BAB I

PENDAHULUAN
1. Latar Belakang
HIV/AIDS termasuk jajaran penyakit yang mempunyai tingkat penularan yang sangat tinggi. Hal
ini terjadi karena seringkali seseorang tidak menyadari bahwa dirinya telah terinfeksi HIV, sehingga
menjadi sumber penularan bagi orang lain. Sampai saat ini diperkirakan terdapat sekitar 28 juta orang
lebih yang terinfeksi HIV di seluruh dunia. Untuk Indonesia sendiri diperkirakan orang yang terinfeksi
HIV mencapai 100.000 sampai 200.000 orang yang dari tahun ke tahun akan terus bertambah.
Seseorang terkena HIV biasanya diketahui jika telah terjadi Sindrom Defisiensi Imun Dapatan
(AIDS) yang ditandai antara lain penurunan berat badan, diare berkepanjangan, Sarkoma Kaposi, dan
beberapa gejala lainnya. Berkembangnya teknologi pemeriksaan saat ini mengijinkan kita untuk
mendeteksi HIV lebih dini.
Pemeriksaan Laboratorium yang paling umum dilakukan sebagai skrining pertama kali
dalam melakukan pemeriksaan Anti HIV (merupakan pemeriksaan anti body) yaitu dengan
metode ELISA.
Enzim-Linked immune sorbent assay (ELISA) atau dalam bahasa indonesianya disebut sebagai uji
penentuan kadar immunosorben taut-enzim, merupakan teknik pengujian serologi yang didasarkan pada
prinsip interaksi antara antibody dan antigen. Pada awalnya, teknik ELISA hanya digunakan dalam
bidang imunologi untuk mendeteksi keberadaan antigen maupun antibody dalam suatu sampel seperti
dalam pendeteksian antibody IgM, IgG, dan IgA pada saat terjadi infeksi (pada tubuh manusia khususnya,
misalya pada saat terkena virus HIV). Namun seiring dengan perkembangan ilmu pengetahuan,teknik
ELISA juga diaplikasikan dalam bidang patologi tumbuhan, kedokteran, dll.

2. Rumusan Masalah
2. 1. Bagaimana sejarah penemuan teknik ELISA?
2. 2. Bagaimana prinsip dasar teknik ELISA?
2. 3. Apa saja alat dan bahan yang dibutuhkan dalam teknik ELISA?
2. 4. Apa saja kelebihan dan kelemahan teknik ELISA?
2. 5. Apa saja macam-macam teknik ELISA?
2. 6. Bagaimana langakah kerja teknik ELISA?

BAB II
ISI
1. Sejarah Penemuan
Teknik ELISA pertama kali diperkenalkan pada tahun 1971 oleh Peter Perlmann dan Eva Engvall.
Mereka menggunakan teknik ELISA ini dalam bidang imunologi (ELISA konvensional) untuk
menganalisis interaksi antara antigen dan antibodi di dalam suatu sampel, dimana interaksi tersebut
ditandai dengan menggunakan suatu enzim yang berfungsi sebagai pelopor/ reporter/ signal.
Dalam perkembangan selanjutnya, selain digunakan sebagai uji kualitatif untuk mengetahui
keberadaan suatu antibodi atau antigen dengan menggunakan antibodi atau antigen spesifik, teknik
ELISA juga dapat diaplikasikan dalam uji kuantitatif untuk mengukur kada antibodi atau antigen yang
diuji dengan menggunakan alat bantu erupa spektrofotometer atau dengan cara menetukan jumlah
penambahan atau kadar antibodi atau antigen, sehingga dapat dibuat suatu kurva standard an kadar
antibodi atau antigen yang tidak diketahui dapat ditentukan.

2. Prinsip Dasar Teknik ELISA

Prinsip dasar dari teknik ELISA ini secara simple dapat dijabarkan sebagai berikut :
Pertama antigen atau antibodi yang hendak diuji ditempelkan pada suatu permukaan yang berupa
microtiter. Penempelan tersebut dapat dilakukan melalui dua cara, yaitu penempelan secara non spesifik
dengan adsorbs ke permukaan microtiter, dan penempelan secara spesifik dengan menggunakan antibody
atau antigen lain yang bersifat spesifik dengan antigen atau antibodi yang diuji (cara ini digunakan pada

teknik ELISA sandwich). Selanjutnya antibodi atau antigen spesifik yang telah ditautkan dengan

suatu enzim signal (disesuaikan dengan sampel => bila sampel berupa antigen, maka digunakan
antibodi spesifik , sedangkan bila sampel berupa antibodi, maka digunakan antigen spesifik)
dicampurkan ke atas permukaan tersebut, sehingga dapat terjadi interaksi antara antibodi dengan
antigen yang bersesuaian. Kemudian ke atas permukaan tersebut dicampurkan suatau substrat yang dapat
bereaksi dengan enzim signal. Pada saat substrat tersebut dicampurkan ke permukaan, enzim yang bertaut
dengan antibodi atau antigen spesifik yang berinteraksi dengan antibodi atau antigen sampel akan
bereaksi dengan substrat dan menimbulkan suatu signal yang dapat dideteksi. Pda ELISA flourescense
misalnya, enzim yang tertaut dengan antibodi atau antigen spesifik akan bereaksi dengan substrat dan
menimbulkan signal yang berupa pendaran flourescense.

3. Kelebihan dn Kelemahan Teknik ELISA

Teknik ELISA ini memiliki beberapa kelebihan, antara lain :

Teknik pengerjaan relatif sederhana
Relatif ekonomis (karena jenis a antibodi yang digunakan hanya satu saja, sehingga menghemat biaya

untuk membeli banyak jenis antibodi)

Hasil memiliki tingkat sensitivitas yang cukup tinggi.
Dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan antigen walaupun kadar antigen tersebut sangat rendah

(hal ini disebabkan sifat interaksi antara antibodi atau antigen yang bersifat sangat spesifik)
Dapat digunakan dalam banyak macam pengujian.

Sedangkan kekurangan dari teknik ELISA antara lain :

Jenis antibodi yang dapat digunakan pada uji dengan teknik ELISA ini hanya jenis antibodi monoklonal

(antibodi yang hanya mengenali satu antigen)

Harga antibodi monoklonal relatif lebih mahal daripada antibodi poliklonal, sehingga pengujian teknik

ELISA ini membutuhkan biaya yang relatif mahal.

Pada beberapa macam teknik ELISA, dapat terjadi kesalahan pengujian akibat kontrol negatif yang

menunjukkan respons positif yang disebabkan inefektivitas dari larutan blocking sehingga antibodi
sekunder atau antigen asing dapat berinteraksi dengan antibodi bertaut enzim signal dan menimbulkan
signal.
Reaksi antara enzim signal dan substrat berlangsung relatif cepat, sehingga pembacaan harus dilakukan
dengan cepat (pada perkembangannya, hal ini dapat diatasi dengan memberikan larutan untuk
menghentikan reaksi).

4. Alat dan Bahan Yang Digunakan

Alat paling utama yang digunakan dalam teknik ELISA adalah microtiter. Microtiter ini berupa
suatu papan plastik dengan cekungan sebanyak 96 buah (8 cekungan ke arah bawah dan 12 cekungan ke
samping). Microtiter ini terbuat dari bahan plistirena. Cekungan dari microtiter memiliki tinggi sekitar 1
cm dan diameter 0,7 cm. Selain itu, alat dan bahan lain yang umum digunakan dalam teknik ELISA antara
lain :

Antigen yang dimurnikan (jika sampel yang akan dideteksi atau dikuantifikasikan berupa antibodi).
Larutan standard (kontrol positif dan negatif).
Sampel yang ingin dites.
Cairan pencuci (buffer).
Antibodi atau antigen yang tertaut dengan enzim signal.
Substrat yang bersifat spesifik terhadap enzim signal.
ELISA reader (spektrofotometer) untuk pengukuran kuantitatif.

5. Macam-macam Teknik ELISA

Secara umum, teknik ELISA dibedakan menjadi dua jenis, yaitu teknik ELISA kompetitif yang
menggunakan konjugat antigen-enzim atau konjugat antibodi-enzim, dan teknik ELISA nonkompetitif
yang menggunakan dua antibodi (primer dan sekunder). Pada teknik ELISA nonkompetitif, antibody
kedua (sekunder) akan dikonjugasikan dengan enzim yang berfungsi sebagai signal. Teknik ELISA
nonkompetitif ini seringkali disebut sebagai teknik ELISA sandwich.
Dewasa ini, teknik ELISA telah berkembang menjadi berbagia macam jenis teknik. Perkembangan
ini didasari pada tujuan dari dilakukannya uji dengan teknik ELISA tersebut sehingga dapat diperoleh
hasil yang optimal. Berikut ini adalah beberapa macam teknik ELISA yang relatif sering digunakan,
antara lain :

5. 1. ELISA Direct

Teknik ELISA ini merupakan teknik ELISA yang paling sederhana. Teknik ini seringkali
digunakan untuk mendeteksi dan mengukur konsentrasi antigen pada sampel ELISA direct menggunakan
suatu antibody spesifik (monoklonal) untuk mendetaksi keberadaan antigen yang diinginkan pada sampel
yang diuji.
Pada ELISA direct, pertama microtiter diisi dengan sampel yang mengandung antigen yang
diinginkan, sehingga antigen tersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding lubang microtiter,
kemudian microtiter dibilas untuk membuang antigen yang tidak menempel pda dinding lubang
microtiter. Lalu antibodi yang telah ditautkan dengan enzim signal dimasukkan ke dalam lubang-lubang
microtiter sehingga dapat berinteraksi dengan antigen yang diinginkan, yang dilanjutkan dengan
membilas microtiter untuk membuang antibody tertaut enzim signl yang tidak berinteraksi dengan
antigen. Lalu, ke dalam lubang-lubang microtiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi
dengan enzim signal, sehingga enzim yang tertaut dengan antibodi yang telah berinteraksi dengan antigen
yang diinginkan akan berinteraksi dengan substrat dan menimbulkan signal dapat dideteksi. Pendeteksian
interaksi antara antibodi dengan antigen tersebut selanjutnya dapat dihitung dengan menggunakan
kolorimetri, chemiluminescent, atau fluorescent end-point.
ELISA direct memiliki beberapa kelemahan, antara lain :
Immunoreaktifitas antibodi kemungkinan akan berkurang akibat bertaut dengan enzim.
Penautan enzim signal ke setiap antibodi menghabiskan waktu dan mahal.

Tidak memiliki fleksibilitas dalam pemilihan tautan enzim (label) dari antibodi pada percobaan yang

berbeda.
Amplifikasi signal hanya sedikit.
Larutan yang mengandung antigen yang diinginkan harus dimurnikan sebelum digunakan untuk uji

ELISA direct.
Sedangkan kelebihan dari ELISA direct antara lain :
Metodologi yang cepat karena hanya menggunakan 1 jenis antibody.
Kemungkinan terjadinya kegagalan dalam uji ELISA akibat reaksi silang dengan antibody lain (antibody
sekunder) dapat diminimalisasi.

