de la flora normal; pero M. pneumoniae es intrnsecamente
patgeno2.
La infeccin se presenta en adultos jvenes y el contagio es persona-persona por medio
de contacto directo y siendo necesario un contacto estrecho. La enfermedad se presenta
como faringitis, bronquitis o neumona siendo por lo general leve, con fiebre y tos no
productiva2.
El tratamiento normalmente no es necesario porque la infeccin se autolimita. En caso
de ser necesario el uso de antibiticos, la eleccin es un

antibitico macrlido,

tetraciclina o eritromicina2.

3.- RICKETTSIAS
El

gnero Rickettsia est

constituido

por

especies

de

pequeos

cocobacilos gramnegativos pleomrficos, inmviles y aerobios que se comportan como

patgenos intracelulares obligados y estn relacionados serolgicamente. Se tien
razonablemente bien con los mtodos de Giemsa, Castaeda y Gimnez y dbilmente
con la tincin de Gram3.
Las rickettsiosis constituyen un grupo de enfermedades zoonticas de distribucin
geogrfica heterognea cuya gravedad vara desde formas benignas y autolimitadas a
infecciones fulminantes de elevada mortalidad. La mayora de los casos se adquieren
por picadura de garrapatas, piojos o pulgas que estn infectados por el microorganismo.
El hombre es un husped accidental en el ciclo biolgico de las rickettsias. Diversos
3

SEMINARIO 1
mamferos, fundamentalmente pequeos roedores, ganado y perros, contribuyen a
perpetuar la infeccin y cerrar el ciclo biolgico de la bacteria. Un hecho de especial
inters con relacin a la epidemiologa de las rickettsiosis reside en que la distribucin
de una especie determinada, en general, coincide con la distribucin de la garrapata
vector. Hasta el ao 1991 slo se conocan cinco enfermedades rickettsiales. Desde
entonces, gracias al desarrollo de los mtodos de cultivo y de las tcnicas de biologa
molecular, se han descrito otras muchas . Las rickettsias se clasifican en dos grupos
atendiendo a las bases clnicas y a los agentes etiolgicos responsables: el grupo de las
fiebres manchadas (GFM) y el de las fiebres tficas (GFT). Las rickettsias
pertenecientes al GFM muestran una distribucin global. La mayora se transmite por
garrapatas y estn muy relacionadas serolgicamente. Los representantes del GFT son
dos: R. prowazekii, responsable del tifus exantemtico epidmico, y R. typhi, que
produce el llamado tifus murino o endmico3.

Los principales sntomas de una rickettsiosis aparecen a los 6-10 das despus de la
picadura y se caracterizan por cefalea, erupciones maculopapulares, dolores musculares,
linfadenopata local y una o varias escaras en el punto de inoculacin. A partir del sitio
de entrada del agente, la infeccin se extiende por la circulacin venosa invadiendo el
endotelio de capilares, venas y arterias, donde se multiplica y produce una vasculitis
ms o menos generalizada. En los casos ms graves, las rickettsiosis suelen ir
acompaadas de edema pulmonar, neumona intersticial y erupcin hemorrgica. Las
alteraciones del sistema nervioso central suelen ser relativamente frecuentes y pueden
provocar distintos cuadros clnicos. Algunas de ellas derivan en importantes secuelas
como sordera, prdida de visin y parapleja, entre otros defectos neurolgicos3.
Tcnicas diagnsticas
El diagnstico microbiolgico se basa en tcnicas serolgicas, de PCR y el cultivo.

SEMINARIO 1

Tincin de Gimnez
Las muestras de tejidos pueden examinarse microscpicamente mediante esta tincin,
que permite visualizar las rickettsias, pero no diferencia en cuanto a especie ni tampoco
otros microorganismos, por lo que su deteccin suele ser dudosa3.
Serologa
La serologa est limitada por las reacciones cruzadas entre el GFM y el GFT. La IFI es
una de las tcnicas ms sensibles y la ms ampliamente utilizada en la actualidad para el
diagnstico de las rickettsiosis exantemticas. Los antgenos estn comercializados,
estandarizados y prefijados en los portaobjetos sobre los que se aaden diluciones
seriadas del suero del paciente. La confirmacin del diagnstico requiere detectar una
seroconversin, que se produce en la fase de convalecencia, entre la tercera y cuarta
semanas. Para una correcta interpretacin de los resultados de serologa, se deben tener
en cuenta los datos de reactividad ba-sal de la poblacin en zonas endmicas. Como
tcnicas experimentales, para evitar la reactividad cruzada, en algunos casos se utilizan
ensayos deinmunobloting con sueros sometidos a absorciones con antgenos

SEMINARIO 1
heterlogos. Este mtodo da como resultado un considerable aumento de la
especificidad, si bien tiene una baja sensibilidad3.
Cultivo
Para el cultivo de las rickettsias del GFM se requiere Minimum Esencial Medium
(medio MEM) sin antibitico suplementado con suero bovino fetal (SBF) al 10%
(concentracin final [CF]), 2 mM de glutamina CF y el 0,2% (CF) de aminocidos no
esenciales. La incubacin de los cultivos se lleva a cabo a 33-35 C en ausencia de
CO2. Para R. typhi se requiere el mismo medio suplementado con SBF al 2% (CF). El
diagnstico definitivo de las rickettsiosis requiere el aislamiento e identificacin de la
especie a partir del cultivo. El cultivo se lleva a cabo en clulas VERO E6 o fibroblastos
L92. El efecto citoptico producido no es muy caracterstico ni especfico de especie y,
aunque puede aparecer a las 24-48 h postinoculacin, generalmente se necesitan 5-7
das para su desarrollo. El cultivo se puede acelerar si se inocula la muestra sobre una
monocapa de las clulas susceptibles previamente crecidas sobre un portaobjetos
circular (shell vial, SV), seguida de una centrifugacin. Despus de 5-7 das de
incubacin se procede a detectar la presencia de la bacteria mediante tincin de
Gimnez, IFI con anticuerpos especficos o PCR. Este procedimiento resulta muy
laborioso, requiere personal especializado e instalaciones con nivel de seguridad 3. Su
principal limitacin es su baja sensibilidad, por lo que se no se recomienda en el caso de
que el paciente haya comenzado con la antibioterapia. Sin embargo, es la tcnica
diagnstica ms especfica, fundamental para la obtencin de antgenos, para el estudio
de

la

sensibilidad

antibiticos

la

determinacin

de

las

especies

de Rickettsia presentes en un rea3.

