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Enzimas

Desde que la clonacin molecular se ha vuelto una tcnica rutinaria de laboratorio,


las manufactureras ofrecen incontables fuentes de enzimas para generar cidos
nucleicos. De esta manera, el seleccionar la enzima adecuada para una tarea
especfica puede parecer difcil para los principiantes. Esta revisin pretende
proveer al lector con algunas indicaciones para la comprensin la funcin y
especificidades de las diferentes fuentes de polimerasas, ligasas, nucleasas,
fosfatasas, metilasas y topoisomerasas usadas para para clonacin molecular.
Proveemos con una descripcin de las enzimas mas comnmente usadas de cada
grupo, y explicamos sus propiedades y mecanismo de accin. Al sealar
requerimientos clave para cada actividad enzimtica y clarificar sus limitaciones,
pretendemos guiar al lector en la seleccin de una fuente enzimtica apropiada y
optimas condiciones para experimentos de clonacin molecular.
Palabras clave.- Enzimas, biologa molecular, Clonacin molecular.
Introduccin
En tiempos en los que la clonacin molecular se ha convertido en una tcnica
rutinaria de laboratorio, pensamos que era importante proveer a los lectores con
algunas indicaciones para entender la funcin y especificidades de diferentes
enzimas usadas para generar y manipular cidos nucleicos. A partir de hace
algunos aos, la tremenda expansin de las tcnicas de clonacin han detonado
un enorme inters en los proveedores de laboratorios. Como resultado,
incontables fuentes de enzimas estn, hoy en da, disponibles, y seleccionar la
enzima adecuada para una tarea especifica parece ser una tarea difcil para
quienes a penas inician. Los cidos nucleicos utilizados para la clonacin
molecular pueden ser de origen sinttico o natural, y sus rangos de longitud desde
solo unos pocos a numerosos nucletidos. Los cidos nucleicos pueden ser
manipulados de manera extensiva para adquirir propiedades y caractersticas
especficas. Tal manipulacin incluye propagacin, ligadura, digestin, o adicin de
grupos modificadores tales como el fosfato. O los grupos metilos. Estas
modificaciones son catalizadas por polimerasas, ligasas, nucleasas, fosfatasas, y
metilasas, respectivamente. En esta revisin, presentamos una descripcin de las
principales enzimas de cada grupo, y se explica sus propiedades y mecanismos
de accin. Nuestro objetivo es dar l lector un mejor entendimiento de las
actividades enzimticas fundamentales que son usadas en la clonacin molecular.
Polimerasas de ADN
Las polimerasas de ADN son enzimas que catalizan la formacin de polmeros
creados por el ensamble de mltiples unidades estructurales de

desoxirribonucleotidos trifosfato (dntp). Ninguna de las ADN polimerasas que han


sido caracterizadas hasta ahora pueden dirigir De novo la sntesis de una
molcula polinucleotdica a partir de nucletidos individuales.
Las polimerasas de ADN solo agregan nucletidos a la punta 3-OH de un grupo
fosfato preexistente contenedor de cebador 5- . Los cebadores son cadenas
cortas de ARN complementarias a alrededor de 10 nucletidos de ADN a la 5
punta de la molcula a replicar. Los cebadores son sintetizados por una
polimerasa de ARN llamada primasa. La mayora de las polimerasas usadas en
biologa molecular se originan de bacterias o de sus virus infecciosos
(bacterifagos o fagos).Solo discutiremos polimerasas procariotas en esta
revisin. Las propiedades funcionales y estructurales de polimerasas eucariotas
de ADN, las cuales son especificas para ADN de la cromatina embebido son
revisadas en otro lado (Frouin et al. 2003; Garg and Burgers 2005).
Una breve descripcin, requerimientos, actividades enzimticas y principales
aplicaciones de las polimerasas ADN presentadas en esta seccin son resumidos
en la tabla 1.
Polimerasas procariotas ADN
En las bacterias, tres polimerasas de ADN actan en conjunto para lograr la
replicacin del ADN: Pol I, Pol II, y Pol III. Las tres enzimas catalizan de 5 ' 3' la
elongacin de cadenas de ADN en presencia de un cebador y un dNTP, pero su
velocidad de elongacin vara. La ADN Pol III fue descubierta en 1970 (Kornberg y
Gefter 1970) y es el principal complejo de conduccin de replicacin procariota
enzimtica.
Los tres ADN Pol tambin tienen un 3 ' 5' (reverso) actividad exonucleasa,
tambin conocida como la actividad de correccin de pruebas, ya que inicia la
eliminacin de bases incorrectamente aadidas como progreso de la polimeracin.
La actividad de correccin de pruebas aumenta la fidelidad pero atrasa la
progresin de la polimerasa. Adems de la polimerasa de correccin de pruebas y
actividades comunes a los tres polimerasas de ADN, el ADN Pol I tambin tiene
una 5' 3' exonucleasa, que se utiliza para la eliminacin del cebador de ARN a
partir del extremo 5 'de cadenas de ADN, y para la excisin-reparacin (contraria a
la polimerizacin). La actividad 5 ' 3' exonucleasa de la Pol I se utiliza in vitro
para la nick-traduccin (es decir, tcnica de etiquetado en la que algunos de los
nucletidos de una secuencia de ADN se sustituyen con anlogos de la etiqueta).
Pol I y el fragmento Klenow
El nombre de ADN Pol I ha sido utilizado con xito para eliminar los extremos 3 de
ADN que sobresalen (en ausencia de dNTPs), o para rellenar los extremos
cohesivos (en presencia de dNTPs) antes de la adicin de enlazadores

moleculares. Sin embargo, el 5 ' 3' exonucleasa de la ADN Pol I lo hace


inadecuado para todas las aplicaciones que requieren solo actividad de
polimerizacin (por ejemplo, para rellenar los extremos cohesivos antes de la
adicin de enlazadores, o para copiar ADN monocatenario en el mtodo didesoxi
para la secuenciacin). Afortunadamente, se descubri que la digestin
proteoltica de E. Coli ADN Pol I (109 kDa) genera dos fragmentos (76 y 36 kDa).
El fragmento grande, tambin conocido como ADN Pol IK o fragmento Klenow (el
nombre de su inventor, (Klenow y Henningsen 1970)), contiene los 5 ' 3' 3 ' 5'
exonucleasa (correccin) las actividades de la polimerasa y de ADN Pol I, mientras
que el pequeo fragmento exhibe la actividad 5 ' 3' exonucleasa sola. Desde
entonces, las fuentes recombinantes de Klenow mejoraron significativamente la
calidad funcional de este fragmento mediante la eliminacin de contaminaciones
debidas a la presencia de enzima nativa residual en las preparaciones tratadas
proteolticamente.
T4 DNA polimerasa
El bacterifago T4 polimerasa requiere una plantilla y un cebador para exhibir dos
actividades: es un 3 ' 5 ' (reverso) exonucleasa en ausencia de dNTPs, y una 5
' 3 ' de la polimerasa en presencia de dNTPs. A diferencia de la E. Coli ADN Pol
I, T4 ADN Pol no exhibe un 5 ' 3 ' exonucleasa ( Englund 1971 ) . Por lo tanto, el
ADN T4 Pol se puede utilizar en lugar de Klenow para rellenar en extremo 5protuberante de fragmentos de ADN, para la Nick-traduccin, o para el etiquetado
del extremo 3 de dplex de ADN ( de doble hebra ) .La velocidad de T4 DNA Pol
exonucleasa es de aproximadamente 40 bases por minuto sobre el ADN de doble
cadena , y alrededor de 4.000 bases en el ADN de cadena sencilla . La velocidad
de T4 DNA Pol de polimerizacin alcanza 15.000 nucletidos por minuto cuando
se ensaya en condiciones estandarizadas.
T7 ADN polimerasa, bacterifago modificado
Un T7 ADN polimerasa bacteriofago modificado qumicamente, ha sido descrito
por Richardson et al., como una herramienta ideal para la secuenciacin del ADN
(Huber et al 1987; Tabor et al 1987; Tabor y Richardson, 1987). T7 DNA Pol
Bacterifago Modificado es un complejo de dos protenas: el producto de 84 kDa
del gen 5 de T7, y el 12 kDa tiorredoxina de E. coli (Mark y Richardson 1976;
Modrich y Richardson 1975). La protena T7 gen 5 proporciona propiedades
catalticas del complejo, mientras que la protena tiorredoxina conecta la protena
T7 gen 5 a una plantilla de cebador, que permite la polimerizacin de miles de
nucletidos sin disociacin, aumentando as la eficiencia de la polimerasa de T7.
Por lo tanto, T7 DNA Pol modificada tiene una velocidad de polimerizacin de ms
de 300 nucletidos por segundo, lo que hace que sea ms de 70 veces ms
rpido que el de la transcriptasa inversa AMV. As, este complejo enzimtico se
puede utilizar para la preparacin de sondas radiactivas y amplificacin de
grandes fragmentos de ADN.

Adems de la caracterizacin identific una regin de 28 aminocidos (residuos


118-145) como esencial para la T7 DNA Pol 3 ' 5' exonucleasa (Tabor y
Richardson 1989). En mutagnesis in vitro de los nucletidos correspondientes en
el gen 5 de T7 result en la eliminacin completa de la actividad de exonucleasa,
lo que aumenta la eficiencia de la polimerasa (9 veces) y la tasa de mutacin
espontnea (14 veces) (Tabor y Richardson, 1989). El complejo de la polimerasa
T7 mutante / tiorredoxina, sta disponible comercialmente bajo el nombre de
Sequenase (United States Biochemical Corporation), se utiliza para la
secuenciacin de ADN debido a su alta eficiencia y capacidad de incorporar
anlogos de nucletidos (tales como 5 '- (-tio) -dNTPs, DC7-GTP, o dITP utiliza
para mejorar la resolucin de los geles de secuenciacin de ADN, y para evitar la
compresin gel resultante de apareamiento de bases).
Terminal desoxinucleotidil transferasa (nucleotidyl-transferasa ADN, EC
2.7.7.31)
Terminal desoxinucleotidil transferasa (TdT), inicialmente purificada a partir de timo
de ternera (Krakow et al. 1962), es una ADN polimerasa que cataliza la adicin de
una cola de homopolmero a 3'-OH extremos de ADN, de una manera
independiente de la plantilla. TdT se utiliza en la biologa molecular para el
marcaje de extremos 3 'de ADN con nucletidos modificados (tales como ddNTP,
DIG dUTP, o nucletidos radiomarcados), para la extensin del cebador, o para la
secuenciacin de ADN. Tambin se utiliza en TUNEL (TdT dUTP Nick End
Labeling) de ensayo para la demostracin de la apoptosis (Gavrieli et al. 1992).
TdT requiere un cebador de ADN monocatenario en presencia de Mg2 + (mnimo
de tres nucletidos de longitud), pero puede aceptar ADN de doble cadena como
un cebador en presencia de iones de cobalto (Roychoudhury et al. 1976). Sin
embargo, la adicin de Co2+ puede resultar en una relajacin de la estructura
helicoidal del ADN, permitiendo as que el tizn de muescas internas. El uso de
Mg2 + reduce este problema, pero resulta en una disminucin significativa de la
longitud de la cola (aproximadamente una quinta parte de la longitud obtenida en
presencia de Co2 + en enzima idntica: proporciones de ADN). Por lo tanto, la
optimizacin de las condiciones de incubacin es crtico para controlar la
especificidad, reactividad, y la actividad de TdT.
ADN polimerasas termoestables
Aunque ADN polimerasas termoestables se purificaron a principios de los aos
setenta, su considerable inters para la clonacin molecular emergi desde el
desarrollo de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) y la subsiguiente
necesidad de enzimas capaces de realizar la sntesis de ADN a alta temperatura.
Desde polimerasas termoestables son funcionales a alta temperatura, que puede

