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TONINA E NOCICEPO
TONINA E NOCICEPO
Dissertao apresentada ao mestrado em
Biotecnologia da Universidade de Mogi das
Cruzes como parte dos requisitos para
obteno do ttulo de mestre.
rea de Concentrao: Biolgica
FINANCIAMENTO
Os laboratrios de Biofsica e de Farmacologia da Inflamao da UFMG
contam com toda a infra-estrutura para desenvolver o projeto proposto.
Alm disso, o projeto conta com apoio financeiro da Fapesp e do CNPq.
612
S719t
DEDICATRIA
trama
incomparavelmente
delicada
que
une
suas
percepes.
A manifestao de conhecimento que no havia ainda sido
posta a nu produz no investigador sensao semelhante
surgida na criana que procura alcanar o nvel de domnio
com que os adultos manipulam as coisas.
(Albert Einstein)
AGRADECIMENTOS
Ao
prof.
Jorge
Luiz
Pesquero,
pela
orientao,
dedicao
RESUMO
A angiotensina II (Ang II), o principal efetor do sistema renina-angiotensina (SRA)
um peptdeo hormonal com potente atividade vasoconstritora, sendo tambm
reconhecido como um peptdeo regulatrio multifuncional, com ao em diversos
tecidos. As aes da Ang II no sistema nervoso central incluem: elevao da
presso arterial, regulao do balano eletroltico, aumento da liberao de
vasopressina, o aumento do apetite ao sdio e da ingesto de gua, a natriurese,
possivelmente funes cognitivas. Tambm tem sido proposto o envolvimento do
SRA no processamento central da informao sensorial. A tonina uma serinaproteinase capaz de formar Ang II a partir da angiotensina I (Ang I), a partir do
angiotensinognio (AG) e de peptdeos sintticos correspondentes poro
tetradecapeptdica N-terminal do (AG(1-14)). Recentemente, geramos camundongos
transgnicos que apresentam superexpresso da tonina de rato [TGM(rTon)]. Este
animal vem sendo estudado quanto ao fentipo em termos bioqumicos, fisiolgicos
e morfolgicos. O animal apresenta pequeno, mas significativo aumento nos nveis
pressricos, apesar de os nveis teciduais e circulantes de angiotensina II no serem
diferentes dos nveis do animal selvagem. O TGM(rTon) provavelmente apresenta
alteraes a nvel renal. Em relao ao volume urinrio no observamos diferenas
significativas entre o TGM(rTon) e seu controle, porm para a gua ingerida
observamos aumento na quantidade para o animal transgnico e este animal
apresentou uma reduo da osmolaridade da urina. Neste trabalho estudou-se a
resposta nociceptiva do animal TGM(rTon). Utilizamos para isso o teste das
contores abdominais ao cido actico, teste de formalina e ainda o teste de rotarod. Os resultados apresentam evidencias de que o animal TGM(rTon) apresenta
reduo da capacidade motora, observada no teste do rota-rod. Esta reduo da
capacidade motora dos animais TGM(rTon) pode, em parte, ser explicada por um
possvel aumento nos nveis de opiides, uma vez que tonina capaz de hidrolisar
beta-LPH e liberar peptdeos com ao opiide. No entanto, com relao a
nocicepo, o TGM(rTon) apresentou significativo aumento na sensibilidade a dor,
especificamente na segunda fase do teste da formalina, fase na qual so liberados
os agentes inflamatrios. Em concluso, apesar do indcio da presena de opiides
endgenos, percebidos atravs do estudo de motricidade, realizado pelo teste de
rota rod, houve resposta hiperalgsica por parte dos animais TGM(rTon) na fase
inflamatria do teste da formalina.