Deteccin molecular
Las tcnicas moleculares, como la PCR, permiten un diagnstico rpido y especfico al
detectar ADN de rickettsia en tejidos infectados, cultivos y garrapatas. Por el momento,
la mayor parte de las tcnicas descritas son de desarrollo propio (in house), y no estn
comercializadas. Los genes ms comnmente analizados son los que codifican dos
protenas de la membrana externa: rOmpA(presente en todas las especies excepto R.
helvetica, R. australis, R. bellii y R. canadensis) y rOmp B(presente en todas las
especies excepto R. helvetica, R. bellii y R. massiliae). Tambin se utiliza el gen gltA,
6

SEMINARIO 1
que codifica la citrato sintetasa (vlido para todas la rickettsias), el gen que codifica la
protena de 17-kDa (vlido para todas las rickettsias del GFM) y el gen D (vlido para la
mayora de las especies). Recientemente, se ha desarrollado una PCR-RLB (reverse line
blotting) que utiliza como diana el espacio intergnico 23S-5S ARNr que, junto con una
hibridacin en fase reversa utilizando sondas espe-cie-especficas, permite la
identificacin de la especie implicada sin necesidad de secuenciacin. Este mtodo es
altamente sensible y especfico, tanto para muestras clnicas como ambientales. Cuando
se busque una mayor sensibilidad, hay que recurrir a PCR anidadas y posterior
hibridacin en fase reversa. La PCR a tiempo real permite obtener resultados en muy
poco tiempo (menos de 1 h). Todas estas ventajas hacen que la PCR se presente como la
prueba ideal para el diagnstico de estas infecciones, aunque existen algunas
desventajas, como son la limitacin para realizar pruebas de sensibilidad a los
antibiticos y la imposibilidad de coleccionar los aislados para futuras investigaciones3.
Las rickettsiosis se previenen evitando la picadura de los artrpodos vectores. El
tratamiento de las rickettsiosis debe iniciarse sobre la base proporcionada por datos
clnico-epidemiolgicos. El tratamiento de eleccin para la infeccin por rickettsias es
la doxiciclina. En nios puede utilizarse en algunos casos la azitromicina3.
4.-CLAMIDIAS
La familia Chlamydiaceae consiste de un gnero, Chlamydia con tres espcies que
causan enferemedad en humanos4:

C. trachomatis, la cual puede causar infecciones urogenitales, tracoma,

conjuntivitis, neumona y linfogranuloma venreo (LGV)

C. pneumoniae, la cual puede causar bronquitis, sinusitis, neumona y

posiblemente aterosclerosis

C. psittaci, la cual puede causar pneumona (psitacosis).

El gnero Clamidia son parsitos pequeos intracelulares obligados y alguna vez

7

SEMINARIO 1
fueron considerados virus. Sin embargo, contienen DNA, RNA y ribosomas por lo
tanto sintetizan sus propias protenas y cidos nucleicos por lo cual ahora se
consideran bacterias verdaderas. Poseen membrana interna y externa de manera
similar a las bacterias gram-negativas y presentan lipopolisacrido pero no tienen
lmina de peptidoglicano. Aunque sintetizan la mayora de sus intermediarios
metablicos, son incapaces de sintetizar su propio ATP y por lo tanto son parsitos
de energa4.
Diagnstico de Laboratorio
Existen

varias

pruebas

de

laboratorio

para

diagnosticar

C.

trachomatis pero la sensibilidad de ellas depende de la naturaleza de

la enfermedad, el sitio de coleccin de la muestra, la calidad de la
misma. Dado que las Clamidia son parsitos intracelulares, para el
anlisis deben enviarse hisopos de los lugares afectados mejor que
los exudados. Se estima hasta el 30% de los especmenes enviados
para su anlisis son inapropiados4.
1.Citologa
El examen por tincin de raspados celulares para bsqueda de la
presencia de cuerpos de inclusin (Figuras 2 y 3) ha sido usado para
el diagnstico pero ste mtodo no es tan sensible como algunos
otros4.
2.Cultivo
El cultivo es el mtodo mas especfico para el diagnstico de las
infecciones de C. trachomatis. Los especmenes se agregan a clulas
susceptibles en cultivo y las clulas infectadas se examinan por la
presencia de cuerpos de inclusin teidos con yodo. El yodo tie el
glucgeno de los cuerpos de inclusin. La presencia de cuerpos de
inclusin teidos con yodo es especfica para la determinacin de C.
trachomatis ya que los cuerpos de inclusin de otras espcies de
clamidia no contienen glucgeno ni se tien con yodo4.
3.Deteccin de Antgeno
8

SEMINARIO 1
Inmunofluorescencia Directa y ELISA (kits) que detectan el LPS-grupo
especfico o protenas de membrana externa (omp) especficas de
cepa estn disponibles para el diagnstico. Esta prueba tampoco es
tan buena como el cultivo, particularmente con muestras conteniendo
pocos microorganismos (ej. pacientes asintomticos) 4.
4.Serologa
Las pruebas serolgicas para el diagnstico son de valor limitado en
los adultos, ya que las pruebas no distinguen entre infecciones
actuales o infecciones previas (pasadas). La deteccin de altos ttulos
de anticuerpos IgM es indicativa de una infeccin reciente. La
deteccin de anticuerpos IgM, es til en la infeccin neonatal4.
5. Sondas de cidos nuclicos
Estn disponibles tres nuevas pruebas basadas en sondas de cidos
nucleicos. Estas pruebas son sensibles y especficas y pueden
reemplazar al cultivo como mtodo de eleccin4.
DIAGNSTICO
MICTICAS:

POR

EL

LABORATORIO

DE

LAS

INFECCIONES

Objetivo principal del laboratorio:

Detectar rpida y eficazmente la presencia de los hongos en muestras clnicas y
determinar si es el agente etiolgico o es un contaminante. Para lograr este objetivo se
requiere realizar adecuadamente la recogida de la muestra, su transporte y
procesamiento, adems de contar con los detalles sobre el cuadro clnico y los
antecedentes epidemiolgicos. Es importante disponer de la siguiente informacin5:
1) Historia clnica del paciente.
2) Tratamientos antimicrobianos, citotxicos o frmacos inmunosupresores.
3) Ocupacin del paciente.
4) Historia de residencia o viajes al exterior.
5) Contacto con animales.
6) Tipo de muestra a analizar.
7) En qu condiciones fue recolectada la muestra.