replicar regiones de ADN con alto contenido de G / C, similar a los encontrados


con frecuencia en organismos termfilos (alto C / secuencias de contenido de G
formar estructuras secundarias que necesitan ser desnaturalizado correctamente
en orden para ser eficiente copiado).
Bst polimerasa
Bst polimerasa termoestable es una ADN PolI que se aisl en 1968 (Stenesh et al.
1968) de la bacteria termfila Bacillus stearothermophilus (Bst), que prolifera entre
39 y 70 C. Bst Pol I es activa a una temperatura ptima de 65 C, y se inactiva
despus de 15 minutos de incubacin a 75 C. Bst Pol I posee un 5 ' 3'
actividad exonucleasa y requiere alta concentracin de Mg2 + para la actividad
mxima.
La digestin con proteasas de Bst ADN Pol I genera dos fragmentos de protenas.
El gran fragmento de protena de Bst ADN Pol I es termoestable, y por lo tanto
muy til para reacciones de secuenciacin realizadas a 65 C para evitar
problemas debidos a la formacin de horquilla. Como Klenow, el fragmento grande
de Bst ADN Pol I muestra un desplazamiento ms rpido hebra que su contraparte
de cuerpo entero. Recombinante Bst ADN Pol I es actualmente disponible de
Epicentre Biotecnologas, que tambin comercializa el fragmento grande de rbSt
ADN Pol I bajo el nombre IsoTherm .
Taq polimerasa
Taq polimerasa se purific por primera vez en 1976 (Chien et al. 1976) a partir de
una bacteria descubierta 8 aos antes en la regin de Gran Fuente de Parque
Nacional de Yellowstone (Brock y Freeze 1969). Esta bacteria, que prospera a 70
C y sobrevive a temperaturas tan altas como 80 C, fue nombrado Thermophilus
aquaticus (T. aquaticus o Taq). Taq polimerasa tiene una vida media de 40 min a
95 C, y 5 min a 100 C, lo que permite la reaccin de PCR. Para la actividad
ptima, Taq polimerasa requiere Mg2 + y una temperatura de 80 C.
Taq polimerasa carece 3 ' 5' exonucleasa actividad (revisin), y por lo tanto a
menudo se describe como una enzima de baja fidelidad (tasa de error entre 1
10-4 y 2 10-5 errores por par de bases, dependiendo de las condiciones
experimentales) . Sin embargo, se debe tener en cuenta que esto corresponde a
una muy buena precisin (inversa de la tasa de error) desde 45.000 nucletidos
pueden ser incorporados en las hebras de ADN recin sintetizadas antes de que
ocurra un error.
Al igual que otras ADN polimerasas que carecen de 3 ' 5' exonucleasa, Taq
polimerasa exhibe una actividad de transferasa desoxinucleotidil que es

responsable de la adicin de unos pocos residuos de adenina en el extremo 3 'de


productos de PCR.
Ms tarde, las ADN polimerasas termoestables adicionales se han descubierto y
comercializado (ver abajo). Estas enzimas tienen una mayor precisin que la Taq
originales. Sin embargo, el trmino "Taq" es comnmente usado en lugar de "ADN
polimerasa termoestable", de ah el trmino errneo "de alta fidelidad Taq", utiliza
a menudo en los laboratorios.
Tth polimerasa
Tth polimerasa, aislada de Thermus thermophilus HB8 (Ruttimann et al. 1985), es
de 94 kDa polimerasa termoestable que carecen de 3 ' 5' exonucleasa actividad
(revisin). Tth polimerasa cataliza la polimerizacin de nucletidos en el ADN
dplex a partir de una plantilla de ADN (ADN polimerasa) en presencia de Mg2 +,
y a partir de una plantilla de ARN en presencia de Mn2 + (transcriptasa inversa).
ADN polimerasas termoestables con actividad correctora
Varios ADN polimerasas aisladas de organismos termfilos exhiben ' 5' actividad
(correccin) 3 exonucleasa, lo que aumenta la fidelidad. Entre ellos, ADN
polimerasa a partir de la arqueobacteria Pyrococcus furiosus (Pfu) tiene una tasa
de error (1,6 10-6) 10 veces menor que la de Taq polimerasa. Se puede adquirir
en numerosos proveedores.
Pow polimerasa (aislada de Pyrococcus woesei) tiene una vida media mayor que 2
h a 100 C y una tasa de error muy bajo de 7,4 10-7. Pow polimerasa
proporciona altos rendimientos de PCR slo para plantillas de menos de 3,5 kb.
Para eludir PCR limitacin de tamao de producto, una mezcla de Taq y Pow ADN
polimerasas ha sido comercializado por Roche Molecular Qumicos (bajo el
nombre "Expand High Fidelity"). Este sistema permite la amplificacin y la
clonacin de largos tramos de ADN (20-35 kb), y representa una herramienta
nica para el anlisis y la secuenciacin de grandes genes eucariotas, o la
introduccin de grandes fragmentos de ADN en fagos lambda o vectores
csmidos.
Polimerasa Vent (tambin conocido como Tli polimerasa desde aislada de
Thermococcus litoralis) tiene una tasa de error comprendida entre la de Taq y Pfu.
Polimerasa Vent tiene una vida media de 7 h a 95 C. Se comercializa por New
England Biolabs, junto con una versin modificada que carece de actividad
exonucleasa (correccin de pruebas).
Dos ADN polimerasa (Pol I y II) que presentan un ' 5' actividad exonucleasa 3
correccin de pruebas tambin se aislaron a partir de Pyrococcus abyssi

(Gueguen et al., 2001). ADN polimerasa Pol I de P. abyssi (Pab), comercializado


por Qbiogen como "Isis ADN polimerasa", tiene una tasa de error (0,66 10-6)
similar a la de Pfu. Sin embargo, Pab es ms termoestable que Pfu o Taq (Pab
tiene una vida media de 5 horas a 100 C), por lo tanto, ser muy til para llevar a
cabo reacciones de PCR que implican incubaciones de alta temperatura.
La mayora de las ADN polimerasas y transcriptasas inversas (descritas a
continuacin) estn disponibles comercialmente en "Hot Start" (o equivalente)
versin. Modificacin Hot Start est dirigido a la prevencin de eventos no
especficos cebado como molde / iniciador de hibridacin o cebador formacin
dimmer, que se producen en condiciones de baja rigurosidad (durante la
preparacin de la PCR). Eventos de cebado no especficos generan productos
secundarios durante la preparacin y en el primer ciclo de la PCR, y se amplifican
an ms en los ciclos posteriores. Tecnologa Start caliente introduce una
"barrera" entre las estructuras secundarias y el sitio de unin al ADN polimerasa.
La "barrera", que puede ser un anticuerpo, un oligonucletido, o una modificacin
qumica reversible de aminocidos de la polimerasa, se libera de la enzima
durante el primer ciclo la desnaturalizacin de la PCR, restaurando as la actividad
enzimtica slo despus de la desnaturalizacin de estructuras secundarias.
Modificaciones de arranque en caliente son muy eficientes en la limitacin de la
actividad de la polimerasa a temperatura ambiente, y de ese modo facilitar la
preparacin de PCR tiempo que mejora la especificidad de la PCR.
La transcriptasa inversa (ADN polimerasa dependiente de ARN EC 2.7.7.49)
Hasta los aos 1960, se pensaba que la transferencia de informacin gentica a
fluir unidireccionalmente del ADN al ARN (Crick 1958). Caracterizacin de la
transcriptasa inversa (RT) de Rous Sarcoma Virus (RSV) virus (Temin y Mizutani
1970) y Rauscher la leucemia (RLV) (Baltimore 1970) ejemplifica que el ADN de
cadena sencilla puede ser sintetizado a partir de una plantilla de ARN. El ADN
monocatenario resultante es una copia "complementaria" de la plantilla de RNA, o
cDNA.
Las principales caractersticas de las transcriptasas inversas discutidos en esta
seccin se resumen en la Tabla 2.

Tabla 2 Transcriptasa inversa principal utilizada en biologa molecular


Enzima

Requerimientos

Actividad

transcriptasas

Plantilla de ARN

RT

Principales
aplicacin/notas
Sntesis de ADNc

inversas
cebador
AMV / MAV
RT
RT MuLV
Plantilla de ARN
cebador

RNasa H

a partir de ARN
(RT-PCR)

RT
RNasa H

RT-PCR
para
transcripciones
largas

transcriptasas plantilla
Tth
Inversa
termoestable

RT
en
presencia
de Mn2 +
Pol ADN en
presencia
de Mg2 +

PCR o RT-PCR,
dependiendo de
la
composicin
del tampn

MonsterScript
RT

cebador
Mn2 +

plantilla

Terma
de plantilla
Fragmento
Klenow de C.

cebador

RT, ninguna RT-PCR


para
actividad
transcripciones
RNasa H
largas
RT

RT-PCR

cebador
Mg2 +

Acontecimientos naturales de la transcriptasa inversa


Transcriptasas- inversas Virales
RSV y RLV pertenecen al grupo de Retroviridae (retrovirus). El ciclo de vida de los
retrovirus incluye una transcripcin dirigida-RT de su genoma de ARN y una
formacin de una molcula de doble cadena de ADN proviral, que est integrado
en el genoma del husped. La descendencia viral infecciosa se produce a partir de
la transcripcin proviral de ADN.
Muchos virus contienen una etapa de transcripcin inversa en su ciclo de
replicacin. Metaviridae est estrechamente relacionada con los retrovirus y
existen como retrotransposones en el genoma del husped eucariota. Los
retrotransposones son elementos mviles que amplifican (multiplican) a travs de

las molculas de ARN, que son intermedios transcritos inversos e integrados en


nuevos lugares en el genoma del husped.
Ejemplos de metaviridae incluyen la Saccharomyces cerevisiae Virus Ty3, virus
gitana Drosophila melanogaster, y Ascaris lumbricoides virus Tas.
Pseudoviridae (por ejemplo, el virus de Saccharomyces cerevisiae Ty1 y
Drosophila melanogaster virus copia) han segmentado un genoma de ARN de
cadena simple.
Hepadnaviridae (como el virus de la hepatitis B (Seeger y Mason 2000)) han
hecho un genoma de dos hilos desiguales de ADN que existen como tramos tanto
individuales y dobles ADN de cadena circular. La polimerasa viral, que cataliza el
ARN dependiente de ADN y la sntesis de ADN, posee tanto RNasa H y
actividades de cebado de protenas. Tras la infeccin, el ADN circular relajado se
convierte en un ADN circular que se transcribe por la ARN anfitrin polimerasa.
Este ARN "pre-genmico" es retrotranscrito en ADNc mediante la RT viral para dar
lugar a las hebras de ADN genmico viral.
Caulimoviridae son virus que infectan plantas no envueltas, incluyendo la coliflor
(virus mosaico de la coliflor) y soja (soja virus del moteado clortico). Tras la
infeccin, el ARN viral poliadenilado se transcribe inversamente por la RT viral
para dar lugar a molculas de ADN de doble cadena genmicas. El ARN Viral
tambin se utiliza para la sntesis de protena viral en el citoplasma de las clulas
infectadas. Aunque el ciclo de vida de Caulimoviridae se asemeja a la de
retrovirus, la replicacin de Caulimoviridae no implica la integracin de material de
ADN en el husped genoma.

Transcriptasas inversas no virales


Los transposones. Casi todos los organismos contienen cantidades variables de
ADN mvil del repetidor conocido como elementos trasladables (ET) o
transposones. Los ET constituyen ms del 80% de la genoma total de en las

plantas, mientras que representa alrededor del 45% del genoma humano. La
clasificacin de Finnegan (Finnegan 1989) distingue los transposones ARN (Clase
I o retrotransposones), que amplifican a travs de un tipo de "copiar y pegar" de
transposicin, y transposones de ADN (clase II), que utilizan una Tipo de
transposicin "cortar y pegar". Sin embargo, la ms reciente clasificacin de
Wicker tiene en cuenta el reciente descubrimiento de las bacterias y eucariotas ET
que copian y pegan sin intermediarios de ARN, y de nuevo en elementos
transponibles miniatura de repeticin invertida (MITEs) (Wicker et al. 2007).