Palavras-chave: Tonina, Nocicepo, Angiotensina II, Opiides
ABSTRACT
Angiotesin II (Ang II), main trigger of the renin-angiotensin (SRA), is a hormonal
peptide with potent vasoconstrictor activity, also being recognized as a
multifunctional regulatory peptide, with action in several woven. Ang II's actions in the
central nervous system include: elevation of the blood pressure, regulation of the
swinging electrolytic, increase of the vasopressin liberation, the increase of sodium
appetite and the increase of water ingestion, called natriurese, a process that
possibly interferes in cognitive functions. There has also been proposed the
involvement of SRA in the central processing of sensorial information. Tonin is a
serine-proteinase capable of forming Ang II starting from angiotensin I (Ang I), or
starting from angiotensinogen (AG) and of synthetic peptides corresponding to the Nterminal tetradecapeptidic portion of the (AG(1-14)). Recently we generated
transgenic mice that presented super expression of the mouse tonin [TGM(rTon)].
This animal has been studied in relation to the phenotype in biochemical,
physiological and morphological terms. The animal presents a small but significant
increase in the pressure levels, although the tissue and circulation levels of
angiotesin II are no different of the ones found in wild animals. The mouse tonin
probably presents changes in the kidneys function. In relation to the urine volume we
have not observed any significant changes between the TGM(rTon) and the control
group, although we observed an increase in the amount of water ingested by the
transgenic animal and this animals kidney presented a reduction of its filtration
capacity. In this thesis we have studied the nociceptive answer of the animal
TGM(rTon). For that, we used a test measuring the amount of abdominal contortion
in response to acetic acid, a formalin test and a rota-rod test. The results show
evidence that the TGM(rTon) animal presents a reduction of the motor skill, observed
in the rota-rod test. This reduction may, in part, be explained by a possible increase
of opioids, seeing that the tonine is capable of hydrolyzing beta-LPH and releasing
peptides with opioid action. However, in relation to the nociceptivity, the TGM(rTon)
presented a significant increase in its pain sensitivity, especially in the second fase of
the formalin test, when the inflammatory agents are released. In conclusion, although
there was a trace of endogenous opioids, noticed through the motricity study,
realized through the rota rod test , there was an hiperalgesic response from the
TGM(rTon) animals in the inflammatory fase of the formalin test.
Keywords: Tonin, Nociception, Angiotesin II, Opioids
LISTA DE ILUSTRAES
12
13
21
27
29
30
32
18
33
34
LISTA DE ABREVIATURAS
AG
Angiotensinognio
Ang I
Angiotensina I
Ang II
Angiotensina II
Arg. Xxx
AT1
AT2
CD
Corno distal
DNA
cido desoxirribonuclico
ECA
FAP
Fen. Xxx
IASP
Icv
Intracerebroventricular
RPM
SRA
Sistema renina-angiotensina
SV40poliA
TGM
Transgenic mouse
LISTA DE ANEXOS
SUMRIO
1 INTRODUO ...................................................................................
11
11
12
14
17
18
20
21
2 OBJETIVOS .......................................................................................
23
3 MTODOS .........................................................................................
24
25
25
26
27
30
30
4 RESULTADOS ...................................................................................
31
31
32
33
5 DISCUSSO ......................................................................................
35
6 CONCLUSES ..................................................................................
38
7 REFERNCIAS ..................................................................................
39
ANEXOS ...............................................................................................
INTRODUO
1.1
SISTEMA RENINA-ANGIOTENSINA
A angiotensina II (Ang II), o principal efetor do sistema reninaangiotensina (SRA, Figura 1) um peptdeo hormonal com potente atividade
vasoconstritora (PEACH, 1977), sendo tambm reconhecido como um peptdeo
regulatrio multifuncional, com ao em diversos tecidos incluindo o crebro, o
corao, a adrenal, o rim, e as gnadas (DZAU et al., 1986; DZAU et al., 1987;
KUNAPULI et al., 1987; LINDPAINTER et al., 1987; KUMAR et al., 1989; LOPES et
al., 1997).
As aes da Ang II no sistema nervoso central incluem: elevao da
presso arterial, regulao do balano eletroltico, aumento da liberao de
vasopressina, aumento do apetite ao sdio e da ingesto de gua, denominada
natriurese (FITZSIMONS, 1980; GANONG et al., 1982; OLSEN et al., 1985), e
possivelmente funes cognitivas (PHILLIPS, 1987). Tambm tem sido proposto o
envolvimento do SRA no processamento central da informao sensorial. Outros
trabalhos mostram que a angiotensina II es t ligada nocicepo (Guasti et al.,
1998).