SEMINARIO 1

Es muy importante que las muestras sean enviadas al laboratorio una vez recolectadas, y
en forma adecuada para su rpido procesamiento; de esta forma se minimiza la prdida
de viabilidad de los hongos, reduce el desarrollo de bacterias y asegura la obtencin por
cultivo del agente etiolgico5.
Segn los tejidos comprometidos, las micosis se clasifican en:

Superficiales, que afectan piel y fanreos.

Profundas, que comprometen tejido subcutneo, osteoarticular y visceral. Estas

ltimas pueden ser producidas por hongos patgenos (Histoplasma capsulatum,
Coccidioides immitis, etctera) o por hongos oportunistas, que son inofensivos
en el husped inmunocompetente, pero que actan como patgenos en el
inmunocomprometido5.

En los ltimos aos se ha observado un aumento importante de micosis oportunistas

debido a la expansin de la poblacin de pacientes inmunocomprometidos. Adems de
las infecciones fngicas oportunista clsicas, como candidiasis, criptococosis,
aspergilosis y mucormicosis, han emergido micosis por otros hongos que hasta hace
poco tiempo se consideraban simples contaminantes, como por ejemplo Fusarium,
Trichosporon, Malassezia, etctera. Esto ha obligado a los microbilogos a
familiarizarse con la morfologa macro y microscpica de estos agentes, ya que el
diagnstico micolgico es eminentemente morfolgico, especialmente en hongos
filamentosos5.
Las tcnicas bsicas de Bacteriologa (aislamiento, identificacin morfolgica y
bioqumica) son, en general aplicables a las levaduras de importancia mdica (gneros:
Candida, Cryptococcus, Trichosporon, Rhodotorula.Pityrosporum y Torolopsis). No
obstante, hay diferencias con respecto a las bacterias que es necesario destacar. El
perodo de generacin es ms largo, por lo tanto debe mantenerse en incubacin durante
un tiempo prolongado. Los demartofitos, por ejemplo, pueden demorar hasta 4 semanas.
Los hongos oportunistas, en cambio, son de desarrollo ms o menos rpido, como por
ejemplo Mcorales 24-48 horas, Apergillus 48-72 horas; Crytococcus 48-72 horas5.
El diagnstico de laboratorio de las infecciones fngicas requiere:

Presuncin diagnstica por parte de los clnicos.

Apropiada recoleccin de muestras.

Procedimientos especiales de Laboratorio.

El estudio micolgico consta de5:

10

SEMINARIO 1
1. Observacin directa al fresco con lquidos clarificantes (KOH 10-20%,
lactofenol) para pesquisa de levaduras e hifas.
2. Cultivos de hongos en agar Sabouraud glucosado, con sin antibiticos, con y sin
ciclohexamida, en que se consideran tiempo de desarrollo, caractersticas
macroscpicas y microscpicas (hifas y esporas), estudios de fermentacin
(zimograma) y utilizacin de carbono (auxonograma).
3. Estudio histolgico: biopsias con tinciones especiales, como Gomori Grocott
(impregnacin argntica).
4. Inmunodiagnstico.
o Deteccin de antgenos capsulares, de pared fngica, etctera; son pruebas
sensibles y una buena alternativa frente a cultivos que requieren perodos de
incubacin prolongados .
o Deteccin de anticuerpos: IgG, IgM con tcnicas de inmunodifusin o con
tcnicas de anticuerpos marcados: ELISA e inmunofluorescencia.
5. Tcnicas de biologa molecular: hibridacin de ADN, PCR,, etctera.
Las micosis que se observan con mayor frecuencia en nuestro medio son, entre las
micosis superficiales, pitiriasis versicolor y dermatofitosis y, entre las profundas
oportunistas, candidiasis, criptococosis, aspergilosis y mucormicosis. A continuacin se
revisar el diagnstico micolgico de stas5.
RECOGIDA Y PROCESAMIENTO DE MUESTRA
Al igual sucede en los restantes de procesos infecciosos, e l diagnstico de laboratorio
de la infeccin causada por hongos. Estos ltimos es especialmente cierto cuando el
microorganismo aislado en los cultivos forma parte de la microflora normal o se
encuentra con frecuencia en el ambiente6.
La microscopia directa tiene una clara utilidad en el diagnstico de las micosis, aunque
puede obtener resultado falsos negativos o falsos positivos. La microscopa dispone de
una sensibilidad menor que los cultivos, y la obtencin de resultados negativos no
descarta la existencia de una micosis. Se emplea diversas tinciones y tcnicas
microscpicas para detectar y caracterizar directamente los hongos en muestras clnicas.
Lo abordajes utilizados ms a menudo en el laboratorio de micologa clnica son el
reactivo fluorescente blanco calcoflor o la tincin de frotis y la preparaciones con
tinciones de gram o giensa. El blanco calcoflor tie las paredes celulares de los hongos
haciendo que emitan florescencia, lo que hace posible su deteccin de forma ms fcil y
rpida. La tincin de gran resulta de utilidad en deteccin de levaduras de gnero como
cndida y cryotococcus, aunque tambin tie las hifas de hongos filamentosos, como las
11

SEMINARIO 1
inclusiones de aspergillus. Generalmente, los hongos son grampositivos, aunque pueden
adoptar un aspectomoteado o gramnegativo. La tincin de giensa es especialmente til
para detectar las formas levaduriformes intracelulares de H. capsulatum en frotis de
sangre perifrica, medula sea o preparaciones touch de tejidos6.