5. 2. ELISA Indirect

Teknik ELISA indirect ini pada dasarnya juga merupakan teknik ELISA yang paling sederhana,
hanya saja dalam teknik ELISA indirect yang dideteksi dan diukur konsentrasinya merupakan antibody.
ELISA indirect menggunakan suatu antigen spesifik (monoklonal) serta antibody sekunder spesifik tertaut
enzim signal untuk mendeteksi keberadaan antibody yang diinginkan pada sampel yang diuji.
Pada ELISA indirect, pertama mocrotiter diisi dengan larutan yang mengandung antigen spesifik,
sehingga antigen spesifik tersebut dapal menempel pada bagian dinding lubang microtiter. Selanjutnya
microtiter dibilas untuk membuang antigen yang tidak menempel pada dinding lubang microtiter.
Kemudian larutan sampel yang mengandung antibody yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubanglubnag microtiter, sehingga terjadi terjadi interaksi antara antigen spesifik dengan antibody yang
dinginkan. Selanjutnya microtiter kembali dibilas untuk membuang antibodi yang tidak berinteraksi
dengan antigen spesifik. Lalu ke dalam lubang microtiter dimasukkan larutan yang berisi antibody
sekunder spesifik tertaut enzim signal, sehingga pada lubang microtiter tersebut terjadi interaksi antara
antibody yang diinginkan dengan antibody sekunder spesifik tertaut enzim signal. Selanjutnya microtiter
dibilas lagi untuk membuang antibody sekunder tertaut enzim signal yang tidak berinteraksi dengan
antibody spesifik. Kemudian pada tahap akhir ELISA indirect, ditambahkan substrat yang dapat bereaksi
dengan enzim signal, lalu enzim yag tertaut dengan antibody sekunder speifik yang telah berinteraksi
dengan antibody yang diinginkan akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat
dideteksi.
ELISA indirect memiliki beberapa kelemahan, antara lain :
Membutuhkan waktu pengujian yang relative lebih lama daripada ELISA direct karena ELISA indirect

membutuhkan 2 kali waktu inkubasi yaitu pada saat terjadi interaksi antara antigen spesifik dengan
antibody yang dinginkan dan antara antibody yang diinginkan dengan antibody sekunder tertaut enzim
signal, sedangkan pada ELISA direct hanya membutuhkan 1 kali waktu inkubasi yaitu pada saat terjadi
interaksi antara antigen yang diinginkan dengan antibody spesifik tertaut enzim signal.
Sedangkan kelebihan dari ELISA indirect antara lain :
Terdapat berbagai macam variasi antibody sekunder yang terjual secar komersial di pasar.
Immunoreaktifitas dari antibody yang diinginkan (target) tidak terpengaruh oleh penautan enzim signal
ke antibody sekunder karena penautan dilakuka pada wadah berbeda.

Tingkat sensitivitas meningkat karena setiap antibody yag diinginkan memiliki beberapa epitop yang bisa
berinteraksi dengan antibody sekunder.

5. 3. ELISA Sandwich
Teknik ELISA jenis ini menggunakan antibody primer spesifik untuk menangkap antigen yang
diinginkan dan antibody sekunder tertaut enzim signal untuk mendeteksi keberadaan antigen yang
diinginkan. Pada dasarnya, prinsip kerja dari ELISA sandwich mirip dengan ELISA direct, hanya saja
pada ELISA sandwich, larutan antigen yang diinginkan tidak perlu dipurifikasi. Namun, karena antigen
yang diinginkan tersebut harus dapat berinteraksi dengan antibody primer spesifik dan antibody sekunder
spesifik tertaut enzim signal, maka teknik ELISA sandwich ini cenderung dikhususkan pada antigen
memiliki minimal 2 sisi antigenic (sisi interaksi dengan antibodi) atau antigen yang bersifat multivalent
seperti polisakarida atau protein. Pada ELISA sandwich, antibody primer seringkali disebut sebagai
antibody penangkap, sedangkan antibody sekunder seringkali disebut sebagai antibody penangkap,
sedagkan antibody sekunder seringkali disebut sebagai antibody deteksi.
Dalam pengaplikasiannya, ELISA sandwich lebih banyak dimanfaatkan untuk mendeteksi
keberadaan antigen multivalent yang kadarnya sangat rendah pada suatu larutan dengan tingkat
kontaminasi tinggi. Hal ini disebabkan ELISA sandwich memiliki tingkat sensitivitas tinggi terhadap
antigen yang diinginkan akibat keharusan dari antigen tersebut untuk berinteraksi dengan kedua antibody.
Pada ELISA sandwich, pertama microtiter diisi dengan larutan yang mengandung antibody
penangkap, sehingga antibody penangkap tersebut dapat menempel pada bagian dinding lubang
microtiter. Selanjutnya microtiter dibilas untuk membuang antibody penangkap yang tidak menempel
pada dinding lubang microtiter. Kemudian larutan sampel yang mengandung antigen yang diinginkan
dimasukkan ke dalam lubang-lubang microtiter, sehingga terjadi interaksi antara antibody penangkap
dengan antigen yang diinginkan. Selanjutnya, microtiter kembali dibilas untuk membuang antigen yang
tidak bereaksi dengan antigen penangkap. Lalu, kedalam lubang microtiter dimasukkan larutan yang
berisi antibody detector sehingga pada lubang microtiter tersebut terjadi interaksi antara antigen yang
diinginkan dengan antibody detector. Selanjutnya microtiter dibilas lagi untuk membuang antibody
detector yang tidak berinteraksi dengan antibody spesifik. Kemudian pada tahap akhir ELISA indirect,
ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal, lalu enzim yang tertaut pada antibody
detector yang telh berinteraksi dengan antigen yang diinginkan akan bereaksi dengan substrat dan
menimbulkan signal yang dapat dideteksi.
Dalam ELISA sandwich, terdapat beberapa faktor yng mempengaruhi tingkat sensitivitas dari hasil
pengujian, antara lain :
Banyak molekul antibody penangkap yang berhasil menempel pada dinding-dinding microtiter.
Avinitas dari antibody penangkap dan antibody detector terhadap antigen sebenarnya, teknik ELISA
sandwich ini merupakan pengembangan dari teknik ELISA terdahulu, yaitu ELISA direct. Kelebihan
teknik ELISA sandwich ini pada dasarnya berada pada tingkat sensitivitasnya yang relatif lebih tinggi
karena antigen yang diinginkan harus dapat berinteraksi dengan dua jenis antibody, yaitu antibody
penangkap dan antibody detector. Namun demikian, teknik ELISA sandwich ini juga memiliki

kelemahan, yaitu teknik ini hanya dapat diaplikasikan untuk medeteksi antigen yang bersifat multivalent
serta sulitnya mencari dua jenis antibody yang dapat berinteraksi antigen yang sama pada sisi antigenic
yang berbeda (epitopnya harus berbeda).

5. 4. ELISA Biotin Sterptavidin (Jenis ELISA Modern)

Pada perkembangan selanjutnya, teknik ELISA sandwich ini juga dikembangkan untuk
mendeteksi antibody dengan tingkat sensitivitas relatif lebih tinggi. Teknik ini dikenal sebagai teknik
ELISA penangkap antibody, dimana prinsip kerjanya sama dengan ELISA sandwich, hanya saja yang
digunakan dalam teknik ini adalah antigen penangkap dan antigen detector (antigen bertaut enzim signal,
bersifat opsional apabila antibody yang diinginkan tidak bertaut dengan enzim signal).
Contoh dari aplikasi teknik ini adalah teknik ELISA untuk mendeteksi vitamin biotin yang
bertaut dengan suatu antibody avidin dengan mengubah antibody avidin menjadi antibody streptavidin,
dimana satu molekul streptavidin dapat mengikat empat molekul biotin (pengembangan dari ELISA
indirect), sehingga signal yang teramplifikasi menjadi semakin kuat akibat interaksi antara biotin dengan
enzim yang menjadi semakin banyak.

5. 5. ELISA Kompetitif
Teknik ELISA jenis ini juga merupakan pengembangan teknik ELISA terdahulu.Prinsip dasar dari
teknik ini adalah dengan menambahkan suatu competitor ke dalam lubang mikrotiter.Teknik ELISA
kompetitif ini dapat diaplikasikan untuk mendeteksi keberadaan antigen atau antibody.
Pada pendeteksian antigen, pertama mikrotiter diisi antibody spesifik yang dapat berinteraksi
dengan antigen yang diinginkan maupun antigen spesifik bertaut enzim signal, sehingga antibody
spesifiktersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding lubangmikrotiter. Lalu larutan yang
mengandung antigen spesifik yang telah ditautkan dengan enzim signal dan larutan sampel yang
mengandung antigen yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang mikrotiter sehingga terjadi
kompetisi antaraantigen spesifik bertaut enzim signal dengan antigen yang diinginkan untuk dapat
berinteraksi dengan antibody spesifik yang dilanjutkan dengan membilas mikrotiter untuk membuang
antigen spesifik tertaut enzim signal atau antigen yang tidak berinteraksi dengan antibody spesifik. Lalu
kedalam lubang-lubang mikrotiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal
yang tertaut pada antigen spesifik, sehingga enzim yang tertaut dengan antigen yang telah berinteraksi
dengan antibody spesifik akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi.
Pada proses pendeteksian ini, pendeteksian positif ditandai oleh tidak adanya signak yang ditimbulkan,
yang berarti bahwa antigen yang diinginkan telah menang berkompetisi dengan antigen spesifik tertaut
enzim signal dan berinteraksi dengan antibody spesifik.
Sedangkan pada pendeteksian antibody, pertama mikrotiter diisi antigen spesifik yang dapat
berinteraksi dengan anti bodi yang diinginkan maupun antibody spesifik tertaut enzim signal, sehingga

antigen spesifik tersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding mikrotiter, kemudian mikrotiter
dibilas untuk membuang antigen spesifik yang tidak menempel pada dinding-dinding mikrotiter. Lalu
larutan yang mengandung antibody spesifik yang telah ditautkan dengan enzim signal dan larutan sampel
yang mengandung antibody yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang mikrotiter, sehingga
terjadi kompetisi antara antibody spesifik tertaut enzim signal dengan antibody yang diinginkan untuk
dapatberinteraksi dengan antigen spesifik, yang dilanjutkan dengan membilas mikrotiter untuk membuang
antibody spesifik tertaut enzim signal atau antibody yang tidak berinteraksi dengan antigen spesifik. Lalu,
kedalam lubang-lubang mikrotiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal
yang tertaut pada antibody spesifik, sehingga enzim yang tertaut dengan antibody yang telah berinteraksi
dengan antigen spesifik akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi.
Pada proses pendeteksian ini, pendeteksian positif juga ditandai oleh tidak adanya signal yang
ditimbulkan, yang berarti antibody yang diinginkan telah menang berkompetisi dengan antibody spesifik
tertaut enzim signal dan berinteraksi dengan antigen spesifik.
Kelebihan dari teknik ELISA kompetitif ini adalah tidak diperlukannya purifikasi terhadap larutan
sampel yang mengandung antibody atau antigen yang diinginkan, tapi hasil yang diperoleh tetap memiliki
tingkat sensitivitas tinggi akibat sifat spesitifitas dari antibody dan antigen.

5. 6. ELISA Multiplex
Teknik ELISA merupakan pengembangan teknik ELISA yang ditujukan untuk pengujian secara
simultan,sedangkan prinsip dasarnya mirip dengan teknik ELISA terdahulu.

6. Contoh Langkah Kerja Teknik ELISA

Berikut ini adalah contoh langkah kerja beberapa macam teknik ELISA, yaitu:
Pendeteksian antibody dengan ELISA indirect:
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Melapisi mikrotiter plate dengan antigen yang sudah dimurnikan dengan membiarkan larutan berisi
antigen menempel pada dinding/ permukaan selama 30-60 menit.
Membilas antigen yang tidak terikat dengan buffer.
Melapisi sisi-sisi tertentuyang mungkin tidak spesifik dilekati oleh antigen dengan protein yang tidak
berhubungan/ tidak spesifik (seperti larutan susu bubuk)
Membilas protein yang tidak melekat.
Menambahkan sampel serum yang akan dideteksi antibodinya dan membiarkan antibody spesifik untuk
berikatan dengan antigen.
Membilas antibody yang tidak terikat.

7.

8.
9.
10.
11.