Los retrotransposones, que constituyen el 42% de los recursos del genoma


humano, codifican una RT utilizado para hacer una copia de ADNc de un ARN
intermedio, que se produce despus de la transcripcin de la retrotransposon
integrado en el genoma.
La telomerasa. Los telmeros son no codificantes, secuencias lineales que tapan
los extremos de las molculas de ADN en cromosomas eucariotas. Los telmeros
son de hasta 2000 repeticiones de tramos TTAGGG. En las clulas normales, la
replicacin del ADN maquinaria no puede duplicar la telomrica completa de ADN.
Como resultado, los telmeros se acortan despus de cada divisin celular
Despus de haber alcanzado una longitud crtica, los telmeros se reconocen
como las lesiones del ADN hebra de quiebre dobles, y las clulas eventualmente
entran senescencia.
En las clulas madres embrionarias y adultas, que tienen una vida til prolongada,
la longitud de los telmeros se mantiene a travs la activacin de la telomerasa.
La telomerasa es un complejo ribonucleoproteico que contiene un ARN (ARN
telmeros de componentes, o TERC) y un RT (transcriptasa inversa de los
telmeros, o de TERT). El ARN proporciona la plantilla AAUCCC que dirige la
sntesis de repeticiones de

TTAGGG por la RT. Curiosamente, la telomerasa

tambin se activa durante la carcinognesis (Raynaud et al., 2008).


La transcriptasa inversa para la biologa molecular

El uso de RT en biologa molecular fundamental y aplicada ha sido impulsado por


la introduccin de la polimerasa de transcripcin inversa en cadena (RT-PCR).
Como resultado, las fuentes comerciales de RT ha florecido en las ltimas dos
dcadas.
Debido a los RTs se ven privados de 3 ' 5' exonucleasa (correccin de pruebas)
la actividad, tiene la fidelidad mucho menor que el DNAdependiente que ADN
polimerasas. Por ejemplo, la RT del VIH tiene una tasa de error de 1 mutacin por
1.500 nucletidos, mientras RT de origen aviar y marino generan 1 mutacin por
cada 17.000 y 30.000 nucletidos, respectivamente (Arezi y Hogrefe 2007;
Roberts et al. 1998).

AMV / MAV RT
Los RT ms utilizados en biologa molecular es la que permite la replicacin del
aviar Myeoloblastosis Virus (AMV), un retrovirus alfa que induce myeoloblastosis
en el pollo (Baluda et al. 1983). Curiosamente, la clonacin de la AMV genoma
identific el oncogn v-myb como responsable de intensa proliferacin de
mieloblastos transformadas. La insercin de secuencias oncognicas-V myb en el
genoma AMV interrumpe la secuencia codificante de la RT, con la AMV RTdeficiente. Como todos los virus deficientes, AMV depende de un virus auxiliar
para su replicacin. El ayudante AMV, la Myeoloblastosis virus asociado (MAV), es
de hecho la Fuente "real" de la RT en el ciclo de vida de AMV, y para la biologa
molecular (Perbal 2008).
El AMV / MAV RT se compone de dos subunidades estructuralmente relacionados
y designados (65 kDa y 95 kDa, respectivamente). La subunidad de la
enzima RT y ofrece actividades de RNasa H. La actividad RT requiere la presencia
de un cebador y una plantilla (Leis et al 1983;. Verma 1977). AMV / MAV RT es
ampliamente utilizado para copiar mensajes totales

de ARN usando polidT o

cebadores aleatorios. Actividad de RNasa H es generada por escisin proteoltica


de la subunidad y se asocia con un fragmento de 24 kDa.
RNasa H es una exoribonuclease processive que degrada ARN especficamente
hebras en los hbridos de ADN -ARN en cualquiera 5 ' 3' o 3 ' 5' direcciones.
En el uso de la transcriptasa inversa se ha encontrado muchas aplicaciones en la
clonacin molecular, dos bien documentados siendo ejemplos la sntesis de ADNc
a partir de ARN en el preparacin de bibliotecas de expresin, como un primer
paso para PCR cuantitativa, y para la secuenciacin de nucletidos. Varios
protocolos tienen establecer condiciones ptimas para altos rendimientos
reacciones (Berger et al. 1983), o para la sntesis de gran Plantillas de ARN
(Retzel et al. 1980).

RT MuLV
El gen pol del virus de la leucemia murina de Moloney (M-MuLV) codifica una
endonucleasa de ADN que carece de actividad RT, y que presenta una actividad
RNAsa H menor de AMV / MAV RT (Moelling 1974). M-MuLV RT es 4 veces
menos eficiente, y Por lo menos 4 veces menos estables que los de AMV / MAV
RT. Por lo tanto, los rendimientos comparables de la sntesis de ADNc requieren
de seis a ocho veces ms M-MuLV RT de AMV / MAV RT. Sin embargo, MMuLV
RT es capaz de generar transcritos ms largos que los que hace AMV / MAV RT
cuando se usa en exceso (Houts et al. 1979).
Transcriptasas inversas termoestables
Varios

RTs

identificados

en

organismos

termfilos

estn

disponibles

comercialmente y son tiles en ciertas condiciones desafiantes (por ejemplo, para


transcribir plantillas con alto contenido de CG o abundantes estructuras
secundarias).

Thermus thermophilus (Tth) es una ADN polimerasa (ver anteriormente) que de


manera eficiente transcribe inversamente ARN en la presencia de MnCl2. Tras la
quelacin de los iones Mn2 +, su Actividad ADN polimerasa permite la
amplificacin por PCR en la presencia de MgCl2.
El epicentro del MonsterScript RT es una Mg 2 + -dependiente RT termoestable
que carece de actividad RNasa H, y es totalmente activa a temperaturas de hasta
65 C. De acuerdo a su fabricante, esta enzima puede producir ADNc ms grande
que 15 kb.
El fragmento de Klenow de hydrogenoformans Carboxydothermus (C. therm.)
Polimerasa es una Mg2 + -dependiente RT que es activo a temperaturas de hasta
72 C. Se comercializa por Roche (C. termia. Mix) para RT PCR utiliza. Thermo-X
RT de Invitrogen tiene una vida media de 120 min a 65 C, la cual es la ms
alta estabilidad informado hasta el momento.
RNA polimerasa (ADN polimerasas dependientes de ARN-)
ADN-polimerasas dependientes de ARN catalizan la 5 ' 3' elongacin de copias
de ARN a partir de plantillas de ADN, un proceso de llamado transcripcin. Al igual
que las ADN polimerasas que carecen de exonucleasa correccin, ARN
polimerasas puede aadir una base extra en el extremo de una transcripcin.
Las dos polimerasas de ARN principales utilizadas en biologa molecular son el
ARN polimerasas SP6- y T7. La ARN polimerasa SP6 es un polipptido de 96 kDa
purificada a partir de SP6 bacterifago infectadas por Salmonella typhimurium LT2
(Butler y Chamberlin 1982), mientras que T7 RNA polimerasa es un polipptido
kDa 98 (Stahl y Zinn 1981) producido por la Bacterifago T7 (Chamberlin et al.
1970). Las ARN polimerasas se utilizan para la sntesis in vitro de ARN antisentido transcripciones (Melton et al. 1984), la produccin de ARN marcado
sondas, o para el mapeo de proteccin de RNasa (Zinn et al. 1983).
SP6 y T7 ARN polimerasas son enzimas similares: ambos requieren Mg2 + y una
plantilla de ADN de doble cadena, y son estimuladas en gran medida por la

espermidina y la albmina de suero (Butler y Chamberlin 1982). Adems, el ARN


polimerasa T7 tpicamente requiere la presencia de ditiotreitol en tampn de
reaccin.
Las polimerasas SP6 y T7 ARN son promotores extremadamente especficos y se
transcriben cualquier secuencia de ADN clonado corriente abajo de su respectivo
promotor (SP6 y T7). Es importante destacar que, la polimerasa SP6- o T7 RNA de
transcripcin procede a travs de tramos de poli (A) (Melton et al. 1984), y por lo
tanto puede progresar alrededor de una plantilla circular varias veces antes de
disociar. Por lo tanto, la linealizacin de la plantilla antes de la traduccin (se
recomienda un voladizo roma o 5 ' (Schenborn y Mierendorf 1985)) con voluntad
de garantizar una eficiente terminacin de la transcripcin. El ARN producido bajo
estas condiciones es biolgicamente activo (Krieg y Melton 1984) y puede ser
adecuadamente empalmado (Green et al. 1983).

Ligasas
Las principales caractersticas de las ligasas discutidass en este seccin se
resumen en la Tabla 3.
Las ADN ligasas (EC 6.5.1.1 y 6.5.1.2 para ATP y + NAD ADN ligasas, repectively)
las ADN ligasas conectan fragmentos de ADN para catalizar la formacin de un
enlace fosfodister entre un 3'-OH y un grupo fosfato 5 'en un descanso de una
sola hebra de cadena doble ADN (Lehman 1974).
En las clulas, las ADN ligasas son esenciales para la unin de los fragmentos de
Okazaki durante la replicacin, y en el ltimo paso del proceso de reparacin del
ADN. Las ligasas de ADN se utilizan en la biologa molecular para unirse a
fragmentos de ADN con extremos romos o pegajosos tales como los generados
por la digestin con enzimas de restriccin, aaden enlazadores o adaptadores al
ADN, o mellas de reparacin.
Las ADN ligasas operan en una reaccin de tres pasos. El primer paso implica la
creacin de una ciclasa-ligasa intermedia, en el que se crea un enlace fosfoamida
entre un residuo de lisina y una molcula de AMP de la enzima cofactor (ATP o
NAD +). En segundo lugar, el AMP se transfiere al extremo 5'-fosfato de la mella

de ADN para formar un ADN-ciclasa (AppDNA). Por ltimo, un ataque nucleoflico


del extremo 3 'del nick ADN dirigido a los resultados de AppDNA en unin de los
dos polinucletidos y liberacin de AMP.
Tabla 3 ligasas principales utilizados en biologa molecular
Enzima
ADN ligasas
T4 - ADN ligasa
ADN ligasa de E. coli

Requerimiento
s
Mg2+
ATP
Mg2+
NAD+

ADN termoestable
Ligasas (varias
fuentes )
ligasas de ARN
T4 ARN ligasa 1
ATP

T4 ARN ligasa 2
(T4 Rnl - 2 )
T4 truncado

Actividad

Mas aplicaciones

Se conecta a extremos romos y


cohesivos en dplex de ADN,
ARN o hbridos de ADN/ARN.
Se conecta a extremos del ADN
de doble hebra preferentemente
cohesivos, activo en extremos
romos de ADN en presencia de
Ficoll o polietilenglicol.
Ligacin a alta temperatura.

Ms frecuentemente
utilizado para la
clonacin.
Ligadura de un
contundente final o
ligadura de ARN /
ADN debe ser evitado

Se liga los cidos nucleicos de


cadena sencilla y polinucletidos
a las molculas de ARN
Se liga al ARN de doble cadena
o conecta dsRNA a dsDNA.

ATP

RNL2

Se liga al extremo 5 preadenilado de ADN o al extremo


5 de molculas de ARN.