12

SEMINARIO 1

En un estudio realizado en los consultorios de dermatologa y el laboratorio del Hospital

Nacional de Clnicas Pedro Vella de la Facultad de Ciencias Mdicas en la
Universidad Nacional de Crdoba, Argentina, se analizaron 88 muestras clnicas de
pacientes con diagnstico presuntivo de micosis superficiales, las muestras se
recolectaron en dos etapas6.
1. Extraccin de material sin preparacin previa 6.
2. Extraccin post-preparacin6:
a) Se suspendi todo medicamento sistmico o tpico con accin antifngica 10 a 15
das antes de la extraccin.
b) Tres a cinco das antes de la toma de muestra no se aplicaron pomadas, cremas o
polvos sobre la piel, as como esmalte de uas.
c) La zona debi ser higienizada con agua y jabn de tocador, as mismo se aconsej
realizar por lo menos tres lavados con infusin de manzanilla o agua hervida y sal
tres das antes de acudir al laboratorio.
d) En el caso de extraccin de material de uas, se recomend no cortarlas en la
semana anterior a la obtencin y adems de los lavados fue necesario el cepillado
de las mismas.
e) Si la zona afectada eran los pies, se recomend usar calzado cerrado y medias
despus del ltimo bao, cuidando que los zapatos no tuvieran restos de talco.
Recoleccin de las muestras6:
13

SEMINARIO 1

Raspado con bistur para las lesiones de piel y uas.

Extraccin de pelos con pinzas.
Hisopos o bistur para las lesiones mucosas y semimucosas.
Todos los materiales fueron recogidos en materiales estriles.
TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS:
Las muestras deben ser transportadas en un recipiente estril, humidificado y a prueba
de vertidos; sin embargo, las muestras dermatolgicas pueden transportarse en un
recipiente seco (placa de petri, papel de fotografa negro, frascos recolectores) o de
forma ideal, sembrarla directamente sobre el medio de cultivo; no deben introducirse en
medios de transporte, a no ser que sea fcil retirar la muestra del medio. Los raspados
corneales y hemocultivos deben sembrarse directamente en el medio de cultivo
adecuado. Las muestras cuyo transporte se prolongue ms de 2 horas deben almacenarse
a 4C, excepto la sangre y los lquidos estriles (30-37C) y las muestras
dermatolgicas (15-30C) 6.
CULTIVO
Por lo general se considera que el mtodo diagnostico dotado de la mayor sensibilidad
frente a las micosis es el aislamiento del hongo en un cultivo. Adems, el cultivo suele
ser necesario para identificar a los agentes etiolgicos en la mayora de los casos. La
recuperacin ptima del material clnico depende de la obtencin de muestra clnica
adecuada y la posterior utilizacin de los mtodos de cultivo que garanticen la
recuperacin de los microorganismos que suelen estar presentes en pequeas cantidades
y crecen muy despacio7Ningn medio de cultivo es suficiente por s mismo para aislar
todos los hongos con importancia mdica y normalmente se acepta la utilizacin de dos
tipos de medio: selectivos y no selectivos7.
El medio no selectivo permite el desarrollo de levaduras y formas filamentosas de
crecimiento rpido, as como los hongos exigentes desde el punto de vista nutricional y
de crecimiento ms lento. Los hongos son capaces de proliferar en casi todos los medios
de cultivo usados para las bacterias; no obstante, su crecimiento puede ser lento y se
recomienda la inoculacin de un medio de ms enriquecido como agar de extracto de
corazn y cerebro o agar SABHI (dextrosa de Sabouraud y BHI). En general la
recuperacin optima de los hongos exigentes desde el punto de vista nutricional como,
H. capsulatum,B.dermatitidis, a partir del material del material clnico suele requerir de
un medio con sangre. A menudo se aade cicloheximida con el propsito de inhibir
levaduras y las formas miceliales de crecimiento ms rpido que estn presentes en la
muestra como contaminantes. Aunque este compuesto no afecta a los patgenos
dimorficos endmicos, inhibe la proliferacin de un gran nmero de patgenos
oportunistas (Candida o Aspergillus) que tambin podran ser responsables de la
infeccin7.
14

SEMINARIO 1
Por ello se debe combinar siempre un medio con ciclohiximida con otros medios
complementarios carentes de esta molcula. Las muestras que podran presentar
contaminacin bacteriana deben inocularse en medios selectivos como SaBHI y BHI
complementarios con antibiticos (a menudo se emplea penicilina asociada a
estreptomicina). Ciertos hongos pueden precisar de medios de especializados. Por
ejemplo la recuperacin optima de Malassezia furfur, un patgeno que produce
infecciones cutneas superficiales y en catteres vasculares exige la utilizacin de un
medio que contenga aceite de oliva u otra fuente de acidos grasos de cadena larga7
La deteccin de una fungemia es un importante componente del diagnostico de una
micosis invasiva. Aunque es posible la contaminacin de los hemocultivos por un
hongo, la obtencin de resultados positivos para hongos en la mayora de estos cultivos
se utilizan se considera significativa. Por desgracia los hemocultivos arrojan con
frecuencia resultados negativos a pesar de la presencia de la enfermedad diseminada en
especial cuando el microorganismo que a causado una infeccin es una forma micelial.
La deteccin de las fungemias ha mejorado como consecuencia de desarrollo de
instrumentos de monitorizacin continua de los hemocultivos con medios de cultivo
mejorados que tienen en cuenta las necesidades de crecimiento de los hongos y
bacterias. Junto a estos sistemas basados en caldos de cultivo, el mtodo de lisiscentrifugacin constituye una herramienta flexible y sensible de deteccin de la
fungemia provocada por levaduras y patgenos dimorficos7.
Tras su inoculacin los cultivos fngicos han de incubarse en una atmosfera aerobia a
una temperatura adecuada y durante un periodo de suficiente para permitir la
recuperacin del hongo a partir de las muestras clnicas6.

