AISLAMIENTO DE Clostridium sporogenes A PARTIR DE MUESTRA DE TIERRA

ISOLATION OF Clostridium sporogenes FROM A SAMPLE OF LAND

Mara Carolina Betancur DAmbrosio Tatiana Paola Soto Borja

RESUMEN
Con el propsito de emplear los conocimientos obtenidos a lo largo del curso de
Microbiologa General, se trabaj en el aislamiento de la bacteria Clostridium sporogenes,
todos los procedimientos requeridos se llevaron a cabo en el laboratorio de Microbiologa
de la Universidad de Crdoba, ubicado en la va que conduce de Montera a Cinaga de
Oro en el corregimiento de Berstegui. Para la obtencin de la muestra utilizada en el
aislamiento se tom una porcin de tierra adquirida a profundidad y se fij en la parte
central de una papa, posterior a esto se cubri la papa para lograr condicin de
anaerobiosis, durante 5 das, se implement otro tipo de procedimientos para una mayor
seguridad al momento de adquirir la muestra, como el uso de carne de res cocida con el
fin de abastecer los nutrientes del microorganismo, lo producido en la papa se diluy en
agua peptonada a 35C por 24 horas en anaerobiosis a igual que la carne, se realizaron
diluciones a partir de la solucin de la papa, con el objetivo de aislar la muestra ms pura.
El inoculo obtenido, fue sembrado en agar SPS e incubado a 35C por 24 horas. Se
present crecimiento en la muestra sembrada a partir de la carne lo cual se evidenci a
travs de colonias de color blancuzco, cuya presencia se logro confirmar por la aplicacin
de la tincin de Shaeffer Fulton.
Palabras claves: Clostridium sporogenes, agua peptonada, agar SPS, tincin de Shaeffer
Fulton.
ABSTRACT
With the purpose to use the knowledge that we got throughout the course of General
Microbiology, we worked on the isolation of the bacterium Clostridium sporogenes, all the
procedures required were conducted in the laboratory of Microbiology of the University of
Cordoba, located in the road of Monteria until Cinaga de Oro in the village of Berstegui.
To obtain the sample used in the isolation we took a portion of land obtain to profundity
and it was fixed in the middle of a potato, then the potato was covered to achieve
anaerobic conditions for 5 days, we implemented another kind of procedures for we have
extra security at the moment to obtain the sample, as the use of cooked meat with the
purpose to supply the nutrients of the microorganism, the product of the potato was
diluted in peptone water at 35 C for 24 hours in anaerobic conditions the same happen
with the meat, we did dilutions, they were made from solution of potato, with the intention
of isolating the purest sample. The inoculum obtained was planted in SPS agar and
incubated at 35 C for 24 hours. It grew up in the sample from cultivated of meat which
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was evidenced by whitish colonies, it can be confirming with the application of stain of
Shaeffer - Fulton.
Keywords: Clostridium sporogenes, peptone water, SPS agar, stain of Shaeffer - Fulton.

INTRODUCCIN
La papa (Solanum tuberosum) es un
tubrculo que posee hidratos de carbono
en concentraciones que equivalen
aproximadamente a un 50% del total de
los componentes nutricionales de la
papa, que en condiciones normales
pueden ser rica fuente de carbohidratos
para muchas bacterias, al igual que los
microorganismos que son capaces de
degradar protenas encontradas en la
carne.
De igual forma a pocos centmetros de
profundidad del suelo podemos tropezar
con miles de microorganismos que
pueden hallarse de forma natural sin
presencia de oxigeno, entre estos
encontramos muchas especies de
Clostridium,
como
el
Clostridium
sporogenes, encontrado comnmente en
el suelo e intestinos de muchos animales
y en los alimentos con baja acidez y
algunas carnes en descomposicin.
Clostridium sporogenes es una bacteria
Gram-positiva, en forma de mazo, en la
tincin de Gram se observan filamentoso
en cultivos viejos, presentan esporas
ovales subterminales, son mviles, sus
colonias se observan con bordes rizoides
se adhieren
firmemente al agar
produciendo velo.
Existen algunos gneros bacterianos,
entre los que destacan Clostridium y,
producen en su interior formas de
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resistencia denominadas endosporas,