No es un sustituto de
la T4 o E. Coli
ligasas , sino que se
utiliza para especficas
tcnicas como la LCR

Etiquetado ARN, la
extensin del cebador
Nicks de reparacin
en dsRNA
Ligadura enlazador
optimizado para la
clonacin de
microRNAs

Las observaciones originales sugirieron que las ADN ligasas bacterianas usan
NAD + como cofactor donde como las ligasas de ADN de los eucariotas, virus y
bacterifagos utilizan ATP (Doherty y Wigley 1999; Timson y Wigley 1999). Sin
embargo, se sabe ahora que algunos ligasas pueden aceptar ya sea un cofactor, a
pesar de que ambos cofactores no son igualmente eficientes (Nakatani et al 2000;
Rolland et al., 2004).
ADN ligasas no termoestable
Los ms pequeos de ADN ligasas conocidos son la ADN ligasa dependiente de
ATP provenientes del virus Chlorella y bacterifago T7 (34 y 41 kDa,
respectivamente). Son mucho ms pequeos que ligasas de ADN eucariotas, que
pueden alcanzar 100 kDa de tamao. Mientras T7 y chlorella-codificado ATPdependiente ligasas ambos contienen slo un nucleotidyl -transferasa dominio y

un dominio OB-cambio (Agrawal y Kishan 2003; Arcus 2002; Theobald et al 2003),


las ligasas eucariticas contienen dominios adicionales que incluyen dedos de zinc
y BRCT (porcin C -terminal de BRCA - 1) dominios con seales de localizacin
nuclear o mitocondrial (Martin y MacNeill 2002).
La ligasa se utiliza con mayor frecuencia en la biologa molecular es la ADN
ligasa del bacterifago T4. DNA ligasa de T4 es un monmero de 68 kDa que
requiere Mg2 + y ATP como cofactores. DNA ligasa de T4 se puede conectar
extremos romos y cohesivos, o reparar nicks de cadena sencilla en dplex
hbridos de ADN, ARN, o ADN/ARN.
La ligasa de ADN de E. Coli trabaja preferentemente en los extremos de ADN de
doble cadena cohesivos. Sin embargo, tambin es activo en extremos romos de
ADN en presencia de Ficoll o polietilenglicol. Los hbridos tales como ADN-ARN o
ARN-ARN no se forman de manera eficiente por ADN ligasa de E. coli. Esto se
puede utilizar como una ventaja cuando la ligadura de ADN de cadena doble se
requiere y ligacin de extremos romos debe ser evitado.
Dado que la actividad ADN ligasas 'dependen de varios factores (tales como la
temperatura, la concentracin de fragmento, la naturaleza de fragmentos extremos romos o pegajosos, la longitud de extremo cohesivo, la estabilidad de
hidrgeno estructura unida -), es difcil presumir las condiciones de incubacin
ideal para una ligacin especfica. Por ejemplo, la ligadura de los fragmentos
generados por Hind III es 10-40 veces ms rpido que el de fragmentos
generados con Sal I (a pesar de que ambas enzimas generan fragmentos
pegajosos). Por estas razones, la definicin de la unidad de ligasa es muy
especfica: una unidad de ligacin se define por la mayora de los proveedores
como la cantidad de enzima que cataliza 50% de ligacin de fragmentos de Hind
III de ADN lambda en 30 min a 16 C en condiciones estndar.
La mayora de los protocolos de ligacin estndares recomiendan la incubacin
de la reaccin de ligacin durante la noche a 16 C. Sin embargo, los protocolos
de ligacin deben ser optimizados para cada ligadura empricamente y de acuerdo
a la cantidad de ADN presente en la reaccin (aunque la mayora de los
proveedores dan directrices de acuerdo al volumen de reaccin y no a la
concentracin de ADN).
Por lo general, se ha reportado la ligadura acertada con T4 ADN ligasa ha sido
reportada con incubacin variando de 10 min a temperatura ambiente a las 24 h a
4 C.

Adems, es una buena prctica para verificar la actividad de una

preparacin ligasa que se mantiene a 20 C para un largo perodo de tiempo,


realizando una prueba peridica de la ligadura. La prueba tpica para la ligadura
de extremos pegajosos se realiza con Digerido con Hind III ADN. Para ligaciones

de extremosterminantes/despuntados , el mismo procedimiento se puede utilizar


con el ADN digerido con Hae III .
Ligasas de ADN termoestables
Las ligasas de ADN Termoestables pueden realizar la ligadura

dplex de

molculas y reparacin de solo nicks a rangos de temperaturas desde 45 hasta


80 C. son altamente especficos y estn muy bien adaptado para aplicaciones
que necesitan alta rigurosidad de ligaduras.
La ADN ligasas termoestables estn aisladas de diversas fuentes, como Thermus
thermophilus (Takahashi et al. 1984), Bacillus stearothermophilus (Brannigan et al.
1999), termo scotoductus (Jonsson et al. 1994), y Rhodothermus marinus
(Thorbjarnardottir et al., 1995). Las Ligasas de ADN termoestables generalmente
no son un sustituto para T4 o e. Coli ADN ligasas pero se utiliza para tcnicas muy
especficas, como la reaccin en cadena de la ligasa (LCR).
LCR es una tcnica utilizada para detectar mutaciones base individuales: es una
cartilla sintetizado en dos fragmentos que cubren ambos lados de una posible
mutacin. La Ligasa termoestable conectar los dos fragmentos slo si coinciden
exactamente con la plantilla secuencia. Posteriores reacciones de PCR se
amplificar slo si el primer est ligado
Ligasas de RNA (EC 6.5.1.3)
Las Ligasas de RNA catalizan la formacin de ATP dependiente de enlaces
fosfodister entre 5-fosfato y terminacin 3-OH de ARN monocatenario o ADN.
En las clulas actan principalmente para volver a sellar los ARN rotos. Como el
ADN ligasas, lAs ARN ligasas operan en una reaccin de tres pasos (Silber et al.
1972; Sugino et al. 1977). En primer lugar, la ligasa RNA reacciona con el ATP a
intermedio, que forma un ligasa covalente-(lysyl-N)-AMP y pirofosfato. Entonces la
parte de la AMP de la ligasa adenilato se transfiere al extremo 5 '-fosfato de la
ARN para formar un RNA-adenilato intermedio (AppRNA). En el tercer paso, un

ataque nucleoflico del extremo 3 '-OH de el RNA en el AppRNA crea un enlace


fosfodister, que sella los dos extremos del RNA.
T4 RNA ligases
La ligasa de RNA mejor caracterizado es el bacterifago T4 Ligasa del RNA
(gp63), que fue identificada en el T4-infectados E. Coli. Ligasa T4 RNA tambin es
el ARN comnmente ms utilizado en biologa molecular. T4 RNA Ligasa 1 se
utiliza para ligar solos cidos nucleicos trenzados y polinucletidos a molculas de
ARN, generalmente para etiquetar molculas de RNA a la terminacin 3 '- l para
el anlisis de la estructura del RNA,mapeo de sitio de unin de protenas,
amplificacin rpida de extremos de ADNc (RLM-raza)(Liu y Gorovsky, 1993;
Maruyama y Sugano 1994),ligadura de adaptadores oligonucletidos de cDNA
(Tessier et al.1986; Zhang y Chiang 1996), la sntesis de oligonucletidos(Kaluz et
al. 1995), las modificaciones del nucletido 5 de nucleicoscidos (Kinoshita et al.
1997) y por extensin de imprimacin para polimerizacin en cadena.
Ligasa T4 RNA tambin puede utilizarse para circularize RNA y las molculas de
ADN. Esta enzima es utilizada en Ambion deprimera opcin RLM-RACE Kit
para etiquetar los extremos 5 demRNA con adaptador de oligonucletidos. Una
segunda ligasa RNA codificada por el bacterifago T4 recientemente ha sido
descrita (Ho y Shuman, 2002). T4 Cataliza ligasa RNA 2, tambin conocido como
T4 Rnl-2 (gp24.1), ligadura de filamento de RNA intramolecular tanto
intermolecular. A diferencia de la ligasa de T4 RNA 1, ligasa T4 RNA 2 es mucho
uniendo ms activo mellas en RNA trenzado doble que en uniendo los extremos
del ARN trenzado simple. Ligasa T4 RNA 2 ligates 3-OH5-fosfato RNA mellas y
tambin puede ligar 3 '-OH de ARN a los 5-fosfato del ADN en una doble
estructura trenzado (Nandakumar et al. 2004; Nandakumar
y Shuman 2004). Una forma truncada de ligasa T4 RNA 2 (T4 truncado RNL2,
tambin conocido como RNL2 1 249) es comercializado por New England
Biolabs. Truncado T4 RNL2, amino primera 249 cidos de la longitud total T4 RNA
ligasa 2 (Ho y Shuman 2002), es incapaz de realizar el primer paso de adenylation
de la reaccin de ligadura. As, la enzima no requiere ATP Pero necesita el

sustrato pre-adenylated para concreto ligates pre-adenylated fin de 5 de DNA o


RNA 3 final de Molculas de ARN (Ho y Shuman, 2002; Nandakumar et al. 2004).
RNL2 T4 truncado reduce la ligadura de fondo porque selecciona adenylated
cartillas. Esta enzima puede ser uso de la ligadura del vinculador optimizado para
la clonacin de microRNAs Aravin y Danziger 2005; Pfeffer et al. 2005).
Tambin se ha identificado una ligasa de RNA marco de codificacin en el gene
pnkpnl (ORF 86) de los baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus
(ACNV) (Durantel et al. 1998; Martins y Shuman 2004a) y de la radiationresistant
bacteria Deinococcus radiodurans (Dra) (Martins y Shuman 2004b). DraRnl ligates
3 '-OH5-fosfato Mellas de RNA que pueden ocurrir en cualquier RNA dplex o en
Hbridos RNADNA. Sin embargo, no puede ligar nicks en ADN las molculas,
como lo requiere un ribonucleotido 3 '-OH.
Ligasas de RNA termoestables
Las ligasas RNA Termoestables han sido aislados de los bacterifagos rm378 y
TS2126 que infecta a la eubacteria rhodothermus marinus y bacteria thermus
scotoductus respectivamente.
Retiro y transferencia de fosfato
Las principales caractersticas de las enzimas utilizadas para transferencia de
fosfato y el retiro en biologa molecular discutidas en esta seccin se resumen en
la tabla 4.
Fosfatasa alcalina (EC 3.1.3.1)
La fosfatasa alcalina se purifica por e. Coli u organismos superiores (ejemplo:
intestino de ternera). Se utiliza para el retiro de grupos 5 '-fosfato de cidos
nucleicos a fin de prevenir la recircularizacion de los vectores de ADN en
experimentos de clonacin. La fosfatasa alcalina no hidroliza los enlaces
fosfodister.
Aunque las fosfatasas alcalinas del intestino de e. Coli y becerro tienen diferentes
estructuras (80 y 140 kDa, respectivamente), ambas enzimas son protenas que
contienen zinc y magnesio (Reid y Wilson 1971). Ellas son inactivadas por agentes
quelantes como EGTA y por bajas concentraciones de fosfato inorgnico. Lo
importante, es necesario retirar los fosfatos inorgnicos despus de las