Menambahkan anti-Ig yang akan berikatan pada daerah Fc pada antibody yang spesifik (sebagai contoh,
anti-rantai gamma manusia yang berikatan dengan IgG manusia). Daerah Fc pada anti-Ig akan berikatan
secara kovalen dengan enzim.
Membilas kompleks antibody-enzim yang tidak terikat.
Menambahkan substrat chromogenic: substrat yang tidak berwarna yang terikat ke enzim akan dikonversi
menjadi produk.
Inkubasi sampai muncul warna, dan
Ukur dengan spectrometer. Jka semakin pekat warna yang dideteksi, maka makin besar kadar antibody
spesifik dalam sampel.
Pendeteksian antigen dengan ELISA sandwich:

1.

Melapisi mikrotiter plate dengan antibodi yang sudah dimurnikandimurnikan dengan membiarkan larutan
berisi antigen menempel pada dinding/ permukaan selama 30-60 menit.
2. Membilas antibodi yang tidak terikat dengan buffer
3. Melapisi sisi-sisi tertentuyang mungkin tidak spesifik dilekati oleh antigen dengan protein yang tidak
berhubungan/ tidak spesifik (seperti larutan susu bubuk)
4. Membilas protein yang tidak melekat.
5. Menambahkan sampel yang akan dideteksi antigennya dan membiarkan antibodi untuk berikatan dengan
antigen spesifik dari sampel.
6. Membilas antigen yang tidak terikat.
7. Menambahkan antibody yang telah terlabeli dengan enzim dan bersifat spesifik untuk epitope yang
berbeda pada antigen sampel, sehingga terbentuk sandwich.
8. Membilas antibody-enzim yang tidak terikat.
9. Menambahkan substrat chromogenic: substrat yang tidak berwarna yang terikat ke enzim akan dikonversi
menjadi produk.
10. Inkubasi sampai muncul warna.
11. Ukur dengan spektrofotometer. Jika semakin pekat warna yang terdeteki, maka makin besar kadarantigen
spesifi dalam sampel.

7. Aplikasi Teknik ELISA

Berikut ini adalah beberapa ontoh aplikasi teknik ELISA, antara lain:
a.

Pemeriksaan donor darah untuk pembuktian adanya kontaminasi virus:

HIV-1 dan HIV-2 (keberadaan antibody anti-HIV)

Hepatitis C (presence of antibodies)

Hepatitis B (test untuk keberadaan antibody dan antigen virus)

HTLV-1 dan -2 (keberadaan entibodi)

b. Pengukuran level hormone

hCG (sebagai tes kehamilan)

c.

LH ( menentukan waktu ovulasi)

TSH, T3dan T4 (untuk fungsi thyroid)

Pendeteksian Infeksi

Agen penularan secara seksual, HIV, Syphilis dan Chlamydia

Hepatitis B dan C

Toxoplasma Gondii

d. Pendeteksian bahan allergen pada makanan dan debu rumah.

e. Pendeteksian keberadaan zat obat-obatab terlarabg, seperti

Cocain

Opium

-9-tetrahydrocannabiol, campuran aktif pada marijuana.

8. Contoh Aplikasi ELISA: Tes Kehamilan Menggunakan Hormon hCG

Pada hari kesepuluh setelah sel telur dibuahi oleh sperma pada saluran Tuba fallopi,sel telur akan
bergerak menuju Rahim dan melekat pada dinding Rahim tersebut. Sejak saat itulah plasenta akan
mengalami perkembangan dan hCG mulai diproduksi. Human Chorionic gonadotropin (hCG) pada
dasarnya merupakan hormone glikoprotein yang diproduksi oleh sel normal trofoblat pada plasenta
selama kehamilan yang dapat ditemukan dalam darah dan air seni.
hCG terdiri dari 2 subunit polipeptida yang terikat secara nonkovalen dengan berat molekul total
39 kD. Subunit rantai identic dengan subunit rantai dari hLH (human Luteinizing Hormone), hFSH
(human Follicle Stimulating Hormone) dan hTSH (human Thyreoidea Stimulating Hormone).
Subunit bertanggung jawab pada efek hormonal molekul hCG. Pengukuran hCG yang sempurna dan
keberadaan subunit memberi hasil yang sama pada darah dan urin, tapi tidak pada subunit . Produksi
hormone hCG akan bertambah banyak selama trimester pertama, dimana level hCG yang sempurna
mempunyai rentang dari 20000 mIU/ml sampai 50000 mIU/ml (1 ng = 15 mIU).
Keberadaan hCG sudah dapat dideteksi dalam darah sejak hari pertama keterlambatan haid, yaitu
kira-kira hari keenam sejak pelekatan janin pada dinding Rahim. Kadar hormone tersebut akan terusmenerus bertambah hingga minggu ke 14-16 kehamilan, terhitung sejak hari terakhir menstruasi.
Sebagian besar ibu hamil akan mengalami penambahan kadar hormone hCG sebanyak dua kali lipat
setiap 3 hari.
Peningkatan kadar hormone ini biasanya ditandai dengan mual dan pusing yang
sering dialami oleh para ibu hamil. Selanjutnya kadar hCG akan menurun terus secara perlahan, dan
hamper mencapai kadar normal beberapa saat setelah persalinan. Pengetesan dapat dilakukan pada saat
wanita mengalami keterlambatan siklus haid atau kira-kira 7 hari setalah berhubungan.Sampel yang
sigunakan pada umumnya adalah urin. Biasanya dianjurkan menggunkan air seni yang keluar pertama
kali setelah bangun pagi, karena pada saat tersebut konsentrasi hormone hCG relatif tinggi. Sebenarnya
uji darah pada tes kehamilan yang dilakukan di laboratorium juga memiliki prinsip kerja yang relatif

sama, yait mendekati kadar hCG. Namun, tes darah mempunyai kelebihan berupa kemampuan untuk
mendeteksi usia janin bertumbuh di dalam Rahim seorang ibu.
Perkiraan Kadar hCG dalam Darah Kehamilan Trimester kedua
Kurang dari 5 IU/L
Perempuan yang tidak hamil dan laki-laki
24-28 hari setelah haid terakhir
II
bu
hamil:

4-5 minggu (1 bulan) setelah haid

terakhir
5-6 minggu setelah haid terakhir
14-16 minggu (4 bulan) setelah haid
terakhir
kehamilan trimester ketiga

Perempuan pasca menopause

(international
per liter)

units

5-100 IU/L
50-500 IU/L
100-10.000 IU/L
12.000-270.000 IU/L
1.000-50.000 IU/L
Kurang dari 10 IU/L

Keuntungan test kehamilan dengan menggunakan uji kadar hormone hCG antara lain:

Analisa yang hemat dan efektif dengan kualitas tinggi dan harganya memadai.
Efisien dan fleksibel: sampel yang berbeda dapat dianalisa secara stimulant dengan jumlah cekungan uji
yang fleksibel.
Spesifik: sepasang antibody mempunyai selektivitas tinggi secara spesifik berikatan dengan -hCG.
Prosedur yang sederhana.
Dalam pengaplikasian teknik ELISA, serum hCG selain dapat digunakan sebagaitest kehamilan
untuk mengetahui keberadaan janin dalam Rahim,juga dapat digunakan untuk berbagai uji kehamilan
lainnya, antara lain:

Prediksi kehamilan yang multiple/ lebih dari 1.

Diagnosis kehamilan yang abnormal.
Penentuan fase kehamilan/ masa kehamilan.
Diagnosis diferensial pada infertilitas/ ketidaksuburan pada wanita atau pria.
Invertigasi lanjut setelah terapi untuk tumor trofoblastik.

Alat tes hCG yang menggunakan teknik ELISA tersedia dalam 2 bentuk di pasaran, yaitu:

Berupa alat yang digunakan dengan cara memaparkannya pada aliran urin saat pertama berkemih di pagi
hari selama beberapa saat. Jenis alat ini sangat umum digunakan, karena dijual bebas di apotek, dan
penggunaannya mudah. Berikutini adalah cara kerjanya:

1.

Pada saat alat tes mulai bekerja, akan muncul garis pada jedela berbentuk lingkaran (Jendela
control).Dimana garis tersebut merupakan garis konttrol yang menunjukkan bahwa tes bekerja secara
benar.
2. Jendela berbentuk persegi akan menunjukkan hasil tes. Apabila garis muncul pada jendela berbentuk
persegi (jendela hasil) maka alat tes telah mendeteksi adanya hormone hCG dan mununjukkan adanya
kehamilan.
Hasil negatif: Munculnya satu garis pada jendela konttrol (berbentuk lingkaran) menandakan bahwa anda
tidak hamil dan tes telah dilakukan dengan benar.
Hasil positif: Muncul 2 garis pada jendela control (berbentuk lingkaran) dan jendela hasil (berbentuk
persegi) menandakan anda hamil
Hasil Tidak Valid: Apabila garis pada jendela control tidak muncul berarti tes tidak dilakukan dengan benar.

1.
2.
3.
4.
5.
6.

Berupa alat digunakan dengan cara membubuhi beberapa tetes serum pada mikrotiter. Berikut ini adalah
cara kerjanya:
Mengandalkan antibody -hCG yang terimbolisasi pada media padat yang berikatan dengan -hCG yang
bebas dari sampel (urin)
Antibodi kelinci anti- -hCG berkonjungsi dengan horseladish peroxidase (HRP) sebagai larutan konjugasi
antibody-enzim.
Sampel tes dibiarkan untuk bereaksi simultan dengan antibody, menghasilkan -hCG antara fase padat
denga antibody-enzim.
Setelah inkubasi, cekungan dibilas untuk membilas antibody-enzim yang tidak terikat. Kemudian substrat
HRP, TMB, ditambahkan untuk menghasilkan warna biru.
Perkembangan warna dihentikan dengan penambahan stop solution yang akan mengubah warna kuning.
Konsentrasi -hCG secara langsung proporsional terhadap intensitas warna yang dihasilkan dan diukur
absorbansinya dengan spektrofotometer.

BAB III
PENUTUP
1. Kesimpulan
ELISA (Enzym-Linked Immunosorbent Assay), tes ini mendeteksi antibodi yang dibuat
tubuh terhadap virus HIV. Antibodi tersebut biasanya diproduksi mulai minggu ke 2, atau
bahkan setelah minggu ke 12 setelah terpapar virus HIV. Kerena alasan inilah maka para ahli
menganjurkan pemeriksaan ELISA dilakukan setelah minggu ke 12 sesudah melakukan
aktivitas seksual berisiko tinggi atau tertusuk jarum suntik yang terkontaminasi. Tes ELISA
dapat dilakukan dengan sampel darah vena, air liur, atau air kencing.
Hasil positif pada ELISA belum memastikan bahwa orang yang diperiksa telah terinfeksi
HIV. Masih diperlukan pemeriksaan lain, yaitu Western Blot atau IFA, untuk mengkonfirmasi
hasil pemeriksaan ELISA ini. Jadi walaupun ELISA menunjukkan hasil positif, masih ada dua
kemungkinan, orang tersebut sebenarnya tidak terinfeksi HIV atau betul-betul telah terinfeksi
HIV.

BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
ELISA sebagai salah satu metode uji serologis mempunyai satu kelebihan yaitu mampu
mendeteksi beberapa jenis antibodi dari 1 sampel serum (tergantung dari kit ELISA yang
digunakan). ELISA juga memiliki tingkat spesifikasi (yaitu kemampuan mendeteksi ayam yang tidak
terinfeksi atau ayam yang tidak terinfeksi dinyatakan negatif) yang tinggi.

Peralatan yang digunakan dalam uji serologis melalui ELISA salah satunya ialah microreader
Metode uji ini banyak digunakan untuk mendeteksi infeksi virus (IB atau IBD) maupun bakteri,
seperti Salmonella sp. dan Pasteurella multocida. ELISA juga merupakan metode uji serologis yang
cepat untuk menguji sampel dalam jumlah besar. Namun peralatannya, seperti reader, washer dan
komputer relatif mahal.