que mediante tinciones se pueden
observar en el microscopio de color
verde
mientras
que
las
formas
vegetativas se observan de color rosado
utilizando la tincin de esporas llamada
Shaeffer - Fulton.
Las pruebas bioqumicas utilizas para la
identificacin de Clostridium sporogenes
son: hidrlisis de la esculina, lectinasa en
donde la mayora de las cepas son
negativos y algunas cepas positivas
ocasionales, la prueba de la lipasa y
derivados de indol, la prueba para
identificacin de la fermentacin de la
glucosa, protelisis de la leche y la
hidrlisis de la gelatina, son las pruebas
utilizadas
frecuentemente
para
el
aislamiento
e
identificacin
del
microorganismo en cuestin, pero
teniendo en cuenta que las pruebas
bioqumicas para la identificacin de
especies de Clostridium, requiere de
cultivos en condiciones de anaerobiosis
estrictas, algunas especies no se pueden
identificar bioqumicamente, pues se
comportan de manera similar; esto obliga
a realizar otras pruebas, por ejemplo,
inoculacin de ratones para detectar
toxigenicidad.
Su temperatura ptima de crecimiento es
de 37C pero puede variar hasta 35C,
son
anaerobios
facultativos
pertenecientes
a
la
familia
de
Clostridiaceae capaz de fermentar la
glucosa e hidrolizar la gelatina, se

deduce con eso, que Clostridium

sporogenes es una bacteria proteoltica y
sacaroltica.

MATERIALES Y MTODOS
El presente aislamiento se desarroll en
el Laboratorio de Microbiologa de la
Universidad
de
Crdoba,
sede
Berstegui, usando los siguientes
materiales:
Balanza analtica, agua de peptona 250
ml, asas (punta y redonda), mechero,
frasco tapa rosca, pipeta, jarra de
Gaspack incubadora, microscopio,
agar SPS.
Para pruebas bioqumicas: Medio KIA,
caldo BHI, medio gelatina, medio SIM.
Para
tinciones:
portaobjetos,
cubreobjetos, cristal violeta,
lugol,
alcohol acetona, safranina de Gram,
agua
destilada,
verde
malaquita,
safranina al 0.5%
Preparacin para la obtencin de la
muestra
En el primer procedimiento realizado, se
tom una muestra aproximadamente de
10g de tierra adquirida a profundidad y
se distribuyeron en 3 papas (Solanum
tuberosum) previamente perforadas con
un sacabocados, se introdujo una
porcin de tierra justo en el centro de la
papa de manera equitativa en cada
tubrculo, posterior a esto se repuso la
pieza extrada anteriormente de este y se
recubri con la parafina de vela para
garantizar la anaerobiosis, luego se
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sujeto la parafina con cinta transparente

adhesiva, se sumergi en agua estril y
agregndole glicerina se asegur el
contacto directo con el aire, otros
microorganismos ajenos al aislamiento y
acelerar el proceso de descomposicin,
(ver figura 1) posterior a esto se cerr
hermticamente, dejndose en dichas
condiciones durante 5 das. Luego de
esto se extrajo la parte descompuesta de
las tres papas (ver figura 2) y se
sumergieron en 90 ml de agua de
peptona por 24 horas a 35C, la solucin
obtenida se denomino solucin 10-1.
Se realizaron dos diluciones a partir del
primer procedimiento (ver figura 3) con el
objetivo de obtener un cultivo puro, esto
se llevo a cabo tomando 9ml de agua de
peptona con 1ml de la solucin obtenida
de la papa (solucin 10-1), se nombr
solucin 10-2, posteriormente, de la
solucin anterior se adicionaron 1ml a 9
ml de agua de peptona consiguiendo as
la solucin
10-3, seguido a esto se
incubo por 24h a 35C.
Este procedimiento se hizo con el fin de
aislar Clostridium sporogenes, el cual
segn bibliografa es un microorganismo
sacaroltico y teniendo en cuenta esta
condicin se realiz el procedimiento en
mencin.
En el segundo procedimiento se tom
una
muestra
de
tierra
de
aproximadamente 10g y se inocul en
agua de peptona por 24 horas a 35 C en
la jarra de Gaspack, al igual que en el
procedimiento anterior se realizaron
diluciones, pero esta vez en 9 tubos, que
contenan cada uno 9ml de agua de
peptona con carne cocida (ver figura 4).
Estas diluciones se efectuaron de la