endonucleasa de restriccin y antes de la incubacin con fosfatasa alcalina. Los


fosfatos inorgnicos se eliminan sin duda si la clonacin estratgica implica la
migracin del gel y purificacin del vector lineal. Si ninguna purificacin es hecha,
la dilisis de endonucleasa requieren el ADN digerido antes del tratamiento de la
fosfatasa alcalina (precipitacin de etanol no eficientemente elimina los fosfatos
inorgnicos). Asimismo, etiquetando fragmentos de ADN en el extremo 5 ' (p.ej.
32P etiquetado), la incubacin con fosfatasa alcalina tiene que preceder a la
incubacin con el polinucletido cinasa en la presencia de 32P trifosfato de
desoxinuclesido.
T4 polinucletido cinasa (polinucletido Cinasa 5'- hidroxi , EC 2.7.1.78 )
Polinucletido cinasa cataliza la transferencia de un grupo fosfato a partir de una
molcula de ATP al extremo 5'- OH de un cido nucleico (ADN o ARN, sin
limitaciones de tamao) , el intercambio de grupos 5'- fosfato ( Berkner y Folk
1980 ; Chaconas y Van de Sande 1980 ) , o la fosforilacin de extremos 3 'de
mononucletidos . Codificada por el gen T pse del bacterifago T4 (Depew et al
1975), la polinucletido cinasa de T4 es un tetrmero de cuatro monmeros
idnticos de 33 kDa (Lillehaug 1977 ; Panet et al 1973) . La Polinucletido cinasa
se utiliza comnmente para experimentos de marcaje con ATP radiomarcado
utilizado como un donador de fosfato. La actividad de transferencia de fosfato es
ptima a 37 C, pH 7.6, en presencia de Mg2 y reactivos reductores (DTT o 2
-mercaptoetanol ), y con un mnimo de 1 mM ATP y una proporcin de 5: 1 de ATP
sobre los extremos 5'- OH (Lillehaug et al. 1976). Cuando la concentracin de
sustrato es limitado, la adicin de 6 polietilenglicol (PEG 8000 ) en la mezcla de
reaccin aumenta el radiomarcador de empotrada, que sobresale , y contundente
el extremo 5'- del ADN (Harrison y Zimmerman 1986 ). Cuando se utiliza la ATP
radiomarcado (por ejemplo 32P-ATP), la polinuclotido cinasa genera la etiqueta
de molculas de DNA o RNA con 32P en sus extremos 5, catalizando cualquier
fosforilacin directa de 5-OH, grupos generados despus de la digestin de la
fosfatasa alcalina, o intercambio de los grupos fosfato 5. Esta reaccin es utilizada
eficientemente para el etiquetado de filamentos de ADN o ARN antes de la
secuencia especfica de la base. La polinucletido cinasa tambin se utiliza para
la cartografa de sitios de restriccin , ADN y ARN de huellas dactilares ( Galas y
Schmitz 1978 ; Gross et al. 1978 ; Reddy et al. 1981 ) , y la sntesis de sustratos
para ADN o ARN ligasa ( Khorana et al 1972 ; . Silber et al 1972). Adems de la
actividad de la cinasa que se ha descrito anteriormente, la T4 polinucletido cinasa
tambin exhibe una actividad 3'- fosfatasa (Cameron y Uhlenbeck, 1977). El pH
ptimo para la actividad de la 3'fosfatasa est comprendido entre 5 y 6, es decir,
ms cida que para la actividad de transferencia de fosfato. Basado en esta
propiedad, protocolos que usan T4 polinucletido cinasa como 3 'fosfatasa
especficas han sido desarrollados (Cameron et Al-1978). Un polinucletido cinasa
T4 que carecen de actividad 3'- fosfatasa ha sido purificada a partir de E. Coli
infectado con un

Tabla 4
Enzima

Requerimiento
s
Zn2+, Mg2+

Actividad

Principal aplicacin

Elimina grupos 5'fosfato de los cidos


nucleicos

Para evitar la
recircularizacin de
vectores de ADN en
experimentos de
clonacin

T4 polinucleotido
cinasa

ATP, Mg2+,
Agentes
reductores

Transfiere un grupo
fosfato desde el ATP
a 5'- OH terminal de
un cido nucleico
(pH neutro) 3'fosfatasa (pH cido)

El cido nucleico
etiquetado

Mutante T4
Polinucleotido cinasa

ATP, Mg2+,
Agentes
reductores

Transfiere un grupo
fosfato desde el ATP
a 5'- OH terminal de
un cido nucleico
(pH neutro)

Igual que el
polinucletido cinasa
T4 , pero sin actividad
de 3'- fosfatasa

Hidroliza enlaces
pirofosfato en
puentes tapas
trifosfato

Elimina casquillo del


ARNm (Primer paso
en el etiquetado
5'mRNA )

La eliminacin de
fosfato y la
transferencia alcalina.
Fosfatasa

Tabaco acido
Pirofosfatasa

Bacteriogrago mutante T4 produciendo un producto del gen alterado T1 (Cameron


et al., 1978). Al igual que la enzima de tipo salvaje, la mutante polinucletido
quinasa est hecho de cuatro subunidades de 33 kDa cada una, transfiere
efectivamente el fosfato gamma de ATP al extremo 5'-OH de ADN y ARN. Adems,
los polinucletidos quinasas mutantes y el tipo salvaje requieren concentraciones
de iones de magnesio similares, tienen el mismo pH optima y se inhibe por tanto
fosfato inorgnico. El polinucletido mutante quinasa es muy til cuando la
actividad de la 3'- exonucleasa debe evitarse (por ejemplo, el terminal 5'-32P
etiquetado de 3'-CMP en vista de extremo etiquetado 3 'del ARN especies antes
de la toma de huellas dactilares o secuenciacin).
PIROFOSFATASA CIDA DE TABACO

Pirofosfatasa cida de tabaco se utiliza como un primer paso para el etiquetado de


mRNAs en sus de extremos 5', que generalmente tienen un lmite, a fin de generar
sondas para radiomarcados de secuenciacin de ARN: in vitro, 32P-etiquetado de
ARNm 5' terminal, exige la eliminacin de los 7-metilguanosina y 5'-fosfato restos
del extremo de tope final. Pirofosfatasa cida del tabaco hidroliza el enlace
pirofosfato en el capuchn del puente de trifosfato, la generacin la terminacin de
un 5'-fosfato en la molcula de ARN (que conduce a p7MeG, pp7MeG y ppN- PNARNm). La capucha abierta generado puede entonces ser desfosforilada por la
fosfatasa alcalina, y la etiqueta con T4 polinucletido quinasa utilizando 32P-ATP.
Las Nucleasas rompen los enlaces fosfodister en la columna vertebral de los
cidos nucleicos. Basado en su modo de accin, dos clases principales se han
definido: exonucleasas son activos en el extremo de molculas de cido nucleico,
y

endonucleasas

de

rompen

cidos

nucleicos

internamente.

Las

desoxirribonucleasas del rompen el ADN y genera nicks (punto en una molcula


de ADN de doble cadena donde no hay enlace fosfodister entre los nucletidos
adyacentes de una hebra, tpicamente a travs del dao o la accin de la enzima),
mientras que las ribonucleasas rompen ARN. Las nucleasas son espadas doble
filo para los bilogos moleculares: por un lado, son el peor enemigo para los
acidos nucleicos integridados y, por otro lado, son muy tiles para cortar y
manipular cidos nucleicos para fines de clonacin.
Las principales caractersticas de las nucleasas discutidas
en esta seccin se resumen en la Tabla 5.
Desoxirribonucleasas
Deoxyribonuclease I (DNase I, EC 3.1.21.1)

Deoxyribonuclease I (DNasa I) es una endonucleasa que acta en el ADN de una


o de doble cadena (ya sea aislada o incorporado en la cromatina). DNasa I se
utiliza para nick de traduccin de ADN, para generar fragmentos aleatorios para
secuenciacin didesoxi, para digerir el ADN en ARN o protena preparaciones, y
para el anlisis de las interacciones protena-ADN en Huella DNasa.

DNasa I es una glicoprotena de 31 kDa, por lo general purificada a partir de


pncreas bovino como una mezcla de cuatro isoenzimas (A, B, C, y D). Es
importante sealar que las preparaciones crudas de DNasa I a menudo estn
contaminados con RNasa A. Por lo tanto, una gran atencin debe ser pagado al
control de calidad proporcionada por el fabricante para garantizar la falta de
actividad RNasa A en DNasa I preparaciones. Al final de la reaccin, DNasa I
puede ser eliminado de la preparacin por desnaturalizacin trmica a 75 C
durante 5 min en presencia de EGTA 5 mM (Huang et al. 1996).
La escisin catalizada por DNasa I se produce preferentemente en 3 'de una
pirimidina (C o T) de nucletidos, y genera polinucletidos con conexin grupo 3'OH y un 5'-fosfato. En presencia de Mg2 +, DNasa I hidroliza cada hebra de ADN
dplex independiente, generando divisiones aleatorios. La actividad mxima se
obtiene en presencia de Ca2 +, Mg2 +, Mn2 + y iones (Kunitz 1950). La naturaleza
de los cationes divalentes presentes en la mezcla de incubacin afecta tanto a la
especificidad y modo de accin de la DNasa I (Campbell y Jackson 1980;
Junowicz y Spencer 1973). Por ejemplo, en presencia de Mn2 +, DNasa I escinde
ambas hebras de ADN en aproximadamente el mismo sitio, la produccin de
extremos romos o fragmentos con 1-2 bases sobresalientes.

Exonucleasa III (exodeoxyribonuclease III, EC 3.1.11.2)


Exonucleasa III se aisl primero a partir de la BE 257 cepa de E. coli, que contiene
un plsmido superproductora termo-inducible (PS3). Exonucleasa III es una
enzima monomrica de 28 kDa (Weiss 1976) con varias actividades interesantes
(Mol et al., 1995): i) la actividad exonucleasa 3 ': exonucleasa III cataliza la
eliminacin de mononucletidos de 3'-OH extremos de ADN de doble hebra ; ii) la
actividad de la fosfatasa: exonucleasa III defosforila cadenas de ADN que terminan
con un grupo fosfato 3 '(este tipo de cadena es generalmente inerte como un
cebador e inhibe la accin de la polimerasa de ADN); iii) la actividad RNasa H:
exonucleasa III degrada cadenas de ARN de los hbridos de ADN / ARN (Rogers y

Weiss 1980); iv) la actividad endonucleasa: exonucleasa III escinde bases purnas
y pirimidinicas del esqueleto de fosfato de azcar en el ADN (Keller y Crouch
1972).
Otra caracterstica significativa de la exonucleasa III es su especificidad relativa
para el ADN de doble cadena. Cuando esta enzima acta como una
endonucleasa, se genera un vaco en las mellas en el ADN de doble cadena,
mientras que cuando acta como una exonucleasa, se
genera un extremo 5'-protuberante (que es resistente a la digestin adicional
desde exonucleasa III no est activo en el ADN de una sola hebra). Exonucleasa
III es nica entre las exonucleasas en su accin fosfo-monoesterase en un
extremo 3'-fosfato (Demple y Harrison 1994;. Mol et al 1995).
Al igual que la enzima de tipo salvaje, la mutante polinucletido quinasa est
hecho de cuatro subunidades de 33 kDa cada una, transfiere efectivamente el
fosfato gamma de ATP al extremo 5'-OH de ADN y ARN. Adems, los
polinucletidos quinasas mutantes y el tipo salvaje requieren concentraciones de
iones de magnesio similares, tienen el mismo pH optima y se inhibe por tanto
fosfato inorgnico. El polinucletido mutante quinasa es muy til cuando la
actividad de la 3'- exonucleasa debe evitarse (por ejemplo, el terminal 5'-32P
etiquetado de 3'-CMP en vista de extremo etiquetado 3 'del ARN especies antes
de la toma de huellas dactilares o secuenciacin).
PIROFOSFATASA CIDA DE TABACO
Pirofosfatasa cida de tabaco se utiliza como un primer paso para el etiquetado de
mRNAs en sus de extremos 5', que generalmente tienen un lmite, a fin de generar
sondas para radiomarcados de secuenciacin de ARN: in vitro, 32P-etiquetado de
ARNm 5' terminal, exige la eliminacin de los 7-metilguanosina y 5'-fosfato restos
del extremo de tope final. Pirofosfatasa cida del tabaco hidroliza el enlace
pirofosfato en el capuchn del puente de trifosfato, la generacin la terminacin de
un 5'-fosfato en la molcula de ARN (que conduce a p7MeG, pp7MeG y ppN- PN-

ARNm). La capucha abierta generado puede entonces ser desfosforilada por la


fosfatasa alcalina, y la etiqueta con T4 polinucletido quinasa utilizando 32P-ATP.
Las Nucleasas rompen los enlaces fosfodister en la columna vertebral de los
cidos nucleicos. Basado en su modo de accin, dos clases principales se han
definido: exonucleasas son activos en el extremo de molculas de cido nucleico,
y

endonucleasas

de

rompen

cidos

nucleicos

internamente.