15

SEMINARIO 1

IDENTIFICACION DE HONGOS FILAMENTOSOS

16

SEMINARIO 1
El

crecimiento

de

hongos

puede

producir

en

sus

habitantes

determinadas patologas entre las que cabe destacar asma y

alveolitis alrgicas. La contaminacin ambiental por hongos en el
interior de edificios, es debida bsicamente a hongos filamentosos y
levaduras8.
Muchas especies de hongos se pueden diferenciar, identificar y clasificar segn su
morfologa, estructura, mecanismo de formacin y elementos formadores de las esporas.
El conocimiento de estas caractersticas puede ser suficiente para identificar especies
que pertenecen al grupo de los hongos filamentosos; sin embargo, cuando se trata de
identificar especies pertenecientes al grupo de las levaduras es imprescindible la
aplicacin de pruebas bioqumicas8.
La mayora de los hongos, sin embargo, son pluricelulares o
filamentosos y se caracterizan por estar constituidos por filamentos
ramificados o hifas que se desarrollan y entrelazan formando el
micelio8.
Existe un micelio vegetativo adosado a la superficie del sustrato
(suelo, plantas, alimentos) y un micelio areo o reproductor, donde se
forman las esporas (asexuales y sexuales) (9).
Los hongos filamentosos y levaduras son en su mayora saprfitos, hallndose libres en
la naturaleza, especialmente en la materia orgnica en descomposicin8.
Principales Mtodos De Identificacin De Hongos
Filamentosos
La identificacin de los hongos filamentosos se basa en el examen macroscpico de la
colonia y en sus caractersticas microscpicas. Semejanzas macroscpicas como la
forma de la colonia, el color de la superficie, la textura y la produccin de pigmentos
son muy tiles para la identificacin8.
En general, la morfologa microscpica de los hongos es estable y
presenta pocas variaciones. La identificacin definitiva se basa en la
17

SEMINARIO 1
forma caracterstica, mtodo de produccin y ordenamiento de las
esporas, siendo tambin importante conocer

el tamao

y la

disposicin de las hifas8.

La preparacin del material para la observacin microscpica puede realizarse en
fresco, con cinta de celofn adhesiva o mediante cultivo sobre portaobjetos8.
Preparacin en fresco
Se realiza empleando el procedimiento descrito a continuacin8:
1. Seleccionar una colonia aislada.
2. Calentar a la llama el alambre de un asa de siembra, y doblar
de forma que se convierta en un objeto cortante.
3. Con la ayuda del asa, extraer un fragmento triangular de la
colonia que contenga adems un poco de agar en la parte
inferior.
4. Depositar el fragmento extrado sobre un portaobjetos en el
cual, previamente, se ha depositado una gota de azul de
lactofenol.
5. Cubrir con un portaobjetos y presionar suavemente para
dispersar la colonia y el agar; de esta forma, la muestra est
disponible para su observacin al microscopio.
Este procedimiento es el que utilizan la mayora de los laboratorios,
ya que las muestras se preparan con facilidad y rapidez y adems
permite identificar muchas de las especies de hongos ms habituales.
El mayor inconveniente de la observacin en fresco es que se puede
alterar el ordenamiento caracterstico de las esporas al presionar con

18

SEMINARIO 1
el cubreobjetos, por lo que este procedimiento no es vlido en los
casos en que es necesario conocer la disposicin de las esporas8.
Preparacin con cinta de celofn adhesiva
El procedimiento se lleva a cabo como sigue8:
1. Apoyar el lado engomado de un trozo de cinta adhesiva
transparente sobre la superficie de una colonia.
2. Colocar la cinta bien extendida sobre una gota de azul de
lactofenol o azul de anilina colocada, a su vez, sobre un
portaobjetos.
3. Observar al microscopio para conocer la forma y ordenamiento
caracterstico de las esporas.
Este mtodo puede considerarse como el ms simple, econmico y
adecuado para la identificacin de hongos, recomendable para los
laboratorios microbiolgicos de cualquier nivel.
La

preparacin de

la

cinta

transparente

permite observar al

microscopio como se desarrolla el microorganismo en el cultivo.

Generalmente las esporas se mantienen intactas y la identificacin se
realiza con facilidad8.
Una de las desventajas de este mtodo es que si la cinta transparente
no se presiona con suficiente firmeza sobre la superficie de la colonia,
la muestra no es adecuada, ya que al no quedar bien adherida la
cinta, las esporas o las hifas no se pueden identificar8.
En los casos en que mediante este mtodo no se observen esporas
deber realizarse la preparacin en fresco8.
Cultivo sobre portaobjetos
19

SEMINARIO 1

Se realiza empleando el procedimiento descrito a continuacin8:

1. Cortar un bloque pequeo de un medio slido adecuado (agar),
que ha sido vertido en una cpsula de Petri, hasta una altura de
2 cm. El bloque puede cortarse con la ayuda de un bistur estril
o con un tubo de ensayo estril sin reborde (lo que permite
obtener un taco redondo) .
2. Colocar un portaobjetos estril sobre una capa de agar al 2%
contenida en una cpsula de Petri.
3. Colocar el bloque de agar sobre el portaobjetos.
4. Con un asa de siembra cuyo alambre ha sido doblado en ngulo
recto,

inocular

los

cuatro

cuadrantes

del

taco

con

el

microorganismo a identificar.
5. Colocar un cubreobjetos estril sobre la superficie del bloque de
agar.
6. Tapar la cpsula de Petri que contiene el cultivo e incubar a 30o
C.
7. Finalizado el perodo de incubacin, retirar el cubreobjetos (este
proceso debe realizarse en una cabina de seguridad biolgica),
y colocarlo en un portaobjetos que contenga azul de lactofenol
o azul de anilina.
8. La observacin al microscopio permite distinguir la forma y
disposicin de las esporas.