siguiente manera: de la muestra de la

tierra con agua de peptona se extrajo 1ml
y se adiciono en un tubo (1), previamente
preparado con 9 ml de agua de peptona
y carne, a partir del tubo 1 se preparo el
tubo 2 y de este el tubo 3; seguidamente
se realizaron dos diluciones del tubo 1
pero esta vez con 0.5ml de la solucin
para as obtener 11 y de esta 12 de igual
forma se diluyeron los tubos 2 y 3 para
un total de 9 tubos, que posteriormente
fueron sometidos a incubacin en jarra
de Gaspack durante 24h a 35C.
Este procedimiento se hizo con el fin de
aislar Clostridium sporogenes, el cual
segn bibliografa es un microorganismo
sacaroltico y proteoltico teniendo en
cuenta esta condicin se realiz el
procedimiento anterior.
Siembra
Del el primer procedimiento se
seleccionaron
las
muestras
que
presentaron mayor turbidez, la solucin
10-1 y la solucin10-2, posterior a esto se
sembr en agar SPS por mtodo clsico
durante 24 horas en la jarra de Gaspack
a 35C, de igual forma en el segundo
procedimiento se tomaron los tubos 1, 2,
3, 11y 12, los cuales presentaron mayor
turbidez con respecto a los dems y as
sembrarlos en agar SPS por 24 horas
incubado
en
condiciones
de
anaerobiosis, para completar un total de
7 cajas de petri.

motilidad en medio SIM), con las cepas

que presentaron crecimiento en los dos
procedimientos llevados a cabo.
RESULTADOS Y DISCUSIN
Teniendo en cuenta el agar y el mtodo
de siembra donde crecen los Clostridium,
las
colonias
se
apreciaron
macroscpicamente con borde rizoide,
pero muy difcil de determinar y observar,
es decir muy pequeas por lo cual se
seleccionaron las cajas de petri donde
hubo mayor crecimiento de colonias y
similitud con respecto las descritas segn
bibliografa.
Las cajas de petri del primer
procedimiento fueron descartadas debido
a que sus colonias no se podan apreciar
en su totalidad y no coincida con lo
consultado (ver figura 5). Sin embargo se
realizaron tincin de Gram y tincin de
Shaeffer Fulton pero estas no contena
bacilos Gram positivos ni presencia de
esporas (ver figura 6).

Pruebas bioqumicas

Las cajas seleccionadas fueron dos,

provenientes de los tubos 1 y 2 en el
segundo procedimiento (ver figura 7), las
cuales presentaron crecimiento de
colonias de color negro debido a la
fermentacin del sulfuro que contena el
agar
SPS
(sulfunato
sdico
de
polianetol). Las cajas de petri restantes
fueron descartadas debido a la escasez
de presencia de colonias, aunque estas
tambin presentaron fermentacin del
H2S.

Se realizaron pruebas bioqumicas

(fermentacin de carbohidratos en medio
KIA, hidrolisis de le esculina en caldo
BHI para anaerobios, prueba de
gelatinasa, prueba de sulfuro, indol y

Se realiz tincin de Gram a las cajas de

petri
seleccionadas
dando
como
resultados bacilos Gram positivo (ver
figura 8), seguidamente se realiz tincin
de Shaeffer Fulton para lo cual se