B. Rumusan Masalah

Apa definisi tes ELISA ?

Apa jenis jenis tes ELISA ?

Bagaimana mekanisme kerja tes ELISA ?

Bagaimana cara kerja tes ELISA ?

Apa guna dari tes ELISA ?

C. Tujuan

Mengetahui pengertian uji serologis dengan metode ELISA

Mengetahui guna dari tes ELISA

Mengetahui jenis-jenis tes ELISA

Mengetahui prosedur kerja dari tes ELISA

Mengetahui mekanisme kerja dari tes ELISA

BAB II
PEMBAHASAN
A. DEFINISI
ELISA (singkatan bahasa Inggris: Enzyme-linked immunosorbent assay) atau 'penetapan
kadar imunosorben taut-enzim' merupakan uji serologis yang umum digunakan di berbagai
laboratorium imunologi. Uji ini memiliki beberapa keunggulan seperti teknik pengerjaan yang relatif
sederhana, ekonomis, dan memiliki sensitivitas yang cukup tinggi. ELISA diperkenalkan pada tahun
1971

oleh

Peter

Perlmann

dan

Eva

Engvall

untuk

menganalisis

adanya

interaksi antigen dengan antibodi di dalam suatu sampel dengan menggunakan enzimsebagai
pelapor (reporter label).
Umumnya ELISA dibedakan menjadi dua jenis, yaitu competitive assay yang menggunakan
konjugat

antigenenzim

menggunakan

dua

atau

antibodi.

konjugat
Pada

antobodienzim,

ELISA non-competitive

dan non-competitive
assay,

antibodi

assay yang
kedua

akan

dikonjugasikan dengan enzim sebagai indikator. Teknik kedua ini seringkali disebut sebagai
"Sandwich" ELISA.
Uji ini dilakukan pada plate 96-well berbahan polistirena. Untuk melakukan teknik "Sandwich" ELISA
ini, diperlukan beberapa tahap yang meliputi:
1. Well dilapisi atau ditempeli antigen.
2. Sampel (antibodi) yang ingin diuji ditambahkan.
3. Ditambahkan antibodi kedua yang dikonjugasikan dengan enzim tertentu seperti
peroksidase alkali. Antibodi kedua ini akan menempel pada antibodi sampel sebelumnya.
4. Dimasukkan substrat enzim yang dapat menimbulkan warna tertentu saat bereaksi.
5. Intensitas

warna

campuran

diukur

dengan spektrofotometer yang

disebut ELISA

readerhingga mendapatkan hasil berupa densitas optis (OD). Dengan menghitung rata-rata
kontrol negatif yang digunakan, didapatkan nilai cut-off untuk menentukan hasil positifnegatif suatu sampel. Hasil OD yang berada di bawah nilai cut-off merupakan hasil negatif,
dan demikian juga sebaliknya.
Uji ini memiliki beberapa kerugian, salah satu di antaranya adalah kemungkinan yang besar
terjadinya hasil false positive karena adanya reaksi silang antara antigen yang satu dengan antigen
lain.[2] Hasil berupa false negative dapat terjadi apabila uji ini dilakukan pada window period, yaitu

waktu pembentukan antibodi terhadap suatu virus baru dimulai sehingga jumlah antibodi tersebut
masih sedikit dan kemungkinan tidak dapat terdeteksi.[3]

B. JENIS TES ELISA

1.

Indirect ELISA
Tahap umum yang digunakan dalam indirect ELISA untuk mendeterminasi konsentrasi antibodi
dalam serum adalah:

1)

Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui konsentrasinya ditempelkan pada permukaan
lubang plate mikrotiter. Antigen tersebut akan menempel pada permukaan plastik dengan cara
adsorpsi. Sampel dari konsentrasi antigen yang diketahui ini akan menetapkan kurva standar yang
digunakan untuk mengkalkulasi konsentrasi antigen dari suatu sampel yang akan diuji.

2)

Suatu larutan pekat dari protein non-interacting, seperti bovine serum albumin (BSA) atau kasein,
ditambahkan dalam semua lubang plate mikrotiter. Tahap ini dikenal sebagai blocking, karena
protein serum memblok adsorpsi non-spesifik dari protein lain ke plate.

3)

Lubang plate mikrotiter atau permukaan lain kemudian dilapisi dengan sampel serum dari antigen
yang tidak diketahui, dilarutkan dalam buffer yang sama dengan yang digunakan untuk antigen
standar. Karena imobilisasi antigen dalam tahap ini terjadi karena adsorpsi non-spesifik, maka
konsentrasi protein total harus sama dengan antigen standar.

4)

Plate dicuci, dan antibodi pendeteksi yang spesifik untuk antigen yang diuji dimasukkan dalam
lubang. Antibodi ini hanya akan mengikat antigen terimobilisasi pada permukaan lubang, bukan
pada protein serum yang lain atau protein yang terbloking.

5)

Antibodi sekunder, yang akan mengikat sembarang antibodi pendeteksi, ditambahkan dalam
lubang. Antibodi sekunder ini akan berkonjugasi menjadi enzim dengan substrat spesifik. Tahap ini
bisa dilewati jika antibodi pendeteksi berkonjugasi dengan enzim.

6)

Plate dicuci untuk membuang kelebihan konjugat enzim-antibodi yang tidak terikat.

7)

Dimasukkan substrat yang akan diubah oleh enzim untuk mendapatkan sinyal kromogenik/
fluorogenik/ elektrokimia.

8)

Hasil dikuantifikasi dengan spektrofotometer, spektrofluorometer atau alat optik/ elektrokimia

lainnya.
Enzim bertindak sebagai amplifier, bahkan jika hanya sedikit antibodi terikat enzim yang tetap
terikat, molekul enzim akan memproduksi berbagai molekul sinyal. Kerugian utama dari
metodeindirect ELISA adalah metode imobilisasi antigennya non-spesifik, sehingga setiap protein
pada sampel akan menempel pada lubang plate mikrotiter, sehingga konsentrasi analit yang kecil
dalam sampel harus berkompetisi dengan protein serum lain saat pengikatan pada permukaan
lubang.

2. Sandwich ELISA

Tahapan dalam Sandwich ELISA adalah sebagai berikut:

1. Disiapkan permukaan untuk mengikatkan antibodi penangkap
2. Semua non spesifik binding sites pada permukaan diblokir
3. Sampel berisi antigen dimasukkan dalam plate
4. Plate dicuci untuk membuang kelebihan antigen yang tidak terikat
5. Antibodi primer ditambahkan, supaya berikatan secara spesifik dengan antigen
6. Antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim dimasukkan, yang akan berikatan dengan
antibodi primer
7. Plate dicuci, sehingga konjugat antibodi-enzim yang tidak terikat dapat dibuang
8. Ditambahkan reagen yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal berwarna/ berfluoresensi/
elektrokimia
9. Diukur absorbansinya untuk menetukan kehadiran dan kuantitas dari antigen
Keuntungan utama dari metode sandwich ELISA adalah kemampuannya menguji sampel
yang tidak murni, dan mampu mengikat secara selektif antigen yang dikehendaki. Tanpa lapisan
pertama antibodi penangkap, semua jenis protein pada sampel (termasuk protein serum) dapat
diserap secara kompetitif oleh permukaan lempeng, menurunkan kuantitas antigen yang
terimobilisasi.

3. ELISA kompetitif
Tahapan pengerjaan ELISA kompetitif berbeda dari dua metode yang telah dibahas sebelumnya,
yaitu:
1. Antibodi yang tidak berlabel diinkubasi dengan kehadiran antigennya
2. Komplek antigen-antibodi ini selanjutnya ditambahkan pada lubang yang telah dilapisi
antigen
3. Plate dicuci, sehingga kelebihan antibodi tercuci (semakin banyak antigen dalam sampel,
semakin sedikit antibodi yang dapat terikat pada antigen yang menempel pada permukaan
lubang, karena inilah disebut kompetisi
4. Ditambahkan antibodi sekunder yang spesifik utnuk antibodi primer. Antibodi sekunder ini
berpasangan dengan enzim
5. Substrat ditambahkan, enzim akan mengubah substrat menjadi sinyal kromogenik/
fluoresensi.
Dalam ELISA kompetitif, semakin tinggi konsentrasi antigen orisinal,semakin lemah sinyal yang
dihasilkan.

C. MEKANISME KERJA

ELISA (singkatan bahasa Inggris: Enzyme-linked immunosorbent assay) atau 'penetapan kadar
imunosorben taut-enzim' merupakan uji serologis yang umum digunakan di berbagai
laboratorium imunologi. Uji ini memiliki beberapa keunggulan seperti teknik pengerjaan yang relatif
sederhana, ekonomis, dan memiliki sensitivitas yang cukup tinggi. ELISA diperkenalkan pada tahun
1971 oleh Peter Perlmann dan Eva Engvall untuk menganalisis adanya
interaksi antigen denganantibodi di dalam suatu sampel dengan menggunakan enzim sebagai
pelapor (reporter label).[1]
Umumnya ELISA dibedakan menjadi dua jenis, yaitu competitive assay yang menggunakan
konjugat antigenenzim atau konjugat antobodienzim, dan non-competitive assay yang
menggunakan dua antibodi. Pada ELISA non-competitive assay, antibodi kedua akan
dikonjugasikan dengan enzim sebagai indikator. Teknik kedua ini seringkali disebut sebagai
"Sandwich" ELISA.
Uji ini dilakukan pada plate 96-well berbahan polistirena. Untuk melakukan teknik "Sandwich" ELISA
ini, diperlukan beberapa tahap yang meliputi:
1. Well dilapisi atau ditempeli antigen.
2. Sampel (antibodi) yang ingin diuji ditambahkan.

3. Ditambahkan antibodi kedua yang dikonjugasikan dengan enzim tertentu seperti

peroksidase alkali. Antibodi kedua ini akan menempel pada antibodi sampel sebelumnya.
4. Dimasukkan substrat enzim yang dapat menimbulkan warna tertentu saat bereaksi.
5. Intensitas warna campuran diukur dengan spektrofotometer yang disebut ELISA
reader hingga mendapatkan hasil berupa densitas optis (OD). Dengan menghitung rata-rata
kontrol negatif yang digunakan, didapatkan nilai cut-off untuk menentukan hasil positifnegatif suatu sampel. Hasil OD yang berada di bawah nilai cut-off merupakan hasil negatif,
dan demikian juga sebaliknya.
Uji ini memiliki beberapa kerugian, salah satu di antaranya adalah kemungkinan yang besar
terjadinya hasil false positive karena adanya reaksi silang antara antigen yang satu dengan antigen
lain.[2] Hasil berupa false negative dapat terjadi apabila uji ini dilakukan pada window period, yaitu
waktu pembentukan antibodi terhadap suatu virus baru dimulai sehingga jumlah antibodi tersebut
masih sedikit dan kemungkinan tidak dapat terdeteksi.

Enzyme-Linked Immune-Sorbent Assay atau ELISA atau yang sering sebut uji kekebalan
enzimatis. ELISA relatif murah dan lebih aman dibanding RIA (radio Immuno Assay) yang
menggunakan bahan radiokatif dan dapat dikerjakan di laboratorium kecil tanpa alat pemecah
radioaktif gamma. Metode ELISA (enzym-linked immunosorbent assay) metode dalam
penelitian dengan Berdasarkan : Ikatan spesifik antara antigen (Ag) antibody(Ab).

ELISA dipakai untuk pengujian semua antigen, hapten atau antibody. Paling banyak dipakai di
laboratorium klinis, misalnya uji immunoglobulin G dan E, hormone seperti insulin, esterogen
dan gonadotrofin.

