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INSTITUTO DE BIOCINCIAS
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA
MEDICINA
Disciplina de Microbiologia Humana
2015
NDICE
LEMBRETES IMPORTANTES.........................................................................................3
RELATRIO DE AULAS PRTICAS..............................................................................3
MORFOLOGIA E COLORAO DA CLULA BACTERIANA..................................5
MEIOS DE CULTURA E CONDIES FSICAS DE CULTIVO BACTERIANO.....8
CONTROLE DE POPULAES BACTERIANAS.....................................................10
GENTICA BACTERIANA (CONJUGAO)...............Erro! Indicador no definido.
DETERMINAO DA SENSIBILIDADE BACTERIANA A DROGAS.....................16
STREPTOCOCCUS..........................................................................................................17
STAPHYLOCOCCUS.......................................................................................................20
PSEUDOMONAS..............................................................................................................24
ENTEROBACTRIAS......................................................................................................26
LEMBRETES IMPORTANTES
1. Durante a permanncia no laboratrio de aulas prticas, necessrio o
uso de avental. Encerradas as atividades, o mesmo deve ser guardado em
uma sacola ou saco plstico, de modo a evitar possvel contaminao do
ambiente fora do laboratrio.
2. No deixe seus pertences sobre as mesas onde os trabalhos prticos so
realizados.
3. Comunique
imediatamente
aos
instrutores
qualquer
acidente
Docentes:
Bacteriologia
Prof. Dr. Augusto Cezar Montelli
Prof. Dr. Josias Rodrigues
Prof. Dr. Rodrigo Tavanelli Hernandes
Profa. Dra. Vera Lcia Mores Rall
Material:
- Lminas contendo o esfregao de bactrias
- Bateria de Gram: violeta genciana (ou cristal violeta), lugol, lcool 95%
e fucsina.
Procedimento:
a) Cobrir os esfregaos com a soluo de violeta genciana. Esperar 1
minuto.
b) Escorrer a violeta genciana e cobrir os esfregaos com lugol.
Esperar 1 minuto.
c) Escorrer o lugol e descorar os esfregaos pelo lcool. Para isto,
deixe o lcool cair, gota a gota, sobre a lmina, mantendo-a
inclinada.
Observar e Desenhar:
Lmina E(Neisseriasp.)
Forma:________________
Arranjo:_________________
Gram:_________________
de
um
paciente
com
Forma:________________
Arranjo:________________
BACTERIANO
Gram: ________________
Material:
- Cultura A (Escherichia coli)
- Cultura B (Staphylococcus aureus)
- Cultura C (Streptococcus agalactiae)
- Caldo sinttico
- Caldo comum
- Caldo glicosado (caldo comum mais glicose)
- Ala de nquel cromo
Procedimento:
1. Semear cada uma das 3 culturas bacterianas nos diferentes meios.
2. Deixar na estufa a 37C at o dia seguinte.
3. Verificar a presena de crescimento (turvao do meio).
4. Anotar os resultados.
Cultura
caldo
Crescimento em:
Caldo
caldo
sinttico
comum
glicosado
A (Escherichia coli)
B (Staphylococcus aureus)
C (Streptococcus
agalactiae)
- Meio de Tiogel
- Cultura A (Escherichia coli)
- Cultura D (Pseudomonas aeruginosa)
- Cultura F (Clostridiumsp.)
- Agulha de nquel cromo
Procedimento:
Com a agulha de nquel cromo, semear as culturas A e D em tubos
de tiogel. Colocar todos os tubos na estufa a 37C por aproximadamente 18
horas. No dia seguinte, observar os tubos, verificando, no meio de tiogel, a
localizao do crescimento. A cultura F ser semeada no Laboratrio de
aula prtica do Departamento de Microbiologia e Imunologia, e observada
juntamente com as culturas A e D.
Local de crescimento no meio de Tiogel:
Culturas
Classifica
o
Superfci
Toda
Base do
extenso
Meio
A (Escherichia coli)
D (Pseudomonas
aeruginosa)
F (Clostridium sp.)