20

SEMINARIO 1
9. Si con este proceso no ha sido posible la identificacin, el resto
del cultivo puede ser usado ms adelante si se contina
incubando. Entonces se retira el bloque de agar y se agrega una
gota de azul de lactofenol o azul de anilina sobre la zona del
cultivo y se coloca un cubreobjetos sobre ella. Es recomendable
realizar dos cultivos sobre el mismo portaobjetos de modo que
si

en

uno

no

se

pueden

observar

las

caractersticas

microscpicas puede disponerse del segundo despus de un

perodo adicional de incubacin.
Este mtodo permite la observacin microscpica del hongo mientras
se desarrolla directamente debajo del cubreobjetos, de forma que las
caractersticas

microscpicas

se

distinguen

con

facilidad,

las

estructuras se mantienen intactas y puede observarse un gran

nmero de reas representativas8.
No

deben

realizarse

cultivos

en

portaobjetos

de

hongos

de

crecimiento lento que pueden ser patgenos dimorfos, como :

Histoplasma capsulatum, Blastomyces derma titidis, Coccidioides
immitis, Paracoccidioides brasilien sis o Sporothrix schenckii 8.

Identificacin de levaduras de importancia clnica

El trmino levadura se refiere bsicamente a un grupo de hongos
unicelulares, donde las hifas y/o pseudohifas pueden o no estar
presentes y tienen una fase sexual perfecta o teleomorfa. Sin
embargo, las levaduras a las que no se le ha descrito an la fase
sexual, y slo se le conoce la fase anamorfa, son denominadas como
formas parecidas a levaduras o yeastlike; estas se reproducen por
gemacin.

Levaduras de Importancia Mdica

Levaduras del gnero Candida

21

SEMINARIO 1

Levaduras del gnero Cryptococcus

Levaduras del gnero Malassezia

Levaduras del gnero Trychosporon

Levaduras del gnero Rhodotorula

Levaduras del gnero Saccharomyces

Gnero Candida
En cuanto a hongos patgenos en humanos, existen cerca de 200
especies que han sido reconocidas; de estas, alrededor de 30 son
levaduras de inters mdico. Entre ellas, desde el punto de vista
clnico, han sido y siguen siendo relevantes las del gnero Candida,
las cuales forman parte de la flora normal de nuestro organismo. Son
los

agentes

causales

de la

candidiasis

o candidosis, micosis

oportunista, aguda, subaguda o crnica, de alta incidencia en nuestro

medio y a nivel mundial; pueden afectar a individuos de cualquier
edad, raza o sexo, siendo los factores predisponentes del husped en
combinacin con los del microorganismo, los que favorecen el
desarrollo de la infeccin.
En cuanto a la incidencia, en los ltimos 20 a 30 aos se ha elevado
el nmero de casos de candidiasis, siendo hasta el presente Candida
albicans el principal agente causal, encontrndose entre un 60-70%
de los aislamientos clnicos, en individuos infectados por VIH, se ha
observado tambin, que un 90% puede sufrir un episodio de
candidiasis orofaringea. En mujeres VIH positivo, la vulvovaginitis
por Candida esta muy relacionada, as como los casos de recidivas.
En estas pacientes se ha aislado C. albicans de secrecin vaginal en
un 20,75% y Candida spp. en 5,66%.
La

identificacin

de

levaduras

del

gnero

biolgicas,Produccin de clamidosporos:
Se utilizan medios pobres AHM-Tween 80

22

Candida,

Pruebas

SEMINARIO 1
Estructuras de resistencia
Se utilizan repiques de 24 hs.
Se observan a las 72 hs. hasta los 7 das.
Personal experimentado 5-7% de las cepas de C. albicans no los
producen
Son de bajo costo
Pruebas bioqumicas

Asimilacin de hidratos de carbono

Auxanograma convencional

Zimograma convencional

Sistemas comerciales de identificacin

Mtodos enzimticos

Fluorognicos

Cromognicos

Auxanograma

Mtodo de estudio bioqumico para identificacin de levaduras del

gnero Candida.
Asimilacin de carbohidratos en aerobiosis.
Repiques de 24 hs de la cepa a estudiar.
Lectura luego de 24 hs a 48 hs previo pasaje por estufa a 37 C.
Halo de crecimiento alrededor del disco, evidencia asimilacin
del carbohidrato.
Gnero Cryptococcus
En orden de importancia siguiendo a C. albicans, se encuentra la
levadura capsulada Cryptococcus neoformans, agente causal de la
criptococosis, micosis sistmica de evolucin subaguda o crnica, que
ocupa el cuarto lugar entre las enfermedades oportunistas en
pacientes con SIDA. En Venezuela, en este tipo de pacientes,
constituye la tercera causa de muerte, despus de la histoplasmosis y
23

SEMINARIO 1
candidiasis. A nivel mundial, esta micosis tiene una prevalencia del
3% en Amrica y Europa, y de 20-35 % en frica, afecta ambos sexos,
siendo ms frecuente en individuos entre los 30 y 60 aos de edad,
principalmente debilitados e inmunosuprimidos. Las formas clnicas
ms frecuentes son la meningitis y la meningoencefalitis; en algunos
casos puede suceder con diseminacin a otros rganos.
Del estado anamorfo de esta levadura se han descrito tres
variedades: C.

neoformans var. grubii (serotipo

neoformans var. neoformans (Serotipo

D),

ambas

A), C.

de

distribucin

mundial y C. neoformans var. gattii (Serotipo B y C), limitada a

regiones tropicales y subtropicales.
Dentro de las 19 especies de Cryptococcus que han sido reconocidas,
6 han sido recuperadas ocasionalmente como agentes infecciosos: C.
albidus var. albidus, C. albidus var. diffluens, C. luteolus, C. laurentii,
C. terreus y C. Gastricus .Entre los otros grupos de levaduras de
inters

mdico,

se

pueden

gnero Malassezia, Geotrichum

Rhodotorula

mucilaginosa,

mencionar

las

candidum,

ocho

especies

del

Trichosporon spp.,

Sporobolomyces spp.,Saccharomyces

cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pneumocystis jiroveci (especie

que infecta

al

humano,

antiguamente

considerado

como

un

protozoario y denominado P. carinii), y otras.