Las

desoxirribonucleasas del rompen el ADN y genera nicks (punto en una molcula


de ADN de doble cadena donde no hay enlace fosfodister entre los nucletidos
adyacentes de una hebra, tpicamente a travs del dao o la accin de la enzima),
mientras que las ribonucleasas rompen ARN. Las nucleasas son espadas doble
filo para los bilogos moleculares: por un lado, son el peor enemigo para los
acidos nucleicos integridados y, por otro lado, son muy tiles para cortar y
manipular cidos nucleicos para fines de clonacin.
Las principales caractersticas de las nucleasas discutidas
en esta seccin se resumen en la Tabla 5.
Desoxirribonucleasas
Deoxyribonuclease I (DNase I, EC 3.1.21.1)

Deoxyribonuclease I (DNasa I) es una endonucleasa que acta en el ADN de una


o de doble cadena (ya sea aislada o incorporado en la cromatina). DNasa I se
utiliza para nick de traduccin de ADN, para generar fragmentos aleatorios para
secuenciacin didesoxi, para digerir el ADN en ARN o protena preparaciones, y
para el anlisis de las interacciones protena-ADN en Huella DNasa.
DNasa I es una glicoprotena de 31 kDa, por lo general purificada a partir de
pncreas bovino como una mezcla de cuatro isoenzimas (A, B, C, y D). Es
importante sealar que las preparaciones crudas de DNasa I a menudo estn
contaminados con RNasa A. Por lo tanto, una gran atencin debe ser pagado al
control de calidad proporcionada por el fabricante para garantizar la falta de
actividad RNasa A en DNasa I preparaciones. Al final de la reaccin, DNasa I

puede ser eliminado de la preparacin por desnaturalizacin trmica a 75 C


durante 5 min en presencia de EGTA 5 mM (Huang et al. 1996).
La escisin catalizada por DNasa I se produce preferentemente en 3 'de una
pirimidina (C o T) de nucletidos, y genera polinucletidos con conexin grupo 3'OH y un 5'-fosfato. En presencia de Mg2 +, DNasa I hidroliza cada hebra de ADN
dplex independiente, generando divisiones aleatorios. La actividad mxima se
obtiene en presencia de Ca2 +, Mg2 +, Mn2 + y iones (Kunitz 1950). La naturaleza
de los cationes divalentes presentes en la mezcla de incubacin afecta tanto a la
especificidad y modo de accin de la DNasa I (Campbell y Jackson 1980;
Junowicz y Spencer 1973). Por ejemplo, en presencia de Mn2 +, DNasa I escinde
ambas hebras de ADN en aproximadamente el mismo sitio, la produccin de
extremos romos o fragmentos con 1-2 bases sobresalientes.

Exonucleasa III (exodeoxyribonuclease III, EC 3.1.11.2)


Exonucleasa III se aisl primero a partir de la BE 257 cepa de E. coli, que contiene
un plsmido superproductora termo-inducible (PS3). Exonucleasa III es una
enzima monomrica de 28 kDa (Weiss 1976) con varias actividades interesantes
(Mol et al., 1995): i) la actividad exonucleasa 3 ': exonucleasa III cataliza la
eliminacin de mononucletidos de 3'-OH extremos de ADN de doble hebra ; ii) la
actividad de la fosfatasa: exonucleasa III defosforila cadenas de ADN que terminan
con un grupo fosfato 3 '(este tipo de cadena es generalmente inerte como un
cebador e inhibe la accin de la polimerasa de ADN); iii) la actividad RNasa H:
exonucleasa III degrada cadenas de ARN de los hbridos de ADN / ARN (Rogers y
Weiss 1980); iv) la actividad endonucleasa: exonucleasa III escinde bases purnas
y pirimidinicas del esqueleto de fosfato de azcar en el ADN (Keller y Crouch
1972).
Otra caracterstica significativa de la exonucleasa III es su especificidad relativa
para el ADN de doble cadena. Cuando esta enzima acta como una

endonucleasa, se genera un vaco en las mellas en el ADN de doble cadena,


mientras que cuando acta como una exonucleasa, se
genera un extremo 5'-protuberante (que es resistente a la digestin adicional
desde exonucleasa III no est activo en el ADN de una sola hebra). Exonucleasa
III es nica entre las exonucleasas en su accin fosfo-monoesterase en un
extremo 3'-fosfato
(Demple y Harrison 1994;. Mol et al 1995).

Exonucleasa III es usualmente usada en conjunto con el fragmento Klenow del


ADN polimerasa del E.Coli para generar hebras de ADN marcado con radio.
Tambin se utiliza de forma secuencial con Nucleasa S1 para reducir la longitud
de doble hlice de ADN.
El pH ptimo para un endonucleoltico de exonucleasa III y actividades
exonucleotidas es de entre 7.6 y 8.5, mientras que la actividad mxima de la
fosfatasa se da entre un pH de 6.8 y 7.4. Se requiere de la presencia de iones
Mg2 o Mn2 para una actividad ptima, mientras que la presencia de Zn2 inhibe la
actividad enzimtica (Richardson and Kornberg 1964; Richardson et al. 1964;
Rogers y Weiss 1980).

Bal 31 nucleasas (EC 3.1.11)

Dos especies moleculares diferentes que se describen como rpido (F) y lenta (S)

Bal 31 nucleasas han sido purificadas a partir del medio de cultivo de Alteromonas
espejiana Bal 31. Ambas especies
acortar dplex de ADN (en tanto 3 'y 5') y sin utilizar mellas internas, y muestran
una muy especfica actividad endonucleasa de ADN de cadena sencilla (escinde
en mellas,las lagunas y las regiones de cadena simple de ADN dplex y ARN).
La Nucleasa F-Bal 31 purificada se utiliza para la restriccin, mapeo, eliminacin
de largos tramos (hasta miles de base pares) o cortos tramos (decenas a cientos
de pares de bases)
del DNA dplex, mapeo de las ensambladuras B-Z ADN, rompiendo el ADN en
sitios de lesiones covalentes (tales como UV-inducida), y acortamiento de las
molculas de ARN. El S-Bal 31 es una enzima de accin lenta utilizada slo para
el mapeo de restriccin y eliminacin de tramos cortos de ADN dplex. Desde que
Ca+2 es un cofactor esencial, EGTA es necesaria para inactivar ambas enzimas.
Ms Bal 31 genera fragmentos de DNA con extremos de bases pareadas, que
adems se puede ligar a cualquier fragmento de ADN de extremos romos como
enlazador molecular. Una pequea fraccin de Bal 31 genera frangmentos de DNA
que albergan 5-sobresalliente.

La mayora de los segmentos de ADB Bal-31 generados tienen completamente apareados


los extremos de las bases, que adems pueden ser ligados a fragmentos de ADN de
cualquier extremo como enlazadores moleculares. Una pequea fraccin de fragmentos
de ADN generados por Bal 31 estn albergando a extremos 5 desbordantes, sugiriendo
que Bal 31 secuencialmente acta como una exonucleasa 35, seguido por el retiro de
endonucleoltico de la que sobresalen de los extremos (Shishido y Ando 1982; Talmadge
et al. 1980; Wei et al. 1983). Por lo tanto, la eficacia de una ligadura de un extremo final
puede incrementarse mediante la utilizacin del fragmento de Klenow de polimerasa de la
DNA de e. Coli o T4 DNA polimerasa para llenar extremos 5- generados por Bal-31.
Aunque F y S especies de Bal 31 tienen actividades similares en ADN trenzado simple,
actan en forma diferente doble trenzado de ADN: F-Bal 31 puede acortar DNA dplex de
aproximadamente 20 veces ms rpido que la S-Bal 31 (Talmadge et al. 1980; Wei et al.
1983), aunque la velocidad de reaccin de digestin depende del contenido de la CG de
la sustrato DNA (Kilpatrick et al., 1983). Cuando est probado bajo condiciones estndar,
1 gml de la F - y S-Bal 31 acorta ADN a velocidades de aproximadamente 130 y 10
pares de bases al trmino de un minuto, respectivamente.
Exonucleasa VII (EC 3.1.11.6)
Exonucleasa VII se ha aislado de la cepa de e. Coli K12 primero como un polipptido 88
kDa (Chase y Richardson 1974b). VII exonucleasa degrada especficamente ADN

trenzado simple, sin actividad aparente en hbridos ARN o ADN ARN (Chase y Richardson
1974a). Puesto que es capaz de atacar a cualquiera de los extremos de las molculas de
ADN, es a menudo utilizado para degradar mucho tiempo a los filamentos de la DNA
dplex que sobresalen (como los generados por la restriccin Endonucleasas) y generar
ADN final. Exonucleasa VII difiere situados I y III en eso i) puede degradar el ADN del
extremo 5 o su 3, ii) puede generar oligonucletidos y iii) sigue plenamente activa en 8
mM EDTA. Exonucleasa VII es particularmente til para la rpida eliminacin de las
cartillas del oligonucletido trenzado simple de una reaccin de polimerizacin en cadena
terminada, cuando diferentes cartillas se requieren para posteriores reacciones de PCR
(Li et al., 1991).
Ribonucleasas
Ribonucleasa pancretica (RNasa A, EC 3.1.27.5)
Ribonucleasa pancretica (tambin llamado RNasa A) es una endonucleasa que hiende
solo RNA varado en nuclesidos 3-fosfatos y 3-fosfo oligonucletidos terminando en Cp o
hacia arriba. RNasa A se utiliza para reducir la contaminacin del RNA en preparaciones
de ADN plsmido, y para las mutaciones de mapeo en DNA o RNA por clivaje de
desajuste, puesto que hiende el RNA en hbridos de RNADNA en los sitios de sola
incompatibilidad de nucletidos. RNasa A degrada el RNA en mono nucletidos 3fosforilados y oligonucletidos, generando un 2, 3 fosfato cclico intermedio durante la
reaccin (Anfinsen y blanco 1961).
RNasa A es difcil de desactivar y activo bajo condiciones muy diferentes. Por lo tanto,
mucho cuidado debe ser tomado para evitar la contaminacin con RNasa A y mayor
degradacin de las muestras de RNA. RNasa-inhibidor de placenta humana podra
utilizarse para inhibir la actividad RNasa. Sin embargo, recomendamos utilizar dietil
Pirocarbonato (DEPC), sales de guanidinio, beta-mercaptoetanol, metales pesados o
vanadyl-ribonuclesido complejos para la eficaz inhibicin de RNasa A. RNasa A est
disponible de muchas fuentes comerciales. Como se mencion anteriormente para otras
enzimas, muy pocos proveedores proporcionan informacin til sobre el origen o la
pureza de su preparacin enzimtica.
Ribonucleasa H (3.1.26.4)
Ribonucleasa H (RNasa H) degrada especficamente RNA en hbridos ARN ADN. Permite
la extraccin de ARN de hibridaciones previas, o la destitucin de colas de poli-A en el
extremo 3 de mRNAs. Se consigue una ptima actividad de RNasa H a un pH
comprendido entre 7,5 y 9.1 (Berkower et al., 1973) en la presencia de reduccin de
reactivos. Actividad RNasa H es inhibida en presencia de N-etilmaleimida (una sustancia
qumica que reaccionan con los grupos SH) y no es afectada notablemente por alta fuerza
inica (actividad 50 % se retiene en presencia de 0,3 M de NaCl). ARNasa H requiere
Mg2 iones, que pueden ser reemplazados parcialmente por los iones Mn2.
Otras ribonucleasas

Muchas otras ribonucleasas han sido utilizadas para la secuencia de RNA. Cada uno de
ellas tiene especificidad y requisito especfico. Abajo se encuentra una lista de estas
ribonucleasas. Ribonucleasa Phy que pueda utilizarse para rpida secuencia de ARN.
Est aislado de cultivos de Physarum polycephalum. Ribonucleasa Phy hiende la
molcula de ARN en G, A y U, pero no en residuos de C. Los productos son mono
nucletidos 3 con 5 C terminal. CL3 RNasa se utiliza para la secuencia ARN. Se la asla
de hgado de pollo (Gallus gallus). RNasa CL3 digiere RNA adyacente al cido citidlico en
una proporcin de 60% de residuos de C digeridos para cada residuo U digerido. La
actividad enzimtica es inhibida por tractos de poli-A, a menos que se agrega la
espermidina. Utilizado principalmente para RNA secuenciacin (Lockard et al.1978),
ribonucleasa cereus es una endorribonucleasa que hiende preferentemente al RNA y a
residuos de C. Ribonucleasa Phy M, purificado de Physarum polycephalum, tambin se
ha utilizado para la secuencia de ARN (Donis-Keller 1980). Ribonucleasa Phy M
preferencial segmenta el RNA en residuos de C y A. Ocasionalmente, puede producirse
G. Esta reaccin indeseada puede minimizarse en presencia de 7 M de urea.