Antibody yaitu Antibodi disekresi oleh Sel Plasma (Sel B), Biasanya digunakan monoklonal
Antibody karena lebih spesifik untuk epitop tertentu daripada policlonal antibodi. Dapat dibeli
terpisah atau dalam paket ELISA Kit, biasanya diproduksi dengan cara induksi respon imun
humoral pada hewan coba ( rat, mouse) dengan cara injeksi Antigen berulang, dilakukan
ekstraksi sel dan purifikasi Ab. Dapat juga diekstraksi dari manusia yang telah diimunisasi
dengan Ag tertentu.

Terdapat 2 Teknik Metode ELISA

Teknik Kualitatif adalah Berdasarkan bahwa tiap antibodi berikatan pada antigen yang
spesifik.
Teknik kuantitatif berdasarkan jumlah ikatan antigen-antibodi yang ditentukan dengan nilai
absorbansi. Teknik ini menggabungkan spesifitas antibody dengan kepekaan uji enzymatis
dengan spektrofotometer biasa atau antigen dilekatkan pada enzyme yang mudah ditera.

1.
2.
3.
4.

Beberapa type ELISA, sebagai berikut :

Direct ELISA, biasanya digunakan dengan kompetisi dan Inhibisi ELISA. Digunakan
untuk deteksi antigen.
Indirect ELISA, antigen terikat pada plate. Digunakan untuk deteksi antibody.
Sandwich ELISA, antibodi terikat pada Plate. Digunakan untuk deteksi antigen.
Capture ELISA, antihuman antibodi terikat pada Plate. Digunakan untuk deteksi
antibody.
ELISA dapat dipakai untuk pengujian antigen lewat cara persaingan (kompetitip) atau cara
antibody ganda (double antibody). Cara Persaingan. Campuran dari antigen yang dilekatkan pada
enzim yang diketahui jumlahnya dengan antigen tanpa enzim yang belum diketahui jumlahnya,
direaksikan dengan antibody yang dilekatkan pada permukaan padat. Setelah reaksi selesai
membentuk kompleks lalu dicuci, kemudian ditambahkan substrat yang cocok untuk enzim dan
aktivitas enzim diukur. Sejumlah antigen yang belum diketahui jenisnya direaksikan dengan
antibody tertentu yang dilekatkan pada permukaan padat, dicuci dan direaksikan dengan
antibody berenzim. Setelah dicuci lagi, ditambahkan substrat enzim khusus. Aktivitas enzim
yang diuji dengan cara biasa menunjukkan jumlah antigen yang ada. Antiserum yang dicurigai,
direaksikan dengan antigen khusus yang dilekatkan pada bahan padat,kemudian dicuci.
Selanjutnya direaksikan dengan antibody yang bersifat anti-immunoglobulin berenzim yang akan
melekat pada antibody yang tadi tererap dari anti serum mula-mula. Kompleks yang terjadi
dicuci, ditambahkan substrat, aktivitas enzim sesuai jumlah antibody pada serum mula-mula.

1.

2.
3.
4.

Beberapa bahan yang digunakan dalam teknik ELISA, yaitu :

Bahan padat yang dipakai dalam ELISA termasuk selulosa, dextran berangkai silang,
poliacrilamide, polistiren dan polipropilen. Bentuknya dapat berupa butiran, lempeng atau
tabung.
Antigen dapat dilekatkan secara adsorpsi pasif atau diikat secara kovalen dengan
sianoben-bromida.
Enzim dipilih yang aktivitasnya tinggi misalnya fosfatse alkalis dan peroksidase. Bahan
pengabung yang sering dipakai adalah glutaraldehide.
Substrat paling baik jika stabil, aman dan murah. Substrat tidak berwarna yang menjadi
berwarna karena perubahan oleh enzim. Misalnya : p-nitrofenilfosfat berubah menjadi p-

nitrofenol berwarna kuning oleh enzim fosfatase alkalis. Substrat lain, misalnya diamino
benzidine,5-aminosalisilat, O-fenilen-diamin dipakai untuk enzim peroksidase.
Material dalam metode ELISA
AntigenM
onoclonal Ab
Microplate
Blocking Buffer
Serum sample
Conjugate (secondary Ab + Enzyme)
Subtrate
Stop Sol.
Alat yang digunakan dalam metode ELISA
96-Wells Microplate
Micropipettes
Multichannel pipette
Elisa test kit
Parameters utama : Solid phase (microplate) 1 reactant Separation bound & free
reagent Color development enzyme

ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent

Assay)
Serologi adalah ilmu yang mempelajari prosedur-prosedur diagnostik dan eksperimental yang berhubungan dengan
imunologi dan menyangkut reaksi-reaksi serum.Tes-tes serologi ini digunakan untuk; Identifikasi mikroorganismemikroorganisme, dan menunjukan antibodi didalam serum dari hospes pada penyakit-penyakit tertentu dimana
penyebab penyakit tidak dapat diisolasi, penemuan spesifik antibodi adalah penting sekali untuk membantu
diagnosa. Salah satu teknik serologi yang bersifat lebih sensitif dibandingkan dua metode serologi yang diuraikan
terlebih dahulu. Enzyme linked immunisorbent assay, disingkat ELISA.
Metode pengujian ini mulai berkembang sejak tahun 1971. ELISA merupakan suatu metode pengujian serologi yang
melekatkan kompleks ikatan antara antibodi dengan antigen di dalam sumuran plate ELISA yang terbuat dari bahan
plastik (Dijkstra et al. 1998). ELISA telah banyak mengalami peubahan sejak pertama kali teknik ini dipublikasikan
ciri utama teknik ini adalah dipakai indikator enzim untuk reaksi imunilogi. ELISA telah berkembang sampai pada
tingkatan yang sangat sulit untuk membuat generasi tentang kemampuan kinerja berbagai konfigrasi. Konfigurasi
yang paling umum mengunakan substrat padat.
ELISA singkatan dari Enzim-Linked Immunosorbent Assay. Ini adalah tes immunochemical cepat yang
melibatkan sebuah enzim (protein yang mengkatalisis suatu reaksi biokimia). Juga melibatkan antibodi atau antigen
(kekebalan molekul). Tes ELISA digunakan untuk mendeteksi zat yang memiliki sifat antigenik, terutama protein

(sebagai lawan dari molekul kecil dan ion seperti glukosa dan kalium. Beberapa di antaranya adalah hormon, bakteri
antigen dan antibodi.

Diposkan oleh ZaCk di 09.39 Tidak ada komentar: Link ke posting ini
Label: ELISA
Selasa, 26 Mei 2009

VARIASI SOMAKLONAL
BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Penyediaan bibit dalam pengembangan suatu tanaman atau dalam suatu proses produksi merupakan
salah satu aspek yang sangat penting. Proses prosuksi skala besar seperti perkebunan akan
memerlukan bibit dalam jumlah besar, bibit dari varietas unggul, seragam, bebasdari hama dan penyakit,
serta penyediannya kontinyu.
Bibit dari suatu varietas unggul yang dihasilkan pemulia tanaman jumlahnya sangat terbatas, sedangkan
bibit yang dibutuhkan sangat banyak. Beberapa tanaman holtikultura, tanaman pangan, maupun
kehutanan banyak yang sulit diperbanyak dengan cara konvensional baik secara vegetative maupun
generative. Selain itu bila diperbanyak dengan cara cangkok, stek, atau penempelan mata tunas
memerlukan bahan tanaman yang sangat besar untuk mendapatkan bibit dalam jumlah besar.
Dengan berkembangnya teknik kultur jaringan, kendala dalam multiplikasi untuk beberapa jenis tanaman
dapat diatasi. Teknik kultur jaringan ini pada mulanya ditujukan untuk membuktikan kebenaran toeri
totipotensi, yang selanjutnya berkembang untuk penelitian dibidang fisiologi tanaman, dan biokimia.
Pada hakekatnya teori totipotensi ini tidak salah tetapi pada kenyataannya telah dapat dibuktikan adanya
penyimpangan dari pembelahan sel, dampak yang diperoleh dari kejadian tersebut adalah terjadinya
variasi kromosom didalam jenis tanaman yang sama, jumlah khromosom yang berkurang, somatic yang
menyusut dan subtitusi khromosom. Akibat dari kejadian-kejadian inilah yang menyebabkan terjadinya
variasi somaklonal.
B. Tujuan
Adapun tujuan dari pembuatan tulisan ini adalah :
1. Menambah ilmu pengetahuan tentang bioteknologi tanaman.
2. Memahami lebih dalam tentang apa itu Variasi Somaklonal.
3. Memenuhi tugas dalam mata kuliah bioteknologi tanaman.

BAB II
PEMBAHASAN
A. Pengertian
Keragaman somaklonal adalah keragaman genetik yang dihasilkan melalui kultur jaringan. Keragaman
somaklonal berasal dari keragaman genetic eksplan dan keragaman genetic yang terjadi dalam kultur
jaringan, keragaman genetic pada eksplan disebabkan adanya sel bermutasi, Keragaman genetic yang
terjadi didalam kultur jaringan disebabkan oleh penggandaan kromosom, perubahan struktur kromosom,
perubahan gen maupun perubahan sitoplasma.
a. Teknik Mendapatkan Somaklonal
Ada tiga cara untuk mendapatkan tanaman somaklonal yaitu : (1) Regenerasi langsung, (2) Kultur sel
tunggal, (3) Kultur protoplasma.
1. Regenerasi langsung
Dengan regenerasi langsung dimaksudkan bahwa dari eksplan langsung diregenerasi tunas adventif dan
embrio somatic tanpa melalui sel tunggal.
1.1 Cara regenerasi langsung