La causa principal de patogenicidad de estas levaduras est
relacionada con alteraciones del sistema inmunolgico del husped,
as como con otros factores predisponentes, que puedan interferir en
el equilibrio del nicho biolgico que mantienen a estas levaduras en
estado de comensal. Entre los factores desencadenantes podemos
mencionar: embarazo, edades extremas (infancia y vejez), uso
prolongado de antibiticos, antineoplsicos, glucocorticoides, drogas,
uso de prtesis dentales, etc.
Estudio micolgico
24

SEMINARIO 1
Examen directo (ED) o microscpico de la muestra clnica: es un
mtodo rpido para la visualizacin de las estructuras fngicas. En
una lmina portaobjeto se aade a la muestra clnica una gota de un
aclarante (KOH 10-40%, Clorazol Black E), para favorecer la ruptura
de los enlaces intercelulares y liberar la clula fngica; se coloca el
cubre objeto y se examina directamente al microscopio de luz (o en
microscopio de fluorescencia en el caso de usar Calcoflor),
observndose estructuras tales como: blastoconidias redondas u
ovales, con o sin gemacin, pseudohifas, (posiblemente Candida
spp.);

artroconidias

blastoconidias,

(Trichosporon

spp.);

slo

artroconidias (Geotrichum spp.), etc. La presencia de blastoconidias y

pseudohifas est asociada con la forma patgena de C. albicans. En
todo caso es importante sealar que el ED slo refiere que se est en
presencia de estructuras compatibles con, siendo necesario el cultivo
para aislar e identificar el microorganismo.
Cultivo: Se efecta por siembra del material clnico en medios de
cultivo como Sabouraud-Dextrosa-Agar, micosel, lactritmel, etc. La
mayora de estas levaduras presentan un crecimiento entre 3-5 das.
El crecimiento del cultivo nos puede mostrar colonias pastosas
compactas o rugosas de color blanco a crema (sugestivas deCandida,
Saccharomyces,

Prototheca), colonias

anaranjadas

coral (Rhodotorula), mucoides (Cryptococcus), de consistencia dura,

superficie rugosa y seca (Geotrichum, Trichosporon), etc.
Como se ha sealado, una vez aislado el agente, slo se puede
sugerir el gnero al cual pertenece, poco se puede referir respecto a
la especie. Para tal fin, se hace necesario recurrir a los diversos
mtodos de identificacin, pero, Es importante llevar a cabo ese tipo
de estudio? En respuesta a esto, McGinnis en 1980, describe que las
levaduras

son

superficialmente

un

grupo

parecen

de

hongos

homogneos,

lo

heterogneos
cual

ya

sugera

que
la

necesidad de llevar a cabo mtodos, que en lo posible, permitieran la

identificacin en cuanto a gnero y especie. Sin embargo, en la
25

SEMINARIO 1
actualidad la importancia de identificar estos microorganismos
conlleva an otra serie de razones como:
La orientacin para el tratamiento antifngico: existen mltiples
reportes en la literatura, sobre la resistencia innata y adquirida de
algunas de estas levaduras de inters mdico a los tratamientos
antifngicos de primera y segunda generacin, como el caso ya
mencionado de C. krusei, C. glabrata y C. albicans, las cuales con
frecuencia pueden presentar resistencia al fluconazol.
Caracterizacin epidemiolgica: Hoy en da, se refleja en muchas
casusticas y publicaciones cientficas, la importancia que ha tenido el
valorar e introducir en los laboratorios de rutina de micologa las
pruebas de identificacin de levaduras, las cuales han permitido
ampliar cada vez ms el conocimiento de estos microorganismos,
desde el punto de vista clnico, micolgico y epidemiolgico.
Estudio biolgico y molecular: No cabe duda que la descripcin de
la nueva especie Candida dubliniensis en 1995, fue debida al sustento
que proporcionaron las tcnicas de biologa molecular, una vez que
los mtodos convencionales de identificacin, no fueron suficientes
para lograr la discriminacin entre esta especie y C. albicans. Cada
da, los estudios de biologa molecular constituyen el asiento de toda
investigacin en el campo taxonmico y biolgico, tanto de hongos
como de cualquier otro microorganismo. Sin embargo, se considera
que an estas tcnicas moleculares no deben ser abordadas en forma
nica, sino en conjunto con ensayos complementarios, que puedan
permitir tener un conocimiento mas integral con respecto a los
caracteres morfolgicos, fisiolgicos y genotpicos de las levaduras.
Identificacin de las Levaduras
Las tcnicas de identificacin pueden ser agrupadas en:
Estudio morfolgico.

26

SEMINARIO 1
Evaluacin macroscpica: examinar en un determinado medio
de cultivo caractersticas de la colonia tales como: color,
textura, topografa de la superficie y bordes de la colonia. Se ha
referido que estos caracteres pueden variar de acuerdo a la
fuente de carbono.
Evaluacin
pseudohifas,

microscpica: presencia
cpsula,

ausencia

blastoconidias,

de

hifas,

artroconidias,

ballistoconidias, etc.
Produccin tubo germinativo: Es una de las pruebas cortas que nos
orienta principalmente hacia la identificacin de C. albicans. Se debe
recordar que la especie descubierta mas reciente, C. dubliniensis,
tambin produce tubo germinal en un corto periodo de tiempo. El
ensayo se aplica colocando un pequeo inculo de la levadura en
suero humano, de conejo o ratn, clara de huevo o en solucin
protica, por el lapso de 2-4 h a 37 C. Se induce el desarrollo de una
estructura tubular a partir del blastoconidio, sin constriccin en su
base, caracterstica que lo diferencia de una pseudohifa
Produccin de clamidosporas: conforma otra de las pruebas rpidas
que se utilizan para diferenciar C. albicansde las otras especies,
teniendo en cuenta que C. dubliniensis, tambin forma clamidosporas
en un lapso de 48 horas de incubacin a temperatura ambiente. Se
requiere la aplicacin de otros ensayos (fisiolgicos, bioqumicos,
moleculares) para diferenciar estas especies.
Estudio fisiolgico y bioqumico
De este tipo de estudio se han derivado los ensayos de asimilacin
(auxonograma-degradacin aerbica) y fermentacin (zimogramadegradacin anaerbica) de carbohidratos para la identificacin de
levaduras. En el auxanograma, la asimilacin del azcar se detecta
por el crecimiento visible y cambio del indicador de color en el medio
de cultivo, mientras que en el zimograma, su producto se detecta a
travs de la produccin de gas (hidrgeno y anhdrido carbnico).
27