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pudieron observar las esporas de color

verde y algunas clulas vegetativas de
color fucsia (ver figura 9), la localizacin
de las esporas fueron subterminales lo
cual es un dato que concuerda con los
datos tericos del microorganismo,
siguiendo con el procedimiento se
realizaron las pruebas bioqumicas
necesarias para la identificacin de
Clostridium sporogenes dando como
resultado que en la prueba de
fermentacin de carbohidratos en medio
KIA produjo acido/acido con rompimiento
del medio es decir formacin de gas en
anaerobiosis y produccin de cido
sulfhdrico (ver figura 10), de la prueba
anterior se puede decir que la mayora
son reacciones propias de la Clostridium
sporogenes, excepto la fermentacin de
la lactosa.
Por otro lado, se logr observar que el
microorganismo aislado produce enzimas
de tipo proteolticas capaces de licuar la
enzima gelatinasa, es decir, que en esta
prueba el resultado es positivo (ver figura
11), adems con el medio SIM se
determin motilidad, indol y produccin
de sulfuro, donde la primera arroj
resultado positivo ya que hubo movilidad
fuera de la lnea de siembra por la
presencia de flagelos en su estructura,
as mismo la prueba de sulfuro result
ser
positiva
presentando
ennegrecimiento del medio, el cual
impeda un poco la observacin de la
movilidad, para el indol el resultado fue
negativo, lo que quiere decir que el
microorganismo no es capaz de
desdoblar el indol de la molcula de
triptfano, (ver figura 12).
La prueba de hidrlisis de esculina en
caldo BHI permite determinar
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Microbiologa general Nov. 2010

la
capacidad
que
posee
el
microorganismo de hidrolizar el glucsido
esculina a esculinata, que en este caso
fue positivo observndose el tubo
totalmente negro, (ver figura 13).
Las anteriores pruebas corresponden
cada vez mas al tipo de microorganismo
que se desea identificar, debido a que las
pruebas realizadas son reacciones que
presenta el Clostridium sporogenes,
razn por la cual existe la posibilidad que
el microorganismo aislado sea esta
especie de Clostridium.
CONCLUSIONES Y
RECOMENDACIONES
Considerando el resultado obtenido de
las pruebas bioqumicas y las tinciones
se puede inferir que posiblemente se
aisl Clostridium sporogenes a partir de
la muestra de tierra adquirida a
profundidad e inoculada en agua
peptonada
con
carne
cocida
y
proporcionndole al microorganismo las
condiciones que necesit para su ptimo
desarrollo, esto se pudo deducir debido
que el microorganismo arrojo resultados
positivos para todas las pruebas excepto
la
prueba
de
fermentacin
de
carbohidratos (+-) ya que el resultado fue
acido/acido, es decir que se ferment la
glucosa en anaerobiosis y la lactosa en
aerobiosis, teniendo en cuenta que el
microorganismo en cuestin vive sin
presencia de oxigeno, por lo cual se
esperaba que solo fermentara la glucosa,
se presume entonces la existencia de
otra bacteria capaz de fermentar la
lactosa, se conjetura tambin que el
tiempo de incubacin de la prueba se
prolongo de lo requerido.

Segn lo realizado en el primer

procedimiento, no se obtuvieron las
caractersticas que se aproximaran a los
resultados tericos del microorganismo,
se cree que se debe a que la muestra de
tierra no fue la ms adecuada ya que
esta se extrajo a pocos centmetros de
profundidad de la superficie terrestre.
De manera general todas pruebas
propuestas
cumplieron
con
los
requerimientos establecidos para la
bacteria Clostridium sporogenes.
Se recomienda para mejores resultados
futuros, adquirir la muestra a una
profundidad de aproximadamente 20
centmetros del suelo, en una zona no
transitable y poblada de arboles, de igual
forma se aconseja una siembra a
profundidad para as garantizar un buen
desarrollo de Clostridium sporogenes. No
es irrelevante sugerir un apropiado
manejo de los implementos del
laboratorio,
las
muestras
de
microorganismos y advertir el cuidado
que estos requieren.
A manera de anexo es importante
resaltar
que
el
porcentaje
de
identificacin correcta que se obtiene del
gnero Clostridium oscila entre 60-80%,
donde casi el 100% de las cepas que
corresponden a C. perfringens son
identificadas correctamente mientras que
los mayores fallos se producen con
cepas de C. inocuum, C. difficile, C.
sporogenes,
C.
tetani
y
C.
clostridioforme.
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ANEXOS