ARNasa T1 es una endorribonucleasa que especficamente degrada ARN en


residuos de G. Hiende el enlace fosfodister entre 3 '-guanlico residuos y los
residuos de 5-OH de nucletidos adyacentes con el formacin de 2 intermedio
correspondiente, 3-cclico fosfatos. ARNasa T1 es un 11 kDa protena purificada a
partir de Aspergillus oryzae. RNasa T2 tambin es purificado de Aspergillus
oryzae. Lo tiene un peso molecular de 36.000 y golpea a todos enlaces
fosfodister en el ARN, con una preferencia por adenlico bonos. U2 RNasa,
purificado de Ustilago sphaerogena, es utilizada como complemento de ARNasa
T1 en la secuencia de RNA, discriminar los residuos purines desde lo
especficamente hiende residuos de adenina cuando se incuban a 50 C, pH3.5 y
en la presencia de urea de 8 M. Cuando se incuban bajo estndar condiciones
(Takahashi 1961), RNasa U2 especficamente hiende el 3-enlaces fosfodister
enlace adyacente a purinas, por lo tanto generacin de purines 3-fosfatos u
oligonucletidos con grupos terminales 3 '-fosfato de purina. 2 cclica, 3 Purina
nucletidos se obtienen como productos intermedios y esa revocacin de la
reaccin final paso puede utilizarse para sintetizar ApN y GpN. RNasa U2 es
termoestable (80 C por 4 min) en solucin acuosa de pH 6,9.

DNA/ RNA nucleasas


S1 nucleasa
Nucleasa S1 es una herramienta muy til para medir el grado de hibridacin (ADN
ADN o DNA-RNA), regiones de ADN dplex de sondeo y la eliminacin de ADN
solo trenzado de extremos generados por enzimas de restriccin que resaltan.
Nucleasa S1 es purificado de Aspergillus oryzae. Esta enzima degrada ARN o

ADN simple trenzado en 5 mononucleotides, pero no se degrada DNA dplex o


RNA hbridos ADN en conformacin nativa.
Nucleasa S1 es un metalloprotein de 32 kDa (Vogt 1973). Zn2 requiere para la
actividad. CO2 y Hg2 pueden reemplazar Zn2, pero son menos eficaces como
cofactores. Actividad ptima de Nucleasa S1 se alcanza a pH 4.0 4.3 (se
observa una reduccin de actividad 50 pH 4.9 y la enzima est inactiva en pH6.0).
Nucleasa S1 es fuertemente inhibida por agentes quelantes como el EDTA y
citrato, o por la baja concentracin de fosfato de sodio (tan bajo como 10 mM).
Nucleasa S1 es resistente a la desnaturalizacin agentes tales como urea, SDS o
formamida (Hofstetter et al. 1976; Vogt 1973) y termoestable (Ando 1966).
Nucleasa S1 hidroliza ADN monocatenario cinco veces ms rpido que el RNA y
75.000 veces ms rpido que el ADN de doble hebra. El bajo nivel de roturas de
hilo que puede ser introducido por Nucleasa S1 en el DNA dplex (barba et al.
1973; Shenk et al., 1975; Vogt 1973, 1980; Wiegand et al. 1975) se puede reducir
por la alta concentracin de sal (es decir, 0,2 M). Nucleasa S1 est activo en sitios
sensibles S1 generados por negativo superenrollamiento de la estructura
helicoidal del ADN (barba et al. 1973; Ahijado 1973; Mechali et al. 1973), la
radiacin ultravioleta (Heflich et al. 1979; Hofstetter et al., 1976; Shishido y Ando
1974), o depurinacin (Shishido y Ando 1975).
Nucleasa S1 es ampliamente utilizado cuando especficos eliminacin de
porciones individuales de ADN dplex, hbridos RNA DNA, o las molculas de ARN
se requiere. Entre estas aplicaciones estn mapeando empalmadas de molculas
de ARN, aislamiento de las regiones dplex en genomas virales trenzados simple
(Shishido y Ikeda 1970, 1971), sondeo filamento roturas en las molculas de ADN
dplex (Germond et al. 1974; Shishido y Ando 1975; Escote Vogt, 1973), de las
regiones con menor estabilidad de hlice (Lilley 1980; Panayotatos y pozos de
1981; Shishido 1979), localizacin de secuencias repetidas invertidas (Lilley 1980;
Panayotatos y pozos de 1981; Shishido 1979), introduccin de mutacin de la
canceladura en sitios lazo D ADN dplex (verde y Tibbetts 1980) y la asignacin
de las regiones genmicas implicadas en las interacciones con protenas de unin
a DNA (Meyeret al. 1980).
Mung bean nucleasa
Mung bean Nucleasa puede utilizarse de la misma manera como Nucleasa S1,
para eliminar que sobresalen termina en el DNA dplex o promotor de
transcripcin mapeo.
Mung bean Nucleasa es una sola trenzado especfico DNA y RNA endonucleasa
purificada a partir de brotes de frijol mungo. Rinde terminado 5-fosfato mono - y

oligonucletidos (Johnson y Laskowski 1968, 1970; Mikulski y Laskowski 1970;


Cantado y Laskowski 1962). Degradacin del ADN dplex completa puede ocurrir
cuando se utilizan enzimas alta concentracin y tiempo de incubacin prolongado.
Esto es debido a un proceso de dos pasos: primero introduce la enzima solo
trenzado mellas, seguidos de dobles trenzados escisiones y la digestin
exonucleolitica de los resultantes fragmentos (Johnson y Laskowski 1970; Kroeker
y Kowalski 1978; Kroeker et al. 1976).
Ajuste adecuado de las extensiones que sobresalen 5 se logra cuando el extremo
despuntado final contiene un par de base G-C en su terminal (Ghangas y Wu
1975). Presencia de un par de bases A-t en la posicin donde terminara despus
de cortar el fragmento pareca interferir con precisa remocin del extremo que
sobresale. Composicin del nucletido del saliente no afecta la eficiencia o calidad
de la digestin de nucleoltica (Ghangas y Wu 1975).
Mung bean Nucleasa tambin fue demostrado para ser muy til para extraer
fragmentos de ADN clonados insertados en vectores siguiendo un relave dAdT
(Wensink et al., 1974). Porque poli(dAdT) no son reconocidos como tpico doble
haba trenzado de estructuras (Johnson y Laskowski 1970), son hidrolizados en
mitad de la tasa de colas trenzadas simple, pero son exfoliados ms
eficientemente que otras regiones dplex en el ADN.
Mung bean nucleasa requiere Zn2 + y un agente reductor tal como cistena para la
mxima actividad y estabilidad. Se inhibe por altas concentraciones de sal
(inhibicin del 80 al 90 % en 200-400 m M NaCl). Triton X- 100 ( 0,001 % w / v)
puede aumentar la estabilidad nucleasa de Mung Bean (cuando se utiliza en
concentraciones bajas tales como menos de 50 U / l) y para evitar la adhesin a
las superficies de nucleasa.
METILASAS
Metilasas de sistemas bacterianos de restriccin-modificacin
Bacterias usan endonucleasas de restriccin para degradar ADN extranjero
introducido por agentes infecciosos como bacterifagos. En orden para prevenir la
destruccin de su propio ADN por sistemas de restriccin enzimtica, las bacterias
marcan su propio ADN agregndole grupos metilo (metilacin). sta modificacin,
que no interfiere con las bases pareadas de ADN, usualmente afecta slo a
algunas bases especficas de cada hebra. Las metilasas son parte del sistema
restriccin-modificacin (RM). Catalizan la transferencia de grupos metilo de Sadenosil-metionina (SAM) a nucletidos especficos en la molcula de ADN de
doble hebra. Las metilasas del sistema tipo II RM (ms comunes) estn
codificados por protenas separadas y actan de manera independiente a sus

respectivas nucleasas de restriccin, mientras las metilasas y las actividades


restrictivas de los sistemas tipo I y III RM son proporcionadas por un nico
complejo de protenas (Wilson 1991).
Metilaciones con frecuencia inhiben las enzimas de restriccin que reconocen las
secuencias correspondientes (Sistla y Rao 2004), a pesar de que hay excepciones
a esta regla (Gruenbaum et al 1981): 1) algunas endonucleasas de restriccin se
pegan al ADN en una secuencia de reconocimiento, siendo modificada por las
metilasas dam o dcm (ver abajo); 2) algunas bacterias poseen endonucleasas de
restriccin que slo degradan el ADN metilado y no al ADN anfitrin sin metilar
(para superar la evolucin del camuflaje de algunos bacterifagos que contienen
ADN metilado).
Las metilasas son usadas a menudo en clonacin molecular para proteger al ADN
de digestin durante la clonacin de ADN, cADN o construccin de la biblioteca
genmica. Por ejemplo, cuando se clonan fragmentos de ADN en el sitio BamH I
de un vector dado, la BamH I metilasa puede ser usada primero para proteger el
potencial interno de los sitions BamH I del vector, antes de la adicin de los
enlazadores BamH I y la digestin con la endonucleasa BamH I.
Una metilasa puede inhibir a una endonucleasa de restriccin de un diferente
sistema RM (e.g. Taql metilasa inhibe a la enzima de restriccin BamH I). La
extensin del solapamiento entre las secuencias
restriccin y metilacin
determina el grado al que la metilacin altera la especificidad y/o actividad de la
hendidura. Hay dos tipos de solapamiento: en el primer caso, la secuencia de
metilacin completamente se superpone con la endonucleasa de restriccin, y la
metilacin altera la especificidad de escisin . En el segundo caso, la secuencia de
metilacin parcialmente se superpone con la endonucleasa de restriccin, y la
metilacin nucleotdica modifica la secuencia de reconocimiento de la
endonucleasa, que llega a ser resistente a la actividad endonucleasa (ver abajo).
La primera clase de sobre posicin ocurre cuando las endonucleasas de
restriccin tienen secuencias de reconocimiento degeneradas, y cuando las
metilasas estn activasen slo uno de los posibles sitios. Por ejemplo, la
secuencia de reconocimiento Hinc II es GTPyPuAC, lo que significa que Hinc II
puede hendirse en la cadena duplex de ADN en las siguientes combinaciones:
GTCGAC, GTCAAC, GTTGAC y GTTAAC. La TaqI metilasa (designada M. TaqI)
cataliza la transferencia de un grupo metil al residuo adenina de la secuencia
TCGA. As, de entre los cuatro posibles sitios de reconocimiento de Hinc II, slo
aquellos que contengan la secuencia TCGA sern metilados por M. TaqI, y
consecuentemente ser resistente a digestin por Hinc II. ste es un tipo de de

sobre posicin puede ser usada para crear nuevas especificaciones para
endonucleasas de restriccin en la cadena duplex de ADN (Nelson et al 1984).
La segunda clase de sobre posicin ocurre en los lmites de la secuencia de
reconocimiento por endonucleasas y metilasas de restriccin. Por ejemplo, cuando
la secuencia GGATCC de un sitio de restriccin Bam HI es seguido por GG, el
sitio Bam HI parcialmente se sobrepone con el sitio de metilacin CCGG del M.
Mspl. Desde que M. Mspl transfiere un grupo metil al residuo de citosina 5 en la
secuencia CCGG, ste metila al sitio Bam HI en su citosina interna. Haciendo
resistente la secuencia de la endonucleasa Bam HI.