Tempo de aquecimento
5
10
15
A (Escherichia coli)
E (Bacillus cereus)
10
Material:
03 zaragatoas estreis
01 placa de gar-nutriente
Procedimento:
1. Divida uma placa de gar nutriente em 3 quadrantes, marcando A (antes do
tratamento), B (depois do primeiro tratamento) e C (depois do segundo
tratamento).
2. Friccionar uma zaragatoa estril na mucosa da bochecha e semear no
quadrante A em ziguezague.
3. Bochechar com parte do o anti-sptico bucal fornecido por 1 minuto.
4. Aguardar aproximadamente 3 minutos e repetir a coleta do material
semeando no quadrante B.
5. Bochechar novamente com o anti-sptico bucal por 1 minuto.
6. Aguardar 3 minutos e repetir a coleta do material semeando no quadrante
C.
7. Deixe a placa na estufa at o dia seguinte.
Resultados:
Fazer a leitura das placas, anotando o crescimento microbiano com cruzes
(de + a ++++) na tabela abaixo.
Cresciment
o
Microbiano
A (antes do tratamento)
B (depois do primeiro tratamento)
C (depois do segundo tratamento)
11
12
Material:
01 Placa de gar-nutriente
03 zaragatoas estreis
Procedimento:
1. Umedea uma zaragatoa em um tubo contendo salina. Aps retirar o excesso
de salina, pressionando a zaragatoa contra a parede do tubo, esfregue-a
vigorosamente no dorso de uma das mos;
2. Passe a zaragatoa em rea correspondente metade de uma placa com gar
nutriente;
3. Umedea uma segunda zaragatoa em lcool iodado a 0,1% e esfregue no
dorso da outra mo;
4. Aguarde 2 minutos para que haja ao do antissptico;
5. Passe ento, nessa rea, uma terceira zaragatoa umedecida, tomando
cuidado para no ultrapassar a rea higienizada. Inocule, passando a
zaragatoa na superfcie da outra metade da placa com gar nutriente;
6. Incube a placa na estufa, durante uma noite.
7. Observe a intensidade de crescimento anotando com sinal + na tabela abaixo.
Resultados:
Observe a intensidade do crescimento microbiano anotando com cruzes
(de + a ++++) na tabela abaixo.
Antes do
Depois do
Tratamento
Tratamento
Crescimento
Microbiano
13
GENTICA BACTERIANA
CONJUGAO
Material:
Procedimento:
1. Semeie as amostras A, B e a mistura (M) nas placas contendo meio
seletivo MacConkey, com antibticos (Nal + Clo), conforme o esquema abaixo.
2. Para controle das culturas A e B, semeie cada uma das culturas recebidas
para essa aula prtica em placas de gar MacConkey contendo Nal e Clo
(separadamente), visando definir a capacidade das amostras em fermentar da
lactose e o perfil de resistncia.
3. Incube as placas a 37C at o dia seguinte.
14
Resultados:
Registre os resultados obtidos na tabela abaixo:
Crescimento em gar
Bactria
MacConkey:
Nal Clo Nal + Clo
Fermentao
Padro
da lactose
de Resistncia
A
B
M
Nal (cido nalidxico, 50 g/mL), Clo (cloranfenicol, 50 g/mL)
15
Amostra
Plasmidial
1
2
3
16
Concentrao
(g/ml)
Dimetro do halo de
inibio do
crescimento
Interpretao*
1
2
3
4
5
* S = Sensvel; R = Resistente; I = Intermedirio.
17
STREPTOCOCCUS
EXERCCIOS
A) Observar placas de gar sangue semeadas com as culturas C, D e E.Verificar
o tipo de hemlise.
Cultura
C
D
E
Hemlise
Cultura C
Cultura E
18
C) Prova da catalase.
Colocar sobre a cultura C(em caldo) e sobre uma cultura controle positivo
(Staphylococcus aureus) algumas gotas de gua oxigenada. Verificar a reao e
anotar o resultado (Positivo = formao de bolhas).
Catalase
Cultura C
Staphylococcus aureus (Controle +)
D) Prova de sensibilidade bacitracina.
Princpio: O princpio desta prova baseia-se na inibio de crescimento do
Streptococcus pyogenes (-hemoltico, grupo A) frente a uma pequena
quantidade de bacitracina.
Tcnica: Verificar se ocorre uma zona de inibio de crescimento ao redor do
disco de papel de filtro contendo bacitracina, colocado sobre a cultura C.