Eksplant Tunas adventif Tanaman atau embrio

Eksplant Kalus Tunas adventif Tanaman atau embrio
Pada cara ini pemilihan eksplan dan media memegang peranan penting. Pemilihan eksplan untuk
mendapat keragaman genetic juga penting didalam proses morfogenesis, media terutama untuk
menghasilkan tunas atau embrio somatic. Pada tanaman kentang eksplan yang berasal dari daun lebih
banyak memberikan keragaman genetic dari bagian eksplan lainnya. Keragaman somaklonal dapat
ditingkatkan dengan pemberian mutagen pada eksplan, baik secara fisik maupun secara kimia.
Pemberian mutagen pada eksplan akan menghasilkan mutan utuh ( solid mutan ) sedangkan pemberian
mutagen pada kalus akan menghasilkan mutan parsial ( chimeric mutan ), pemuliaan in vitro dengan cara
regenerasi langsung relative lebih mudah dibandingkan cara in vitro lainnya. Cara ini dapat dilakukan
pada berbagai jenis bunga seperti : mawar, garbera, dianthus, anthurium, petunia, dll.
2. Kultur sel tungal
Prosedur seleksi melalui kultur sel dimulai dari penanaman dan pemilihan eksplan, induksi kalus, isolasi
sel, penebaran sel, induksi tunas adventif, dan pemindahan kelapangan, genotip dan umur tanaman
untuk dijadikan eksplan sangat menentukan proses selanjutnya ( pembentukan kalus dari regenerasi
tunas ). Selain factor eksplan, factor media sangat menentukan keberhasilan organogenesis. Mulai dari
penanaman eksplan sampai perakaran tunas terdapat enam macam media, yang terutama berbeda
didalam komposisi ZPT .
Organogenesis tidak selalu membentuk tunas adventif atau embrio somatic, tetapi kadang-kadang juga
akar, pada umumnya jika terbentuk akar sukar untuk berorganogenesis menjadi tunas kembali. Pada
kultur sel tunggal, sel yang ditebar itu harus sel-sel yang mempunyai viabilitas tinggi dan berkemampuan
untuk membelah, karena itu sebelum sel ditebar perlu diuji dengan viabilitas sel (pewarnaan dengan
FDA), seleksi sel dan perhitungan jumlah sel per ml, sel-sel itu bisa ditebar dengan kepadatan 4-6 x
100.000 sel/ml, menyaring sel adalah untuk memisahkan sel-sel yang besar yang biasa mempunyai
vakuola yang besar dan sitoplasma yang sedikit, sel yang demikian tidak mampu untuk membelah
membentuk agregat sel. Hanya sel-sel dengan sitoplasma yang penuh (ukuran sedang) yang mampu
membelah dan membentuk agregat dan kalus dan selanjutnya membentuk tunas adventif. Tekanan
seleksi sudah dapat dilakukan mulai dari penebaran sel.
Tekanan seleksi pada tingkat sel ini hanya berlaku pada sifat-sifat ketahanan terhadap penyakit, kadar
garam yang tinggi dan sifat0sifat lain yang sudah diekspresikan pada tingkat sel. Seleksi ini sebaiknya
dilakukan pada M4, karena kalus pada tingkat itu pada umumnnya berasal dari satu sel, seleksi pada
tingkat sel perlu diperlakukan lagi pada waktu kalus itu telah menjadi tanaman untuk meyakinkan bahwa
sifat yang ditampilkan pada tingkat sel juga ditampilkan pada tingkat tanaman.
Seleksi dengan mempergunakan kultur sel ini adalah cara yang diinginkan pada seleksi in vitro tanaman
bunga. Kultur sel mirip dengan kultur protoplasma tapi jauh lebih sederhana dari kultur protoplasma.
3. Kultur protoplasma
Kultur protoplasma merupakan salah satu cara untuk memperbaiki major gen atau poligen yang defektif
pada kultivar yang ada. Sifat-sifat dari major gen itu berupa ketahanan terhadap penyakit, toleransi
terhadap stress dan sifat-sifat morfologi tertentu.
Cara ini dilakukan untuk memperbaiki sifat beberapa jenis tanaman, terutama pada tanaman kentang,
petunia, dan tomat, Sifat-sifat yang diperbaiki pada tanaman kentang berupa ketahanan terhadap
penyakit, toleransi terhadap stress, bentuk dan warna kulit umbi serta sifat morfologis lainnya. Protoplas
adalah sel yang telah dihilangkan dinding sel secara ensimatik atau sel telanjang.
Protoplas dipergunakan untuk memperbaiki tanaman melalui kultur protoplas, fusi protoplas dan
transformasi, didalam kultur protoplas yang penting bahwa dapat diisolasi protoplas yang utuh, protoplas
tersebut harus dapat membentuk dinding sel, kemudian membelah membentuk kalus dan meregenerasi
tanaman.
Urutan didalam kerja protoplas adalah :
1. Penyiapan eksplan
2. Isolasi dan purifikasi protoplas
3. Penebaran protoplas
4. Rebenerasi protoplas kalus
5. Regenerasi planlet
Jenis eksplan yang dipergunakan untuk isolasi protoplas dapat berasal dari kultur suspensi, mesofil daun,

kotiledon, hipokotil, tangkai daun, daun bunga, dan serbuk sari. Jenis eksplan ini dapat berasal dari in
vivo atau in vitro. Pada umumnya dipergunakan eksplan in vitro dari kultur suspense dan kultur tunas.
Keuntungan dari eksplan in vitro adalah :
1. Eksplan tersebut steril.
2. Eksplan in vitro dikulturkan dan diinkubasikan pada keadaan optimum untuk menghasilkan protoplas
serta proses organogenesis selanjutnya.
Isolasi protoplas dan purifikasi terdiri dari pelarutan dinding sel secara ensimatik dan pemisahan
kotoranlain dari protoplasma dengan cara sentrifus. Sel tanaman terdiri dari selulose dan pectin sehingga
enzim yang dipakai untuk menghilangkan dinding sel adalah selulose dan pektinase. Larutan yang
dipergunakan untuk isolasi selain enzim, juga terdapat unsure hara dan osmotikum. Unsur hara untuk
mempertahankan viabilitas protoplasma dan osmotikum untuk mencegah pecahnya protoplasma.
Osmotikum umumnya terdiri dari gula (sukrosa, glucose dan gula alcohol).
Sesudah isolasi protoplasma dilakukan pengecekan viabilitas, perhitungan protoplasma dan pengenceran
protoplasma. Viabilitas dilakukan denan cara mewarnai protoplas dengan FDA dan di teliti dibawah
mikroskop. Perhitungan protoplas dilakukan dengan mempergunakan haemocymeter, perlu dilakukan
pengenceran sebab sesudah isolasi itu kepadatan protoplas berkisar antara 100.000 dan 1000.000
protoplasma. Tiga sampai tujuh hari dalam media tebar, protoplas telah membelah dan membentuk
agreat maka selanjutnya akan dipindah secara berurutan ke media p-kalus, media regenerasi tunas.
Media dasar yang dipergunakan untuk media kalus dan tunas adalah MS atau senyawa organik MS
ditambah senyawa organic dari Nitsch dan Nitsch. Kadar sucrose dan ZPT berupa factor penentu
didalam proses organogenesis. Kadar sucrose yang lebih tinggi dari 2% kadang-kadang menghambat
pertumbuhan p-kalus, regenerasi p-kalus menjadi tunas sering membutuhkan sitokinin khusus seperti
zeatin dan tidak dapat digantikan oleh BAP atai kinetin.
Intensitas cahaya tinggi (lebih dari 4000 luks) dan suhu sekitar 24 derajat celcius merupakan lingkungan
inkubasi yang optimum untuk regenerasi p-kalus menjadi tunas. Untuk regenerasi protoplasma menjadi
tunas membutuhkan waktu 12-16 minggu tergantung dari jenis tanaman dan genitofnya.
Tanaman regenerasi dari protoplasma menunjukkan keragaman genetic yang cukup tinggi. Umumnya
keragaman ini dikarenakan perubahan kromosom dan perubahan gen. Keragaman ini lebih tinggi pada
tanaman yang berasal dari protoplasma kultur suspense dari pada tanaman yang berasal dari
protoplasma mesofil daun. Protoplasma juga dapat dipergunakan untuk memproduksi tanaman dengan
ploidi yang lebih tinggi dari ploidi asal protoplasma.

BAB IV
PENUTUP
A. SIMPULAN
Keragaman somaklonal adalah keragaman genetik yang dihasilkan melalui kultur jaringan. Keragaman
somaklonal berasal dari keragaman genetic eksplan dan keragaman genetic yang terjadi dalam kultur
jaringan, keragaman genetic pada eksplan disebabkan adanya sel bermutasi, Keragaman genetic yang
terjadi didalam kultur jaringan disebabkan oleh penggandaan kromosom.
Keragaman somaklonal dapat ditimbulkan dengan pemberian mutagen baik fisik maupun kimia, mutagen
yang diberikan pada kalus akan membentuk mutasi parsial atau mutan chimeric sedangkan mutagen
yang diberikan pada eksplan akan membentuk mutasi utuh atau solid mutan.
Ada tiga cara untuk mendapatkan tanaman somaklonal yaitu :
1. Regenerasi langsung
2. Kultur sel tunggal
3. Kultur protoplasma
B. SARAN
1. Hendaknya mahasiswa diberikan ulasan sedikit tentang topik yang akan dibahas.

DAFTAR PUSTAKA
Wattimena,Ga.dkk.1991.Bioteknologi Tanaman.Pusat Antar Universitas Bioteknologi Institut Pertanian
Bogor.Bogor.
e.2008.Jurnal Biogen.Peningkatan Keragaman Genetik Melalui Variasi Somaklonal

Pemeriksaan Metode ELISA (Enzyme Linked

Immunosorbent Assay)
ELISA (singkatan bahasa inggris: Enzyme Linked Immunosorbent Assay) merupakan
suatu pemeriksaan untuk menganalisis adanya interaksi antigen dengan antibodi di
dalam suatu sampel dengan menggunakan enzim sebagai pelapor (reporter label).

Metode ELISA yang paling sering digunakan :

1.
2.

Indirek ELISA
Capture ELISA (Sandwich ELISA)

3.

Kompetitif ELISA

A. Indirek ELISA
Antigen dilapisi ke permukaan mikrotiter plate. Antigen dikenali antibodi yang ada
dalam sampel (anti bodi primer) dan terjadi ikatan . Selanjutnya anti bodi primer di
kenali oleh anti bodi sekunder yang telah terhubung dengan enzym. Substrat bereaksi
dengan enzim menghasilkan produk yang berwarna

B. Capture ELISA (Sandwich ELISA)

Capture ELISA atau dikenal juga dengan Sandwich ELISA merupakan satu tes yang
sensitif untuk mengukur pikogram atau mikrogram jumlah zat (seperti hormon, sel
pemberi tanda kimia, infeksi, antigen, dan sitokin)
Desain ELISA tipe ini mungkin lebih dibutuhkan dibanding ELISA direk dan indirek
karena beberapa alasan. Substansi yang dianalisis mungkin terlalu encer

untuk

mengikat lempeng mikro pada polisteryn(seperti protein dalam supernatan kultur sel
atau tidak mengikat baik dengan plastik(molekul anorganik)

Prinsip :
Plate dilapisi oleh antibodi penangkap . Sampel ditambahkan, dan beberapa antigen
yang ada berikatan dengan antibodi penangkap. Antibodi pendeteksi berlabel enzim
mengenali dan berikatan dengan
menghasilkan produk yang berwarna

antigen.

Enzim

bereaksi

dengan

substrat

Jumat, 08 Juni 2012

PEMERIKSAAN ELISA

Sejarah
Sebelum

pengembangan

ELISA,

satu-satunya

pilihan

untuk

melaksanakanimmunoassay adalah radioimmunoassay , teknik menggunakan radioaktif antigen atau

antibodi berlabel. Dalam radioimmunoassay, radioaktivitas memberikan sinyal, yang menunjukkan
apakah suatu antigen tertentu atau antibodi hadir dalam sampel. Radioimmunoassay pertama kali
dijelaskan dalam kertas oleh Rosalyn Sussman Yalow dan Salomo Berson diterbitkan pada tahun 1960.
Sebuah mikrobiologi menggunakan enzim suatu Linked tes Assay (ELISA) immunosorbent, dalam rangka
untuk mengembangkan metode untuk deteksi cepat antigen p24 HIV dalam sampel darah.
Karena radioaktivitas menimbulkan ancaman kesehatan potensial, alternatif yang lebih aman itu
dicari. Sebuah alternatif yang cocok untuk radioimmunoassay akan mengganti sinyal non-radioaktif di
tempat sinyal radioaktif. Ketika enzim (sepertiperoksidase ) bereaksi dengan substrat yang sesuai
(seperti ABTS atau 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine ), perubahan warna terjadi, yang digunakan sebagai
sinyal. Namun, sinyal tersebut harus dikaitkan dengan keberadaan antibodi atau antigen, yang mengapa
enzim harus dihubungkan dengan antibodi yang sesuai. Proses menghubungkan secara independen
dikembangkan oleh Stratis Avrameas dan GB Pierce. [6] Karena itu perlu untuk menghilangkan antibodi
atau antigen terikat dengan mencuci, antibodi atau antigen harus tetap ke permukaan wadah;
yaituimmunosorbent telah harus dipersiapkan. Sebuah teknik untuk mencapai hal ini diterbitkan oleh
Wide dan Jerker Porath pada tahun 1966. [7]
Pada tahun 1971, Petrus Perlmann dan Eva Engvall di Universitas Stockholm di Swedia, dan
Anton Schuurs dan Bauke van Weemen di Belanda mandiri makalah yang disintesis pengetahuan ini ke
dalam metode untuk melakukan EIA / ELISA.