SEMINARIO 1

Deteccin de enzimas
Prueba de ureasa: mide la capacidad de la levadura de hidrolizar la
molcula de rea en dos molculas de amonio por la accin de la
enzima ureasa; esto genera un incremento del pH del medio y en
consecuencia el cambio de color de naranja a fucsia. Esta enzima por
lo general esta ausente en el grupo de los Ascomycetes, pero est
siempre presente en los Basidiomycetes. Es as como permite
diferenciar los gnerosCryptococcus, Trichosporon y Rhodotorula, los
cuales son ureasa positivos, de Candida y Geotrichum que son
negativos a este ensayo, salvo algunas excepciones, como C.
krusei, la cual puede o no presentarla.
Actividad de fenol-oxidasa: se produce en presencia de sustratos ortofenlicos como cido cafico o bilis esculina, los cuales son
hidrolizados; los productos reaccionan con las sales de Fe+3 dando
como resultado un pigmento oscuro o negro, indicativo de la
positividad de la prueba. C. neoformans, la especie ms patgena de
este gnero, tiene la capacidad de producir esta enzima, sin embargo,
esta puede ser variable en las otras especies del gnero. La
asimilacin del carbohidrato inositol es comn a todas.
Otras pruebas enzimticas como la deteccin de -galactosidasa,
gelatinazas y -glucosidasa, son de gran utilidad en la identificacin
de levaduras. Por ejemplo, el ensayo de -glucosidasa: positiva
para C. albicans y negativa para C. dubliniensis . Sin embargo,
reportes ms recientes han demostrado la ausencia de esta enzima
en algunos aislados de C. albicans.
Mtodos automatizados
Son mtodos de identificacin rpida basados en ensayos de
asimilacin de carbohidratos y otras pruebas bioqumicas, los cuales
se encuentran estandarizados y simplificados en forma de sustratos
liofilizados. A diferencia de las pruebas convencionales, que pueden
tomar
28

entre

2-20

das,

el

sistema

automatizado

permite

la

SEMINARIO 1
identificacin de la levadura en un lapso de 24-48 horas y los
resultados pueden ser ledos en forma manual o automtica a travs
de un Software. Entre estos sistemas podemos mencionar el
API Candida, API-ATB, ID 32C, API 20C, Vitek Systems, Baxter
MicroScan System y otros.
Medios diferenciales o de identificacin directa
Comprende una serie de medios de cultivo a los cuales se les ha
adicionado sustratos cromognicos o fluorognicos, que ponen de
manifiesto la presencia o no de un grupo de enzimas del hongo: Lprolina-aminopeptidasa,

N-acetil--D-galactosaminidasa,

-D-

glucosidasa, pirofosfato-diesterasa y fosfatasa cida. En presencia de

sustratos fluorognicos, la reaccin enzimtica da lugar a compuestos
fluorescentes, que pueden ser ledos con luz UV, mientras que un
sustrato cromognico da lugar a una colonia pigmentada. Por
ejemplo, C.

albicans es

positiva, mientras

que

L-prolina

en C.

tropicalis la

-galactosaminidasa
segunda

enzima

es

negativa, lo cual hace que en presencia de la mezcla cromognica, C.

albicans, desarrolle una colonia color verdey C. tropicalis azul.
Estos medios de cultivo diferenciales, a pesar de arrojar una
identificacin presuntiva, tienen la gran ventaja de no requerir mucha
experiencia tcnica, son rpidos y especficos, permiten identificar el
agente a partir del cultivo primario y discriminan entre mezclas de
levaduras de una misma muestra, sin embargo, slo pueden
identificar unas pocas especies.
El medio CHROMAgar Candida (Biomedics) descrito por Odds y
Barnaerts en 1994, uno de los primeros en salir al mercado, ha
mostrado un 100% de sensibilidad y especificidad en la identificacin
de C. albicans y C. tropicalis;tambin ha sido referido la identificacin
de C. glabrata y C. krusei. Entre otra de sus ventajas resalta su
utilidad en la diferenciacin entre C. albicans y C. dubliniensis, las
cuales

29

desarrollan

un

color

verde

claro

verde

oscuro

SEMINARIO 1
respectivamente; similares resultados se han observado en el
medio CandidaID.
Mtodos inmunolgicos
Las tcnicas serolgicas siguen siendo una herramienta de gran valor
en el diagnstico de las micosis profundas, para la deteccin de
antgenos o anticuerpos. Estos ensayos, han sido aplicados en el
diagnostico e identificacin rpida de hongos con el uso de
anticuerpos

monoclonales

monoespecificos

por

ensayos

de

Inmunodifusin Doble, inmunofluorescencia, aglutinacin, ELISA e

inmunoperoxidasa. Hoy en da disponemos de pruebas comerciales
rpidas y de fcil ejecucin como Bicholatex Albicans y Krusei color
(Francia), consistentes en partculas de latex sensibilizadas con
anticuerpos monoclonales que reaccionan en forma especifica con
antgenos de superficie de la levadura. Otras tcnicas tambin estn
disponibles en el mercado para diagnstico e identificacin rpida del
agente causal.
Biologa molecular, y otros como son estudios quimiotaxonmicos.
Son herramientas de alto potencial tanto para el diagnstico como
para la identificacin y clasificacin taxonmica de microorganismos.
Estos ensayos estn basados en el anlisis de secuencias de ADN
genmico,

con

el

uso

de

secuencias

cortas

especficas

de

oligonucletidos con tcnicas de PCR y PCR-EIA. Mtodos ms

avanzados estn siendo realizados en formatos miniaturizados, donde
se ensayan en una sola reaccin secuencias de ADN o de pptidos
para diagnstico, identificacin y evaluacin de otros aspectos
biolgicos del microorganismo.
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