Leitura: sensvel: existncia de uma zona de inibio do crescimento.
resistente: ausncia de zona de inibio de crescimento.
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E) CAMP Teste
Princpio:A atividade da hemolisina do S. aureus aumentada pela atividade
hemoltica do S. agalactiae (-hemoltico do grupo B).
Tcnica: Verificar zona de hemlise, em placa de gar sangue (feito c/ sangue
de carneiro), semeada coma cultura D e S. aureus.
Leitura: resultado - positivo: formao de uma zona de hemlise semelhante
"ponta de flecha" na unio das duas hemolisinas.
negativo: no formao de "ponta de flecha".
F) Prova da bilesolubilidade
Princpio: Esta prova verifica a sensibilidade da bactria lise por sais biliares
Tcnica: Adicionar 0,1 ml de uma soluo a 10% de desoxicolato de sdio a 1
ml da cultura D. Incubar a 37 o C e examinar aps 15 minutos.
Anotar o
Bile-solubilidade
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STAPHYLOCOCCUS
Caractersticas das
Colnias
Hemlise
A
B
Cultura A
21
C) Prova da Catalase
Colocar sobre as culturas A e B e sobre uma cultura controle algumas gotas de
gua oxigenada. Observar a reao e anotar o resultado.
Cultura
A
B
Prova da Catalase
D) Prova da Coagulase
Princpio:
A coagulase uma enzima bacteriana que age sobre o plasma sanguneo.
Tcnica:
Misturar 0,5 ml da cultura A com 0,25 ml de plasma citratado de sangue de coelho
a 1%. Incubar a 37 oC e observar durante 4 horas. Fazer o mesmo com a cultura
B e anotar os resultados.
Resultado positivo - formao de cogulo.
negativo - suspenso inalterada
Cultura
A
B
Prova da Coagulase
Catalase
Coagulase
Identificao
Cultura A
Cultura B
22
23
PSEUDOMONAS
P. aeruginosa
24
Pseudomonas aeruginosa
25
Cultura
Pseudomonas aeruginosa
Escherichia coli
Cor da Meio
Fermentao da Glicose
4. Prova da Citrocromo-oxidase
Fazer prova da citocromo-oxidase com a cultura de P. aeruginosa e com
uma cultura de Escherichia coli, para fins de comparao. Anotar o resultado.
Cultura
Pseudomonas aeruginosa
Escherichia coli
Prova da citocromo-oxidase
26
ENTEROBACTRIAS
1. Observar a colorao das colnias das bactrias A, B e C cultivadas em placas
de gar MacConkey e SS. Anotar os resultados da prova de lactose.
Cultura
Colorao da colnia em
MacConkey
SS
Lactose
A
B
C
D
2. Interpretar crescimento das culturas A, B, C e D em meio de EPM, MILi e
Citrato de Simmons (conforme orientao nas pginas 26 e27) Anotar abaixo os
resultados (+ ou -) das provas para cada cultura.
Prova
A
Cultura
B
C
Citrato
Glicose
Gs
Urease
H2S
LTD*
Motilidade
Lisina
Indol
Lactose**
*LTD = L-triptofano desaminase
** Ver resultados nos meios de isolamento (item 1)
Comparando o perfil acima com o apresentado na tabela da pgina 28, identificar
cada uma das culturas.
Culturas: A________________________
B________________________
C________________________
D________________________
27
Soro
Cultura
B
28
29
E. coli Shigella Edwardsiella Salmonella Citrobacter Klebsiella Enterobacter Serratia Proteus Proteus Morganella Providencia
tarda
flexneri
sp
freundii pneumoniae cloacae marcescens mirabili vulgaris morganii
rettigeri
s
+ ou+
+
+
+
+ ou+ ou+
+
+ ou-
+ ou+ ou-
+
+
+
+ ou-
+
+
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+
+
+
-
+
+
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-
+
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+ ou-
+
+
+ ou-
+
+
+
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+
+
+
+ ou-
+
+ ou-
+
+
+ ou+ ou-
+ ou-
+
+
-
+
+
+
-
+ ou-
+ ou-
+ ou-
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
-
+ ou-
+
-