Pelo SRA, o angiotensinognio (AG) clivado pela renina, levando
formao da angiotensina I (Ang I). A Ang I, pela ao da enzima conversora de
angiotensina (ECA), hidrolisada na ligao Fen8-His9, com conseqente liberao
do octapeptdeo Ang II. Outras vias enzimticas podem contribuir para a formao
da Ang I e da Ang II (BOUCHER et al., 1974; GENEST, 1983). No se conhece
ainda a importncia relativa de cada via formadora de Ang II que est presente nos
diferentes tecidos, porm, existem indcios de que, em alguns neurnios cerebrais, a
maior parte da Ang II possa ser formada por outras enzimas que no a ECA e a
renina (BUNNEMAN et al., 1993).
Asp.Arg.Val.Tir.Ile.His.Pro.Fen.His.Leu.Val.Ile ...
Angiotensinognio humano
Renina
Asp.Arg.Val.Tir.Ile.His.Pro.Fen.His.Leu
Angiotensina I
ECA
Asp.Arg.Val.Tir.Ile.His.Pro.Fen
Angiotensina II
receptor AT2
Rim
reteno de sdio
fibrose
Glndula adrenal
liberao de
aldosterona
Corao
inotropia
cronotropia
hipertrofia
fibrose
Vasos
constrico
hipertrofia
Crebro
sede
apetite ao sal
ativao simptica
liberao de
vasopressina
et al.,1995),( ICHIKI, T. et
al.1995) . Os efeitos da Ang II, resultantes de sua interao com estes receptores
especficos esto mostrados na figura 1.
Enzimas semelhantes renina, proteinases como a catepsina D, a
pepsina e outras aspartil-proteinases, so capazes de produzir Ang I a partir do AG.
Alm disso, outras enzimas que no a ECA, so capazes de produzir Ang II, tanto a
partir de Ang I como diretamente do AG, entre elas a catepsina G e a tonina.
1.2
SISTEMA TONINA-ANGIOTENSINA II
Angiotensinognio
Renina
Catepsina D
Angiotensina I
ECA
Catepsina G
TONINA
Quimase
Catepsina G
TONINA
Angiotensina II
3. Dor e nocicepo
Os antigos gregos, dentre eles Aristteles, acreditavam que a dor era um
"desgosto", sentimento oposto ao prazer experimentado no corao, e Willian
Harvey, descobridor da circulao, acreditava que o corao e no o crebro fosse o
"sensorium communum" onde a dor era sentida (BONICA, 1976). Em 1644,
Descartes descreveu a conduo das sensaes, inclusive dor, via "sensores
delicados" contidos em nervos que conectava os tecidos ao crebro, onde a
sensao era produzida.
A dor um componente sintomtico de diversas desordens clnicas, afetando
grande parte da populao (BESSON e DICKENSON, 1997). De um modo geral, a
sua funo operar como mecanismo de auto-preservao do corpo, ocorrendo
quando um tecido lesado quer seja por mtodos mecnicos ou por mtodos
qumicos, fazendo com que o indivduo reaja com o intuito de remover a causa do
3.1.
Modulao da nocicepo
que est relacionada a dor evocada por um estmulo no nocivo (MILLAN, 1999).
3.2. Analgesia
demonstraram
que
ratos
espontaneamente
hipertensos
tm
uma
gfap
ton
SV40
O transgene est expresso em vrios tecidos deste animal sendo que o maior
nvel foi encontrado no encfalo, seguido do corao, rim, fgado, estmago, bao,
tecido adiposo e aorta. O animal apresenta pequeno aumento da presso arterial e
nenhuma diferena de freqncia cardaca quando comparado ao grupo controle
(selvagem). Para esta pesquisa, props-se caracterizar o animal TGM(rTon) quanto
resposta nociceptiva.