ELISA (singkatan bahasa Inggris: Enzyme-linked immunosorbent assay) atau

'penetapan kadar imunosorben taut-enzim' merupakan ujiserologisyangumum
digunakan di berbagai laboratoriumimunologi. Uji ini memiliki beberapakeunggulan
seperti teknik pengerjaan yang relatif sederhana, ekonomis, dan memiliki
sensitivitas yang cukup tinggi. ELISA diperkenalkan pada tahun 1971oleh Peter
Perlmann dan Eva Engvall untuk menganalisis adanya
interaksiantigen denganantibodidi dalam suatu sampel dengan
menggunakanenzimsebagai pelapor (reporter label) (Lequin, 2005).
Teknik ELISA merupakan teknik kuantitatif yang sangat
s e n s i t i f , penggunaannya sangay luas, memerlukan peralatan yang sedikit,
reagen yangdiperlukan sudah tersedia dan dijual secara komersial dan sangat mudah
didapat.Tes ELISA dapat digunakan untuk mendeteksi antigen maupun
antibodiPemeriksaan ELISA dapat digunakan untuk mendeteksi antibodi dalam
tubuhmanusia maupun hewan. Terdapat berbagai teknik dalam pemeriksaan ELISA.
Metode ELISA (enzym-linked immunosorbent assay)
Metode dalam penelitian dengan Berdasarkan : Ikatan spesifik antara antigen (Ag)
antibody(Ab) terdiri dari :
1. Teknik Qualitatif : Tiap berikatan pada Ag spesifik
2. Teknik Quantitatif : Jumlah Ikatan Ag-Ab ditentukan dengan nilai absorbansi.
Macam sistem metode yang digunakan dalam elisa :
- Direct
- Indirect
- Sandwich
- Capture

METODE PEMERIKSAAN ELISA

ELISA diperkenalkan pada tahun 1971 oleh Peter Perlmann dan Eva Engvall untuk
menganalisis adanya interaksi antigen dengan antibodi di dalam suatu sampel dengan
menggunakan enzim sebagai pelapor. telah digunakan sebagai alat diagnostik dalam bidang
medis, patologi tumbuhan, dan juga berbagai bidang industri. Dalam pengertian
sederhana, sejumlah antigen yang tidak dikenal ditempelkan pada suatu permukaan,
kemudian antibodi spesifik dicucikan pada permukaan tersebut, sehingga akan
berikatan dengan antigennya.
Antibodi ini terikat dengan suatu enzim, dan pada tahap terakhir, ditambahkan
substansi yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal yang dapat dideteksi. Dalam
ELISA fluoresensi, saat cahaya dengan panjang gelombang tertentu disinarkan pada

suatu sampel, kompleks antigen/antibodi akan berfluoresensi sehingga jumlah antigen

pada sampel dapat disimpulkan berdasarkan besarnya fluoresensi.
Penggunaan ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesifitas untuk
antigen tertentu. Sampel dengan jumlah antigen yang tidak diketahui diimobilisasi pada
suatu permukaan solid (biasanya berupa lempeng mikrotiter polistirene), baik yang
non-spesifik (melalui penyerapan pada permukaan) atau spesifik (melalui penangkapan
oleh antibodi lain yang spesifik untuk antigen yang sama, disebut sandwich ELISA).
Setelah antigen diimobilisasi, antibodi pendeteksi ditambahkan, membentuk kompleks
dengan antigen.
Antibodi pendeteksi dapat berikatan juga dengan enzim, atau dapat dideteksi
secara langsung oleh antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim melalui
biokonjugasi. Di antara tiap tahap,plate harus dicuci dengan larutan deterjen lembut
untuk membuang kelebihan protein atau antibodi yang tidak terikat. Setelah tahap
pencucian terakhir, dalam plate ditambahkan substrat enzimatik untuk memproduksi
sinyal yang visibel, yang menunjukkan kuantitas antigen dalam sampel. Teknik ELISA
yang lama menggunakan substrat kromogenik, meskipun metode-metode terbaru
mengembangkan substrat fluorogenik yang jauh lebih sensitive.

Prinsip metode ELISA

mereaksikan antibodi dan antigen secara spesifik, perbedaannya ada pada
substrat ( zat yang digunakan untuk mendeteksi suatu hasil reaksi ) yang digunakan.
Pada ELISA, hasil reaksi akan memunculkan warna yang bisa diukur dengan alat yang
disebut Colorimetri. Pada Fluorescence, hasil reaksi berupa pendaran cahaya yang
terbaca oleh fluoresensi, sedangkan pada Chemiluminescence hasil reaksi berupa
pendaran kimiawi yang terbaca oleh Chemiluminescent.

Jenis Pemeriksaan ELISA

Langkah-langkah "tidak langsung" ELISA mengikuti mekanisme di bawah ini:

Sebuah solusi buffer dari antigen yang akan diuji untuk ditambahkan ke setiap
sumur dari lempeng mikro , di mana ia diberi waktu untuk mematuhi plastik
melalui interaksi biaya.

Sebuah solusi non-protein bereaksi, seperti bovine serum albumin atau kasein ,
ditambahkan untuk memblokir setiap permukaan plastik di sumur yang masih
dilapisi oleh antigen.

Selanjutnya antibodi primer ditambahkan, yang mengikat secara khusus

terhadap antigen lapisan tes yang baik. Antibodi primer ini juga bisa dalam
serum donor akan diuji untuk reaktivitas terhadap antigen.

Setelah itu, sebuah antibodi sekunder yang ditambahkan, yang akan mengikat
antibodi primer.. Antibodi sekunder ini sering memiliki enzim yang melekat
padanya, yang memiliki efek yang dapat diabaikan pada sifat pengikatan
antibodi.

Sebuah substrat untuk enzim ini kemudian ditambahkan. Seringkali, perubahan

warna substrat ini pada reaksi dengan enzim. Perubahan warna menunjukkan
bahwa antibodi sekunder telah terikat antibodi primer, yang sangat menyiratkan
bahwa donor memiliki reaksi kekebalan terhadap antigen uji. Hal ini dapat
membantu dalam pengaturan klinis, dan dalam R & D.

Semakin tinggi konsentrasi antibodi primer yang hadir dalam serum, semakin
kuat perubahan warna. Seringkali spektrometer digunakan untuk memberikan
nilai kuantitatif untuk kekuatan warna.

Enzim bertindak sebagai penguat, bahkan jika hanya sedikit enzyme-linked tetap terikat antibodi,
molekul enzim akan menghasilkan banyak molekul sinyal. Dalam keterbatasan akal sehat, enzim dapat
terus menghasilkan warna tanpa batas waktu, tetapi yang lebih utama antibodi hadir dalam serum
antibodi

donor

lebih

sekunder

enzim

akan

mengikat,

dan

warna

lebih

cepat

akan

berkembang.. Kelemahan utama dari ELISA tidak langsung adalah bahwa metode imobilisasi antigen
non-spesifik, ketika serum digunakan sebagai sumber antigen tes, semua protein dalam sampel bisa tetap
berpegang pada pelat mikro dengan baik, konsentrasi begitu kecil analit dalam serum harus bersaing
dengan protein serum lainnya ketika mengikat ke permukaan baik. Sandwich atau langsung ELISA
memberikan solusi untuk masalah ini, dengan menggunakan "menangkap" antibodi spesifik untuk
antigen tes untuk menariknya keluar dari campuran molekul serum itu.
ELISA dapat dijalankan dalam format kualitatif atau kuantitatif. Hasil kualitatif memberikan hasil
positif atau negatif sederhana (ya atau tidak) untuk sampel. Cutoff antara positif dan negatif ditentukan
oleh analis dan mungkin statistik. Dua atau tiga kali standar deviasi (kesalahan yang melekat dalam tes)
sering digunakan untuk membedakan positif dari sampel negatif. Dalam kuantitatif ELISA, densitas
optik (OD) dari sampel dibandingkan dengan kurva standar, yang biasanya pengenceran serial solusi
dikenal-konsentrasi dari molekul target. Sebagai contoh, jika sebuah sampel uji mengembalikan OD 1,0,
titik pada kurva standar yang memberi OD = 1,0 harus dari konsentrasi analit yang sama sebagai sampel
Anda.
Gambar untuk hak tersebut termasuk penggunaan antibodi sekunder terkonjugasi untuk enzim,
meskipun, dalam arti teknis, hal ini tidak diperlukan jika antibodi primer adalah konjugasi enzim.
Namun, penggunaan konjugasi antibodi sekunder-menghindari proses yang mahal untuk menciptakan
enzim-linked antibodi untuk setiap antigen yang satu mungkin ingin mendeteksi. Dengan menggunakan
antibodi enzyme-linked yang mengikat wilayah Fc dari antibodi lain, antibodi ini enzyme-linked yang
sama dapat digunakan dalam berbagai situasi. Tanpa lapisan pertama antibodi "menangkap", setiap
protein dalam sampel (termasuk protein serum) dapat menyerap kompetitif ke permukaan piring,
menurunkan jumlah antigen amobil. Penggunaan antibodi spesifik dimurnikan untuk melampirkan
antigen ke plastik menghilangkan kebutuhan untuk memurnikan antigen dari campuran yang rumit

sebelum pengukuran, menyederhanakan uji, dan meningkatkan spesifisitas dan sensitivitas pengujian
tersebut.

DAFTAR PUSTAKA

http://moko31.wordpress.com/2011/06/28/tinjauan-tentang-elisa/

: http://id.shvoong.com/exact-sciences/bioengineering-and-biotechnology/2113282-metodeelisa-enzym-linked-immunosorbent/#ixzz1dla9xpCX

ELISA
Sebelum pengembangan ELISA, satu-satunya
pilihan untuk
melakukan suatuimmunoassay adalah radioimmunoassay, teknik
menggunakan antigen berlabel
radioaktif atau
antibodi. Dalam radioimmunoassay, radioaktivitas memberikan sinyal, yang
menunjukkanapakah
suatu antigen
tertentu atau
antibodi hadir dalam
sampel. Radioimmunoassay pertama
kali
dijelaskan dalam
kertas
oleh Rosalyn Sussman Yalow dan
Salomo Berson diterbitkan
pada
tahun
1960. Sebuah mikrobiologi menggunakan enzim suatu Linked tes Assay (ELISA)imm
unosorbent, dalam
rangka untuk
mengembangkan
metode untuk deteksi
cepat antigen p24 HIV dalam sampel darah.
Karena radioaktivitas menimbulkan ancaman kesehatan potensial, alternatif
yang
lebih
aman itu
dicari. Sebuah alternatif
yang
cocok
untuk radioimmunoassay akan
mengganti sinyalnon-radioaktif di
tempat sinyal radioaktif. Ketika enzim (seperti peroksidase) bereaksi
dengansubstrat yang
sesuai (seperti ABTS atau 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine),
perubahan warna terjadi, yang digunakan sebagai sinyal. Namun, sinyal tersebut
harus dikaitkan dengankeberadaan
antibodi atau
antigen, yang
mengapa enzim harus dihubungkan
dengan antibodiyang
sesuai. Proses menghubungkan secara
independen dikembangkan
oleh Stratis Avrameasdan
GB Pierce. Karena itu
perlu untuk
menghilangkan antibodi atau
antigen terikat dengan
mencuci,
antibodi atau

antigen harus tetap

ke permukaan wadah;. Yaitu, immunosorbent telahharus
dipersiapkan. Sebuah teknik untuk mencapai hal ini diterbitkan oleh Wide
dan JerkerPorath pada tahun 1966.
Pada
tahun
1971, Petrus Perlmann dan
Eva Engvall di
Universitas
Stockholm di
Swedia,dan
Anton Schuurs dan Bauke van Weemen di
Belanda mandiri makalah yang disintesispengetahuan ini ke dalam metode untuk
melakukan EIA / ELISA.