Dam y dem metilasas.


Muchas de las cepas B, K y W de E. coli contienen dos sitios especficos para
DNA metilasas, que no son parte del sistema RM y son codificados por los genes
dam y dcm (Pirrotta 1976). La dam metilasa transfiere un grupo metilo del SAM a
la posicin N6 del residuo de adenina en la secuencia GATC, mientras que dcm
metilasa (tambin conocida como mec) transfiere un grupo metilo del SAM al
residuo interno de citosina en la secuencia CCAGG o CCTGG.
La metilacin dam regula las reparaciones de los desajustes post replicacin. Todo
el ADN aislado de E. coli no est metilado en la misma medida. Por instancia, el
plsmido pBR322 purificado del ADN de E. coli, tras amplificacin con
cloranfenicol, es resistente a la digestin por Mbo I, que no corta en los sitios
metilados. Adems, slo 50% del ADN obtenido un dam + de una cepa de E. coli
es metilado. El grado de metilacin de citosina in vivo en la secuencia CpG se
relaciona al nivel de expresin gentica en clulas eucariotas, y la cantidad
metilada de los residuos de citosina estn inversamente correlacionados con la
actividad gnica.
Consideraciones practicas en los usos de metilacin in vitro
Los fragmentos de ADN obtenidos por digestin con endonucleasas de restriccin
de ADN metilado in vivo son en muchos aspectos indistinguibles del ADN no
metilado. Sin embargo, es importante para notar que la citosina metilada no
genera una banda en el canal C cuando se secuencia ADN por el mtodo Maxan y
Gilbert. En adicin, la presencia de residuos metil-citosina en el ADN reduce la
eficiencia de transformacin en las cepas ms comunes de E. coli. ste segundo
problema resulta de la existencia de sistemas de restriccin en E. coli K12,
responsable de la degradacin de ADN conteniendo citosinas metiladas. stos
sistemas de restriccin, designados enzimas de restriccin
especfica 5metilcitosina (mcr)-A y mcr B, son similar a aquellas hidroximetilcitosina
degradantes que contienen ADN (rglA y rglB). Las tensiones mcrA + cortan el ADN

modificado por la Hae III, Alu I, Hha I y Msp I metilasas. La deficiencia del sitema
mcrB en cepas de E. coli estn disponibles en New England Biolabs.
Las metilasas de ADN en sistemas del tipo II RM realizan la reaccin de metilacin
bajo condiciones similares as como la restriccin de endonucleasas, excepto que
las metilasas requieren SAM como donador de grupos metilo. Adems, es
generalmente aceptable llevar a cabo la reaccin de metilacin usando buffers
endonucleasas de restriccin estndar donde SAM se ha unido. Tambin, las
metilasas no requieren cationes divalentes para ser activadas, mientras que
muchas endonucleasas de restriccin si.
Otras enzimas
Polyadenilato polimerasa de E. coli
El poliadenilato (polyA) polimerasa de E.coli es un polipptido de 58 kDa que
polimeriza residuos de adenilato en el final 3 de varios polirribonucleotids, en una
manera independiente de la plantilla. In vitro, es usada para extensin 3 de ARN
para preparar un sitio cebador para sintesis cADN usando oligo-dT, o para
purificaciones basadas en poly-dT. Dependiendo de las condiciones
experimentales, polyA polimerasa puede polimerizar un tramo desde 20 a 2000
nucleotidos de largo.
La polyA polimerasa en E. coli cataliza la adicin de monofosfatos de adenina
(AMPs) usando ATP como sustrato, ADP, dATP, y GTP no son considerados
sustratos de polyA polimerasa, pero CTP y UTP si lo son. Poly A polimerasa es
inhibida por iones fosfato y pirofosfato, y cido aurin tricarboxilico es un inhibidor
de ambos ARN polimerasa y de la unin de mRNA a los ribosomas. PolyA
polimerasa es ms bien una enzima inusual en que su ptima actividad requiere la
presencia de altas concentraciones de cationes monovalentes. Es estmulado por
Mn2+ y es insensible a antibiticos como fifampicina y streptoligdina (inhibidores
transcripcionales de inciacion y elongacin, respectivamente. En contraste a la
polinucleotido fosforilasa, otro templete polinucleotido independiente de la plantilla
que sintetiza enzimas, polyA polimeraza no degrada su propio producto polyA.
La polyA polimerasa usa una amplia variedad de especies de RNA monocatenario
como primers. ARN bicatenario y algunos polinucleotidos son primers muy pobres.
El ADN no funciona como primer. sta ltima propiedad es comn a prcticamente
todas las otras polimerasas, excepto por las enzimas aisladas de plantas como
maz que muestra actividad considerable con oligo y poli-dNTPs sintticos.
Topoisomerasas

Las topoisomera I es una protena de 105 kDa que cataliza la relajacin


superenrrollada del ADN por escisin transitoria de una cadena duplex de ADN en
su azcar esqueleto fosfato, y ligado adicional de dos finales generados). La
topoisomerasa I es una protena ubicua nuclear que es usada por celulas durante
los procesos de replicacin, recombinacin o interaccin de protenas de ADN que
involucran desenrrollado del ADN, y as crear superenrrollamiento excesivo ro
arriba del punto de desenrrollado.
In vitro, la topoisomerasa I fue incialmente usada para preparacin circular del
ADN, y para estudiar la unin de nucleosomas o las estructuras terciarias del ADN.
Despus, fue mostrado que la topoisomerasa I tambin cataliza la transferencia
covalente de una hebra de ADN (donador) a un ADN heterologo (aceptor). sta
reaccin involucra la unin inicial de la enzima a una nica hebra de ADN y as
formar ADN covalente/ enzima compleja, que es capaz de ligar un fragmento de
una nica hebra al final 5-OH del ADN aceptor. sta habilidad de topoisomerasa I
funciona como ambas nucleasa y ligasa ha sido utilizada para desarrollar nuevos
vectores de clonacin. El mtodo de clonacin TOPO usa topoisomerasa I de virus
vaccinia que 1) especficamente corta la doble hlice de ADN al final de una
secuencia (C/T) CCTT, y 2) une covalentemente al 3-fosfato de la timina del ADN
generado. La actividad ligasa de la topoisomerasa I pueden entonces unir un ADN
aceptor con final compatible. Los vectores de forma TOPO Invitrogen son
proporcionadas como ADN duplex linear como contenedor de topoisomerasa I
unido covalentemente al fosfato-3 en una hebra, y un GTGG sobresaliente en la
otra hebra. La clonacin se ha alcanzado usando productos de PCR que han sido
amplificados usando un primer promotor que contiene cuatro bases extra (CACC)
en el extremo final 5. El sobresaliente en el vector colando (GTGG) hibridiza el
extremo 5 del producto de PCR, hibrida con las bases aadidas, y la
topoisomerasa liga los productos de PCR in el orden correcto. Tambin liga los
productos en el extremo embotado 3.
Topoisomerasa I se activa a un pH de 7.5 en presencia de 50 a 200 mM NaCl, y se
inactiva por 0.2% SDS. Union covalente del ADN es estimulada por 5-10 mM Mg 2+.
Topoisomerasa II (e. Coli ADN girasa, EC 5.99.1.3)
La topoisomerasa II, el cual es purificado de M. Luteus (Klevan y Wang 1980),
cataliza la rotura y resellado de ambas cadenas de ADN dplex, cambiando el
enlace nmero de formas discretas superenrollados de ADN por dos (Brown et al.
1979; Liu y Miller 1981). Topoisomerasa II tambin es capaz de anudar reversible
ADN circular intacto (Brown et al. 1979; Liu y Miller 1981). Topoisomerasas de tipo

II son protenas multimricas que requieren ATP a estar completamente activo.


Topoisomerasa de tipo II es inhibida por etopsido, un agente quimioteraputico
usado para reducir el crecimiento de dividir rpidamente las clulas cancerosas
(Baldwiny Osheroff, 2005).
Guanylyl transferasa del virus vaccinia
Guanylyl transferasa es un complejo de enzima encapsulada, aislada del virus
de la Vaccinia. Guanylyl transferasa. Se utiliza a la etiqueta ambos extremos 5 di y trifosfato de molculas de ARN, o capuchn (capped)

extremos 5 de ARN

despus del retiro qumico de la Terminal 7-metil-guanosina (m7 G) residuos de.


Este complejo cuenta con tres actividades enzimticas:
1) acta como un RNA trifosfatasa de catalizar la hendidura de una pirofosfato a
partir de un final de trifosfato de un RNA molcula, liberando un extremo bifosfato
RNA;
2) es un guanylyl transferasa, capaz de transferir una molcula de GTP RNA,
liberando pirofosfato (porque el extremo 5 ' de la Molcula de ARN termina en un
grupo fosfato, el vnculo formado entre el RNA y el GTP molcula es una inusual
5-5 acoplamiento de trifosfato, en lugar de los lmites de 3-5 que existen entre
los otros nucletidos formando un filamento del RNA); y
3) es un RNA (guanina-7)-transferasa de metilo que transfiere un grupo metilo de
SAM para el residuo de guanidina 5 de una molcula de RNA. Guanylyl
transferasa

compleja

no

acepta

monofosfato

RNA

como

sustrato.

En

consecuencia, el degradado o Mellado de RNA no ser marcado excepto en el


extremo 5-tapa.
La cantidad ptima de enzima a utilizar debe ser determinar empricamente.
Durante experimentos de etiquetado, es aconsejable verificar que todas las
etiquetas se incorporaron en una autntica gorra estructura. Con este fin, puede
ser Pirofosfatasa cido del tabaco utilizado en una parte alcuota de las muestras

etiquetadas: todo etiquetado debe ser liberado en forma de 5 GMP despus de la


digestin.
Conclusin
Innumerables fuentes de enzimas estn ahora disponibles para cientfico para
propagar, cortar o modificar nucleicos cidos. Una buena comprensin de la
actividad de cada uno enzimas utilizadas en un protocolo especfico sern sin
duda ayudar a seleccionar la fuente ms apropiada de enzimtica actividad
necesaria para un propsito especfico y definir el condiciones ptimas de la
reaccin. Preparaciones ms comerciales de enzimas son confiables y puede ser
utilizado con gran confianza. Sin embargo, no es siempre es posible obtener
informacin sobre la origen biolgico, medida de controles de calidad y de unidad
definicin de varias enzimas ofrecidas por diferentes proveedores. sin embargo,
dicha informacin es crucial para ptimo definir las condiciones de reaccin
clonacin (unidad por reaccin, temperatura ptima, la composicin de bfer,
tiempo

de

incubacin,

condiciones

de

desnaturalizacin,

contaminacin

enzimtica, etc.).Las actividades enzimticas cuidadosamente escogidas y


reactivos de calidad son claves para el xito de experimentos de clonacin.