II. OBJETIVOS
a) Geral
Avaliar a capacidade nociceptiva dos camundongos TGM(rTon). Executar
experimentos que possam mostrar a possvel participao da tonina em processos
de nocicepo.
b) Especficos
1. Comit de tica
2. Material
Formaldedo 0,92%;
Pipetas de preciso;
3. Animais
analgsicas.
Rotineiramente os testes nociceptivos utilizados em animais requerem algum
movimento para mostrar que um estmulo nocivo est tendo efeito. A ausncia ou
diminuio de uma resposta no pode ser tomada como evidncia de ao antinociceptiva, a menos que seja excluda a possibilidade de que o animal no tenha a
habilidade motora para executar o requerido movimento.
Colier (1970) preconiza a utilizao de um teste de coordenao motora em
combinao com o teste nociceptivo rotineiro, a fim de comprovar que os animais
usados em testes so aptos a responder em situaes onde so requeridos
movimentos em resposta ao estmulo aplicado. Sua teoria foi mais tarde corroborada
por diversos pesquisadores do tema, como Millan (1999), Santos et al. (1999) e Le
Bars et al. (2001).
que
observaram
ao
injetar
compostos
orgnicos
iodados,
intraperitonealmente em ratos.
A injeo subcutnea de cido actico, via peritoneal, em camundongos,
determina o aparecimento de uma gama de respostas motoras bem caracterizadas,
cuja quantificao permite que se avalie a intensidade da resposta nociceptiva. Esta
resposta desenvolve-se bem caracterizada, sendo basicamente de origem
neurognica.
Foi utilizado o teste de contoro induzido por cido actico descrito por
Koster (1956), modificado por Castro (2000), no qual considerado o nmero de
contores abdominais dos membros posteriores ocorridas entre 5 e 20 minutos
aps a administrao i.p (intraperitonealmente) de 10 mg/kg de cido actico 0,6%.
Em cubas de vidro ou acrlico, medindo 12x12x12 cm, so observados dois animais
de cada vez, sendo considerados somente os camundongos que apresentam a
contoro abdominal imediatamente aps a injeo do cido.
O cido actico injetado na regio abdominal do camundongo. Espelhos
colocados na parede posterior da caixa, em ngulo de 45, com piso transparente
permitem a visualizao do camundongo durante todo o tempo (figura 6).
os
animais
foram
submetidos
eutansia
em
cmara
de
abdominal,
Figura
7.
Camundongo
TGM(rTon),
aps
experimento
de
contoro
do
programa
GRAPH
PAD
PRISM
for
Windows.
IV. RESULTADOS
em
considerao
que
os
camundongos
transgnicos
1. Teste de rota-rod
Tempo de permanncia
4
3
2
1
0
Swiss
Selvagem
TGM (rTon)
As colunas
Nmero de contores
30
20
10
Selvagem
TGM (rTon)
3. Teste de formalina
Nesse teste foi observado o comportamento de lambida nas duas fases que
so desenvolvidas, sendo que na primeira fase temos a resposta nociceptiva, ligada
aos efeitos em cascata que so desencadeados por ao da formalina, que provoca
mobilizao e edema de pata. J na segunda fase tem-se como resposta uma
n de lambidas
250
200
150
100
50
0
1 fase
2 fase
Figura 10. Teste de formalina. Nmero de lambidas induzidas pela injeo de formalina em
camundongos selvagens (S) e transgnicos (T). A primeira fase corresponde ao tempo de 0 - 5
minutos aps a injeao e a segunda fase 15 - 30 minutos. *p < 0,05. As colunas representam a
mdia epm (n = 6).
V. DISCUSSO
VI. CONCLUSES
VII. REFERNCIAS
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Hugo
FERREIRA,
Daniel.
Analgesia,
sedao
relaxamento
ANEXO 1 TABELAS
Analise estatstica das contores abdominais em c. Actico
( Graph Pad Prism)
Anlise
estatstica
no
teste
de
formalina
Graph
Pad
Prism)