Pengertian ELISA
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah suatu teknik biokimia yang terutama
digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen dalam suatu
sampel. ELISA telah digunakan sebagai alat diagnostik dalam bidang medis, patologi tumbuhan,
dan juga berbagai bidang industri. Dalam pengertian sederhana, sejumlah antigen yang tidak
dikenal ditempelkan pada suatu permukaan, kemudian antibodi spesifik dicucikan pada permukaan
tersebut, sehingga akan berikatan dengan antigennya. Antibodi ini terikat dengan suatu enzim, dan
pada tahap terakhir, ditambahkan substansi yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal yang
dapat dideteksi. Dalam ELISA fluoresensi, saat cahaya dengan panjang gelombang tertentu
disinarkan pada suatu sampel, kompleks antigen/antibodi akan berfluoresensi sehingga jumlah
antigen pada sampel dapat disimpulkan berdasarkan besarnya fluoresensi.
Penggunaan ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesifitas untuk antigen tertentu.
Sampel dengan jumlah antigen yang tidak diketahui diimobilisasi pada suatu permukaan solid
(biasanya berupa lempeng mikrotiter polistirene), baik yang non-spesifik (melalui penyerapan pada
permukaan) atau spesifik (melalui penangkapan oleh antibodi lain yang spesifik untuk antigen yang
sama, disebut sandwich ELISA). Setelah antigen diimobilisasi, antibodi pendeteksi ditambahkan,
membentuk kompleks dengan antigen. Antibodi pendeteksi dapat berikatan juga dengan enzim, atau
dapat dideteksi secara langsung oleh antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim melalui
biokonjugasi. Di antara tiap tahap, plate harus dicuci dengan larutan deterjen lembut untuk
membuang kelebihan protein atau antibodi yang tidak terikat. Setelah tahap pencucian terakhir,
dalamplate ditambahkan substrat enzimatik untuk memproduksi sinyal yang visibel, yang
menunjukkan kuantitas antigen dalam sampel. Teknik ELISA yang lama menggunakan substrat
kromogenik, meskipun metode-metode terbaru mengembangkan substrat fluorogenik yang jauh
lebih sensitif.

Aplikasi ELISA
ELISA dapat mengevaluasi kehadiran antigen dan antibodi dalam suatu
sampel, karenanya merupakan metode yang sangat berguna untuk mendeterminasi

konsentrasi antibodi dalam serum (seperti dalam tes HIV), dan juga untuk
mendeteksi kehadiran antigen. Metode ini juga bisa diaplikasikan dalam industri
makanan untuk mendeteksi allergen potensial dalam makanan seperti susu,
kacang, walnut, almond, dan telur. ELISA juga dapat digunakan dalam bidang
toksikologi untuk uji pendugaan cepat pada berbagai kelas obat.
ELISA adalah tes skrining dahulu banyak digunakan untuk HIV karena
kepekaan tinggi. Dalam ELISA, serum seseorang diencerkan 400 kali lipat dan
diterapkan pada pelat yang antigen HIV yang terpasang. Jika antibodi terhadap HIV
hadir dalam serum, mereka dapat mengikat antigen HIV. Pelat ini kemudian dicuci
untuk menghapus semua komponen lain dari serum. Sebuah "antibodi sekunder"
khusus disiapkan - antibodi yang mengikat antibodi lain - kemudian diterapkan ke
piring, mencuci diikuti oleh yang lain. Ini antibodi sekunder secara kimiawi
terkait di muka untuk enzim.
"Anti IgG manusia" Antibodi Ganda Sandwich ELISA
Dengan demikian, piring akan berisi enzim sebanding dengan jumlah antibodi
sekunder terikat ke piring. Sebuah substrat untuk enzim diterapkan, dan katalisis
oleh enzim mengarah ke perubahan pada warna atau fluoresensi. Hasil ELISA
dilaporkan sebagai nomor; aspek paling kontroversial dari tes ini adalah
menentukan "cut-off" titik antara positif dan hasil negatif.Sebuah titik cut-off dapat
ditentukan dengan membandingkannya dengan standar yang dikenal. Jika tes ELISA
digunakan untuk skrining obat di tempat kerja, konsentrasi cut-off, 50 ng / mL,
misalnya, didirikan, dan sampel yang berisi konsentrasi analit standar akan
disiapkan. Diketahui bahwa menghasilkan sinyal yang lebih kuat daripada sampel
dikenal adalah "positif." Merekayang menghasilkan sinyal lemah, yang
"negatif." Dokter Dennis E Bidwell dan Alister Voller menciptakan tes.
Kegunaan lain dari ELISA meliputi:
1. deteksi antibodi mikobakteri dalam TB.
2. deteksi rotavirus dalam tinja.
3. deteksi penanda hepatitis B dalam serum.
4. deteksi enterotoksin E. coli dalam tinja.

Tipe-tipe ELISA
Ada beberapa tipe-tipe ELISA, diantaranya adalah sebagai berikut:

1.

Indirect ELISA

2.

Sandwich ELISA

3.

Competitive ELISA

1. Indirect ELISA

(Gambar Mekanisme Indirect ELISA)

Tahap umum yang digunakan dalam indirect ELISA untuk mendeterminasi

konsentrasi antibodi dalam serum adalah:
a)

Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui konsentrasinya ditempelkan pada permukaan
lubang plate mikrotiter. Antigen tersebut akan menempel pada permukaan plastik dengan cara
adsorpsi. Sampel dari konsentrasi antigen yang diketahui ini akan menetapkan kurva standar yang
digunakan untuk mengkalkulasi konsentrasi antigen dari suatu sampel yang akan diuji.

b)

Suatu larutan pekat dari protein non-interacting, seperti bovine serum albumin (BSA) atau kasein,
ditambahkan dalam semua lubang plate mikrotiter. Tahap ini dikenal sebagaiblocking, karena
protein serum memblok adsorpsi non-spesifik dari protein lain ke plate.

c)

Lubang plate mikrotiter atau permukaan lain kemudian dilapisi dengan sampel serum dari antigen
yang tidak diketahui, dilarutkan dalam buffer yang sama dengan yang digunakan untuk antigen
standar. Karena imobilisasi antigen dalam tahap ini terjadi karena adsorpsi non-spesifik, maka
konsentrasi protein total harus sama dengan antigen standar.

d)

Plate dicuci, dan antibodi pendeteksi yang spesifik untuk antigen yang diuji dimasukkan dalam
lubang. Antibodi ini hanya akan mengikat antigen terimobilisasi pada permukaan lubang, bukan
pada protein serum yang lain atau protein yang terbloking.

e)

Antibodi sekunder, yang akan mengikat sembarang antibodi pendeteksi, ditambahkan dalam
lubang. Antibodi sekunder ini akan berkonjugasi menjadi enzim dengan substrat spesifik. Tahap ini
bisa dilewati jika antibodi pendeteksi berkonjugasi dengan enzim.

f)

Plate dicuci untuk membuang kelebihan konjugat enzim-antibodi yang tidak terikat.

g)

Dimasukkan substrat yang akan diubah oleh enzim untuk mendapatkan sinyal kromogenik/
fluorogenik/ elektrokimia.

h)

Hasil dikuantifikasi dengan spektrofotometer, spektrofluorometer atau alat optik/ elektrokimia

lainnya.
Enzim bertindak sebagai amplifier, bahkan jika hanya sedikit antibodi terikat enzim yang
tetap terikat, molekul enzim akan memproduksi berbagai molekul sinyal. Kerugian utama dari
metode indirect ELISA adalah metode imobilisasi antigennya non-spesifik, sehingga setiap protein
pada sampel akan menempel pada lubang plate mikrotiter, sehingga konsentrasi analit yang kecil
dalam sampel harus berkompetisi dengan protein serum lain saat pengikatan pada permukaan
lubang.

2. Sandwich ELISA

Tahapan dalam Sandwich ELISA adalah sebagai berikut:

a)

Disiapkan permukaan untuk mengikatkan antibodi penangkap

b)

Semua non spesifik binding sites pada permukaan diblokir

c)

Sampel berisi antigen dimasukkan dalam plate

d)

Plate dicuci untuk membuang kelebihan antigen yang tidak terikat

e)

Antibodi primer ditambahkan, supaya berikatan secara spesifik dengan antigen

f)

g)
h)

Antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim dimasukkan, yang akan berikatan
dengan antibodi primer
Plate dicuci, sehingga konjugat antibodi-enzim yang tidak terikat dapat dibuang
Ditambahkan reagen yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal berwarna/
berfluoresensi/ elektrokimia

i)

Diukur absorbansinya untuk menetukan kehadiran dan kuantitas dari antigen

Keuntungan utama dari metode sandwich ELISA adalah kemampuannya
menguji sampel yang tidak murni, dan mampu mengikat secara selektif antigen
yang dikehendaki. Tanpa lapisan pertama antibodi penangkap, semua jenis protein
pada sampel (termasuk protein serum) dapat diserap secara kompetitif oleh
permukaan lempeng, menurunkan kuantitas antigen yang terimobilisasi.
Prinsip kerja sandwich ELISA dapat dilihat pada skema berikut ini:

3. Competitive ELISA
Tahapan pengerjaan ELISA kompetitif berbeda dari dua metode yang telah
dibahas sebelumnya, yaitu:

a)

Antibodi yang tidak berlabel diinkubasi dengan kehadiran antigennya

b)

Komplek antigen-antibodi ini selanjutnya ditambahkan pada lubang yang telah

dilapisi antigen

c)

Plate dicuci, sehingga kelebihan antibodi tercuci (semakin banyak antigen dalam
sampel, semakin sedikit antibodi yang dapat terikat pada antigen yang menempel
pada permukaan lubang, karena inilah disebut kompetisi

d)

Ditambahkan antibodi sekunder yang spesifik utnuk antibodi primer. Antibodi

sekunder ini berpasangan dengan enzim

e)

Substrat ditambahkan, enzim akan mengubah substrat menjadi sinyal kromogenik/

fluoresensi.
Dalam ELISA kompetitif, semakin tinggi konsentrasi antigen orisinal, semakin
lemah sinyal yang dihasilkan. Prinsip kerjanya dapat dilihat pada gambar berikut ini:

Secara singkat tahapan kerja dalam metode ELISA dapat digambarkan sebagai
berikut:

4. Beberapa dan Portable ELISA (M & P ELISA)

(ELISA Reverse di makalah yang diterbitkan)

Sebuah teknik baru (EP 1 499 894 B1 di EPO Buletin 25.02.209 N. 2009/09;
USPTO 7510687 di USPTO Buletin 2009/03/31; ZL 03.810.029,0 di SIPO RRC Buletin
2009/08/04) menggunakan fase padat terdiri dari polistiren immunosorbent batang
dengan 8-12 ogives menonjol. Seluruh perangkat direndam dalam tabung reaksi
berisi sampel dikumpulkan dan langkah-langkah berikut (cuci, inkubasi dalam
conjugate dan inkubasi dalam chromogenous) dilakukan oleh mencelupkan ogives
di microwells standar microplates pra-diisi dengan reagen.

Keuntungan dari teknik ini adalah sebagai berikut:

Para ogives masing-masing dapat peka terhadap reagen yang berbeda,
memungkinkan deteksi simultan dari antibodi yang berbeda dan / atau antigen
yang berbeda untuk multi-target tes;
Volume sampel dapat ditingkatkan untuk meningkatkan sensitivitas tes di klinik
(darah, air liur, urin), makanan (susu curah, telur dikumpulkan) dan (air) lingkungan
sampel;
Satu ogive yang tersisa unsensitized untuk mengukur reaksi non-spesifik sampel;
Penggunaan perlengkapan laboratorium untuk mengeluarkan alikuot sampel,
mencuci solusi dan reagen dalam microwells tidak diperlukan, memfasilitasi
pengembangan siap menggunakan laboratorium-kit dan di tempat kit.

5. Material Dalam Metode ELISA

Antigen
Monoclonal Ab
Microplate
Blocking Buffer
Serum sample
Conjugate (secondary Ab + Enzyme)
Subtrate

 Stop Sol.